Utilization of OGU-INRA Hybrid System in Winter Rapeseed Breeding

UTILIZATION OF OGU-INRA HYBRID SYSTEM IN WINTER
RAPESEED BREEDING
VYUŽITÍ HYBRIDNÍHO SYSTÉMU OGU-INRA PŘI ŠLECHTĚNÍ ŘEPKY
OZIMÉ
Koprna R. 1 , Macháčková I. 2 , Horáček J. 3 , Ehrenbergerová J. 4
1 OSEVA PRO s.r.o., odštěpný závod Výzkumný ústav olejnin Opava, Purkyňova 10, 746 01 Opava.
2 Selgen, a.s., Šlechtitelská stanice Chlumec nad Cidlinou, 503 51
3 AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Zemědělská 1, 787 01 Šumperk
4 Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská
a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno.
E-mail: 1 koprna@oseva.cz, 2 chlumec@selgen.cz, 3 horacek@agritec.cz, 4 ehren@mendelu.cz
ABSTRACT
Restorer lines of Ogu-INRA hybrid system with RfRf gene and low glucosinolates content in
seed were selected. On the begining selection of the restorer lines were carried out according
to GSL content. Following selection was aimed at restoring ability in F1 generation after
pollination of sterile CMS component. Total 284 restorer lines were tested according their
restoring ability. The 65 restorer lines (i.e. 22.89 %) with restoring ability above 90 % were
founded. The 45 restorer lines (i.e. 15.84 %) had also GSL content below 18 µmol/g seed.
Molecular method using of SCAR marker SG34 was optimallized and successfuly used for
markering of Rf restorer gene. Check test evaluation on 50 random selected restorer plants
confirmed accuracy of detection dominant Rf gene using these molecular marker. Because of
impossibility for recognize dominant homozygous and heterozygous forms of the Rf gene
using of fertility restoring test according to fertile flowers in F1 generation in addition to
molecular methods is considered in future. Correlation coefficient r=0.24** between GSL
content in restorer lines and their restoring ability in F1 generation were evaluated using of
284 lines and their progeny. Close connection between gene for high GSL content in restorer
lines and Rf gene was confirmed. Finally the 7 restorer lines selected according to healthness
and other convenient agronomical traits were used for creating the 196 experimental 3-lines
Ogu-INRA hybrids.
Key words: winter rapeseed, hybrid, Ogu-INRA, restorer, Rf gene, seed quality,
glucosinolates, molecular markers

ÚVOD
V hybridním šlechtění řepky olejné (Brassica napus L. conv. napus) se využívá
heterozního efektu ve formě nárůstu výnosu semene, výnosu oleje, výšky rostlin, vitality a
jistoty přezimování. Naopak na znaky jako obsah oleje, hmotnost tisíce semen, odolnost proti
poléhání, rezistenci a obsah glukosinolátů heteroze vliv nemá (Paulmann, 1999). Heterozní
efekt byl u řepky olejné prokázán mnoha studiemi (Röbbelen, 1985; Brandle, McVetty,
1989). Kudla (1996) uvádí průměrný heterozní efekt pro výnos semene v generaci F1 u řepky
na úrovni 10%. Na základě výsledků Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu
zemědělského, reálná úroveň heterozního efektu u hybridů registrovaných v ČR se projevuje
zvýšeným výnosem ve srovnání s liniovými odrůdami o 4 – 10%, z toho u systému Ogu-
INRA o 4 – 9% (Zehnálek et al., 2004-2006). Podíl hybridních odrůd řepky stoupl od
hospodářského roku 1998/99, kdy se začali hybridní odrůdy u nás pěstovat na podíl 25,2 %
v zásevu na rok 2006/07 (Baranyk, 2007). Od roku 2000 se sklizňové plochy řepky ozimé
pohybují kolem hranice 300 tis. ha a nadále mírně stoupají.
V současnosti jsou v Evropě nejvíce rozšířené hybridní systémy MSL (Mänlicher
Sterilität Lembke) a CMS (Cytoplasmatic Male Sterility) Ogu-INRA. Výhodou systému Ogu-
INRA oproti rozšířenému systému MSL je vysoká stabilita samčí sterility a relativně nízké
náklady na výrobu osiva (Frauen et al., 2001). Naopak nevýhodou tohoto systému je
nespolehlivá obnova fertility a problémy s obsahem GSL u obnovitele. Oba systémy mají
omezenou genetickou bázi.
Systém cytoplazmatické samčí sterility (CMS) vznikl fůzí protoplastů z ředkve –
japonské odrůdy Ogura do řepky ozimé (Pelletier et al., 1983, 1987). Hlavním cílem
od 80tých let byla tvorba obnovitele fertility pro systém CMS Ogu-INRA (Pelletier et al.,
1987). Tento systém je ovlivněn sterilní cytoplazmou (S), naopak pylově fertilní rostliny mají
fertilní cytoplazmu (F). V případě obnovitele fertility dochází k interakci mezi geny obnovy
fertility RfRf a sterilní cytoplazmou (S). V takovém případě je F1 generace fertilní Rfrf (S).
Pokud dojde k opylení sterilní linie heterozygotním obnovitelem fertility Rfrf, resp. rfRf
výsledkem je generace F1, která je z 50 % fertilní Rfrf (S) a z 50 % sterilní rfrf (S). Alelický
pár v jádru F1 restaurovaného hybrida je pak heterozygotní Rfrf (S). Udržovatelem sterility je
jakákoliv pěstovaná linie řepky, která po opylení sterilního komponentu má v generaci F1
vždy sterilní cytoplazmu (S) a tudíž neprodukuje pyl (Delourme et al., 1998). Negativním
jevem při šlechtění Ogu-INRA hybridů je těsná vazba mezi genem restaurujícím fertilitu a
genem pro vyšší obsah glukosinolátů (GSL) v semeni. Vysoký obsah GSL u linií obnovitele
je způsoben přenosem genu obnovy fertility z ředkve Ogura do řepky (Delourme et al., 1998).
První Ogu-INRA hybridy byly kompozitní, tj. do sterilního hybridu byl přidán určitý
podíl opylovače. Nová generace Ogu-INRA hybridů je v F1 hybridní generaci plně fertilní,
problémem však zůstává hraniční, resp. i nadlimitní obsah nežádoucích glukosinolátů (GSL)
v semeni. Proto je dlouhodobým cílem tvorba dvounulových obnovitelů fertility s dobrými
agronomickými vlastnostmi (Primard-Bisset et al., 2003). První hybridní odrůdy založené na
systému Ogu-INRA registrované v České republice byly kompozitní, tj. osivo bylo tvořeno ze
70-80 % pylově sterilním hybridním komponentem a z 20-30 % opylovačem – nejčastěji

výkonnou odrůdou. Těmito hybridy byly Synergy (1998) a Betty (1999) (Zehnálek, Holubář,
2000). Další vývojovou řadou byly u nás registrované 3-liniové hybridy – Embleme (2002),
jehož finální generace štěpí v poměru 1 : 1 na plně fertilní a sterilní, dále topcross hybrid
Spirit (2003), jehož finální generace štěpí na cca 70% pylově fertilních rostlin a 30% pylově
sterilních. Nejmladšími a z hlediska výnosu i stability opylení bez ohledu na průběh počasí
nejdokonalejšími, jsou pylově fertilní (restaurované) hybridy Extra (2003), Executive (2004),
Vectra (2004) (Zehnálek et al., 2005).
V souvislosti s přerušením vazby mezi vysokým obsahem GSL a geny obnovy
fertility se vyvíjely techniky za účelem efektivní selekce linií obnovitele nesoucích Rf gen.
Využívány jsou izoenzymové a molekulární analýzy i fenotypové pozorování hybridní
generace a její schopnosti produkovat pyl.
Gen obnovy fertility Rf byl lokalizován v těsné vazbě alely Pgi-2 pocházející z ředkve
(Delourme and Eber, 1992). Tyto vazba umožňuje využití molekulárních a izoenzymových
technik při selekci linií obnovitele fertility. Selekce linií obnovitele pomocí izoenzymové
metody u linií s velmi nízkým obsahem GSL je problematická, protože snižovánám GSL se
ztrácí alela Pgi-2 (Bartkowiak-Broda et al., 2003). Ztráta Pgi-2 je zejména u žádoucích linií
s nízkým obsahem GSL. Proto je problematická selekce linií obnovitele s dvounulovou
kvalitou a homozygotním alelickým párem Rf. Při použití izoenzymové analýzy na detekci
Pgi-2 bylo ve skupině materiálů s obsahem GSL do 18,8 µM/g semene detekováno jen 40,1%
rostlin. Naproti tomu ve stejném souboru byl marker OPC 02 detekován u všech testovaných
rostlin. Izoenzymová analýza Pgi-2 byla zavedena pro potřeby šlechtitelů i v České republice
(Horáček and Ačanová, 2003). Jako využitelná metoda selekce linií obnovitele s nízkým
obsahem GSL se jeví použití metody PCR-RAPD s využitím markeru OPC 02, který není
závislý na obsahu GSL v semeni (Barkowiak-Broda et al., 2003). Nevýhodou RAPD markerů
je jejich dominantní charakter, proto jimi není možné rozlišit heterozygotní Rfrf, resp. rfRf
formy genu obnovy fertility od homozygotní RfRf. Jako nejlepší pro detekci linií obnovitele
se jevil SCAR marker SG 34 (Horáček, 2007). Využití nových primerů a techniky PCR
potvrdily Hu et al. (2007). Pro detekci linií obnovitele použili primery BnRFO-DL2R,
BnRFO-AS2F, BnRFO-AS1 a BnRFO-AS2R.
Další možností selekce linií obnovitele na základě fenotypového projevu RfRf genu
v F1 generaci po nakřížení linie obnovitele na sterilní mateřský komponent je tzv. test obnovy
fertility (Koprna and Macháčková, 2006). Ten využívá procentické kvantifikace fertilních a
sterilních rostlin v F1 generaci po nakřížení linie nesoucí Rf gen na sterilní komponent.
Hlavním problémem u linií obnovitele v posledních letech byl vysoký obsah antinutričních
glukosinolátů (GSL). Ty patří mezi nejsledovanější antinutriční látky v řepkovém šrotu. Jsou
to jsou rostlinné glykosidy, které v rostlině plní mimo jiné ochrannou funkci. Jejich rozkladné
produkty (izothiokyanáty a 2-oxazolidinethion) mají fungicidní a antibakteriální účinky, čímž
sice do určité míry rostlinu chrání, jsou ale škodlivé pro organismus konzumentů. Současný
obsah GSL u odrůd registrovaných v ČR je kolem 8 – 20 µmol/g sušiny semene při 9 %
vlhkosti a 46 % olejnatosti. Norma pro registraci odrůd je u nás v současnosti do 18 µmol/g
sušiny semene při 9 % vlhkosti a 46 % olejnatosti. Obsah GSL je dán hlavně genotypem a

mezi odrůdami existují poměrně veliké rozdíly. Rücker and Röbbelen (1994) uvádějí
koeficienty dědivost pro obsah glukosinolátů v semeni h2ns=0.87, resp. h2bs=0.95. Nízký
obsah GSL je podle autorů podmíněn 4-5 recesivními geny s aditivním účinkem.
MATERIÁL A METODIKA
1. Kontrola kvality semene
Všechny izolované rostliny linií obnovitele fertility nesoucí Rf gen a F 1 hybridní
rostliny u kterých byl proveden odečet fertility, byly analyzovány nedestrukční metodou
NIRS (Near Infrared Spectroscopy) ve VÚRV v.v.i. - pracoviště Výzkumná stanice travních
ekosystémů Jevíčko na obsah celkových glukosinolátů (GSL). Obsah GSL je uveden v
µmol/g semene a standardizován na 9 % vlhkost. Vzorky byly měřeny na analyzéru Foss-
NIRSystems 6500 při vlnové délce 400 – 2500 nm v krocích po 2 nm. Koeficient determinace
je pro měření celkových GSL na přístroji NIRS R 2 =0,84 (Míka et al., 2003). Jako referenční
metoda stanovení celkového obsahu GSL pro kalibraci NIRS, ale také pro měření vybraných
linií obnovitelů fertility nesoucích Rf gen byla použita metoda kapalinové chromatografie
(HPLC – High Pressure Liquid Chromatography) - podle normy ISO 9167-1 na pracovišti
OSEVA PRO s.r.o., VÚOl Opava.
2. Selekce linií obnovitele fertility
2.1. Selekce linií obnovitele fertility podle testu obnovy fertility
Výchozí materiál Ogu-INRA hybridu nesoucí gen obnovy fertility Rf byl získán v
roce 1999. Tento genový zdroj nesl heterozygotní alelický pár genu obnovy Rfrf a měl
nadlimitní obsah GSL (31,07 µmol/g semene). Selekce linií obnovitelů fertility byla
prováděna na pracovištích SELGEN a.s., ŠS Chlumec nad Cidlinou a OSEVA PRO s.r.o.,
o.z. Výzkumný ústav olejnin Opava. Do hodnocení byly použity sklizňové roky 2005, 2006 a
2007 z pracoviště Chlumec nad Cidlinou, dále roky 2004, 2006 a 2007 z pracoviště Opava.
V letech 1999 – 2003 byla selekce obnovitele zaměřena jen na kvalitu semene, tj. na
obsah GSL. V prvním sklizňovém roce 2000 bylo samostatně izolováno 95 fertilních rostlin
F 2 generace získaných samoopylením hybridního materiálu nesoucího alespoň jeden Rf gen.
Tento hybridní materiál pocházející od firmy INRA (Francie) v rámci licenční smlouvy, byl
vytvořen křížením mateřského komponentu se sterilní cytoplazmou (S) a obnovitelem fertility
(RfRf). Proto jednotlivé rostliny v F 2 generaci štěpily ve formách Rfrf, resp. rfRf jako fertilní a
rfrf jako sterilní. V roce 2001 bylo selekční kritérium na obsah GSL 13 µmol/g sušiny
semene, roce 2002 a 2003 to bylo 15 µmol/g sušiny semene. Dalším selekčním kritériem
kromě obsahu GSL v semeni byl fenotypový projev Rf genu. Ten u selektovaných rostlin
způsobil produkci pylu na prašnících v době květu. Rostliny byly selektovány podle
morfologie květu (obrázek č.1.):
a) sterilní rostliny – mají menší korunní plátky a zakrnělé prašníky bez pylových zrn

) fertilní rostliny – mají plně vyvinuté korunní plátky a prašníky produkují pyl
Do roku 2003 byly selekce zaměřeny jen na izolaci rostlin produkujících pyl a stanovení
obsahu GSL v semeni. Produkce osiva byla zabezpečena izolací rostliny během kvetení
mikroperforovaným polypropylenovým sáčkem o rozměrech 65 x 35 cm.
V roce 2003 byly poprvé nakříženy vybrané linie obnovitele nesoucí Rf gen na sterilní
komponent – tzv. „tester“. Jako tester byla použita linie A115, která byla vytvořena na
pracovišti Chlumec nad Cidlinou metodu backcrossu výchozího novošlechtění B115 na
sterilní CMS linii. Od roku 2003 byl tento tester BC5 A115 použit jako mateřský komponent
pro zkoušku obnovy fertility otcovských linií nesoucích Rf gen. Po sklizni hybridního osiva
vzniklého křížením otcovské linie obnovitele na sterilní CMS komponent nesoucí sterilní
cytoplazmu (S), bylo toto osivo vyseto v následujícím roce do mikroparcel na ploše 3 m 2 a byl
u nich proveden odečet všech fertilních a sterilních rostlin. Podle podílu fertilních a sterilních
rostlin byla kvantifikována procentická schopnost obnovy fertility sledované linie obnovitele.
Varianty s menším počtem rostlin v F 1 generaci než 10, byly vyloučeny z hodnocení. Po
procentickém výpočtu fertilních rostlin v F 1 generaci bylo stanoveno selekční kritérium pro
linie obnovitele fertility nad hranici 80 % obnovy. Stálým selekčním kritériem zůstal i obsah
GSL pod 18 µmol/g semene při 9 % vlhkosti.
Obrázek č.1: Sterilní květ CMS mateřské linie (vlevo) a plně fertilní květ obnovitele fertility,
resp. udržovatele sterility (vpravo)
2.1.Selekce linií obnovitele fertility pomocí molekulárních markerů:
Pro potřeby molekulární analýzy byl z mladých rostlin odebrán druhý pravý list.
Izolace genomové DNA byla provedena pomocí afinitních kolon Invisorb Spin Plant Kit
(Invitek). Získaná DNA byla použita jako templát při PCR. Sekvence specifických primerů
pro marker SG34 typu SCAR byly získány z literatury (Primard-Brisset et al. 2005). Produkt
PCR byl analyzován pomocí elektroforézy na agarozovém gelu (1,5% agaroza (Serva), TBE
pufr), proužky byly vizualizovány pomocí ethidiumbromidu (Sigma) v UV-světle. Pro určení

velikosti fragmentu byl použit žebřík 100bp Ladder Plus (MBI Fermentas). Přítomnost
proužku znamenala pylovou fertilitu, nepřítomnost proužku pak pylovou sterilitu.
3. Tvorba sterilních mateřských CMS linií a experimentálních 3-liniových hybridů
Výchozí mateřská sterilní CMS linie z roku 1998 měla nadlimitní obsah GSL (34,73
µmol/g semene při 9 % vlhkosti podle HPLC). Základní metodou zlepšení kvality bylo 6–7
zpětných zpětných křížení s donory kvality. Zpětná křížení u 250 kombinací byla prováděna
na pracovišti ŠS Chlumec nad Cidlinou. Kvalita rodičovských komponent byla každoročně
kontrolována pomocí skríningové analýzy NIRS. Během šestiletého cyklu zpětných křížení
bylo dvakrát provedeno kontrolní analytické měření kvality sterilních mateřských linií
metodou HPLC. Kritériem pro konečný výběr perspektivních CMS linií byla kvalita semene,
stabilní úroveň sterility a dobré agronomické vlastnosti.
Tvorba experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů začala v roce 2006 křížením
28 výkonných udržovatelů sterility z pracovišť ŠS Chlumec nad Cidlinou a VÚOl Opava na
CMS linii A115. Tyto kombinace byly vyprodukovány systémem setí dvou krajních řádků
opylovač o délce 1,5 m a dvou řádků sterilní CMS linie umístěných uprostřed. Každá
kombinace byla zaizolována izolátorem o velikosti 1,5 x 1,5 m a výšce 1,8 m. Po sklizni
hybridního osiva byl v roce 2006 založen na obou pracovištích blok předstihového množení
experimentálních hybridů v prostorové izolaci (obrázek č. 3.). V jednotlivých blocích
rozdělených podle původu opylovačů došlo k opylení sterilních F 1 hybridů příslušnou linií
obnovitele fertility.
4. Ověření korelace mezi obsahem GSL v semeni linií obnovitelů a jejich schopností obnovy
fertility v F 1 generaci
Po vyhodnocení obnovy fertility otcovských linií nesoucích Rf gen a analýze kvality
semene byly ze sklizňových let 2004, 2005 a 2006 z pracoviště Chlumec nad Cidlinou, dále
z let 2004, 2006 a 2007 z pracoviště Opava vypočteny korelační koeficienty mezi obsahem
GSL v liniích obnovitele a jejich schopností obnovovat fertilitu v generaci F 1 . Pro konečný
výpočet korelačního koeficientu (r) bylo použito celkem 284 kombinací testovacího křížení
linií obnovitelů na sterilní tester (linie A115).
VÝSLEDKY A DISKUZE
1. Kontrola kvality semene
V jednotlivých letech byly selektovány linie obnovitele fertility podle selekčních
kritérií uvedených v tabulce č.1. Ze 166 rostlin bylo v roce 2001 selektováno na základě
obsahu GSL v semeni 34 rostlin (20,48 %), v roce 2002 z 21 celkem bylo selektováno
9 rostlin (45 %) a v roce 2003 bylo ze 20 rostlin vybráno 8 (40 %). Současně bylo vybráno na
základě kvality dalších 55 rostlin (76,37 %) z celkového počtu 76 rostlin F 2 generace, které
vznikly samoopylením hybridních rostlin. V roce 2003 bylo vybráno na základě nízkého

obsahu GSL v semeni celkem 63 linií obnovitele fertility s obsahem GSL do 15 µmol/g
semene určených na test obnovy fertility v následujícím roce. Průměrný obsah GSL ve
skupině obnovitele fertility byl ve sledovaném období let 2001 – 2004 od 16,17 do 19,23
µmol/g semene (tabulka č.2). V této skupině obnovitelů fertility nebyla do roku 2003
kontrolována jejich schopnost obnovovat fertilitu v F 1 generaci. Nejvyšší ohlas na selekci byl
po roce 2001, kdy bylo vybráno jen 20,48 % rostlin na základě obsahu GSL. Po poklesu
selekčního kritéria na obsah GSL v roce 2002 u potomstva v roce 2003 obsah GSL mírně
stoupl. Nejvyšší nárůst obsahu GSL byl zaznamenám po selekci v roce 2003, kdy u potomstva
analyzovaného v roce 2004 stoupl o 2,72 µmol/g semene. Tento nárůst koresponduje se
závěry Rückera and Röbbelena (1994) o recesivním založení genů pro nízký obsah GSL
v semeni řepky.
Tabulka č.1: Počet rostlin (N), rok selekce, selekční kritérium, selekční rozdíl (S) a ohlas na
selekci (R) ve sledované skupině obnovitelů fertility.
N rodiče / rok N potomci / rok
S
(µmol GSL/g sem.)
R
(µmol GSL/g sem.)
selekční kritérium
(µmol GSL/g sem.)
166 / 2001 21 / 2002 6,463 1,499 13
21 / 2002 20 / 2003 4,661 0,342 15
20 / 2003 98 / 2004 6,610 2,721 15
Tabulka č.2.: Obsah glukosinolátů (GSL) v souboru obnovitelů fertility použitých pro selekci
Rf genu
rok N prům ěr min max rozptyl sm. odch. var.koef.
2001 166 17,67 3,57 32,17 24,51 4,95 28,02
2002 21 16,17 8,37 35,45 32,34 5,69 37,17
2003 20 16,51 6,90 41,40 59,79 7,73 49,89
2004 98 19,23 4,56 48,13 62,39 7,90 41,07
2.1. Selekce linií obnovitele fertility podle testu obnovy fertility
Na základě testu obnovy fertility u hybridního potomstva bylo v letech 2004 - 2007
získáno 80 linií obnovitele fertility se schopností obnovy nad 80 % z celkového počtu 284
testovaných linií na přítomnost Rf genu (graf č.1). Z tohoto počtu mělo 58 linií obnovitele
(72,50 %) obsah GSL v pod hranicí 18 µmol/g semene. Z celkového počtu sledovaných linií
obnovitele mělo 65 schopnost obnovy fertility v F 1 generaci nad 90 %, z toho 45 linií
(69,23 %) mělo obsah GSL v semeni pod stanovenou hranici 18 µmol/g semene. Po ověření
kvality a schopnosti obnovy fertility nad 95 % v F 1 generaci bylo vybráno 7 linií obnovitelů
fertility pro zásev množitelské plochy experimentálních Ogu-INRA hybridů v roce 2006.
Obsah GSL je u vybraných linií obnovitelů od 9,81 do 17,60 µmol/g semene (podle HPLC).
Vyšší výskyt linií obnovitelů nesoucích Rf gen, kteří obnovují fertilitu od 40 do 60 %
v generaci F 1 (32,39 % výskytu) a linií obnovujících fertilitu nad 90 % (22,89 % výskytu)
pravděpodobně potvrzuje údaje Delourme et al. (1998) o principu obnovy fertility u systému
Ogu-INRA. Její úroveň závisí podle toho, zda-li má otcovský komponent geny obnovy
fertility v heterozygotní formě Rfrf, resp. frRf, nebo v homozygotní dominantní formě RfRf.

Linie nesoucí homozygotní formu genu obnovy RfRf jsou pravděpodobně schopni obnovovat
fertilitu nad hranici 90 % v generaci F 1 .
Graf č.1: Celkový počet linií obnovitele fertility podle schopnosti obnovovat fertilitu v F1
generaci
70
65
60
54
počet linií obnovitele
50
40
30
20
10
21
9 10
25
38
31
16 15
0
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
% obnovy fertility v F1 generaci
2.2. Selekce linií obnovitele fertility pomocí molekulárních markerů:
Rutinnímu využití markeru SG34 pro selekce linií obnovitele fertility předcházelo
rozsáhlé hledání a testování různých typů markerů. Po opuštění techniky využívající
isoenzymových markerů PGI bylo otestováno 60 RAPD markerů, z nichž některé byly
schopné odlišit pylově sterilní a pylově fertilní rostliny řepky. Nevýhodou RAPD markerů
však byla malá reprodukovatelnost analýz a komplikovaná spektra proužků. Proto byly
vybrány nejvhodnější RAPD markery a převedeny do formy markerů typu SCAR (Horáček
2007). Tyto jsou již poměrně robustní a výsledkem analýzy je pouze jediný proužek. Nově
vyvinuté SCAR markery byly porovnány s markery získanými z literatury (Primard-Brisset et
al. 2005). Jako nejvhodnější byl vybrán marker SG34 (obrázek č.2). Pomocí markeru SG34
bylo analyzováno 5 genotypů řepky, každý genotyp po 10 vzorcích. Rostliny byly poté
dopěstovány do fáze květu. Byla ověřena 100% korelace mezi výsledky molekulárních analýz
a pylovou fertilitou/sterilitou jednotlivých rostlin.

Obrázek č.2: Analýza SCAR markeru genu Rfo (marker SG34). Přítomnost proužku
znamená fertilní kombinaci alel (RfoRfo nebo Rforfo), nepřítomnost proužku pak pylovou
sterilitu (rforfo).
3. Tvorba sterilních mateřských CMS linií a experimentálních 3-liniových hybridů
Po sklizni 28 kombinací F 1 sterilních Ogu-INRA hybridů v roce 2005 byly tyto
následně zasety v roce 2006 do bloku předstihového množení s vybranými 7 liniemi
obnovitelů fertility (obrázek č.3.). Sklizené osivo všech kombinací bylo sklizeno v roce 2007
a ve stejném roce zaseto ve 2 opakováních na 2 pokusných lokalitách do bloku zkoušek užitné
hodnoty s kontrolními hybridy Sitro a Baldur. Vzniklo tak celkem 196 kombinací
experimentálních Ogu-INRA hybridů.
Obrázek č.3: Schéma množení experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů v roce
2006/07
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 3.
CMS č.1.
Obnovitel č. 3.
CMS č.2.
Obnovitel č. 3.
CMS č.3.
Obnovitel č. 3.
CMS č.4.
Obnovitel č. 3.
CMS č.5.
Obnovitel č. 3.
CMS č.6.
Obnovitel č. 3.
CMS č.7.
Obnovitel č. 3.
CMS č.8.
Obnovitel č. 3.
CMS č.9.
Obnovitel č. 3.
CMS č.10.
Obnovitel č. 3.
CMS č.11.
Obnovitel č. 3.
CMS č.12.
Obnovitel č. 3.
CMS č.13.
Obnovitel č. 3.
CMS č.14.
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 3.
CMS č.28.
Obnovitel č. 3.
CMS č.27.
Obnovitel č. 3.
CMS č.26.
Obnovitel č. 3.
CMS č.25.
Obnovitel č. 3.
CMS č.24.
Obnovitel č. 3.
CMS č.23.
Obnovitel č. 3.
CMS č.22.
Obnovitel č. 3.
CMS č.21.
Obnovitel č. 3.
CMS č.20.
Obnovitel č. 3.
CMS č.19.
Obnovitel č. 3.
CMS č.18.
Obnovitel č. 3.
CMS č.17.
Obnovitel č. 3.
CMS č.16.
Obnovitel č. 3.
CMS č.15.
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 3.
Obnovitel č. 4.
Obnovitel č. 4.
CMS č.1.
Obnovitel č. 4.
CMS č.2.
Obnovitel č. 4.
CMS č.3.
Obnovitel č. 4.
CMS č.4.
Obnovitel č. 4.
CMS č.5.
Obnovitel č. 4.
CMS č.6.
Obnovitel č. 4.
CMS č.7.
Obnovitel č. 4.
CMS č.8.
Obnovitel č. 4.
CMS č.9.
Obnovitel č. 4.
CMS č.10.
Obnovitel č. 4.
CMS č.11.
Obnovitel č. 4.
CMS č.12.
Obnovitel č. 4.
CMS č.13.
Obnovitel č. 4.
CMS č.14.
Obnovitel č. 4.
Obnovitel č. 4.
Obnovitel č. 4.
Obnovitel č. 4.
CMS č.28.
Obnovitel č. 4.
CMS č.27.
Obnovitel č. 4.
CMS č.26.
Obnovitel č. 4.
CMS č.25.
Obnovitel č. 4.
CMS č.24.
Obnovitel č. 4.
CMS č.23.
Obnovitel č. 4.
CMS č.22.
Obnovitel č. 4.
CMS č.21.
Obnovitel č. 4.
CMS č.20.
Obnovitel č. 4.
CMS č.19.
Obnovitel č. 4.
CMS č.18.
Obnovitel č. 4.
CMS č.17.
Obnovitel č. 4.
CMS č.16.
Obnovitel č. 4.
CMS č.15.
Obnovitel č. 4.
Obnovitel č. 4.

4. Ověření korelace mezi obsahem GSL v semeni linií obnovitelů a jejich schopností obnovy
fertility v F 1 generaci
U celkového počtu 284 linií obnovitele fertility byly vypočteny korelační koeficienty
mezi jejich obsahem GSL a schopností obnovovat fertilitu v F 1 generaci (graf č.2., tabulka
č.3.). Ve 4 souborech pozorování byly zjištěny korelační koeficienty r=0,15 až r=0,53**.
Průměrná hodnota korelačního koeficientu za celý sledovaný soubor (r=0,23**) potvrzuje
údaje Delourme and Ebera (1992) a Delourme et al. (1998) o vazbě genu obnovy fertility
s vyšším obsahem GSL v semeni. I přes tuto vazbu se však podařilo nalézt linie obnovitele
fertility s vysokou úrovní obnovy v F 1 generaci a podlimitním obsahem GSL.
Tabulka č.3: Charakteristika materiálů použitých pro výpočet korelačního koeficientu mezi
obsahem GSL obnovitelů a jejich schopností obnovy fertility v generaci F1
schopnost obnovy fertility v
F1 generaci (%)
obsan GSL v semeni linií
obnovitele (mikromoly /g
sem.)
korelace mezi obsahem
GSL obnovitele a
scopností obnovovat
rok, lokalita N průměr min max průměr min max ferilitu v F1
2004, Opava 64 53,01 16,67 100 17,10 5,33 32,15 0,48**
2006, Opava 43 68,24 3,7 100 16,59 8,51 36,54 0,22**
2007, Opava 45 60,93 0 100 10,61 0,37 22,54 0,15
2005, Chlumec 36 58,18 0 100 16,1 3,27 38,66 0,59**
2006, Chlumec 39 58,31 1,56 98,4 13,08 0,58 35,61 0,54**
2007, Chlumec 57 59,6 0 100 14,00 2,18 23,71 0,02
Celkem 284 59,28 0 100 14,69 0,37 38,66 0,24**
Graf č.2: Závislost obsahu GSL u linií obnovitele a jejich schopnosti obnovy fertility v F1
generaci
Obsah GSL u linií obnovitelů fertility
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
y = 0,0536x + 11,524
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
% obnovy fertility v F1 generaci

ZÁVĚR
Pomocí postupné selekce na nízký obsah glukosinolátů (GSL) a později na schopnost
obnovovat fertilitu v F 1 generaci po opylení sterilního CMS testera, se podařilo nalézt celkem
linie obnovitele fertility s RfRf genem a dobrou kvalitou semene. Celkový počet testovaných
linií na schopnost obnovy fertility byl 284. Z tohoto bylo vybráno 65 linií obnovitelů
(22,89 %), kteří v F 1 generaci restaurovali fertilitu nad 90 %, z toho 45 linií obnovitelů
(15,84 %) mělo současně i obsah GSL v semeni pod 18 µmol/g semene. Podařilo se
optimalizovat metodu molekulárního markerování Rf genu obnovy fertility s použitím SCAR
markeru SG34. Kontrolní hodnocení na 50 náhodně vybraných rostlinách potvrdilo 100 %
detekci dominantního Rf genu. Z důvodu problematickém odlišení homozygotního (RfRf) a
heterozygotního (Rfrf) alelického páru nesoucího Rf gen, se však nadále uvažuje o využití
klasické metody selekce obnovitelů pomocí kontroly fertility v F 1 generaci v kombinaci s
technikou molekulárního markerování. Po analýze kvality 284 linií obnovitelů a jejich
schopnosti obnovy fertility v F 1 generaci po nakřížení na sterilní tester A115, byla korelačním
koeficientem r=0,24** potvrzena vazba mezi geny pro vysoký obsah GSL v semeni
obnovitelů a Rf genem pro obnovu fertility. Na základě zdravotního stavu a dalších
agronomických vlastností bylo nakonec vybráno 7 linií obnovitelů fertility pro tvorbu 196
experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů.
Publikované výsledky vznikly za finanční podpory projektu MZe ČR – NAZV, projekt
č. 1G46061 „Využití inovovaných metod a specifických šlechtitelských materiálů pro
zvýšení efektivnosti tvorby nových odrůd ozimé řepky.“
LITERATURA
Baranyk P. (2007): Stanovisko k odrůdové skladbě řepky pro rok 2007/08. SPZO Praha,
ISBN 80-87065-01-8.
Bartkowiak-Broda I., Poplawska W., Furguth A. (2003). Characteristic of winter rapeseed
double low restorer lines for cms ogura system. In: Proceedings from the 11th
International Rapeseed Congress, Copenhagen, 6-10th July, 2003, 303-305.
Brandle J.E., McVetty P.B.E. (1989): Heterosis and combining ability in hybrids derived from
oilseed rape cultivars and inbred lines. Crop Science, 29: 1191-1195.
Delourme R., Foisset N., Horvais R. Barret P., Champagne G., Cheung W.Y., Landry B.S.,
Renard M. (1998): Characterisation of the radish introgression carrying the Rfo
restorer gene from the Ogu-INRA cytoplasmatic male sterility in rapeseed (Brassica
napus L.). Theor. Appl. Genet. 97: 129-134.
Delourme R., Eber F. (1992): Linkage between an isosyme marker and a restorer gene in
radish cytoplasmatic male sterility of rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl.
Genet., 85., 222-228.
Frauen M., Winkelmann H.E., Baer A., Brauer D. (2001): Hybridní odrůdy ozimé řepky:
současný stav a budoucnost. Sborník, Seminář Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin
20.-22..11.2001, Hluk, sborník s. 199-205.

Horáček J. (2007): Isozyme and DNA markers of male fertility restorer gene in the rape.
Sborník abstraktů“ 7th International Symposium in the Series Recent advances in
plant biotechnology“, pp. 89, Stará Lesná.
Horáček J., Ačanová M. (2003). Glucose-6-phosphate Isomerase as a marker of Fertility
Restorer Gene in Rape. Czech J. Genet. Plant Breed., 39, 2003 (4): 130-133.
Hu X., Sullivan-Gilbert M., Kubik T, Danielson J, Hnatiuk N., Marchione W., Gupta M.,
Armstrong K., Thompson S. (2007): Development of moleculat markers specific to
Ogura fertility restorer gene Rfo in canola (Brassica napus L.). In: Proceedings, The
12th International Rapeseed Congress, Vol.II., 26.-30.3.2007, Wuhan, China, 314-316.
Koprna R., Macháčková I. (2006): Aktuální výsledky šlechtění hybridů ozimé řepky na bázi
systému Ogu-INRA. Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění a ochraně rostlin,
Sborník referátů z konference, Brno 23.-24.11.2006,str. 207-213.ISBN 80-86908-03-8
Kudla M. (1996): General combining ability of inbred lines and heterosis effect of winter
oilseed rape F1 and F2 hybrids. In: Rośliny Oleiste, 1996, 17:1, 61-71.
Míka V., Tillmann P., Koprna R., Nerušil P., Kučera V. (2003) Fast prediction of quality in
whole seeds of oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Soil Environ., 49, (4):141-145.
Paulmann W. (1999): Pokrok ve šlechtění hybridní řepky a pěstování MSL – hybridních
odrůd. Sborník, Seminář Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin 16.-18..11.1999, Hluk,
sborník s. 96-99.
Pelletier G., Primard C., Vedel F., Chétrit P., Renard M., Delourme R. (1987). Molecular,
phenotypic and genetic characterization of mitochondrial recombinants in rapeseed.
Proceedings from 7th International Rapeseed Congress, Vol.I., Poznań, 1987,113-118.
Pelletier G., Primard C., Vedel F., Chetrit P., Remy R., Rouselle P., Renard M. (1983):
Intergeneric cytoplasmatic hybridization in Cruciferae by protoplast fusion. Mol.
Genet. 191: 244-250.
Primard-Brisset C., Poupard J.P., Horvais R., Budar F., Pelletier G., Rennard M., Delourme
R. (2003). A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRA cms in
rapeseed. In: Proceedings from the 11th International Rapeseed Congress,
Copenhagen, 6-10th July, 2003, 300-302.
Primard-Brisset C., Poupard P., Horvais R., Eber F., Pelletier G., Renard M., Delourme R.,
(2005). In: Theor.Appl.Genet 111: 736-746
Renard M., Delourme R., Valleé P., Pierre J. (1997): Hybrid rapeseed breeding and
production. Proceedings of the International Symposium on Brassicas. Rennes,
France, 23-27th Sept. 1997, 291-289.
Röbbelen G. (1985): Züchtung von Hybridraps. Bericht der Arbeitstagung Saatzuchtleiter,
Gumpenstein, 173-185.
Rücker R., Röbbelen G. (1994): Inheritance of total and individual glucosinolate contents in
seeds of winter oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Breed.., 1994, 113:3, 206-206.
Zehnálek P., Holubář J. (2000): Přehled odrůd olejnin a kmínu 2000. ÚKZÚZ Brno, ISBN
80-86051-66-8.
Zehnálek P., Holubář J. (2004): Přehled odrůd olejnin a kmínu 2004. ÚKZÚZ Brno, ISBN
80-86548-42-2.

Zehnálek P., Holubář J., Mezlík T. (2005): Přehled odrůd olejnin a kmínu 2005. ÚKZÚZ
Brno, ISBN 80-86548-63-5.
Zehnálek P., Holubář J., Mezlík T. (2006): Seznam doporučených odrůd 2006: Řepka olejka.
ÚKZÚZ Brno, ISBN 80-86548-75-9.