Camera Separatoria - ZakÅad Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...

Uniwersytet Przyrodniczo‐Humanistyczny w Siedlcach 

Instytut Chemii 

Camera Separatoria 

Volume 4, Number 1 / June 2012 

Siedlce 2012

Editors (reviewers): 

Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński – Gdańsk, 

Piotr M. Słomkiewicz – Kielce, Piotr Stepnowski – Gdańsk, Andrzej Stołyhwo – 

Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos – Lublin, Paweł K. Zarzycki – Koszalin 

Co-Editors-in-Chief: 

Bronisław K. Głód (Siedlce) and Marian Kamiński (Gdańsk) 

Technical Editors: 

Paweł Piszcz, Paweł M. Wantusiak 

URL: http://dach.ich.uph.edu.pl/pl/_cs.html 

Adres Redakcji / Editorial office’s address: 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce 

tel. (25) 64310 41 

e-mail: psc1@onet.eu 

Publishing House 

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

08-110 Siedlce, ul. Bema 1 

phone: 48 25 643 15 20 

e-mail: wydawnictwo@uph.edu.pl 

www.wydawnictwo.uph.edu.pl

SPIS TREŚCI 

(CONTENTS) 

Prace przeglądowe / Review papers 

Jolanta Kumirska, Marta Potrykus, Natalia Migowska, Ewa Mulkiewicz 

Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania 

wybranych estrogenów w próbkach środowi-skowych ................................... 7 

Natalia Migowska, Jolanta Kumirska 

Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji i/lub 

wzbogacania pozostałości wybranych farmaceutyków w próbkach 

środowiskowych ............................................................................................ 37 

Magda Caban, Anna Michalak, Jolanta Kumirska 

Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów 

w próbkach środowiskowych ........................................................................ 61 

Prace oryginalne / Original papers 

Monika Waksmundzka-Hajnos, Anna Oniszczuk, Rafał Podgórski 

Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji 

na wydajność izolacji wybranych furanokumaryn 

z owoców gorysza wyniosłego (Peucedanum verticillare) ............................ 83 

Bronisław K. Głód, Ewa Szafraniuk, Justyna Pijanowska 

Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów ............................ 93 

Instrukcje dla autorów ................................................................................. 105 

Instructions for Authors and Editorial Policy ............................................... 109


PRACE PRZEGLĄDOWE 

(REVIEW PAPERS)

CAMERA SEPARATORIA 

Volume 4, Number 1 / January 2012, 7-36 

Jolanta KUMIRSKA*, Marta POTRYKUS, Natalia MIGOWSKA, 

Ewa MULKIEWICZ 

Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, 

Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka, 

Zakład Analizy Środowiska, 

ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk, 

*e-mail: kumirska@chem.univ.gda.pl 

Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i 

oznaczania wybranych estrogenów w próbkach środowiskowych 

Streszczenie: Estrogeny to związki hormonalne, których obecność w środowisku - nawet w 

bardzo niskich stężeniach (poniżej 1 ng/L) - może wywierać negatywny wpływ na reprodukcje i 

rozwój organizmów żywych. Opracowywanie odpowiednio czułych metodyk przygotowania 

próbki, rozdzielania i oznaczania tych związków w próbkach środowiskowych stało się zatem 

jednym z ważniejszych zadań z zakresu chemii analitycznej oraz ochrony środowiska. W pracy 

przedstawiono przegląd metodyk przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania wybranych 

substancji estrogenowych (estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu, dietylostilbestrolu) 

w różnych komponentach środowiska techniką GC-MS (ang. gas chromatography coupled 

with mass spectrometry). 

Słowa kluczowe: związki estrogenowe, matryce środowiskowe, chromatografia gazowa, 

spektrometria mas, przygotowanie próbki 

Application of gas chromatography for separation and 

determination of selected estrogenic compounds in the 

environmental samples 

Abstract: Estrogens are hormonal active compounds, which presence in the environment - also 

in very low concentrations (less than 1 ng/L) – could have a negative influence on reproduction 

and growth of the living organisms. Development of the sensitive methods for determination of 

these compounds in the environmental samples has been found as one of the most important 

tasks of analytical chemistry and environmental protection. In this work, a review of methods for 

determination of selected estrogenic compounds (estrone, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethinylestradiol 

and diethylstilbestrol) in environmental compartments using GC-MS (ang. gas chromatography 

coupled with mass spectrometry) technique is presented. 

Key words: estrogenic compounds, environmental matrices, gas chromatography, mass 

spectrometry, sample preparation

8 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz 

1. Wstęp 

(Introduction) 

Estrogeny wraz z gestagenami stanowią żeńskie hormony płciowe, 

które między innymi zapewniają prawidłowy rozwój i funkcjonowanie narządów 

rodnych [1-3]. Ilość wydalanych estrogenów naturalnych (17β-estradiolu 

- E2, estronu – E1, estriolu - E3 oraz estetrolu - E4) zależy od wieku, 

diety, pory roku, stanu zdrowia [4]. Związki te od zawsze były obecne w środowisku, 

ale pierwsze doniesienia o ich wykryciu w wodach powierzchniowych 

pojawiły się w roku 1980 [5]. Obecnie obserwowany jest wzrost stężeń 

środowiskowych ich syntetycznych odpowiedników (17α-etynyloestradiolu - 

EE2, dietylostilbestrolu - DES czy mestranolu - MES) [6]. Tłumaczy się to 

przede wszystkim stosowaniem doustnych środków antykoncepcyjnych w 

postaci jedno- lub dwuskładnikowej. Zawierają one hormon estrogenowy i 

progestagenowy w różnych proporcjach, zależnych od fazy środka antykoncepcyjnego 

[7]. 

W medycynie, estrogeny wykorzystuje się w hormonalnej terapii zastępczej 

(HTZ), której celem jest uzupełnienie niedoboru estrogenów, występującym 

w okresie około menopauzalnym. Zaleca się tę metodę w łagodzeniu 

objawów naczynioruchowych, w zaburzeniach układu kostnego 

(osteoporoza), w suchości pochwy i atrofii układu moczowo-płciowego oraz 

chorobach układu krążenia [8]. U mężczyzn stosowane są wspomagająco w 

leczeniu raka gruczołu krokowego [7]. 

W hodowli zwierząt, hormony estrogenowe podawane są jako dodatki 

do pasz (tzw. promotory wzrostu), w celu przyspieszenie wzrostu i zwiększenia 

masy mięsnej bydła, drobiu, trzody chlewnej [9]. 

Metabolity leków wydalane są w formie wolnej oraz związanej i wraz 

ze ściekami trafiają do środowiska. Badania przeprowadzone w ostatnich 

latach wykazały występowanie śladowych ilości hormonów estrogenowych 

nie tylko w ściekach [10] i wodach powierzchniowych [11], ale także w wodzie 

gruntowej [12] i co jest szczególnie niepokojące - w wodzie pitnej [13]. 

Jedną z głównych przyczyn są nieefektywne metody usuwania tych związków 

podczas konwencjonalnych metod oczyszczania ścieków [4]. 

Estrogeny wykazują duży potencjał aktywności biologicznej, wpływając 

w istotny sposób na prawidłowy rozwój płciowy organizmów żywych [1, 

13, 14]. Po przeniknięciu do środowiska mogą zakłócać prawidłowe funkcjonowanie 

układów hormonalnych, stąd zaliczane są do związków zakłócających 

działanie endokrynne, w skrócie EDC (ang. Endocrine-Disrupting Compounds). 

Wpływają na czynniki warunkujące utrzymanie homeostazy, zachowanie 

gatunku i jego reprodukcję [13]. Po raz pierwszy negatywne oddziaływanie 

EDC na środowisko zaobserwowano 30 lat temu [14]. Były to 

nieprawidłowości w procesach rozrodczych u organizmów wodnych, zwłaszcza 

ryb [14], polegające na feminizacji osobników męskich. Związki te wpływają 

na indukcję witellogeniny, obniżają produkcję jaj, indeks gonadosomatyczny 

samców (GSI), wywołują obupłciowość, zmniejszają zachowania 

seksualne samców [15-18]. Zaburzenia rozrodczości i rozwoju organizmów 

Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012

Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych… 

9 

spowodowane ekspozycją na estrogeny objawiają się także zmniejszoną 

płodnością, dystocją (tzw „ciężkimi” porodami), przedwczesnymi porodami, 

skróconym okresem ciąży, poronieniami, zakłóceniami owulacji [19-24]. Należy 

podkreślić, iż w przypadku EE2 zjawiska te obserwuje się już przy stężeniach 

oznaczanych w środowisku na poziomie 0,05-10 ng/L. Według wielu 

autorów istnieje możliwość bioakumulacji tych związków w organizmach 

wodnych, a tym samym dotarcia poprzez łańcuch pokarmowy do organizmów 

wyższych [23]. 

W celu oszacowania ryzyka ekotoksykologicznego konieczne było 

opracowanie bardzo czułych i selektywnych technik analitycznych, które 

pozwalałyby na rozdzielenie i oznaczanie związków z grupy estrogenów w 

złożonych próbkach środowiskowych. 

2. Struktura oraz właściwości wybranych estrogenów 

(Structures and properties of selected estrogens) 

Estrogeny należą do hormonów steroidowych, których struktura wywodzi 

się od cyklopentenoperhydrofenantrenu (steranu) (Rys. 1). Pierścień 

A ma charakter aromatyczny, natomiast obecność grupy fenolowej w pozycji 

C-3 pozwala na odróżnienie hormonów steroidowych od pozostałych związków 

steroidowych [2, 25]. 

Rys. 1 Struktura steranu 

Fig. 1 Structure of sterane 

Struktury chemiczne oraz właściwości fizykochemiczne wybranych związków 

o działaniu estrogenowym przedstawiono w Tabeli 1. 

Vol. 4, No 1/2012 

Camera Separatoria


Tabela 1. Budowa chemiczna oraz właściwości fizykochemiczne wybranych 

związków o działaniu estrogenowym (M - masa cząsteczkowa, 

log K ow - współczynnik podziału n-oktanol/woda, S H2O - 

rozpuszczalność w wodzie [26-31] 

Table 1. Chemical structures and physicochemical properties of selected 

estrogenic compounds (M – molecular weight, log K ow - partition 

coefficient of n-octanol / water, S H2O – solubility in water) [26-31] 

Związek 

Wzór sumaryczny 

Numer CAS 

Compound 

Chemical formula 

CAS number 

Estron (E1) 

Estrone (E1) 

C 18H 22O 2 

[57-16-7] 

(naturalny estrogen) 

(natural estrogen) 

Struktura chemiczna 

Chemical structure 

Wybrane właściwości 

fizykochemiczne 

Selected 

physicochemical 

properties 

M = 270,4 g/mol 

Log K OW = 3,43 

S H2O = 13,0 mg/L 

17β-estradiol 

(Estradiol) (E2) 

Estradiol (E2) 

C 18H 24O 2 

[50-28-2] 



Estriol (E3) 

Estriole (E3) 

C 18H 24O 3 

[50-27-1] 



M = 272,4 g/mol 

Log K OW = 3,94 

S H2O = 13,9 mg/L 

M = 288,4 g/mol 

Log K OW = 3,84 

S H2O = 13,2 mg/L 

Estetrol (E4) 

C 18H 24O 4 

[15183-37-6] 



M = 304,38 g/mol 

Log K OW brak danych 

(bd) 

S H2O = bd 



11 

17α- 

Etynyloestradiol 

(EE2) 

Ethinylestradiol 

(EE2) 

C 20H 24O 2 

[57-63-6] 

(syntetyczny 

estrogen) 

(synthetic estrogen) 

M = 296,4 g/mol 

Log K OW = 4,15 

S H2O = 4,8 mg/L 

Dietylostilbestrol 

(DES) 

Diethylstilbestrol 

(DES) 

C 18H 20O 2 

[56-53-1] 

(niesteroidowy 

syntetyczny 

estrogen) 

(non-steroid 

synthetic estrogen) 

M = 268,4 g/mol 

Log K OW = 5,07 

S H2O = 12,5 mg/L 

Estradiol (E2), będący najważniejszym naturalnym estrogenem (Tabela 

1), występuje w postaci dwóch izomerów: 17α-estradiolu i 17β-estradiolu, 

spośród których 17α-estradiol nie jest syntezowany w organizmie 

człowieka [2, 3, 32]. Estriol (E3) charakteryzuje się najsłabszym działaniem 

biologicznym spośród wymienionych naturalnych hormonów żeńskich [3], 

zaś 17α-etynyloestradiol (EE2) będący półsyntetyczną pochodną estradiolu, 

posiada dodatkową grupę etinylową w pozycji C-17α, której obecność warunkuje 

15-20 razy silniejsze działanie niż E2 [33]. Najwięcej grup hydroksylowych 

występuje w estetrolu (E4) (Tabela 1), który syntezowany jest wyłącznie 

w trakcie ciąży. Z uwagi na fakt, że do oznaczania tego estrogenu w 

środowisku nie stosuje się techniki chromatografii gazowej, nie będzie on 

omawiany w dalszej części pracy. 

Wydalanie estrogenów następuje w dużej mierze z moczem, w mniejszym 

stopniu z kałem. Estrogeny usuwane z moczem występują głównie w 

formie koniugatów, najczęściej w postaci siarczanów i glukuronianów, podczas 

gdy ze stolcem eliminowane są w formie wolnej [4]. Usuwanie estrogenów 

z organizmu kobiet zależne jest od fazy cyklu: w I fazie – 10-25 

µg/dobę, a w II fazie - 30-50 µg/dobę [3]. Ilość/stężenie estrogenów wydalanych 

u kobiet w ciąży są wielokrotnie większe niż u kobiet w okresie cyklu 

menstruacyjnego. Szczególnie ilość wydalanego estriolu, często nazywanego 

hormonem ciążowym, jest nawet tysiąckrotnie większa. Pod koniec 

ciąży zawartość tego hormonu stanowi ponad 90% wszystkich estrogenów 

stwierdzanych w moczu [3]. 

90% wszystkich wydalanych przez bydło hormonów żeńskich stanowią: 

estron, 17β-estradiol i 17α-estradiol w formie koniugatów i wolnej. W 

Vol. 4, No 1/2012 



przypadku trzody chlewnej i drobiu wydalany jest 17β-E2, E1 i E3 oraz ich 

siarczany i glukuroniany, rzadziej zaś 17α-estradiol. U bydła 58% całkowitej 

ilości estrogenów usuwane jest z kałem, natomiast u trzody chlewnej (96%) i 

drobiu (69%) wydalanie hormonów następuje głównie z moczem [4, 34]. 

Estrogeny naturalne (E1, E2 i E3) mają wyższą rozpuszczalność w 

wodzie, niż ich syntetyczne odpowiedniki (EE2) (Tabela 1), choć dla DES 

jest ona porównywalna. Wartości log K OW świadczą możliwości wbudowywania 

się do struktury koloidów organicznych i makrocząsteczek występujących 

w środowisku wodnym, a także informuje o hydrofobowości tych związków. 

3. Rozdzielenie i analityka pozostałości estrogenów w 

próbkach środowiskowych techniką GC 

(Separation and analytics of estrogenic compounds 

residues in the environmental samples using GC 

technique) 

Analiza pozostałości estrogenów i ich syntetycznych odpowiedników 

w środowisku nie jest zadaniem łatwym z dwóch zasadniczych powodów: 

złożoności matryc środowiskowych oraz bardzo niskich stężeń oznaczanych 

związków (rzędu pg – ng/L). Metody analityczne muszą charakteryzować się 

zatem niezwykle wysoką czułością oraz selektywnością. Jest to możliwe w 

przypadku zastosowania odpowiednich sposobów pobierania i przechowywania 

próbki oraz czaso- i pracochłonnych procedur przygotowania do analizy 

właściwej [35, 36]. Dotychczas, najczęściej wybieraną techniką analityczną 

stosowaną do śladowej analityki pozostałości estrogenów jest chromatografia 

cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) lub tandemową 

spektrometrią mas (LC-MS/MS) [35. 36]. Mimo dogodności jaką daje 

ta metoda analityczna, głównie w zakresie znacznego uproszczenia etapu 

przygotowania próbek do analizy, ma ona szereg ograniczeń [37], do których 

należą m.in. interferencje analitów ze składem matrycy wpływające bezpośrednio 

na granice oznaczalności i wykrywalności, znaczący wpływ rodzaju 

fazy ruchomej na proces jonizacji i fragmentacji związków, problemy z powtarzalnością 

i odtwarzalnością wyników, wąski zakres liniowości odpowiedzi 

ilościowej detektora mas, konieczność optymalizacji parametrów pracy 

spektrometru mas praktycznie dla każdego analizowanego związku by 

zwiększyć czułość i selektywność metody, brak biblioteki widm mas czy wysoki 

koszt analizy. Z kolei słabością techniki chromatografii cieczowej z detekcją 

spektrofotometryczną (UV) lub fluorescencyjną jest zbyt niska wiarygodność 

identyfikacji substancji, bazująca jedynie na czasie retencji (zgodnie 

z najnowszymi dyrektywami identyfikacja ksenobiotyków (w tym farmaceutyków) 

w środowisku powinna opierać się na przynajmniej 4 punktach 

identyfikacyjnych, przy czym czas retencji dostarcza tylko jednego [38]). 

Interesującą alternatywą jest zastosowanie chromatografii gazowej połączonej 

ze spektrometrią mas, szczególnie w tych przypadkach, gdy badane leki 

występują na bardzo niskim poziomie stężeń, a skład matrycy zakłóca pra- 



13 

widłową detekcję tych związków techniką LC-MS/MS. Niższe koszty analizy 

oraz mniejsze zużycie rozpuszczalników także przemawiają na korzyść tego 

rozwiązania. Z uwagi na fakt, iż związki estrogenowe mają charakter średnio 

polarny, wymagane jest jednak przeprowadzenie ich w postać odpowiednich, 

lotnych pochodnych, które dodatkowo zwiększą ich stabilność termiczną. 

3.1. Pobieranie i przechowywanie próbek 

(Collection and sample storage) 

Jak już wspomniano, estrogeny wydalane są z organizmu głównie w 

formie koniugatów (przeważnie siarczanów i glukuronianów), co podnosi ich 

charakter polarny. Sprawia to, że związki estrogenowe w środowisku kumulują 

się przede wszystkim w układzie wodnym. Z tego powodu analizie poddawane 

są głównie ścieki, wody powierzchniowe, wody gruntowe oraz woda 

pitna. Ilość próbki, którą należy pobrać zależy od spodziewanego stężenia 

oraz czułości metody analitycznej i waha się od 200 ml do nawet 80 litrów 

[36]. Objętość próbki nie powinna przekraczać jednak 5 litrów, gdyż zawarte 

w niej kwasy humusowe mogą przeszkadzać w dalszej analizie. Z reguły 

wynosi ona od 250 ml do 1000 ml. 

Najlepszą metodą przechowywania próbki jest przepuszczenie jej 

przez złoże Carbograph-4, przemycie metanolem i przechowywanie metanolowych 

roztworów analitów w temperaturze -18°C [39]. Stwierdzono bowiem, 

że w takich warunkach związki estrogenowe są stabilne przez minimum 

60 dni. Alternatywą może być konserwacja próbki 1% roztworem formaldehydu 

i przechowywanie jej w butelkach z ciemnego szkła bursztynowego 

w temperaturze 4°C [40]. Wprowadzenie formaldehydu zapobiega 

rozwojowi mikroorganizmów, dzięki czemu może być ona stabilna w ciągu 

24 dni [41]. Do konserwacji próbki stosuje się także metanol [42], chlorek 

rtęci [43] oraz kwas siarkowy [44]. 

Próbki wód ściekowych przechowywane są z reguły przez 24 godziny 

w temperaturze 4°C bez stosowania zabiegów konserwujących. W niektórych 

badaniach okres ten przedłuża się do tygodnia [45], albo są one zamrażane 

i trzymane do czasu analizy w temp. -20°C [46]. 

Alternatywną metodą pobierania próbek jest zastosowanie technik 

pasywnych, tj. adsorpcji analitów na specjalnych, półprzepuszczalnych 

membranach, umieszczonych przez okres od 1 do 10 tygodni w analizowanych 

próbkach wody. Zaadsorbowane na nich estrogeny ekstrahuje się następnie 

dichlorometanem (100 ml CH 2 Cl 2 na 900 ml wody) i poddaje dalszej 

procedurze oczyszczania [47-49]. Zhang i Hibbered testowali membrany 

polieterosulfonowe i polisulfonowe do izolacji estrogenów i uznali, iż te 

pierwsze są bardziej efektywne [50]. 

W przypadku badania osadów dennych suszy się je na powietrzu, 

przepuszcza przez sita o wielkości porów 0,5 mm i przechowuje do czasu 

analizy w temperaturze 0°C (mniej niż 15 godzin) [51]. Inna metoda polega 

homogenizacji pobranych osadów, przeniesieniu ich do skrzynek wykona- 

Vol. 4, No 1/2012 



nych ze stali nierdzewnej, szczelnym zamknięciu i przechowywaniu w temp. 

4°C do czasu analizy [52]. 

Próbki gleby pobiera się z głębokości 40 cm wycinając 5 cm segmenty, 

które następnie łączy się i miesza uzyskując uśrednioną próbkę [53]. 

Innym rodzajem próbek stałych analizowanych pod kątem obecności 

związków estrogenowych są organizmy wodne. I tak na przykład małże płucze 

się pod bieżącą wodą przez 10 godzin, wydziela się z nich tkankę 

miękką, łączy ją, homogenizuje, a następnie przechowuje w temp. - 20°C 

[44]. 

3.2. Przygotowanie próbki 

(Sample preparation) 

3.2.1. Filtracja 

(Filtration) 

Filtracja jest zwykle pierwszym etapem przygotowania próbek wodnych, 

szczególnie wtedy gdy izolacja analitów odbywa się za pomocą ekstrakcji 

do fazy stałej (SPE, ang. Solid-Phase Extraction). Dzięki temu usuwane 

są cząstki stałe, które mogą zapychać złoże. Rodzaj stosowanego 

filtra (sączek, włókno szklane, itp.) oraz jego rozmiar zależą od rodzaju oraz 

ilości analizowanej próbki. Najczęściej wykorzystuje się filtry szklane o rozmiarach 

porów pomiędzy 0,22 a 1,20 μm [35, 36, 52]. Aby uniknąć strat analitów 

niektórzy przemywają filtry metanolem (3 - 10 ml), a uzyskany ekstrakt 

dołączają do próbki [37, 54]. Czasami usuwanie zawiesin odbywa się poprzez 

odwirowanie próbki [55]. 

3.2.2. Ekstrakcja - wzbogacanie 

(Extraction) 

Ekstrakcja naturalnych oraz syntetycznych związków estrogenowych z 

wodnych próbek środowiskowych odbywa się najczęściej za pomocą SPE. 

Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz (LLE, ang. Liquid-Liquid Extraction) jest 

stosowana sporadycznie [35, 36], tak samo jak technika mikroekstrakcji do 

fazy stałej (SPME, ang. Solid Phase Microextraction) [11, 31, 44, 56-71] 

(patrz Tabela 4). Izolacja estrogenów z próbek stałych przeprowadzana jest 

najczęściej z zastosowaniem ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wspomaganej 

ultradźwiękami (UAE, ang. Ultrasound-Assisted Extraction) [46, 70, 

72], ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wspomaganej promieniowaniem 

mikrofalowym (MAE, ang. Microwave Assisted Extraction) [69] czy przyspieszonej 

ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika (ASE, ang. Accelerated 

Solvent Extraction) [73]. 

Z uwagi na dominujące znaczenie techniki SPE w ekstrakcji estrogenów 

z próbek środowiskowych zostanie ona omówiona nieco szerzej. 

Do wzbogacania i izolacji analitów wykorzystuje się zarówno kolumienki, 

jak i krążki ekstrakcyjne (Tabela 4). Początkowo jako złoże stoso- 



15 

wano krzemionkę modyfikowaną ugrupowaniami oktadecylowymi (C18) [36]. 

Sorbent ten jest wciąż używany [31, 44, 62, 66, 68], ale coraz częściej zastępuje 

się go złożem kopolimerowym polistyrenu i diwinylobenzenu (SDB), 

dostępnym jako kolumienki Isolut ENV+ [42, 54] lub jako krążki ekstrakcyjne 

SDB-XC [11, 63] oraz złożem kopolimerowym polistyrenu i diwinylobenzenu 

modyfikowanym winylopirolidonu (kolumienki Oasis HLB, firmy Waters) [10, 

60, 64, 69-71]. Czasami, aby zwiększyć selektywność, stosuje się kombinację 

dwóch kolumienek, np. LiChrolut RP18 z LiChlorut EN [65] czy Oasis 

HLB z krzemionką lub tlenkiem glinu [70]. Procedura postępowania zależy 

od rodzaju analitów i zastosowanego wypełnienia. Doskonałe porównanie 

skuteczności ekstrakcji naturalnych oraz syntetycznych związków estrogenowych 

z próbek środowiskowych z zastosowaniem różnych złóż i procedur 

ekstrakcji SPE przedstawili Lopez de Alba i Balcero [74] oraz Hájková i inni 

[72]. 

Przykładowe procedury ekstrakcji techniką SPE estronu, 17β-estradiolu, 

estriolu, 17α-etynylestradiolu i dietylstilbestrolu z wodnych próbek środowiskowych 

oraz uzyskane odzyski analitów przedstawiono w Tabeli 2. 

Tabela 2. Przykładowe procedury wzbogacania i ekstrakcji za pomocą SPE 

oraz uzyskane odzyski estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynylestradiolu 

i dietylstilbestrolu z wodnych próbek środowiskowych 

Table 2. Examples of SPE extraction procedures and obtained recoveries 

of estrone, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethynylestradiol, diethylstilbestrol 

from environmental water samples 

Procedura 

ekstrakcji 

Extraction 

procedure 

Kondycjonowa 

nie 

Conditioning 

step 

Nanoszenie 

próbki 

Loading step 

Isolute 

ENV 

[74] 

7 ml MeOH 

5 ml ACN 

5 ml H 2O 

5 ml /min 

v = 200 ml 

woda 

rzeczna 

Rodzaj kolumienki Type of SPE cartridges 

C18 Oasis 

(Honeyw HLB 

ell [69] 

LiChrolut LiChrolut Burdick 

EN RP-18 & 

[74] [74] Jackson, 

MI, 

USA) 

[76] 

7 ml 

MeOH 

5 ml ACN 

5 ml H 2O 

5 ml /min 

v = 200 

ml 

woda 

rzeczna 

7 ml 

MeOH 

5 ml ACN 

5 ml H 2O 

5 ml /min 

v = 200 ml 

woda 

rzeczna 

3 ml 

ACN 

3 ml 

H 2O 

5 ml/min 

v = 200 

ml 

ścieki 

3 ml EtAC 

3 ml 

MeOH 

3 ml H 2O 

(pH 

próbki) 

15 – 20 

ml /min 

v = 2000 

ml 

woda 

rzeczna 

Oasis HLB 

[75] 

5 ml 

CH 2Cl 2 

5 ml 

MTBE (eter 

t-butylowometylowy) 

5 ml MeOH 

5 ml H 2O 

15 ml/min 

pH = 2 

v = 1000 

ml 

ścieki 

Przemywanie 5 ml H 2O 5 ml H 2O 5 ml H 2O Brak tylko 5 ml H 2O 

Vol. 4, No 1/2012 



Flushing step suszenie Suszenie suszenie danych suszenie Suszenie 

5 ml MeOH 

5 ml 

Wymywanie 2 x 4 ml 2 x 4 ml 2 x 4 ml 3 x 1 ml 

3 ml ACN MeOH/MT 

Elution step ACN ACN ACN ACN 

BE (10/90; 

v/v) 

Odzysk 

Recovery 

E1 98 

E2 83 

E3 38 

EE2 89 

DES 68 

E1 100 

E2 90 

E3 39 

EE2 90 

DES 59 

E1 100 

E2 87 

E3 88 

EE2 79 

DES 58 

E1 102 

E2 106 

E3 106 

EE2 106 

E1 104 

E2 96 

E3 97 

EE2 87 

DES 101 

E1 90 

E2 92 

E3 101 

EE2 92 

Do elucji analitów stosuje się najczęściej acetonitryl, metanol, bądź 

kombinację tych rozpuszczalników z innymi rozpuszczalnikami. Odzysk analizowanych 

związków (poza E3 na złożu Isolute ENV i LiChlorut EN) kształtują 

się na zadawalającym poziomie tzn. w zakresie 58-104%. 

Pomimo, iż w literaturze dostępnych jest szereg procedur wydzielania 

i wzbogacania związków estrogenowych techniką SPE często należy dostosować 

je do potrzeb aktualnie analizowanych próbek. Dotyczy to w szczególności 

konieczności modyfikacji sposobu oczyszczania i elucji analitów. 

Jednym ze sposobów optymalizacji procesu SPE jest zastosowanie metody 

krzywych przebicia, przy czym należy zaznaczyć iż procedura ta jest bardzo 

pracochłonna i wymaga użycia znacznych ilości substancji wzorcowych, 

które z reguły nie są tanie (77,78). Doboru odpowiednich warunków oczyszczania 

można dokonać także metodami obliczeniowymi, w oparciu o wybrane 

parametry fizykochemiczne rozpuszczalników i analitów [79] lub poprzez 

badanie odzysku analitów, przy ustalonej arbitralnie (na podstawie 

polarności analizowanych związków oraz układu faz SPE) objętości i składu 

cieczy czyszczącej matrycę i wymywającej anality [80, 81, 82]. 

Jedną z nowszych propozycji ekstrakcji naturalnych i syntetycznych 

estrogenów z próbek środowiskowych jest zastosowanie techniki mikroekstrakcji 

na upakowanym sorbencie (MEPS, ang. Microextraction by Packed 

Sorbents) oraz polimerów z nadrukiem molekularnym (MIP, ang. Molecularly 

Imprinted Polimer) [83]. Użycie w pełni zautomatyzowanego połączenia 

MEPS z dozownikiem zestawu GC-MS, pozwalającym na wprowadzanie 

dużych objętości próbki i in-port upochodnienie (system on-line) sprawiło, że 

można oznaczać estrogeny w zakresie stężeń ng/L do μg/L dysponując jedynie 

800 μL próbki [83]. 

3.2.2.1. Oczyszczanie ekstraktów 

(Extracts purification) 

Ekstrakty uzyskane z silnie zanieczyszczonych ścieków, osadów, gleb 

czy tkanek ryb bądź skorupiaków, przed analizą właściwą muszą być często 

poddane dodatkowemu procesowi oczyszczania. Może być ono przeprowadzone 

za pomocą ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz [75], ekstrakcji do fazy 

stałej (w kolumience C18 [44, 52, 64], Oasis HLB [76]), chromatografii kolumnowej 

ze złożem krzemionkowym [84], chromatografii wykluczania / że- 



17 

lowej stosując wypełnienie CO785 [52], wysokosprawnej chromatografii cieczowej 

[85, 86], czy dowolnej kombinacji wymienionych wyżej technik [36]. 

3.2.3. Hydroliza koniugatów 

(Conjugates hydrolysis) 

Jak wspomniano, część estrogenów usuwanych z organizmu występują 

w formie koniugatów, najczęściej w postaci siarczanów i glukuronianów 

[4]. Aby oznaczyć je w środowisku techniką chromatografii gazowej niezbędne 

jest przeprowadzenie hydrolizy enzymatycznej tych związków do 

postaci wolnych hormonów. Najczęściej posługujemy się enzymem zwanym 

glukuronidazą. Zawartość koniugatów w próbce wyznacza się na podstawie 

różnicy zawartości estrogenów przed i po hydrolizie [40, 46]. Należy przy 

tym pamiętać, że o ile konwersja glukuronianu estradiolu do E2 zachodzi ze 

100% wydajnością, to siarczanu estradiolu do E2 jedynie z 30% [40]. Inną 

skuteczną metodą uwolnienia estrogenów z koniugatów jest zastosowanie 

hydrolizy kwasowej. Porównanie tych dwóch podejść znajduje się m.in. w 

publikacji Carignana i Lodgetych’ego [87]. 

3.2.4. Derywatyzacja 

(Derivatization) 

Z uwagi na to, że estrogeny mają charakter średnio polarny oraz cechują 

się niewielką lotnością, ich bezpośrednia analiza za pomocą chromatografii 

gazowej jest rzadko stosowana [10, 68]. Derywatyzację związków 

estrogenowych przeprowadza się zatem by zwiększyć lotność i stabilność 

termiczną analitów, a tym samym poprawić czułość, selektywność i sprawność 

układu chromatograficznego. Najczęściej stosowanymi metodami konwersji 

związków estrogenowych w lotne pochodne jest: sililowanie, acylowanie 

i alkilowanie (Tabela 4). Na Rys. 2 przedstawiono przykładowe reakcje 

upochodnienia 17β-estradiolu. 

A) 

MSTFA 17β-E2 pochodna trimetylosililowa 17β-E2 

Vol. 4, No 1/2012 



B) 

C) 

PFPA 17β-E2 pochodna acylowa 17β-E2 

PFBBr 17β-E2 pochodna alkilowa 17β-E2 

Rys. 2. Schemat reakcji upochodnienia 17β-estradiolu odczynnikiem: A) MSTFA (N,O 

bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid) – sililowanie; B) PFPA (bezwodnik 

pentafluoropropionowy) – acylowanie; C) PFBBr (bromek pentafluorobenzylowy) – 

alkilowanie. 

Fig. 2. Derivatization schematic of 17β-estradiol using: A) MSTFA (N,O 

bis(trimethylsilil)trifluoroacetamide) – silylation; B) PFPA (pentafluoropropionic 

anhydrate) – acylation; C) PFBBr (pentafluorobenzyl bromide) –alkylation. 

Do upochadniania grup hydroksylowych obecnych w strukturze tych związków 

stosuje się następujące odczynniki derywatyzujące: 

- sililujące: MSTFA [31, 57, 58, 69, 61, 63, 65, 66, 89], mieszaninę 99 % 

BSTFA (N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid)+ 1 % TMCS (trimetylochlorosilan) 

[10, 44, 60, 62, 64, 70, 71], TMSI (N-trimetylosililoimidazol) [31, 56, 

61, 62, 65, 66], MTBSTFA (N-metylo-N-(tert-butylodimetylosilylo)trifluoroacetamid) 

[90], 

- acylujące: PFPA (bezwodnik pentafluoropropionowy) [88], TFAA (bezwodnik 

trifluorooctowy) [57] i HFBI (heptafluorobutyryloimidazol) [59], 

- alkilujące: PFBBr (bromek pentafluorobenzylowy) [56]. 

Różnią się one między sobą reaktywnością względem grup hydroksylowych 

przyłączonych do układu aromatycznego i alifatycznego związków estrogenowych 

(Tabela 1) oraz stabilnością tworzących się pochodnych. Pochodne 

tert-butylodimetylosililowe (t-BDMS) oraz pentafluoropropylowe (PFP), chociaż 

tworzą się szybciej i są mniej wrażliwe na hydrolizę niż pochodne trimetylosililowe 

(TMS), prowadzą do powstawania monopodstawionych, mniej 

lotnych pochodnych, co prowadzi do obniżenia czułości metodyki analitycznej 

[91 ,92]. 

Ważnymi etapami procesu optymalizacji reakcji spochadniania jest: 

wybór odczynnika derywatyzującego, jego ilości, czasu reakcji, temperatury, 

dodatku katalizatora, czy rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika. Przykładowe 

procedury upochodnienia hormonów estrogenowych przedstawiono w 

Tabeli 3. 



19 

Tabela 3. Wybrane procedury konwersji chemicznej związków 

estrogenowych do postaci lotnych pochodnych 

Table 3. Selected procedures for chemical conversion of estrogen 

compounds to volatile derivatives form 

Odczynnik 

Derivatizin 

g agent 

Przebieg procedury 

Procedure 

Literatura 

Literature 

MSTFA 50 µl MSTFA; 120 min; temp. 60 °C [89] 

MSTFA 50 µl MSTFA; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [93] 

99% BSTFA 

+ 1% TMCS 

50 µl BSTFA + 1% TMCS; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [62] 

TMSI 50 µl TMSI; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [62] 

PFPA 

100 µl PFPA; 120 min; temp. 60 °C; - oddmuchanie w 

strumieniu azotu; 100 µl n-heksanu 

[88] 

HFBI 

250 µl mieszaniny n-heksan:eter diizopropylowy (1:1, v/v); 20 

µl HFBI; 45 min; temp.55 °C 

[59] 

TFAA 150 µl toluenu; 6 µl TFAA; 5 min; temp. pokojowa [59] 

Porównanie różnych metod derywatyzacji związków estrogenowych przedstawiono 

w pracy [93]. Najwyższą skutecznością spochadniania związków 

estrogenowych zaobserwowano przy użyciu mieszaniny 99 % BSTFA + 1% 

TMCS i pirydyny (1:1, v/v) w temperaturze 60 °C przez 30 min. Wykazano 

także wysoką efektywność działania mieszaniny MSTFA i pirydyny (1:1, v/v) 

przy tym samym czasie reakcji i przy temperaturze 50 °C. 

3.3. Rozdzielanie i analiza chromatograficzna 

(Chromatographic analysis) 

Technika chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas 

jest najczęściej wykorzystywana do rozdzielania i analizy związków estrogenowych, 

pomimo iż wymagana jest wcześniejsza derywatyzacja analitów 

(Tabela 4). Szczególnie układ GC-MS z rejestracją wybranych jonów (SIM, 

ang. Single Ion Monitoring) jest powszechnie stosowany [10, 31, 56, 58, 60, 

63, 64, 65]. Dzieje się tak dlatego, ponieważ metody immunochemiczne [94- 

97] charakteryzują się niższą selektywnością i co za tym idzie kłopotami z 

poprawną identyfikacją estrogenów. Podczas rozdzielania I analityki LC-MS 

(ang. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) i LC-MS/MS (ang. Liquid 

Chromatography-tandem Mass Spectrometry) [98-104], szczególnie gdy 

jonizacja próbki odbywa się techniką elektrorozpraszania (ESI, ang. Electrospray 

Ionization) obecność wielu substancji w złożonych próbkach środowiskowych 

może znacząco modyfikować wyniki [46, 105]. Spowodowane jest 

to wpływem substancji interferujących na odpowiedź detektora (jej zmniejszaniem 

poprzez supresję jonów, bądź zwiększaniem z powodu nakładania 

się sygnałów). W efekcie pojawiają się problemy z powtarzalnością i dokładnością 

metodyk (tzw. efekty matrycy). Takie zjawiska są znacznie rzadziej 

obserwowane gdy używana jest technika GC-MS. Na korzyść stosowania 

Vol. 4, No 1/2012 



układu GC-MS w porównaniu z LC-MS/MS przemawia dodatkowo stosunkowo 

łatwa optymalizacja procedury oraz niższy koszt analizy. 

3.3.1. Warunki pracy aparatu chromatograficznego 

(Operating conditions of chromatographic system) 

Do rozdzielenia estrogenów za pomocą GC wykorzystuje się najczęściej 

kolumny kapilarne średnio polarne (DB-5, HP-5, BP-5, XTI-5), w której 

fazą stacjonarną jest kopolimer 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu (Tabela 

4). Niskie granice wykrywalności i oznaczalności analitów techniką GC uzyskuje 

się poprzez wprowadzanie do kolumny od 1 do 4 μl próbki bez dzielenia 

strumienia (tryb splitless). Jako gaz nośny stosuje się najczęściej hel, a 

program temperaturowy, w zależności od rodzaju analitów, mieści się w zakresie 

od 50 do 300°C. 

3.3.2. Warunki pracy spektrometru mas 

(Mass spectrometer operating conditions) 

Jonizację próbki przeprowadza się zwykle za pomocą bombardowania 

wiązką elektronów o energii 70 eV (EI, ang. Electron Impact Ionization), 

chemicznej jonizacji (CI, ang. Chemical Ionization) czasami techniką elektrorozpraszania 

(ESI) lub z wykorzystaniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem 

atmosferycznym (APCI, ang. Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 

[35, 36] (Tabela 4). Detekcję można prowadzić w trybie rejestracji jonów 

dodatnich (PI, ang. Positive Ions), jonów ujemnych (NI, ang. Negative 

Ions), z zastosowaniem zapisu całkowitego prądu jonowego (ang. full scan), 

bądź monitorowania wybranych jonów (SIM). Wprowadzenie do układu 

detekcyjnego tandemowej spektrometrii mas (układ GC-MS/MS) pozwala na 

znaczne obniżenie granic wykrywalności i oznaczalności analizowanych 

związków, a także poprawia parametry analizy jakościowej (m.in. poprzez 

używanie trybu monitorowania wybranych reakcji fragmentacji (MRM, ang. 

Multiple Reaction Monitoring). Gazem kolizyjnym jest wówczas argon o 

ciśnieniu 1 x 10 -4 mbar, a energia kolizji dla wszystkich przejść (tranzycji) 

wynosi 12 V [np. 106]. Najczęściej stosowanymi układem detekcyjnym jest 

potrójny kwadrupol (QqQ), kwadrupol połączony z analizatorem czasu przelotu 

(QTof) oraz pułapka jonowa (IT, ang. Ion Trap). Porównując metodę 

GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS i LC-MS/MS stwierdzono, iż czułość oznaczeń 

wzrasta w kolejności LC-ESI(NI)MS < GC-(EI)MS < GC-(EI)MS/MS ≤ LC- 

ESI(NI)MS/MS [94]. 



21 

3.4. Wybrane metody oznaczania wybranych związków 

estrogenowych w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem 

techniki GC 

(Selected methods for the determination of selected estrogen 

compounds in environmental samples using GC) 

Zestawienie metodyk oznaczania wybranych substancji estrogenowych 

(estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu, dietylostilbestrolu) 

w próbkach środowiskowych wykorzystujących technikę GC przedstawiono 

w Tabeli 4. 

Vol. 4, No 1/2012 


Tabela 4. Wybrane metody oznaczania wybranych związków estrogenowych w próbkach środowiskowych wykorzystujących 

technikę GC 

Table 4. Selected methods for the determination of selected estrogen compounds in environmental samples using 

GC technique 

Estrogeny naturalne 

i syntetyczne 

Natural and 

synthetic estrogens 

E1, 17α-E2, 

17β-E2, E3, 

EE2 

E1, 17β-E2, 

EE2, DES 

Matryca 

Matrix 

woda 

rzeczna 

mięśnie, 

ścieki, 

woda 

morska 

Derywatyzacja 

Derivatization 

Ekstrakcja 

Extraction 

SPE 

(Excelpak 

SPE- 

ENV/124) 

SPE (C18 

ENVI-18) 

5% PFBBr 

(1 h 60 °C) 

+ TMSI (30 

min, temp. 

pokojowa) 

BSTFA + 

1% TMCS 

(1 h, 60 C) 

Kolumna 

GC 

GC column 

HP-5MS (30 

m x 0,25 

mm, 0,25 

µm) 

DB-5 (30m x 

0,32 mm, 

0,25 µm) 

Metoda detekcji 

Type of detection 

GC- 

(NICI)MS 

(SIM) 

GC- 

(IT)MS/MS 

Granica oznaczalności 

[ng/L 

próbki ciekłe, 

ng/g próbki 

stałe] 

Limit of quantification 

[ng/L 

liquid samples, 

ng/g solid 

samples 

0,10-0,28 dla 

wszystkich 

związków 

mięśnie: 100- 

1000 

próbki wodne: 

0,5-1,2 

Oznaczone 

stężenie [ng/L 

próbki ciekłe, 

ng/g próbki 

stałe] 

Determined 

concentraction 

[ng/L liquid 

samples, ng/g 

solid samples 

bd 

w mięśniach: < 

LOD 

w próbkach 

wodnych: 

1,5 (E1) 

1,8 (17β-E2) 

< LOD (DES, 

EE2) 

Literatura 

Literature 

[56] 

[44] 



E1, 17β-E2, 

EE2 (+ inne 

EDC) 

E1, 17β-E2, 

EE2, DES, MES 

E1, 17β-E2, E3, 

EE2, DES, MES 

E1, 17β-E2, 

17α-E2, E3, 

EE2, DES, DIE 

ścieki 

ścieki 

woda 

rzeczna 

ścieki 

wprowadz 

ane 

i oczyszc 

zone 

woda 

powierzch 

niowa, 

ścieki 

SPE 

(Oasis 

HLB) 

SPME 

(85 µm 

włókno 

poliakryla 

nowe) 

SPE 

(Oasis 

HLB) 

SPE 

BSTFA + 

pirydyna ( 

25 min, 65 

°C) 

bez 

derywatyzac 

ji 

MSTFA (30 

min, 60 °C) 

MSTFA (100 

min, 85 °C) 

HFBA( 5 

min, temp. 

pokoj.), 

TFAA (5 

min, temp. 

pokoj.) 

HP-5MS (30 

m x 0,25 

mm, 0,25 

µm) 

BP-5 (30 m 

x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

BP-5 (30 m 

x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

BP-5 (30 m 

x 0,32 mm, 

0,17 µm) 

DB-XLB (30 

m x 0,25 

mm, 0,25 

µm) 

GC-(IT)MS 

(SIM) 

GC-MS/MS 

GC-MS/MS 

GC-(EI)MS 

GC- 

(EI)MS/MS 

GC- 

(NICI)MS 

8,5 (E1) 

17,0 (17β-E2) 

4,0 (EE2) 

7,5 (E1) 

27,5 (17β-E2) 

17,5 (EE2) 

0,2-3,0 dla 

wszystkich 

związków 

2,0 – 6,0 dla 

wszystkich 

związków 

1,0-3,0 dla 

wszystkich 

związków 

wody 

powierzchniowe: 

0,05-1,0 

ścieki płynne: 

0,1-1,0 

94,7 (E1) 

55,0 (17β-E2) 

< LOD (EE2) 

86,9 (E1) 

49,4 (17β-E2) 

< LOD (EE2) 

bd 

30,0 (E1) 

3,0 (E2) 

< LOD (E3) 

30-33 (E1) 

3-13 (E2) 

< 62 (E3) 

bd 

[10] 

[57] 

[69] 

[59] 


23 

Vol. 4, No 1/2012 


E1, 17β-E2, 

EE2 (+inne 

EDC) 

E1, 17β-E2, 

EE2, MES 

E1, 17β-E2, 

17α-E2, EE2, 

E1, EE2 

E1, 17β-E2, E3, 

EE2 

woda 

rzeczna, 

woda 

morska 

ścieki 

woda 

powierzch 

niowa, 

ścieki 

woda 

rzeczna 

(ujście 

rzeki) 

woda 

rzeczna 

SPE 

(Oasis 

HLB) 

UAE 

(metanol+ 

aceton) 

krążki 

ekstrakcyj 

ne SDB-X 

SPE 

(C18) 

krążki 

ekstrakcyj 

ne SPE 

SDB-XC 

BSTFA + 

1% TMCS 

(30 min, 60 - 

70 °C) 

MSTFA+ 

TMSI+ DTE 

DMDCS (60 

min, 60 °C) 

BSTFA + 

1% TMCS + 

pirydyna (30 

min, 50 °C) 

PFPCl (180 

min, 80 °C) 

ZB-5 (30 m 

x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

XTI-5 (30 m 

x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

DB-5MS (30 

m x 0,25 

mm, 0,25 

µm) 

DB-5 (30 m 

x 0,32 mm, 

0,25 µm) 

HP-5MS (15 

m x 0,25 

mm, 0,25 

µm) 

GC-(IT)MS 

(SIM) 

GC- 

(IT)MS/MS 

GC-MS/MS 

GC-(EI)MS 

GC- 

(NICI)MS 

(SIM) 

1,7 (E1) 

3,4 (17β-E2) 

0,8 (EE2) 

2,0 - 4,0 dla 

wszystkich 

związków 

wody 


0,2-0,3 (E1) 

0,3-0,6 (17β-E2) 

0,1-0,3 (17α-E2) 

0,1-0,3(EE2) 

ścieki: 

0,3-1,0 (E1) 

0,5-2,4 (17β-E2) 

0,1-1,2 (17α-E2) 

0,3-1,8(EE2) 

0,05-0,2 (E1) 

0,05 (EE2) 

0,2 (E1) 

0,03 (17β-E2) 

0,06 (E3) 

0,05(EE2) 

5,6 (E1) 

11,2 (17β-E2) 

2,6 (EE2) 

16-37 (E1) 

5-49(17β-E2) 

2 -17(EE2) 

< LOD (MES) 

bd 

bd 

0,2-17 (E1) 

0,5-7 (17β-E2) 

1,2-3,1 (E3) 

[60] 

[61] 

[11] 

[62] 

[63] 



E1, 17β-E2, E3, 

EE2 (+inne EDC) 

E1, 17β-E2, E3, 

EE2 

E1, 17β-E2 

E1, 17β-E2, EE2 

E1, 17β-E2 (+ 

inne EDC) 

woda 

powierzchn 

iowa i 

ścieki 

woda 

rzeczna 

i jeziorna, 

ścieki 

oczyszczon 

e 

ścieki 

wprowadza 

ne i 

oczyszczon 

e 

woda 

rzeczna 

ścieki 

SPE (Oasis 

HLB) 

SPE 

(LiChrolut 

RP18+ 

LiChlorut 

EN) 

SPE (C18) 

SPE (C18) 

krążki 

ekstrakcyjn 

e C18 SPE 

BSTFA ( 15 

min., 60 °C) 

MSTFA+ 

TMSI+ DTE 

(1000:2:2, 

v:v:w) 

MSTFA+TMSI 

+ 

DTE 

MSTFA+TMSI 

+ 

DTE 

(1000:4:2, 

v/v/w) 

HFBA ( 90 

min., 55 °C) 

CP-Sil 8 CB 

(30 m x 0,25 

mm, 0,25 

µm), BPX-5 

(30 m x 0,25 

mm, 0,25 µm) 

XTI-5 (30 m x 

0,25 mm, 0,25 

µm) 

JW DB-5 (60 

m x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

CP-Sil 8 (30 

m x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

MDN-5S (30 

m x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

GC-(EI)MS 

(SIM), GC- 

MS/MS 

GC-(EI)MS 

(SIM) 

GC-HRMS 

GC-(IT)MS 

(SIM) 

GC-MS/MS 

wody 


2-10 

ścieki: 2-20 

0,1-1 (E1) 

0,3-0,9 (17β-E2) 

0,3-1,5 (E3) 

0,2-1 (EE2) 

0,7 (E1) 

0,8 (17β-E2) 

0,5-1,0 dla 

wszystkich 

związków 

12 (E1) 

4 (17β-E2) 

bd 

< 51 (E1) 

< 6 (17β-E2) 

< 2 (EE2) 

ścieki 

wprowadzane 

19-78 (E1) 

2,4-26 (17β-E2) 

ścieki 

oczyszczone 

1-96 (E1) 

0,2-14,7 (17β-E2) 

1,1,-1,3 (E1) 

1,3 (17β-E2) 

< LOD (EE2) 

0,2 (E1) 

0,1 (17β-E2) 

[64] 

[65] 

[66] 

[31] 

[67] 


25 

Vol. 4, No 1/2012 



UAE +SPE 

(Oasis HLB 

+kolumienk 

a z 

krzemionką 

lub Al2O3 

E1, E2, EE2 

E1, E2, EE2 

E1, E2, E3, EE2 

E1, E2, EE2 

woda 

powierzchn 

iowa, 

ścieki 

woda 

powierzchnio 

wa, 

ścieki 

osad 

czynny 

woda, osad 

SPE (C18) 

SPME 

SPE (Oasis 

HLB) (woda) 

MAE 

(osad) 

bd 

MSTFA 

BSTFA + 1% 

TMCS + 

pirydyna 

BSTFA +1% 

TMCS + 

pirydyna 

DB-5MS (30 

m x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

VF-1 (30 m x 

0,32 mm, 0,25 

µm) 

HP-5MS (30 

m x 0,25 mm, 

0,25 µm) 

Agilent HP-5 

30 m x 0,25 

mm, 0,25 µm) 

GC- 

(EI)MS(SIM) 

GC-MS(SIM) 

GC-(EI)MS 

GC-MS/MS 

0,041 (E1) 

0,046 (E2) 

0,031 (EE2) 

12 (E1) 

5,5 (E2) 

30 (EE2) 

1,2 (E1) 

0,8 (E2) 

2,3 (E3) 

4,0 (EE2) 

0,01-0,49 woda 

0,05-0,14 osad 

bd 

bd 

bd 

bd 

[68] 

[58] 

[70] 

[71] 



27 

4. Podsumowanie 

Pomimo, iż do analityki związków estrogenowych w próbkach środowiskowych 

stosuje się zarówno metody immunochemiczne jak i bazujące na 

chromatografii cieczowej, technika chromatografii gazowej wykorzystywana 

jest najczęściej. Dzieje się tak, ponieważ metody immunochemiczne charakteryzują 

się niższą selektywnością, natomiast analizy LC-MS i LC-MS/MS 

kłopotami z powtarzalnością i dokładnością metody z powodu silnych efektów 

matrycy. Takie zjawiska są znacznie rzadziej obserwowane, gdy do 

rozdzielania i oznaczania używana jest technika GC-MS z upochodnieniem 

przed-kolumnowym i z jonizacją próbki za pomocą wiązki elektronów oraz 

detekcją w trybie monitorowania wybranych jonów SIM. Na korzyść stosowania 

układu GC-MS w porównaniu z LC-MS/MS przemawia dodatkowo 

niższy koszt analizy oraz prostota obsługi aparatury. Wprowadzenie do 

układu detekcyjnego tandemowej spektrometrii mas (układ GC-MS/MS) 

pozwala na znaczne obniżenie granic wykrywalności (LOD) i oznaczalności 

(LOQ) analizowanych związków, a także poprawia parametry analizy jakościowej 

(identyfikacji) m.in. poprzez używanie trybu monitorowania wybranych 

reakcji fragmentacji (MRM). Najczęściej stosowanymi układami analizatorów 

w tandemowej spektrometrii mas jest potrójny kwadrupol (QqQ) 

oraz kwadrupol połączony z analizatorem czasu przelotu (QTof). Z uwagi na 

średnio polarny charakter analitów oraz ich niską lotność konieczna jest 

jednak derywatyzacja analitów. Ponieważ poprawność oznaczeń w dużym 

stopniu zależy od sposobu pobierania i przechowywania próbki oraz przygotowania 

jej do analizy właściwej, także te etapy procedury analitycznej 

muszą być poddane optymalizacji. W pracy przedstawiono najważniejsze 

informacje dotyczące metodyk przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania 

naturalnych i syntetycznych estrogenów w próbkach środowiskowych 

z wykorzystaniem techniki GC, ze szczególnym uwzględnieniem analizy 

estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu i dietylostilbestrolu. 

Summary 

Although for the analysis of estrogen compounds in environmental 

samples are used both immunochemical methods and based on liquid 

chromatography, gas chromatography is used the most often. This is because 

the immunochemical methods are characterized by a lower selectivity, 

while the analysis of LC-MS and LC-MS/MS by troubles with repeatability 

and accuracy of the method because of strong matrix effects. These phenomena 

are much less frequently observed when for the separation and 

identification GC-MS technique is used with pre-column derivatization and 

the ionization of the sample using an electron impact and detection in selected 

SIM ion monitoring mode. In favour of the usage of GC-MS in comparison 

with LC-MS/MS also speak a lower cost of analysis and ease of 

using the apparatus. Introduction to the detection of tandem mass spectrometry 

(GC-MS/MS system) enables a significant reduction in the limit of de- 

Vol. 4, No 1/2012 



tection (LOD) and quantification (LOQ) of the analysed compounds and also 

improves the qualitative analysis (identification), inter alia by using monitoring 

mode of selected fragmentation reactions (MRM). The most commonly 

used systems of analyzers in tandem mass spectrometry is a triple quadrupole 

(QQQ) and quadrupole connected to the analyser of the time of flight 

(QTof). Due to the medium polar nature of the analytes and their low volatility 

however, derivatization of analytes is required. Since the correctness of 

determination to a large extent depends on method of collecting sample, its 

storage and preparing it for proper analysis, also those steps of the analytical 

procedure must be subjected to optimization. The paper presents key 

information about the methodology of sample preparation, separation and 

identification of natural and synthetic estrogens in environmental samples 

using GC technique, with particular emphasis on the analysis of estrone, 

17ß -estradiol, estriole, 17α-ethinylestradiol and diethylstillbestrol. 

Podziękowania 

(Acknowledgements) 

Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w 

ramach projektu badawczego numer N N204 260237 (2009-2012) oraz 

funduszu DS 8110-4-0085-1. 

Financial support was provided by the Polish Ministry of Research and 

Higher Education under grants N N204 260237 (2009-2012) and DS 8110-4- 

0085-1. 

Literatura 

(References) 

1. W. Kostowski, Z.S. Herman, „Farmakologia. Podstawy farmakoterapii” 

(polish), Pharmacology. Grounds for pharmacotheraphy Tom 1, 

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003. 

2. A. Zejc, M. Gorczyca, „Chemia leków”, Drugs chemistry Wydawnictwo 

Lekarskie PZWL, Warszawa 2002. 

3. M. Pawlikowski, „Leczenie hormonami i pochodnymi hormonów”, 

Treatment with hormones and hormone derivatives Wydawnictwo 

Lekarskie PZWL, Warszawa 1996. 

4. D.S. Aga, Fate of Pharmaceuticals in the Environment and in Water 

Treatment Systems, CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton 

2008. 

5. V. Gabet, C. Miege, P. Bados, M. Coquery, Analysis of estrogens in 

environmental matrices. Trends Anal. Chem., 26(2007)1113. 

6. J. Carpinteiro, J.B. Quintana, I. Rodriguez, A.M. Carro, R.A. Lorenzo, R. 

Cela, Applicability of solid-phase microextraction followed by on-fiber 

silylation for the determination of estrogens in water samples by gas 



29 

chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 

1056(2004)179. 

7. G. Rajtar-Cynke, „Farmakologia. Podręcznik dla studentów i 

absolwentów wydziału pielęgniarstwa i nauk o zdrowiu akademii 

medycznych”, Pharmacology. Textbook for students and graduates of 

the department of nursing and health sciences academy of medical 

Wydawnictwo Czelej, Lublin 2002. 

8. W. Jańca, „Kompendium farmakologii”, Compendium of pharmacology, 

Wyd. 2, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006. 

9. S.J. Khan, D.J. Roser, C.M. Davies, G.M. Peters, R.M. Stuetz, R. 

Tucker, N.J. Ashbolt, Chemical contaminants in feedlot wastes: 

Concentrations, effects and attenuation, Environ. Int., 34(2008)839. 

10. M.D. Hernando, M. Mezcua, M.J. Gómez, O. Malato, A. Aguera, A.R. 

Fernandez-Alba, Comparative study of analytical methods involving gas 

chromatography-mass spectrometry after derivatization and gas 

chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of 

selected endocrine disrupting compounds in wastewaters, J. 

Chromatogr. A, 1047(2004)129. 

11. A.C. Belfroid, A. Van der Horst, A.D. Vethaak, A.J. Schafer, G.B.J. Rijs, 

J. Wegener, W.P. Cofino, Analysis of estrogenic hormones and their 

glucuronides in surface water and waste water in The Netherlands, Sci. 

Total Environ., 225(1999)101. 

12. E. Vulliet, L. Wiest, R. Baudot, M.-F. Grenier-Loustalot, Multi-residue 

analysis of steroids at sub-ng/L levels in surface and ground-waters 

using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, J. 

Chromatogr. A, 1210(2008)84. 

13. K. Kozłowska-Tylingo, J. Namieśnik, Hormony płciowe w środowisku, 

zagrożenia, jakie niosą ze sobą, Sex hormones in the environment, 

threats posed by them, Analityka, 1(2009)52. 

14. T. Hintemann, C. Schneider, H.F. Scholer, R.J. Schneider, Field study 

using two immunoassays for determination of estradiol and 

ethinylestradiol in the aquatic environment, Water Res., 40(2006)2287. 

15. H. Segner, K. Caroll, M. Fenske, C.R. Janssen, G. Maack, D. Pascoe, 

C. Schafers, G.F. Vandenbergh, M. Watts, A. Wenzel, Identification of 

endocrine-disrupting effects in aquatic vertebrates and invertebrates: 

report from the European IDEA project. Ecotoxicol. Environ. Safety, 

54(2003)302. 

16. J.L. Parrott, B.R. Blunt, Life-cycle exposure of fathead minnows 

(Pimephales promelas) to an ethinylestradiol concentration below 1 

ng/L reduces egg fertilization success and desmasculinizes males, 

Environ. Toxicol., 20(2005)131. 

17. S. Orn, H. Holbech, T.H. Madsen, L. Norrgren, G.I. Petersen, Gonad 

development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) 

exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone, Aquat. Toxicol., 

65(2003)397. 

Vol. 4, No 1/2012 



18. L.J. Mills, C. Chichester, Review of evidence: Are endocrine-disrupting 

chemicals in the aquatic environment impacting fish populations, Sci. 

Total Environ., 343(2005)1. 

19. H. Xu, J. Yang, Y. Wang, Q. Jiang, H. Chen, H. Song, Exposure to 17- 

ethynylestradiol impairs reproductive functions of both male and female 

zebrafish (Danio rerio), Aquat. Toxicol., 88(2008)1. 

20. Y. Jin, R. Chen, W. Liu, Z. Fu, Effect of endocrine disrupting chemicals 

on the transcription of genes related to the innate immune system in the 

early developmental stage of zebrafish (Danio rerio), Fish Shellfish 

Immunol., 28(2010)854. 

21. E.F. Orlando, L.J. Guillette, Sexual dimorphic responses in wildlife 

exposed to endocrine disrupting chemicals, Environ. Res., 

104(2007)163. 

22. J.A. Jukosky, M.C. Watzin, J.C. Leiter, Elevated concentrations of 

ethinylestradiol, 17-estradiol, and m edroxyprogesterone have little 

effect on reproduction and survival of Ceriodaphnia dubia, Environ. 

Contam. Toxicol., 81(2008)230. 

23. D.G.J. Larsson, M. Adolfsson-Erici, J. Parkkonen, M. Pettersson, A.H. 

Berg, P.-E. Olsson, L. Forlin, Ethinylestradiol—an undesired fish 

contraceptive Aquat. Toxicol., 45(1999)91. 

24. G.P. Daston, J.W. Gooch, W.J. Breslin. D.L. Shuey, A.I. Nikiforov, T.A. 

Fico, J.W. Gorsuch, Environmental estrogens and reproductive health: 

a discussion of the human and environmental data, Reprod. Toxicol., 

11(1997)465 

25. U. Wrzeciono, L. Zaprutko, „Chemia związków naturalnych”, Chemistry 

of natural compounds, AM Poznań, Poznań 2001. 

26. M. Dudziak, M. Bodzek, Removal of Estrogens by Nanofiltration, 

Ochrona Środowiska, 27(2005)9. 

27. U.S. Department of Health and Human Services, Report on 

Carcinogens, Eleventh Edition, Public Health Service, National 

Toxicology Program, Washington 2005. 

28. http://www.drugbank.ca 

29. http://toxnet.nlm.nih.gov 

30. www.OSHA.gov 

31. M. Dudziak, K. Luks-Betlej, Ocena obecności estrogenów - 

steroidowych hormonów płciowych - w wybranych wodach rzecznych w 

Polsce, Assessment of estrogen - steroid hormones - in selected waters 

of the river in Poland, Ochrona Środowiska, 26(2004)21. 

32. J. McMurry, „Chemia organiczna”, Organic Chemistry, Tom 3, 

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005. 

33. J.K. Podlewski, A. Chwalibogowska-Podlewska, „Leki współczesnej 

terapii. Encyklopedia dla Lekarzy i Farmaceutów”, Medication therapy 

today. Encyclopedia for Physicians and Pharmacists, Wyd. 19, Medical 

Tribune Polska, Warszawa 2009. 

34. M. Petrović, D. Barceló, Analysis, fate and removal of pharmaceuticals 

in the water cycle, Wilson&Wilson’s, Amsterdam, Boston, Heidelberg, 



31 

Londyn, Nowy Jork, Oxford, Paryż, San Diego, San Francisco, 

Singapur, Sydney, Tokio 2007. 

35. R.D. Briciu, A. Kot-Wasik, J. Namieśnik, Analytical Challenges and 

Recent Advances in the Determination of Estrogens in Water 

Environments, J. Chromatogr. Sci., 47(2009)127. 

36. M.J. López de Alda, D. Barceló, Review of analytical methods for the 

determination of estrogens and progestogens in waste waters, 

Fresenius J. Anal. Chem., 371(2001)437. 

37. T. Reemtsma, The use of liquid chromatography-atmospheric pressure 

ionization-mass spectrometry in water analysis - Part II: Obstacles 

Trends Anal. Chem., 20(2001)533. 

38. Commision Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 

96/23/EC concerning the performance of analytical methods and 

interpretation of results, European Union, Brussels, 2002, pp. 66 

(available at http://europe.eu.int). 

39. C. Baronti, R. Curini, G. D’Ascenzo , A. Di Corcia, D. Centili, R. 

Samperi, Monitoring natural and synthetic estrogen at activated sludge 

treatment plants and in receiving river water, Environ. Sci. Technol., 

34(2000)5059. 

40. C.-H. Huang, , D.L. Sedlak, Analysis of estrogenic hormones in 

municipal wastewater effluent and surface water using enzyme-linked 

immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass 

spectrometry, Environ. Toxicol. Chem., 20(2001)133. 

41. J. Hu, H. Zhang, and H. Chang, Improved method for analyzing 

estrogens in water by liquid chromatography–electrospray mass 

spectrometry. J. Chromatogr. A ,1070(2005)221. 

42. C. Desbrow, E.J. Routledge, G.C.Brighty, J.P. Sumpter, M. Waldock, 

Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 1. Chemical 

Fractionation and in Vitro Biological Screening, Environ. Sci. Technol., 

32(1998)1549. 

43. R. Siegener, R.F. Chen, Detection of pharmaceuticals entering Boston 

Harbor. In Analysis of Environmental Endocrine Disruptors, ACS Symp. 

Ser., 747(2000)125. 

44. G. Saravanabhavan, R. Helleur, J.Hellou, GC–MS/MS measurement of 

natural and synthetic estrogens in receiving waters and mussels close 

to a raw sewage ocean outfall, Chemosphere, 76(2009)1156. 

45. H.M. Kuch, K. Ballschmiter, Determination of endogenous and 

exogenous estrogens in effluents from sewage treatment plants at the 

ng/L-level, Fresenius J. Anal. Chem. 366(2000)392. 

46. G.G.J. Larsson, M. Adolfsson-Erici, J. Parkkonen, M. Pettersson, A.H. 

Berg, P.-E. Olsson, L. Förlin, Ethinyloestradiol — an undesired fish 

contraceptive, Aquat. Toxicol., 45(1999)91. 

47. D.A. Alvarez, J.D. Petty, J.N. Huckins, T.L. Jones-Lepp, D.T. Getting, 

J.P. Goddard. Development of a passive, in situ, integrative sampler for 

hydrophilic organic contaminants in aquatic environments, Environ. 

Toxicol. Chem., 23(2004)1640. 

Vol. 4, No 1/2012 



48. D.A. Alvarez, P.E. Stackelberg, J.D. Petty, J.N. Huckins, E.T. Furlong, 

S.D. Zaugg, Comparison of a novel passive sampler to standard watercolumn 

sampling for organic contaminants associated with wastewater 

effluents entering a New Jersey stream, Chemosphere, 61(2005)610. 

49. A. Arditsoglou, D. Voutsa, Passive sampling of selected endocrine 

disrupting compounds using polar organic chemical integrative 

samplers, Environ. Poll., 156(2008)316. 

50. Z. Zhang, A. Hibberd, J.L. Zhou, Analysis of emerging contaminants in 

sewage effluent and river water: Comparison between spot and passive 

sampling, Anal. Chim. Acta, 607(2008)37. 

51. Y. Yu, L. Wu, Analysis of endocrine disrupting compounds, 

pharmaceuticals and personal care products in sewage sludge by gas 

chromatography–mass spectrometry, Talanta (2011), 

doi:10.1016/j.talanta.2011.12.023. 

52. B. Lei, S. Huang, Y. Zhou, D. Wang, Z. Wang, Levels of six estrogens 

in water and sediment from three rivers in Tianjin area, China, 

Chemosphere, 76(2009)36. 

53. J. Xu, L. Wu, W. Chen and A. C. Chang, Simultaneous determination of 

pharmaceuticals, endocrine disrupting compounds and hormone in soils 

by gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 

1202(2008)189. 

54. A.C. Johnson, A. Belfroid, A. Di Corcia, Estimating steroid oestrogen 

inputs to activated sludge treatment works and observations on their 

removal from the effluent, Sci. Total Environ., 256(2000)163. 

55. L.S. Shore, M. Gurevitz, M. Shemesh, Estrogen as an environmental 

pollutants. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 51(1993)361. 

56. S. Rodriguez-Mozaz, M-P. Marco, M.J. Lopez de Alda, D. Barcelo, 

Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a 

review article, Anal. Bioanal. Chem., 378(2004)588. 




chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 

1056(2004)179. 

58. S. Zorita, P. Hallgren, L. Mathiasson, Steroid hormone determination in 

water using an environmentally friendly membrane based extraction 

technique, J. Chromatogr. A, 1192(2008)1. 

59. O. Lerch, P. Zinn, Derivatisation and gas chromatography-chemical 

ionization mass spectrometry of selected synthetic and natural 

endocrine disruptive chemicals, J. Chromatogr. A, 991(2003)77. 

60. R. Liu, J.L. Zhou, AS. Wilding, Simultaneous determination of endocrine 

disrupting phenolic compounds and steroids in water by solid-phase 

extraction-gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 

1022(2004)179. 



33 

61. T. Ternes, H. Andersen, D. Gilberg, M. Bonerz, Determination of 

estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS, 

Anal. Chem., 74(2002)3498. 

62. K. Zhang, Y Zuo, Pitfalls and solution for simultaneous determination of 

estrone and 17α-ethinyloestradiol by gas chromatography-mass 

spectrometry after derivatization with N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, 

Anal. Chim. Acta, 554(2005)190. 

63. X-Y. Xia, D.V. McCalley, J. McEvoy, Analysis of estrogens in river water 

and effluents using solid-phase extraction and gas-chromatography – 

negative chemical ionization mass spectrometry of the 

pentafluorobenzoyl derivatives, J. Chromatogr. A, 923(2001)195. 

64. R. Jeannot, H. Sabik, E. Sauvard, T. Dagnac, K. Dohrendorf, 

Determination of endocrine-disrupting compounds in environmental 

samples using gas and liquid chromatography with mass spectrometry, 

J. Chromatogr. A, 974(2002)143. 

65. H.-R. Aerni, B. Kobler, B.V. Rutishauser, F.E. Wettstein, R. Fisher, W. 

Giger, A. Hungerbuhler, M.D. Marazuela, A. Peter, R. Schonenberger, 

A.C. Vogeli, M.J.-F. Suter, R.I.L. Eggen, Combined biological and 

chemical assessment of estrogenic activities in wastewater treatment 

plants effluents, Anal. Bioanal. Chem., 378(2004)688. 

66. M.R. Servos, D.T. Bennie, B.K. Burnison, A. Jurkovic, R. McInnis, T. 

Neheli, A. Schnell, P. Seto, S.A. Smyth, T.A. Ternes, Distribution of 

estrogens, 17β-estradiol and estrone, in Canadian municipal 

wastewater treatment plants, Sci. Total Environ., 336(2005)155. 

67. E.P. Kolodziej, J.L. Gray, D.L. Sedlak, Quantification of steroid 

hormones with pheromonal properties In municipal wastewater effluent, 

Environ. Toxicol. Chem., 22(2003)2622. 

68. R. Hu, L. Zhang, Z. Yang, Picogram determination of estrogens in water 

using large volume injection gas chromatography–mass spectrometry, 

Anal. Bioanal. Chem., 390(2008)349. 

69. J.B. Quintana, J. Carpinteiro, I. Rodriguez , R.A. Lorenzo, A.M. Carro, 

R. Cela, Determination of natural and synthetic estrogens in water by 

gas chromatography with mass spectrometric detection, J. Chromatogr. 

A, 1024(2004)177. 

70. Y. Nie, Z. Qiang, H. Zhang, C. Adams, Determination of endocrinedisrupting 

chemicals in the liquid and solid phases of activated sludge 

by solid phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry, 

J. Chromatogr. A, 1216(2009)7071. 

71. . A. Hibberd, K. Maskaoui, Z. Zhang, J.L. Zhou, An improved method for 

the simultaneous analysis of phenolic and steroidal estrogens in water 

and sediment, Talanta, 77(2009)1315. 

72. K. Hájková, J. Pulkrabová, J. Schůrek, J. Hajšlová, J. Poustka, M. 

Nápravníková, V. Kocourek, Novel approaches to the analysis of steroid 

estrogens in river sediments, Anal. Bioanal. Chem., 387(2007)1351. 

73. S. Combalbert, M.L. Pype, N. Bernet ,G.Hernandez-Raquet, Enhanced 

methods for conditioning, storage, and extraction of liquid and solid 

Vol. 4, No 1/2012 



samples of manure for determination of steroid hormones by solidphase 

extraction and gas chromatography–mass spectrometry, Anal. 

Bioanal. Chem., 398(2010)973. 

74. M.J. Lopez de Alda, D. Barcelo, Use of solid-phase extraction in various 

of its modalities for sample preparation in the determination of 

estrogens and progestogens in sediment and water, J. Chromatogr. A, 

938(2001)145. 

75. R.A. Trenholm, B.J. Vanderford, J.C. Holady, D.J. Rexing, S. A. Snyder, 

Broad range analysis of endocrine disruptors and pharmaceuticals 

using gas chromatography and liquid chromatography tandem mass 

spectrometry, Chemosphere, 65(2006)1990. 

76. A. Karnjanapiboonwong, J.G. Suski, A.A. Shah, Qi. Cai, A.N. Morse, 

T.A. Anderson, Occurrence of PPCPs at a Wastewater Treatment Plant 

and in Soil and Groundwater at a Land Application Site, Water Air Soil 

Pollut., 216(2011)257. 

77. Zarzycki P.K., Kulhanek K.M., Smith R., Clifton V.L., Determination of 

steroids in human plasma using temperature-dependent inclusion 

chromatography for metabolomic investigations, J. Chromatogr. A, 

1104(2006)203. 

78. Zarzycki P.K., Simple horizontal chamber for thermostated microthinlayer 

chromatography, J. Chromatogr. A, 1187(2008)250. 

79. Zarzycki P.K, Włodarczyk E., Zarzycka M.B., Głód B.K., Optimization of 

a solid-phase extraction protocol for fractionation of selected steroids 

using retention data from micro thin-layer chromatography, Anal. Sci., 

25(2009)935. 

80. Zarzycki P.K., Wybrane elementy teorii i praktyki chromatografii 

cieczowej, Monografia Wydziału Budownictwa i Inżynierii Środowiska, 

Nr 26, Wydawnictwo Uczelniane Politechniki Koszalińskiej, Koszalin 

2006. 

81. M.B. Zarzycka, Wykorzystanie danych retencyjnych uzyskanych przy 

pomocy techniki mikro-TLC w doborze warunków procesu ekstrakcji do 

fazy stałej (SPE) prowadzonej z użyciem faz odwróconych (Application 

of retention data derived from micro-TLC plates for optimization of a 

reversed phase solid-phase extraction protocol), Camera Separatoria, 

3(2011)129, 

82. P.K. Zarzycki, M.M. Ślączka, M.B. Zarzycka, M.A. Bartoszuk, E. 

Włodarczyk, M.J. Baran, Temperature-controlled micro-TLC: A versatile 

green chemistry and fast analytical tool for separation and preliminary 

screening of steroids fraction from biological and environmental samples, 

J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 127(2011) 418. 

83. A. Prieto, A. Vallejo, O. Zuloaga, A. Paschke, B. Sellergen, E. Schillinger, 

S. Schrader, M. Möder, Selective determination of estrogenic compounds 

in water by microextraction by packed sorbents and a molecularly 

imprinted polymer coupled with large volume injection-in-port-derivatization 

gas chromatography–mass spectrometry, Anal. Chim. Acta, 

703(2011)41. 



35 

84. H.M. Kuch, K. Ballschmiter, Determination of endogenous and exogenous 

estrogens in effluents from sewage treatment plants at the ng/Llevel, 

Fresenius J. Anal. Chem., 366(2000)392. 

84. T.P. Rodgers-Gray, S. Jobling, S. Morris, C. Kelly, S. Kirby, A. Janbakhsh, 

J.E. Harries, M.J. Waldock, J.P. Sumpter, C.R. Tyler, Longterm 

temporal changes in the estrogenic composition of treated sewage 

effluent and its biological effects on fish, Environ. Sci. Technol., 

34(2000)1521. 

86. S.A. Snyder, T.L. Keith, D.A. Verbrugge, E.M. Snyder, T.S. Gross, K. 

Kannan, J.P. Giesy, Analytical methods for detection of selected estrogenic 

compounds in aqueous mixtures, Environ. Sci. Technol., 

33(1999)2814. 

87. G. Carignan, B.A. Lodge, Comparison of acidic and enzymatic hydrolysis 

procedures for identification of natural estrogens in pharmaceutical 

preparations, J. Pharmac. Sci. 69(1980) 1453–1454. 

88 X. Peng, Z. Wang, C. Yang, C. Fanrong, B. Mai, Simultaneous 

determination of endocrine-disrupting phenols and steroid estrogens in 

sediment by gas chromatography mass spectrometry, J. Chromatogr. 

A, 1116(2006)51. 

89. J. Beck, K.U. Totsche, I. Kogel-Knabner, A rapid and efficient 

determination of natural estrogens in soils by pressuried liquid extraction 

and gas chromatography-mass spectrometry, Chemosphere, 

71(2008)954. 

90. A. Shareef, C.J. Parnis, M.J. Angove, J.D. Wells, B.B. Johnson. 

Suitability of N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide and N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide 

as derivatization reagents for 

the determination of the estrogens estrone and 17 -ethinylestradiol by 

gas chromatography-mass spectrometry, J Chromatogr A, 

1026(2004)295. 

91. H.G.J. Mol, S. Sunarto, O.M. Steijger, Determination of endocrine 

disruptors in water after derivatization with N-methyl-N-(tertbutyldimethyltrifluoroacetamide) 

using gas chromatography with mass spectrometric 

detection, J. Chromatogr. A; 879(2000)97. 

92. H.B. Lee, T.E. Peart, Determination of 17β-estradiol and its metabolites 

in sewage effluent by solid-phase extraction and gas chromatography/mass 

spectrometry, J. AOAC Int., 81(1998)1209. 

93. J. Kumirska, N. Migowska, M. Caban, A. Plenis, P.Stepnowski, Chemometric 

analysis for optimizing derivatization in GC-based procedures, J. 

Chemometrics, 25(2011)636. 

94. C. Bicchib, T. Schiliròa, C. Pignataa, E. Feaa, C. Corderob, F. Canaleb, 

G. Gillia, Analysis of environmental endocrine disrupting chemicals using 

the E-screen method and stir bar sorptive extraction in wastewater 

treatment plant effluents, Sci. Total Environ., 407(2009)1842. 

95. H.M. Coleman, M. Troester, S.J. Khan, J.A. McDonald, G. Watkins, 

R.M. Stuetz, Assessment of trace organic chemical removal by mem- 

Vol. 4, No 1/2012 



brane bioreactor using gas chromatography/mass spectrometry and 

yeast screen bioassay, Environ. Toxicol. Chem., 28(2009)2537. 

96. G.H. Lu, W.T. Song, C. Wang, Z.H. Yan, Assessment of in vivo estrogenic 

response and the identification of environmental estrogens in the 

Yangtze River (Nanjing section), Chemosphere, 80(2010)982. 

97. M. Avberšek, B. Žegura, M. Filipič, E. Heath, Integration of GC-MSD 

and ER-Calux® assay into a single protocol for determining steroid estrogens 

in environmental samples, Sci. Total Environ., 409(2011)5069. 

98. S. Kinani, S. Bouchonnet, N. Creusot, S. Bourcier, P. Balaguer, J.-M. 

Porcher, S. Aït-Aïssa, Bioanalytical characterisation of multiple endocrine- 

and dioxin-like activities in sediments from reference and impacted 

small rivers, Environ. Pollution., 158(2010)74. 

99. S. Kinani, S. Bouchonnet, N. Creusot, S. Bourcier, P. Balaguer, J.-M. 

Porcher, S. Aït-Aïssa, Bioanalytical characterisation of multiple endocrine- 

and dioxin-like activities in sediments from reference and impacted 

small rivers, Environ. Pollution., 158(2010)74. 

100. H. Noppe, K. Arijs, K. De Wasch, S. Van Cruchten, S. Poelmans, D. 

Courtheyn, E. Cobbaert, W. Gillis, P. Vanthemsche, H.De Brabander, 

C. Janssen, N. Van Hoof, Biological and Chemical Approaches for the 

Detection and Identification of Illegal Estrogens in Water-based Solutions, 

Veter. Res. Commun., 30(2006)577. 

101. L. Viganò, E. Benfenati, A. van Cauwenberge, J.K. Eidem, C. Erratico, 

A. Goksøyr, W. Kloas, S. Maggioni, A. Mandich, R. Urbatzka, Estrogenicity 

profile and estrogenic compounds determined in river sediments 

by chemical analysis, ELISA and yeast assays, Chemosphere, 

73(2008)1078. 

102. R. Jeannota, H. Sabik, E.Sauvard, T. Dagnac, K. Dohrendorf, 

Determination of endocrine-disrupting compounds in environmental 

samples using gas and liquid chromatography with mass spectrometry, 

J. Chromatogr. A, 974(2002)143. 

103. M.S. Díaz-Cruz, M.J. López de Alda, R. López, D. Barceló, Determination 

of estrogens and progestogens by mass spectrometric techniques 

(GC/MS, LC/MS and LC/MS/MS), J. Mass Spectrom., 38(2003)917. 

104. J.B. Gadd, L.A. Tremblay, G.L. Northcott, Steroid estrogens, conjugated 

estrogens and estrogenic activity in farm dairy shed effluents, Environ. 

Pollut., 158(2010)730. 

105. E. Heath, T. Kosjek, H.R. Andersen, H.-C. Holten Lützhøft, M. Adolfson 

Erici, M. Coquery, R.-A. Düring, O. Gans, C. Guignard, P. Karlsson, F. 

Manciot, Z. Moldovan, D. Patureau, L. Cruceru, F. Sacherm, A. Ledin, 

Inter-laboratory exercise on steroid estrogens in aqueous samples, Environ. 

Pollution, 158(2010)658. 

106. K.A. Fenlon, A.C. Johnson, C.R. Tyler, E.M. Hill, Gas–liquid 

chromatography–tandem mass spectrometry methodology for the 

quantitation of estrogenic contaminants in bile of fish exposed to 

wastewater treatment works effluents and from wild populations, J. 

Chromatogr.A,1217(2010)112 




Natalia MIGOWSKA*, Jolanta KUMIRSKA 


Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka, Zakład Analizy Środowiska, 

ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk 

e-mail: natalia@chem.univ.gda.pl 

Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących 

do izolacji i/lub wzbogacania pozostałości wybranych 

farmaceutyków w próbkach środowiskowych 

Streszczenie: Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych jest 

zadaniem trudnym, ze względu na fakt, iż często stężenie zanieczyszczeń w próbce znacznie 

przewyższa stężenie szukanych związków. Postęp w dziedzinie technik izolacji i wzbogacania 

analitów, który nastąpił w przeciągu kilkunastu lat, sprawił, iż obecnie analityka dysponuje 

szeregiem technik, które mogą być wykorzystane do ekstrakcji wybranych związków. W pracy 

dokonano przeglądu zastosowań innowacyjnych metod ekstrakcji takich jak ekstrakcja 

z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym, mikroekstrakcja do fazy 

stacjonarnej, ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego oraz mikroekstrakcja 

poprzez membranę do fazy ciekłej do oznaczania pozostałości farmaceutyków w próbkach 

środowiskowych. 

Słowa kluczowe: pozostałości farmaceutyków, próbki środowiskowe, techniki izolacji 

i wzbogacania, ekstrakcja z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym, 

mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej, ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego, 

mikroekstrakcja poprzez membranę do fazy ciekłej 

Application of some innovative techniques for the isolation 

and enrichment of selected pharmaceutical residues in 

environmental samples 

Abstract: This paper focuses on the application of novel extraction techniques such as 

Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction, Solid-Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive 

Extraction and Hollow-Fiber Liquid-Phase Microextraction used for isolation and enrichment of 

pharmaceutical residues in environmental samples. Determination of pharmaceutical residues 

in such complex matrix is a difficult task, due to the fact that the concentration of the matrix 

impurities are much higher than analytes. A great progress in extraction approaches, which has 

occurred within a few years, means that the analysts have a number of techniques that can be 

used for the extraction of selected compounds. 

Key words: pharmaceutical residues, environmental samples, Molecularly Imprinted Solid- 

Phase Extraction, Solid-Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive Extraction and Hollow-Fiber 

Liquid-Phase Microextraction 

Vol. 4, No 1/2012 


38 N. Migowska, J. Kumirska 

1. Wstęp 


Przemysł farmaceutyczny - mało podatny na wahania i kryzysy gospodarcze 

- jest jedną z najlepiej rozwijających się gałęzi gospodarki. Czynniki, 

które wpływają na wzrost produkcji farmaceutycznej to między innymi 

starzenie się społeczeństwa, bogacenie się ludności, postęp 

w diagnozowaniu i leczeniu chorób, dostępność leków bez recepty i ich 

promowanie w reklamach. W krajach Unii Europejskiej na rynku znajduje się 

ponad 3000 substancji farmaceutycznych [1]. Farmaceutyki przenikają do 

środowiska wieloma drogami, np. wraz ze ściekami szpitalnymi i domowymi, 

poprzez nieodpowiednią utylizację przeterminowanych lub niezużytych leków, 

bądź też poprzez złą gospodarkę ściekową zakładów farmaceutycznych. 

Oczyszczalnie ścieków nie są w stanie całkowicie usunąć tego typu 

zanieczyszczeń, przez co dostają się one do wód powierzchniowych, a nawet 

pitnych. Badania naukowe potwierdziły obecność ponad 160 różnych 

farmaceutyków w wodach wypływających z oczyszczalni ścieków [2]. Biorąc 

pod uwagę liczbę leków dostępnych na rynku, można się spodziewać, że ich 

obecność w środowisku jest z pewnością większa, a uwaga badaczy skupia 

się jedynie na tych najbardziej popularnych. 

Stwierdzenie obecności pozostałości leków w środowisku nie jest zjawiskiem 

nowym, gdyż pierwsza praca na ten temat ukazała się w latach 

siedemdziesiątych w Stanach Zjednoczonych i dotyczyła wykrycia kwasu 

klofibrowego w ściekach oczyszczonych [3]. Brak odpowiednich narzędzi 

analitycznych, w tym odpowiednich technik przygotowania próbki, sprawił, iż 

dopiero 20 lat później nastąpił gwałtowny rozwój tej tematyki. Stało się tak 

po opublikowaniu kilku przełomowych prac stwierdzających obecność pozostałości 

farmaceutyków w wodach powierzchniowych, m.in wyników badań 

Daughtona i Ternesa w 1999, które wykazały obecność 20 farmaceutyków i 

4 metabolitów w wodach niemieckich rzek [4]. Aktualnie problem obecności 

aktywnych związków farmaceutycznych w różnych komponentach środowiska 

jest jednym z najważniejszych z zakresu chemii środowiska. 

Przygotowanie próbek do analizy pozostałości leków jest zadaniem 

trudnym. Wynika to nie tylko z niskiej zawartości farmaceutyków w badanych 

próbkach, ale także ze złożoności matryc środowiskowych, zawierających 

szereg związków przeszkadzających w ich oznaczaniu. Wymaga to zastosowania 

złożonych operacji i procesów, które mogą być przyczyną strat 

analitów i stać się źródłem dodatkowych zanieczyszczeń. Najczęściej wykorzystywanymi 

technikami oznaczenia końcowego pozostałości farmaceutyków 

są techniki chromatograficzne, zarówno chromatografia cieczowa, jak 

również chromatografia gazowa połączone ze spektrometrią mas. Przed 

analizą chromatograficzną konieczne jest przeprowadzenie etapu 

izolacji i wzbogacania analitów za pomocą odpowiedniej techniki 


Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji… 

39 

ekstrakcji. Aktualne tendencje analityczne wcielają koncepcję "zielonej chemii" 

skupiając się na redukcji zużycia rozpuszczalników oraz na oznaczaniu 

szerokiej gamy analitów występujących na niskich poziomach stężeń przy 

zastosowaniu jednej procedury analitycznej. Niniejsza praca przedstawia 

zastosowanie wybranych, innowacyjnych technik ekstrakcji do izolacji i/lub 

wzbogacania pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych. 

2. Ekstrakcja z wykorzystaniem polimerów z nadrukiem 

molekularnym 

(Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction) 

Podstawowym problemem z jakim zmagają się chemicy-analitycy 

podczas oznaczania pozostałości farmaceutyków jest ilościowe wyodrębnianie 

bardzo małej ilości analitu, z próbki, w której stężenia zanieczyszczeń 

znacznie przewyższają stężenia szukanych związków. Obecnie najczęściej 

stosowaną techniką izolacji pozostałości farmaceutyków z próbek wodnych 

jest ekstrakcja do fazy stałej (Solid-Phase Extraction - SPE). Zasada ekstrakcji 

ciecz–ciało stałe opiera się na wykorzystaniu zjawiska podziału 

związków między dwie fazy: stałą i ciekłą. Najczęściej wykorzystywanymi 

złożami są żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi (C18) 

oraz sorbenty polimerowe na bazie polistyrenu i diwinylobenzenu, takie jak 

np. Oasis HLB i Strata X [5]. Wadą tradycyjnych sorbentów może być ich 

mała selektywność w stosunku do analitów, powodująca, że oprócz związków 

oznaczanych zatrzymaniu mogą ulec również składniki towarzyszące. 

Problem ten może być rozwiązany przez wytworzenie bardziej selektywnych 

sorbentów takich jak np. polimery z nadrukiem molekularnym (Molecularly 

Imprinted Polymers - MIPs). 

Synteza polimerów MIP polega na obudowaniu cząsteczki wzorca 

analitu monomerami funkcyjnymi zdolnymi do polimeryzacji. Monomer posiada 

odpowiednie grupy funkcyjne, które wiążą się z molekułą wzorcową 

wiązaniem kowalencyjnym, bądź też oddziaływaniem elektrostatycznym, 

wodorowym lub hydrofobowym. W wyniku tego powstaje kompleks monomer-cząsteczka, 

który ulega właściwej polimeryzacji, najczęściej 

w obecności odczynnika sieciującego. Po syntezie polimeru, następuje usunięciu 

molekuły wzorca. Powstały polimer posiada wnęki (nadruki molekularne), 

które wielkością i kształtem odpowiadają analitom [6]. Retencja substancji 

oznaczanych na tych sorbentach zachodzi głównie na zasadzie rozpoznawania 

kształtu, ale udział biorą także wiązania chemiczne 

i oddziaływania międzycząsteczkowe. Wobec tego odciski cząsteczkowe 

wykazują powinowactwo do jednego rodzaju struktury [7]. 

Wykorzystanie polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym, jako 

sorbentu w technice ekstrakcji do fazy stałej (Molecularly Imprinted Solid- 

Phase Extraction - MIP-SPE or MISPE) zwiększa selektywność wyodrębniania 

analitów nawet z bardzo skomplikowanych matryc środowiskowych. 

Wzrost selektywności w stosunku do innych sorbentów powoduje także 

wzrost czułości, ponieważ większa ilość analitu może zostać wyekstraho- 

Vol. 4, No 1/2012 



wana [7]. W rezultacie zastosowanie MISPE prowadzi do obniżenia granic 

oznaczalności analitów, uzyskania czystych ekstraktów, a tym samym wyeliminowania 

problemu efektów matrycy, które powstają podczas oznaczenia 

końcowego przy wykorzystania techniki chromatografii cieczowej połączonej 

z tandemową spektrometrią mas LC-MS/MS. Polimery z nadrukiem 

cząsteczkowym nazywane są często sztucznymi przeciwciałami, gdyż 

swoimi selektywnymi właściwościami przypominają immunosorbenty. Dzięki 

produkcji bazującej na syntezie chemicznej są tańsze i łatwiejsze do ponownego 

przygotowania niż immunosorbenty [8]. Ponadto wykazują wyższą 

stabilność w rozpuszczalnikach wodnych i organicznych. 

Technika MISPE nie jest jednak pozbawiona wad. W związku z silnym 

oddziaływaniem sorbentu z analitem desorpcja analitów może okazać się 

skomplikowana. Kolejnym problemem może być niekompletne usunięcie 

molekuły wzorcowej z polimeru, co powoduje wymywanie tej pozostałości 

podczas analizy. Aby temu zapobiec należy dokładnie oczyścić sorbent 

przed analizą. Ponadto należy pamiętać, iż zdolność zatrzymania analitu na 

sorbencie jest ograniczona przez konkretną liczbę nadruków molekularnych 

oraz zależy od matrycy próbki (może nastąpić blokowanie miejsc aktywnych 

poprzez inne składniki próbki). Z tego powodu, jak również poprzez możliwość 

pojawienia się równocześnie zachodzących różnych mechanizmów 

retencji składników próbki z sorbentem, sprawność takiego układu może 

ulec drastycznemu obniżeniu [9]. 

Proces optymalizacji procedury MISPE jest analogiczny do optymalizacji 

ekstrakcji tradycyjną techniką SPE. Etap nanoszenia próbki jest poprzedzony 

etapem kondycjonowania złoża umieszczonego w kolumience 

ekstrakcyjnej. Kondycjonowanie sorbentu polega na przepłukaniu złoża rozpuszczalnikiem 

organicznym, najczęściej metanolem, a następnie wodą. 

Następny etap to nanoszenie próbki. Ważnym parametrem podczas wprowadzania 

próbki jest prędkość jej przepływu. Oczywiście im mniejsza prędkość 

przepływu, tym najwyższe prawdopodobieństwo wzajemnego oddziaływania 

analitu z nadrukiem molekularnym. Najczęściej naniesienie próbki w 

technice MISPE odbywa się metodą grawitacyjną, bez stosowania pomp 

próżniowych [9]. Ważnym parametrem jest pH nanoszonej próbki, które 

powinno być dostosowane do pK a analitów. W celu uzyskania właściwego 

oddziaływania analitu z hydrofobową strukturą polimeru anality nie powinny 

posiadać ładunku i być w formie zdysocjowanej. Zorita S. i inni [10] podczas 

swoich badań nad optymalizacją ekstrakcji ibuprofenu, naproksenu, diklofenaku 

i kwasu klofibrowego z zastosowaniem MISPE, zauważyli że podczas 

testowania różnego pH nanoszonej próbki wynoszącego 3, 5, 7, 9 dla trzech 

pierwszych analitów najlepsze rezultaty zostały osiągnięte przy pH 3-5, a dla 

kwasu klofibrowego jedynie przy pH 3. Wartość pK a kwasu klofibrowego 

wynosi 3,2 wobec tego przy wartości pH 5 występował on w formie zdysocjowanej 

i nie wiązał się całkowicie ze złożem sorbentu. 

Jak już wspomniano ilość nadruków molekularnych w polimerze jest 

ograniczona, w związku z tym ważnym krokiem jest wyznaczenie pojemności 

złoża. González-Mariňo i inni [9] w ramach badań nad optymalizacją 



41 

procedury oznaczania amfetaminy i jej pochodnych w ściekach, przeprowadzili 

eksperymenty, podczas których na złoże kolumienki wprowadzili ultra 

czystą wodę oraz ścieki surowe w objętości 10, 20, 50 i 100 ml, do których 

uprzednio dodali po 100 ng każdego z analitów. Porównanie odzysków uzyskanych 

po ekstrakcji wykazało, że w przypadku ultra czystej wody wprowadzenie 

nawet 100 ml próbki nie wpłynęło znacząco na obniżenie odzysków, 

podczas gdy dla ścieków surowych naniesienie 100 ml próbki spowodowało 

wyraźny spadek odzysków wszystkich analitów. Optymalna objętość przepuszczanych 

ścieków surowych wynosiła 50 ml. Przegląd danych literaturowych 

wskazuje, że w większości wykonywanych badań optymalna objętość 

nanoszonej próbki wynosiła 25-50 ml [9, 11-12]. 

W technice MISPE etap oczyszczania jest bardzo ważny. W związku 

z tym, iż oznaczane związki wykazują silnie powinowactwo do odcisku cząsteczkowego, 

właściwie wykonane oczyszczanie pozwala usunąć zanieczyszczenia, 

bez wymywania analitów. Aby pozbyć się wszelkich interferentów 

najczęściej stosuje się przemywanie polarnym, a następnie niepolarnym 

rozpuszczalnikiem lub mieszaninami rozpuszczalników. Etap ten należy 

dokładnie zoptymalizować, aby nie dopuścić do elucji analitów zatrzymanych 

przez kolumienki MISPE. Gros M. i współpracownicy [11] wykazali, że zastosowanie 

mieszaniny ACN/H 2 O w stosunku (60/40, v/v) powodowało elucję 

znacznej ilości β-blokerów, natomiast zastosowanie wody, osuszenie 

złoża, a następnie użycie czystego acetonitrylu nie powodowało takich strat 

González-Mariňo i współpracownicy [9] zbadali użyteczność sorbentów 

MIP, kolumienek OASIS HLB oraz OASIS MCX do izolacji, wzbogacania 

oraz oznaczania pochodnych amfetaminy w próbkach wody. Z badań wynika, 

że nieznacznie lepsze odzyski otrzymuje się przy użyciu kolumienek 

MIP (91 -114 %) w porównaniu z odzyskami uzyskanymi przy wykorzystaniu 

kolumienek Oasis MCX (101-137 %). Ponadto współczynnik zmienności 

wyników przy wykorzystaniu kolumienek MIP jest niższy (1,5-4,9 %), niż 

przy zastosowaniu kolumienek Oasis MCX (2,0-11,9 %). Co więcej granica 

wykrywalności jest 2 razy niższa stosując kolumienki MIP, niż kolumienki 

Oasis MCX. Jako wadę wykorzystania kolumienek MIP autorzy podali dłuższy 

czas przeprowadzania ekstrakcji ze względu na grawitacyjny sposób 

przepuszczanie próbki (trwające 50 min) w porównaniu z 10 minutowym 

przepuszczaniem próbki przez kolumienki Oasis MCX oraz mniejszą pojemność 

złoża w porównaniu z kolumienkami Oasis MCX. 

"Inteligentne polimery" z odciskiem cząsteczkowym, stanowią obiecującą 

alternatywę, która na razie wykorzystywana jest do ekstrakcji niewielkiej 

liczby leków. Aby upowszechnić użycie polimerów MIP do oznaczania 

farmaceutyków z próbek środowiskowych należy stworzyć szereg polimerów 

posiadających wnęki (nadruki molekularne), które wielkością i kształtem 

będą odpowiadały większej liczbie związków z grupy analitów. 

Vol. 4, No 1/2012 



3. Mikroekstrakcja 

(Microextraction) 

Opracowanie przez Pawliszyna i współpracowników [13] w 1990 roku 

techniki mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (ang. Solid-Phase Microextraction, 

SPME) zapoczątkowało zainteresowanie technikami mikroekstrakcji w 

chemii analitycznej. W 1999 roku Baltussen i współpracownicy [14] zaprezentowali 

ekstrakcję z zastosowaniem wirującego elementu sorpcyjnego 

(ang. Stir bar sorptive extraction, SBSE), w tym samym roku Pedersen-Bjergaard 

i Rasmussen [15] wprowadzili technikę mikroekstrakcję poprzez 

membranę do fazy ciekłej (ang. Hollow-fiber liquid-phase microextraction, 

HF-LPME). Zgodnie z ideą "zielonej chemii analitycznej" techniki te minimalizują 

zużycie toksycznych rozpuszczalników i są przyjazne dla środowiska, 

ponadto są mniej praco- i czasochłonne, niż „klasyczne” techniki ekstrakcyjne. 

4. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej 

(Solid phase microextraction) 

W 1993 roku firma Supelco wprowadziła na rynek włókno pokryte sorbentem 

przymocowane do tłoka mikrostrzykawki, służące do przeprowadzenia 

mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej [16]. Od tej pory, technika ta, cieszy 

się dużym zainteresowaniem gdyż służy do izolacji szerokiej gamy analitów 

lotnych lub średniolotnych z próbek ciekłych, gazowych lub stałych, w tym z 

próbek o skomplikowanej matrycy. 

W analizie metodą SPME wyróżnia się dwa etapy: 

1 etap - podziału związków pomiędzy pokryciem włókna a matrycą próbki, 

2 etap - desorpcji zaadsorbowanych na włóknie analitów oraz ich oznaczanie. 

W pierwszym etapie włókno eksponowane jest albo bezpośrednio 

w próbce (Direct immersion - solid-phase microextraction, DI-SPME) albo 

w fazie nadpowierzchniowej próbki (Head space - solid-phase microextraction, 

HS-SPME). Następuje wówczas podział analitu pomiędzy matrycą 

próbki a fazą stacjonarną umieszczoną na włóknie bądź też pomiędzy 

próbką, jej fazą nadpowierzchniową, a włóknem SPME. Na wydajność i 

czułość ekstrakcji wpływ mają takie parametry jak: temperatura, siła jonowa, 

polarność i objętość próbki, a w przypadku ekstrakcji HS-SPME również 

objętość fazy nadpowierzchniowej oraz rodzaj i grubość fazy stacjonarnej 

użytego włókna. Czas ekstrakcji jest zależny od temperatury i intensywności 

mieszania próbki. Wszystkie te parametry powinny być uwzględnione w procesie 

optymalizacji [17]. 

Etap desorpcji uzależniony jest od rodzaju zastosowanej techniki 

oznaczenia końcowego. W przypadku chromatografii cieczowej niezbędne 

jest zastosowanie specjalnej przystawki SPME/HPLC do desorpcji analitów 

cieczą, natomiast w przypadku chromatografii gazowej desorpcja odbywa 

się bezpośrednio w dozowniku chromatografu gazowego [5]. Jeżeli ozna- 



43 

czenie wybranych związków wymaga przeprowadzenia ich w pochodne 

możliwe jest wprowadzenie etapu upochodnienia. Proces derywatyzacji 

można przeprowadzić bezpośrednio w matrycy „in situ” i uzyskane pochodne 

ekstrahować za pomocą SPME, bądź też przekształcenie analitów 

w pochodne może zachodzić na włóknie lub też w komorze dozownika 

chromatografu – ex situ [19]. 

SPME bardzo dobrze sprawdza się w połączeniu z metodami chromatograficznymi, 

zarówno z chromatografią gazową, jak i cieczową. Różnorodność 

włókien dostępnych komercyjnie umożliwiło wykorzystanie tej techniki 

do ekstrakcji szerokiej gamy analitów między innymi do oznaczeń farmaceutyków 

w próbkach wodnych Przykłady zastosowań podano w Tabeli 

1. 

Vol. 4, No 1/2012 



o C 

- desorpcja 280 o C, 5 

Tabela 1. Przegląd metod wykorzystania SPME do oznaczania wybranych farmaceutyków w próbkach 

środowiskowych 

Table 1. Survey of SPME methods for the extraction of the pharmaceuticals from environmental samples 

Anality 

Analytes 

Dietylostilbestr 

ol (DES) 

Estron (E1) 

17 β-Estradiol 

(E2) 

17 α- 

Etynyloestradi 

ol (EE2) 

Ibuprofen 

Naproksen 

Ketoprofen 

Diklofenak 

Ibuprofen 

Paracetamol 

Naproksen 

Indometacyna 

Matryca 

Sample type 

Woda 

wodociągowa 

Ścieki 

Woda 

kranowa 

Rodzaj włókna 

SPME 

SPME fiber type 

PA 

PDMS 

PDMS/DVB 

PA 

PDMS 

PDMS/DVB 

CAR/PDMS 

CW/DVB 

PA 

PDMS/DVB 

CW/DVB 

Procedura 

Sample preparation 

procedure 

- pH = 2, NaCl C = 30 % 

- ekstrakcja 160 min 

temp. pokojowa, 

mieszanie 105 rad/s, 

- derywatyzacja 100 µl 

MSTFA 30 min temp. 60 

min 

- pH = 3 

- ekstrakcja 40 min temp. 

pokojowa, 


MTBSTFA 20 min temp. 

40 o C 

- desorpcja 280 o C, 3 min 

- pH = 2, NaCl 1 g/4 ml 

- ekstrakcja 30 min temp. 

pokojowa, mieszanie 1000 

rpm, 

- derywatyzacja BSTFA 60 

min temp. 40 o C 


min 

Metoda 

rozdzielania i 

detekcji 

Separation 

and 

detection 

technique 

GC-MS (SIM) 

GC-MS 

GC-MS 

Odzysk [%] 

Recovery [%] 

- DES 99 ± 2 

- E1 102 ± 3 

- E2 100 ± 2 

- EE2 104 ± 5 

b.d. 

b.d. 

Granica 

wykrywalnoś 

ci [ng L -1 ] 

Limit of 

detection [ng 

L -1 ] 

- Des 18,3 

- E1 8 

-E2 2,7 

- EE2 11 

- Ibuprofen 18 

- Naproksen 15 

- Ketoprofen 40 

- Diklofenak 20 

b.d. 

Litera 

tura 

Refer 

ences 

[19] 

[20] 

[21] 



45 

- pH = 6, Na2SO4 

o C 


o C 


Ibuprofen 

Naproksen 

Ibuprofen, 

Fenoprofen, 

Naproksen, 

Ketoprofen, 

Flurbiprofen, 

Fluoksetyna, 

Estron, 


Simwastatyna 


ol 

Estron 


17 α- 

Etynyloestradi 

ol 


ol 

Estron 


Woda 

kranowa, 

ścieki 

Ścieki 

Woda 

rzeczna i 

ścieki 

Woda 

rzeczna 

PA 

PDMS-DVB 

PA 

PDMS 

PDMS/DVB 

CAR/PDMS 

PA 

2,88 g/6 ml, 

- ekstrakcja i 

derywatyzacja 

15 µl DMS, 70 o C, 45 

min, mieszanie 500 rpm 

- desorpcja 250 o C, 

3 min 

- pH 10, derywatyzacja 

„in situ” 0,16 mL 

chloromrówczanu etylu 

0,3 mlL etanol/pirydyna 

(3:2) 

- ekstrakcja 70 °C 60 

min 

- desorpcja 250 °C 10 

mi 

- pH=6, NaCl 30 mg/ml 


temp. pokojowa, 

mieszanie 400rpm 


MSTFA 30 min temp. 60 

min 

- pH=2, NaCl 100 g/l 


temp.45 o C, 


BSTFA 60 min temp. 60 

min 

GC-MS 

(SIM) 

GC-MS (SIM) 

GC-MS/MS 

(ITD) 

GC-MS (SIM) 

- Ibuprofen 

94,3 

- Naproksen 

102,7 

b.d. 

b.d. 

b.d. 

- Ibuprofen 1 

- Naproksen 9 

500 

- DES 0,2 

- E1 1 

- E2 0,7 

- EE2 3 

- DES 5 

- E1 57 

- E2 22 

[22] 

[23] 

[24] 

[25] 

Vol. 4, No 1/2012 


Sulfaguanidyn 

a 

Sulfacetamid 

Sulfadiazyna 

Sulfatiazyna 

Sulfapirydyna 

Sulfamerazyn 

a 

Sulfametazyna 

Sulfametoksaz 

ol 

Sulfadimetoks 

yna 

Sulfasalazyna 

Ścieki 

oczyszczone 

i 

nieoczyszczo 

ne 

CW/DVB 

- pH = 4,5, 10% m/o KCl 


- statyczna desorpcja 

MeOH przez 30 min 

LC-MS 

Sulfaguanidyn 

a 112 ± 20 

Sulfacetamid 

107 ± 23,5 

Sulfadiazyna 

97,7 ± 17,2 

Sulfatiazol 

29,0 ± 18,1 

Sulfapirydyna 

97,7 ± 20,1 

Sulfamerazyn 

a 92,1 ± 20,1 

Sulfametazyna 

39,8 ± 18,9 

Sulfametoksaz 

ol 59,2 ± 15,8 

Sulfadimetoks 

yna 74,2 ± 

17,6 

Sulfasalazyna 

229 ± 11,1 

Sulfaguanidyn 

a 1370 

Sulfacetamid 

47500 

Sulfadiazyna 

9040 

Sulfatiazol 

26300 

Sulfapirydyna 

35400 

Sulfamerazyn 

a 55300 

Sulfametazyna 

16200 

Sulfametoksaz 

ol 14000 

Sulfadimetoks 

yna 12400 

Sulfasalazyna 

229 ± 11,1 

[26] 




47 

Jedną z ważniejszych zalet zastosowania techniki mikroesktrakcji do fazy 

stacjonarnej jest wyeliminowanie dużej ilości rozpuszczalników z etapu 

przygotowania próbki. Ponadto czas ekstrakcji metodą SPME jest krótszy 

niż przy zastosowaniu metody ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub metody 

ekstrakcji ciecz-ciecz (ang. Liquid-Liquid Extraction – LLE). Technika SPME 

jest prosta i łatwa do automatyzacji. Jeśli wykonywana jest ekstrakcja analitów 

z fazy nadpowierzchniowej, wówczas cząsteczki stałe obecne w próbce 

nie mają wpływu na przebieg procesu. Kolejną zaletą SPME jest liniowość 

odpowiedzi detektora w szerokim zakresie stężeń. 

Główną wadą tej techniki jest stosunkowo wysoki koszt włókna 

i ograniczony czas jego użytkowania, związany z częściową degradacją 

włókna w wysokiej temperaturze jak również z zanieczyszczeniem włókna 

podczas ekstrakcji oraz mechanicznymi uszkodzeniami [17]. Może obniżać 

to dokładność i precyzję analizy oraz podnosić koszt analizy wywołany degradacją 

włókna podczas procesu ekstrakcji. 

5. Ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego 

(Stir bar sorptive extraction) 

Ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego wykorzystuje 

jako medium ekstrakcyjne mieszadełko pokryte polidimetylosiloksanem 

(PDMS), które dostępne jest pod nazwą handlową Twister® (GERSTEL 

GmbH & Co.). Procedura ekstrakcji składa się z trzech głównych etapów: 

ekstrakcji, czyli ekspozycji wirującego mieszadełka w próbce wody przez 

określony czas; przemycia, czyli usunięcia resztek matrycy; oraz uwolnienia 

zaadsorbowanych analitów przez desorpcję termiczną lub ekstrakcję rozpuszczalnikiem. 

Desorpcja termiczna odbywa się z użyciem automatycznych 

desorberów zintegrowanych z układem chromatograficznym. SBSE podobnie 

jak SPME jest bezrozpuszczalnikową metodą przygotowania próbki opierającą 

się na ekstrakcji sorpcyjnej. Ilość fazy PDMS pokrywająca mieszadełko 

magnetyczne w technice SBSE jest 50-250 razy większa, co pozwala 

na efektywniejszą ekstrakcję analitu w porównaniu z techniką SPME. 

Główną wadą tej techniki jest fakt, iż na rynku dostępne są przeważnie mieszadełka 

magnetyczne pokryte polidimetylosiloksanem. Uniemożliwia to 

ekstrakcję związków polarnych, które słabo ekstrahują do fazy PDMS. Aby 

ocenić, czy osiągnie się wystarczającą wydajność ekstrakcji danego analitu 

techniką SBSE z wykorzystaniem fazy PDMS, można posłużyć się stałą 

podziału oktanol – woda K OW . Przyjmuje się, że związki, których log K OW jest 

mniejszy od jedności, charakteryzowane są jako hydrofilowe, więc nie będą 

się rozpuszczały w niepolarnej fazie PDMS. Związki, dla których log K OW 

mieści się między wartością 1 a 3, charakteryzują się średnim charakterem 

hydrofilowym (lub średnim charakterem hydrofobowym) i mogą 

w ograniczonym stopniu rozpuszczać się w fazie PDMS. Natomiast związki, 

których log K OW osiąga wartość powyżej 3, charakteryzowane są jako hydrofobowe 

i będą dobrze rozpuszczały się w niepolarnej fazie PDMS [27]. 

Vol. 4, No 1/2012 



Kawaguchi i współpracownicy [28] zastosowali ekstrakcję SBSE do 

oznaczenia naturalnych i syntetycznych hormonów takich jak, estron, 17βestradiol 

oraz 17α-etynyloestradiol w próbkach wody. Anality przeprowadzili 

w pochodne za pomocą bezwodnika octowego i uzyskali granice wykrywalności 

(LOD) na poziomie ng/L. Ci sami autorzy podczas wykonywania następnych 

badań [30] zastosowali metodę podwójnej derywatyzacji do oznaczania 

17β-estradiolu w próbkach wody rzecznej. 17β-Estradiol w swojej 

strukturze posiada ugrupowanie hydroksylowe oraz fenolowe. W pierwszym 

etapie upochodnienia „in situ” przeprowadzeniu w pochodną uległo ugrupowanie 

fenolowe, co zwiększyło zdolność analitu do rozpuszczenia się w fazie 

PDMS. Następnie analit zdesorbowali termicznie i poddali reakcji z odczynnikiem 

BSTFA (N,O-bis(trimetylsililo)trifluoroacetamid). Przeprowadzenie 

w pochodną trimetylosiliową miało na celu zwiększenie lotności analitu 

i poprawę czułości przy oznaczeniu za pomocą GC-MS. Uzyskane w ten 

sposób wartości LOD były bardzo zbliżone do wyników poprzednich badań. 

Wprowadzenie automatycznego urządzenia, służącego do desorpcji 

analitów z wirującego elementu sorpcyjnego, znacznie ułatwiło, przyspieszyło, 

a przede wszystkim uczyniło z niej bardziej ekonomiczną technikę 

ekstrakcji. Największym ograniczeniem tej techniki jest dostępność na rynku 

jedynie mieszadełek pokrytych fazą PDMS, jednak w niektórych ośrodkach 

naukowych, prowadzone są prace nad wykorzystaniem innych faz stacjonarnych 

niż polidimetylosiloksanowa. Przykładowe prace zestawiono w Tabeli 

2. 


Tabela 2. Wykorzystanie nowych faz stacjonarnych w ekstrakcji SBSE do izolacji i/lub wzbogacenia oraz. oznaczania 

pozostałości leków w próbkach środowiskowych 

Table 2. Use of new phases in SBSE extraction for determination of pharmaceutical residues in environmental. 

samples 

Anality 

Analytes 

Farmaceutyki: 

Paracetamol (PAR) 

Antypiryna (ANT) 

Propanolol (PRO) 

Karbamezepina 

(CAR) 

Diklofenak (DIC) 

Ibuprofen (IBU) 

oraz środki higieny 

osobistej 

Matryca 

Sample type 

Woda rzeczna, 

ścieki 

Rodzaj 

mieszadełka SBSE 

Stir bar sorbent 

VPD-DVB 

(kopolimer 

winylopirolidonu z 

diwinylobenzenem) 

Technika 

rozdzielania 

i oznaczenia 

końcowego 

Separation and 

detection 

technique 

LC-MS/MS 

Odzysk [%] 

Recoveries [%] 

Woda rzeczna 

PAR 8 

ANT 34 

PRO 56 

CAR 99 

DIC 75 

IBU 70 

Ścieki oczyszczone 

PAR 8 

ANT 35 

PRO 64 

CAR 85 

DIC 74 

IBU 73 

Ścieki 

nieoczyszczone 

PAR 

ANT - 

PRO 29 

CAR 74 

DIC 67 

IBU - 

Granica 

oznaczalnoś 

ci 

Limit of 

detection 

20-100 ng L -1 

Literatura 

References 

[30] 


49 

Vol. 4, No 1/2012 


Estron (E1), 

17β-Estradiol (E2), 

Estriol (E3) 

17 α- 

Etynyloestradiol 

Kwas 

acetylosalicylowy 

(ACA), 

Ibuprofen (IBU), 

Diklofenak (DIC), 

Naproksen (NAP), 

Kwas 

mefenamowy 

(MEF), 

Gemfibrozyl (GEM) 

Woda rzeczna i 

jeziorna 

Woda 

dejonizowana, 

PDMS/β-CD 

polydimethylsiloksa 

n/-cyklodekstryna 

Porównanie włókna 

PDMS z PU 

(poliuretanowym) 

HPLC – UV 

HPLC-DAD 

Woda rzeczna 

E3 84,6 ± 9,3 

E2 108,5 ± 2,0 

EE2 118,8 ± 5,7 

E1 124,1 ± 2,7 

Woda jeziorna 

E3 87,1 ± 8,0 

E2 110,6 ± 4,7 

EE2 123,5 ± 5,8 

E1 117,9 ± 5,7 

PDMS 

ACA < 1,0 

NAP 9,8 ± 1,6 

DIC 34,6 ± 6,9 

IBU 43,4 ± 5,4 

MEF 71,3 ± 5,8 

GEM 73,4 ± 5,0 

PU 

ACA 45,3 ± 9,0 

NAP 78,3 ± 3,4 

DIC 77,7 ± 2,7 

IBU 90,6 ± 7,2 

MEF 48,4 ± 8,4 

GEM 84,0 ± 9,0 

Granica 

wykrywalności: 

E3 0,04 µg L -1 

E2 0,09 µg L -1 

EE2 0,09 µg L -1 

E1 0,11 µg L -1 

PDMS 

ACA - 

NAP 3,2 µg L -1 

DIC 5,4 µg L -1 

IBU 5,5 µg L -1 

MEF 5,1 µg L -1 

GEM 5,8 µg L -1 

PU 

ACA 2,7 µg L -1 

NAP 1,5 µg L -1 

DIC 2,4 µg L -1 

IBU 3,6 µg L -1 

MEF 4,2 µg L -1 

GEM 2,5 µg L -1 

[31] 

[32] 




51 

6. Mikroekstrakcja poprzez membranę do fazy ciekłej 

(Hollow-fiber liquid-phase microextraction) 

W technice mikroekstrakcji poprzez membranę do fazy ciekłej rozpuszczalnik 

organiczny unieruchomiony jest w przestrzeniach porowatej 

membrany zanurzonej w próbce. Małe pory włókna utrzymują ciecz ekstrahującą 

oraz uniemożliwiają przedostania się do niej dużych molekuł. Technika 

ta może mieć szerokie zastosowanie, dzięki możliwości doboru odpowiedniej 

cieczy ekstrahującej oraz rodzaju porowatego włókna. Istnieją dwa 

typy ekstrakcji: dwufazowe HF-LPME oraz trójfazowe HF-LPME. 

W dwufazowym HF-LPME anality ekstrahowane są na drodze biernej ekstrakcji 

z próbki do hydrofobowego rozpuszczalnika organicznego, natomiast 

w trójfazowym HF-LPME anality ekstrahowane są z próbki przez rozpuszczalnik 

organiczny unieruchomiony w membranie, a następnie przenikają do 

fazy wodnej [34]. Basheer i współpracownicy [35] zastosowali dwufazowe 

HF-LPME do wydzielenia naturalnych i syntetycznych hormonów takich jak 

estron, 17β-estradiol, dietylostilbestrol oraz 17α-etynyloestradiol z próbek 

wodnych. Użyli oni membrany, w której przestrzeniach znajdował się dihydroksylowany 

polimetakrylan (DHPMM) służący jako ekstrahent. Dla porównania 

przeprowadzono ekstrakcję tych związków z wykorzystaniem techniki 

SPME. Polimer DHPMM w porównaniu z poliakrylanowym (PA) włóknem 

SPME posiada dużo więcej ugrupowań hydroksylowych (-OH), dlatego też 

był bardziej odpowiedni do ekstrakcji związków polarnych jakimi są estrogeny. 

Metoda HF-LPME w połączeniu z techniką GC-MS pozwoliła na obniżenie 

granic oznaczalności związków przeprowadzonych uprzednio w trimetylosillilowe 

pochodne za pomocą odczynnika MSTFA (N-Metyl-N- 

(trimetylsilyl)trifluoroacetamid) do poziomu 0,03 do 0,08 ng/L oraz odzysków 

wynoszących odpowiednio 87 do 108 % z wody wodociągowej oraz 86 do 

110 % z wody powierzchniowej. 

Trójfazowe HF-LPME wykorzystywane jest najczęściej do ekstrakcji 

związków posiadających właściwości kwasowe lub zasadowe. Quintana 

i współpracownicy [36] podczas swoich badań nad optymalizacją izolacji 

i wzbogacania ibuprofenu, piroksykamu, kwasu klofibrowego, bezafibratu, 

diklofenaku oraz indometacyny techniką HF-LPME testowali takie parametry 

jak: pH próbki, dodatek soli, objętość próbki, stężenie buforu i dodatek metanolu 

do fazy akceptorowej. Ponieważ wybrane do analizy związki posiadały 

właściwości kwasowe proces ich ekstrakcji w trójfazowym HF-LPME polegał 

na zakwaszeniu próbki, w której znajdowały się anality do pH 2, wskutek 

czego anality znajdowały się w formie niezdysocjowanej. Dzięki temu, miały 

one możliwość przeniknięcia przez rozpuszczalnik organiczny (1-oktanol) i 

przedostania do akceptora zasadowego (buforu węglanowego o stężeniu 10 

mM) znajdującego się wewnątrz membrany. W buforze anality uległy jonizacji 

(deprotonacji) ze względu na wysokie pH, wskutek czego zostały uwięzione 

wewnątrz membrany i nie mogły dyfundować z powrotem przez rozpuszczalnik 

do próbki. Podczas badań kinetyki ekstrakcji przy stałej prędkości 

mieszania autorzy stwierdzili, że równowaga procesu ekstrakcji osią- 

Vol. 4, No 1/2012 



gnięta została w czasie 45 minut. Czas ten był porównywalny lub krótszy z 

czasem niezbędnym do przeprowadzenia ekstrakcji SPE. Średni odzysk 

analitów po zastosowaniu optymalnej procedury ekstrakcji wynosił 93 ± 

35 % dla ścieków oczyszczonych oraz 125 ± 45 % dla ścieków surowych, 

przy czym przed wykonaniem ekstrakcji konieczne było przefiltrowanie 

próbki. Stosunkowo słaba precyzja oznaczeń spowodowana była małą objętością 

próbki. 

Zaletą zastosowania tej techniki jest jej wysoka selektywność, która 

przejawiła się brakiem efektów matrycy podczas oznaczeń 

z wykorzystaniem techniki LC-ESI-MS 2 . W literaturze można znaleźć wiele 

przykładów stosowania techniki HF-LPME do ekstrakcji farmaceutyków 

z próbek wodnych (woda kranowa, powierzchniowa, ścieki) [35-46], natomiast 

istnieje niewiele procedur wykorzystujących ją do ekstrakcji leków z 

próbek stałych (osadów ściekowych, gleby) [47-48]. 

Technika HF-LPME w porównaniu z tradycyjną ekstrakcją ciecz-ciecz 

lub popularną ekstrakcją SPE zapewnia porównywalną i zadowalającą czułość 

oznaczeń, lepsze wzbogacanie analitów, a zużycie rozpuszczalników 

jest znacznie zredukowane (nawet o kilkaset lub kilka tysięcy razy). Ponadto 

jest prosta, szybka i niedroga. Ze względu na małą objętość rozpuszczalnika 

ekstrahującego, wyodrębnione ekstrakty nie wymagają dodatkowego wzbogacania 

przed oznaczeniem końcowym, a tym samym całkowity czas analizy 

znacznie zmniejsza się w porównaniu z tradycyjną procedurą LLE. Z 

uwagi na możliwość pracy w szerokim zakresie pH, może być stosowana w 

sytuacjach, w których wykorzystanie ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub mikroekstrakcji 

do fazy stacjonarnej (SPME) byłoby niemożliwe. W niektórych 

technikach ekstrakcyjnych, np. w SPME, istnieje „efekt pamięci złoża”, w 

związku z czym istnieje konieczność kondycjonowania włókna. W przypadku 

HF-LPME problem ten jest wyeliminowany, gdyż wykorzystywane membrany 

są niedrogie i są jednokrotnego użytku. 

Podsumowanie 

Ważnym etapem oznaczenia pozostałości farmaceutyków w próbkach 

środowiskowych jest wybór odpowiedniej metody ekstrakcji, w celu izolacji 

oraz wzbogacenia analitów. Tradycyjne metody przygotowania próbek, takie 

jak LLE lub SPE, posiadają wiele wad, między innymi: zużycie dużej objętości 

próbek i toksycznych rozpuszczalników, są praco- i czasochłonne, drogie, 

mało selektywne oraz niebezpieczne dla środowiska. Współczesne 

tendencje w rozwoju metod przygotowania próbek doprowadziły z jednej 

strony do opracowywania selektywnych metod ekstrakcji, takich jak np. ekstrakcja 

z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym 

(MIP-SPE), z drugiej umożliwiły miniaturyzację aparatury do prowadzenia 

procesów przygotowania próbki, które ze względu na minimalne zużycie 

rozpuszczalników są przyjazne dla środowiska. Przykładem tego typu rozwiązań 

jest technika mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej SPME, ekstrakcja 

za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego SBSE czy mikroekstrakcja 



53 

poprzez membranę do fazy ciekłej HF-LPME. Eliminacja lub redukcja ilości 

rozpuszczalników używanych podczas etapu przygotowania próbki niesie ze 

sobą wiele korzyści, między innymi: oszczędności ekonomiczne związane z 

zakupem i utylizacją rozpuszczalników, mniejsze obciążenie środowiska 

toksycznymi rozpuszczalnikami oraz zmniejszenie ekspozycji pracowników 

laboratoryjnych na kontakt z trującymi substancjami. Omówione w niniejszej 

pracy techniki ekstrakcyjne posiadają rozwiązania technologiczne umożliwiające 

ich automatyzację, łącznie z techniką HF-LPME, której automatyzacji 

sprostał zespół badawczy pod kierownictwem prof. Pawliszyna [49]. 

Techniki te pozwalają także na oznaczanie szerokiej gamy analitów występujących 

na niskich poziomach stężeń przy zastosowaniu jednej procedury 

analitycznej. W pracy przedstawiono podstawowe informacje, dotyczące 

zastosowania technik ekstrakcji MIP-SPE, SPME, SBSE i HF-LPME do 

oznaczania pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych. Ze 

względu na aspekt ekotoksykologiczny i ekonomiczny techniki te stanowią 

interesującą alternatywę dla tradycyjnych metod ekstrakcji. 

Summary 

An important step in determination of pharmaceutical residues in environmental 

samples is the selection of a suitable extraction method in order 

to isolate and enrich analytes. Traditional methods of sample preparation, 

such as LLE or SPE, have many drawbacks including: using large volumes 

of samples and toxic solvents, being labor- and time-consuming, expensive 

and environmentally hazardous. Recent improvements in the sample preparation 

methods not only led to the development of selective extraction methods 

like Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction (MIP-SPE), but also 

enabled the miniaturization of the apparatus for conducting the sample 

preparation process which due to minimal solvent consumption are environmentally 

friendly. An example of such solutions is the technique of Solid- 

Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive Extraction or Hollow-Fiber Liquid 

Phase Microextraction. Elimination or reduction of the usage of solvents 

brings many benefits including: the economic savings associated with the 

purchase and disposal of solvents, reduced pollution with toxic solvents and 

exposure of laboratory and diminished exposure of laboratory workers to 

poisonous substances. Extraction techniques discussed in this paper are 

easy to automate, including HF-LPME, automation of which met the research 

team led by prof. Pawliszyn [49]. These techniques also allow the 

determination of a wide range of analytes presented at low concentration 

levels using a single analytical procedure. The paper presents basic information 

on the application of MIP-SPE, SPME, SBSE and HF-LPME extraction 

techniques for the determination of pharmaceutical residues in environmental 

samples. Due to the economic and ecotoxicological aspects these 

techniques are an interesting alternative to conventional extraction methods. 

Vol. 4, No 1/2012 





Badania finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, 

projekt badawczy numer N N204 260237 (2009-2012). 

Financial support was provided by the Polish Ministry of Research and 

Higher Education under grant N N204 260237 (2009-2012). 

Praca naukowa współfinansowana ze środków Europejskiego Funduszu 

Społecznego, w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytetu 

IV, projekt pt. „Program wdrożenia nowoczesnych elementów kształcenia 

w Uniwersytecie Gdańskim”, Zadanie „Stypendia naukowe dla doktorantów 

szansą na rozwój gospodarki”. 

The publication is financed from European Social Fund in as a part of the 

project " Educators for the elite - integrated training program for PhD 

students, post-docs and professors as academic teachers at University of 

Gdansk" within the framework of Human Capital Operational Programme, 

Action 4.1.1, Improving the quality of educational offer of tertiary education 

institutions. 



55 

Literatura 

(References) 

1. E. Touraud, B. Roig, J.P. Sumpter, C. Coetsier, Drug residues and 

endocrine disruptors in drinking water: Risk for humans, Int. J. Hyg. 

Envir. Heal. 214(2009)437. 

2. K. Kümmerer., The presence of pharmaceuticals in the environment 

due to human use – present knowledge and future challenges, J. 

Environ. Manag. 90(2009)2354. 

3. A.W. Garrison, J.D. Pope, F.R. Allen, 1976 – Identification and Analysis 

of Organic Pollutants In Water. Keith Ch (ed) Ann Arbor Science 

Publisher Inc, Ann. Arbor., s. 517. 

4. T.A. Ternes, Occurrence of drugs in German sewage treatment plants 

and rivers, Water Research, 32(1998)3245. 

5. D.M. Pavlović, S. Babić, A.J.M. Horvat, M. Kaštelan-Macan, Sample 

preparation in analysis of pharmaceutical, Trend. Anal. Chem. 

26(2007)1062 

6. P. Luliński, Polimery ze śladem molekularnym w naukach 

farmaceutycznych Moleculary imprinted polymers in pharmaceutical 

sciences, Polimery 55(2005)799. 

7. S. Mitra, Sample preparation techniques in analytical chemistry, John 

Wiley & Sons, New Jersey 2003. 

8. B. Sellergren (Ed.), Mollecularly Imprinted Polymers: Man-made Mimics 

of Antibodies and their Application in Analytical Chemistry, Elsevier, 

Amsterdam, 2001. 

9. I. González-Mariño, J.B. Quintana, I. Rodríguez, R. Rodil, J. González- 

Peñas, R. Cela, Comparison of molecularly imprinted, mixed-mode and 

hydrophilic balance sorbents performance in the solid-phase extraction 

of amphetamine drugs from wastewater samples for liquid 

chromatography–tandem mass spectrometry determination, J. 

Chromatogr. A 1216(2009)8435. 

10. S. Zorita, B. Boydb, S. Jönssonb, E. Yilmaz, C. Svenssona, L. 

Mathiassona, S. Bergström, Selective determination of acidic 

pharmaceuticals in wastewater using molecularly imprinted solid-phase 

extraction, Anal. Chim. Acta 626(2008)147. 

11. M. Gros, T-M. Pizzolato, M. Petrović, M.J. López de Alda, D. Barceló, 

Trace level determination of β-blockers in waste waters by highly 

selective molecularly imprinted polymers extraction followed by liquid 

chromatography–quadrupole-linear ion trap mass spectrometry, J. 

Chromatogr. A 1189(2008)347. 

12. K. Demeestere, M. Petrović, M. Gros, J. Dewulf, H. Van Langenhove, 

D. Barceló, Trace analysis of antidepressants in environmental waters 

by molecularly imprinted polymer-based solid-phase extraction followed 

by ultra-performance liquid chromatography coupled to triple 

quadrupole mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem. 396(2010)825. 

Vol. 4, No 1/2012 



13. C.L. Arthur, J. Pawliszyn, Solid phase microextraction with thermal 

desorption using fused silica optical fiber, Anal. Chem. 62(1990)2145. 

14. E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Stir Bar Sorptive 

Extraction (SBSE), a Novel Extraction Technique for Aqueous Samples: 

Theory and Principles, J. Microcolumn. Sep. 11(1999)737. 

15. S. Pedersen-Bjergaard, K. E. Rasmussen, Liquid-liquid-liquid 

microextraction for sample preparation of biological fluids prior to 

capillary electrophoresis, Anal. Chem. 71(1999)2650. 

16. P. Popp and A. Paschke, Solid phase microextraction of volatile organic 

compounds using carboxen-polydimethylsiloxane fibers, 

Chromatographia 46(1997)419. 

17. A. Banel, B. Zygmunt, Zastosowanie połączenia mikroekstrakcji do fazy 

stacjonarnej i chromatografii gazowej do oznaczania lotnych kwasów 

tłuszczowych w próbkach środowiskowych i pokrewnych Application of 

combination of solid phase microextraction and gas chromatography for 

determination of volatile fatty AIDS in environmental and releted 

samples, Ecol. Chem. Eng. S 5(2008)1. 

18. C.D. Stalikas, Y.C. Fiamegos, Microextraction combined with 

derivatization, Trend. Anal. Chem. 27(2008)6. 

19. C. Basheer, A. Jayaraman, M.K. Kee., S. Valiyaveettil, H.K. Lee, 

Polymer-coated hollow-fiber microextraction of estrogens in water 

samples with analysis by gas chromatography–mass spektrometry, J. 

Chromatogr. A 1100(2005)137. 

20. I. Rodrıguez, J. Carpinteiro, J. B. Quintana, A M. Carro, R.A. Lorenzo, 

R. Cela, Solid-phase microextraction with on-fiber derivatization for the 

analysis of anti-inflammatory drugs in water samples, J. Chromatogr. A 

1024(2004)1. 

21. M. Moedera, S. Schrader, M. Winkler, P. Popp, Solid-phase 

microextraction–gas chromatography–mass spectrometry of biologically 

active substances in water samples, J. Chromatogr. A 873(2000)95. 

22. L. Araujo, J. Wild, N. Villa, N. Camargo, D. Cubillan, A. Prieto, 

Determination of anti-inflammatory drugs in water samples, by in situ 

derivatization, solid phase microextraction and gas chromatography– 

mass spektrometry, Talanta 75(2008)111. 

23. P.C. Feitosa de Lima Gomes, J.Y. Barletta, C.E.D. Nazario, A´.l.J. 

Santos-Neto, M.A. Von Wolff, C.M. R. Coneglian, G.A. Umbuzeiro, F. 

M. Lancas, Optimization of in situ derivatization SPME by experimental 

design for GC-MS multiresidue analysis of pharmaceutical drugs in 

wastewater, J. Sep. Sci. 34(2011)436. 




chromatography–tandem mass spektrometry, J. Chromatogr. A 

1056(2004)179. 

25. L. Yang, T. Luan, C. Lan, Solid-phase microextraction with on-fiber 

silylation for simultaneous determinations of endocrine disrupting 



57 

chemicals and steroid hormones by gas chromatography–mass 

spectrometry, J. Chromatogr. A 1104(2006)23. 

26. V.K. Balakrishnan, K.A. Terry, J. Toito, Determination of sulfonamide 

antibiotics in wastewater: A comparison of solid phase microextraction 

and solid phase extraction methods, J. Chromatogr. A 1131(2006)1. 

27. P. Stepnowski, E. Synak, B. Szafranek, Z. Kaczyński, Techniki 

Separacyjne Separation Techniques, Wydawnictwo Uniwersytetu 

Gdańskiego, ISBN 978-83-7326-712-1, Gdańsk 2010. 

28. M. Kawaguchi, Y. Ishii, N. Sakui, N. Okanouchi, R. Ito, K. Inoue, K. 

Saito, H. Nakazawa, Stir bar sorptive extraction with in situ 

derivatization and thermal desorption-gas chromatography-mass 

spectrometry in the multi-shot mode for determination of estrogens in 

river water samples, J. Chromatogr. A 1049(2004)1. 

29. M. Kawaguchi, R. Ito, N. Sakui, N. Okanouchi, K. Saito, H. Nakazawa, 

Dual derivatization–stir bar sorptive extraction–thermal desorption–gas 

chromatography–mass spectrometry for determination of 17β-estradiol 

in water sample, J. Chromatogr. A 1105(2006)140. 

30. D. Bratkowska, R.M. Marcé, P.A.G. Cormack, F. Borrull, N. Fontanals, 

Development and application of a polar coating for stir bar sorptive 

extraction of emerging pollutants from environmental water samples 

Anal. Chim. Acta 706(2011)135. 

31. Y. Hu, Y. Zheng, F. Zhu, G. Li, Sol–gel coated polydimethylsiloxane/ β- 

cyclodextrin as novel stationary phase for stir bar sorptive extraction 

and its application to analysis of estrogens and bisphenol A, J. 

Chromatogr. A 1148(2007)16. 

32. A.R.M. Silva, F.C.M. Portugal, J.M.F. Nogueira, Advances in stir bar 

sorptive extraction for the determination of acidic pharmaceuticals in 

environmental water matrices. Comparison between polyurethane and 

polydimethylsiloxane polymeric phases, J. Chromatogr. A 

1209(2008)10. 

33. M. Ramos-Payán, M.Á. Bello López, R. Fernández-Torres, J.L. Pérez 

Bernal, M.C. Mochón, HPLC determination of ibuprofen, diclofenac and 

salicylic acid using hollow fiber-based liquid phase microextraction (HF- 

LPME); Anal Chim Acta 653(2009)184. 

34. C. Basheer, A. Jayaraman, M.K. Kee, S. Valiyaveettil, H.K. Lee, 

Polymer-coated hollow-fiber microextraction of estrogens in water 

samples with analysis by gas chromatography–mass spectrometry, J. 

Chromatogr. A 1100(2005)137. 

35. J.B. Quintana, R. Rodil, T. Reemtsma, Suitability of hollow fibre liquidphase 

microextraction for the determination of acidic pharmaceuticals in 

wastewater by liquid chromatography–electrospray tandem mass 

spectrometry without matrix effects, J. Chromatogr. A 1061(2004)19. 

36. J. Zhang, H.K. Lee, Application of dynamic liquid-phase microextraction 

and injection port derivatization combined with gas chromatography– 

mass spectrometry to the determination of acidic pharmaceutically 

active compounds in water samples, J. Chromatogr. A 1216(2009)7527. 

Vol. 4, No 1/2012 



37. Z. Es´haghi, Determination of widely used non-steroidal antiinflammatory 

drugs in water samples by in situ derivatization, 

continuous hollow fiber liquid-phase microextraction and gas 

chromatography-flame ionization detector, Anal. Chim. Acta 

641(2009)83. 

38. M. Ramos Payán, M.A. Bello López, R. Fernández-Torres, M. Callejón 

Mochón, J.L. Gómez Ariza, Application of hollow fiber-based liquidphase 

microextraction (HF-LPME) for the determination of acidic 

pharmaceuticals in wastewaters, Talanta 82(2010)854. 

39. C. Basheer, J. Lee, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, H.K. Lee, 

Simultaneous extraction of acidic and basic drugs at neutral sample pH: 

A novel electro-mediated microextraction approach, J. Chromatogr. A 

1217(2010)6661. 

40. Y. Wu, B. Hu, Simultaneous determination of several phytohormones in 

natural coconut juice by hollow fiber-based liquid–liquid–liquid 

microextraction-high performance liquid chromatography, J. 

Chromatogr. A 1216(2009)7657. 

41. S. Zorita, T. Barri, L. Mathiasson, A novel hollow-fibre microporous 

membrane liquid–liquid extraction for determination of free 4- 

isobutylacetophenone concentration at ultra trace level in environmental 

aqueous samples, J. Chromatogr. A 1157(2007)30. 

42. Y. Tao, J.-F. Liu, X.-L. Hu, H.-C. Li, T. Wang, G.-B. Jiang, Hollow fiber 

supported ionic liquid membrane microextraction for determination of 

sulfonamides in environmental water samples by high-performance 

liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1216(2009)6259. 

43. A. Esrafili, Y. Yamini, S. Shariati, Hollow fiber-based liquid phase 

microextraction combined with high-performance liquid chromatography 

for extraction and determination of some antidepressant drugs in 

biological fluids, Anal. Chim. Acta 604(2007)127. 

44. T.S. Ho, T. Vasskog, T. Anderssen, E. Jensen, K.E. Rasmussen, S. 

Pedersen-Bjergaard, 25,000-fold pre-concentration in a single step with 

liquid-phase microextraction, Anal. Chim. Acta 592(2007)1. 

45. S. Zorita, P. Hallgren, L. Mathiasson, Steroid hormone determination in 

water using an environmentally friendly membrane based extraction 

technique, J. Chromatogr. A 1192(2008)1. 

46. M. Ramos Payan, M. A. Bello López, R. Fernandez-Torres, M. Villar 

Navarro, M. Callejon Mochon, Hollow fiber-based liquid phase 

microextraction (HF-LPME) for a highly sensitive HPLC determination of 

sulfonamides and their main metabolites, J. Chromatogr. B 

879(2011)197-204. 

47. E. Sagristá , E. Larsson, M. Ezoddin, M. Hidalgo, V. Salvadó , J. Å. 

Jönsson, Determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in 

sewage sludge by direct hollow fiber supported liquid membrane 

extraction and liquid chromatography–mass spectrometry, J. 

Chromatogr. A 1217(2010)6153. 



59 

48. A. Saleh, E. Larsson, Y. Yamini, JÅ. Jönsson, Hollow fiber liquid phase 

microextraction as a preconcentration and clean-up step after 

pressurized hot water extraction for the determination of non-steroidal 

anti-inflammatory drugs in sewage sludge, J. Chromatogr. A 

1218(2011)1331. 

49. G. Ouyang, W. Zhao, J. Pawliszyn, Automation and optimization of 

liquid-phase microextraction by gas chromatography, J. Chromatogr. A 

1138(2007)47. 

Vol. 4, No 1/2012 


xxx



Magda CABAN*, Anna MICHALAK, Jolanta KUMIRSKA 


Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka, 

Zakład Analizy Środowiska, 

ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk, 

e-mail: magdac@chem.univ.gda.pl 

Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i 

β-agonistów w próbkach środowiskowych 

Streszczenie: Duża konsumpcja leków z grup β-blokerów i β-agonistów, niepełny metabolizm 

oraz niecałkowite usuwanie w oczyszczalniach ścieków sprawiają, że pozostałości tych farmaceutyków 

są często wykrywane w próbkach środowiskowych, szczególnie w ekosystemach 

wodnych. Pomimo, iż stężenia tych związków nie są wysokie, stanowią one realne zagrożenie 

dla ekosystemu wodnego oraz zdrowia człowieka. Do oszacowania stopnia zanieczyszczenia 

środowiska tymi farmaceutykami oraz do oceny ryzyka ekotoksykologicznego wykorzystywane 

są metody chromatografii cieczowej i gazowej z detekcją masową. Obie te techniki wymagają 

wstępnej izolacji z próbek środowiskowych oraz wzbogacenia analitów powyżej granicy oznaczalności 

użytej metody analitycznej. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu ekstrakcję do 

fazy stałe. Trwają również prace na wykorzystaniem technik mikroekstrakcji. Poniższa praca 

przedstawia metody oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych. 

Słowa kluczowe: β-blokery, β-agoniści, chromatografia gazowa, chromatografia cieczowa, 

spektrometria mas, analiza pozostałości farmaceutyków w środowisku, ekstrakcja do fazy stałej 

Methods of separation and determination of β-blockers and 

β-agonist residues in environmental samples 

Abstract: High consumption of β-blockers and β-agonists drugs, exhaustive metabolism and 

incomplete removal in wastewater treatment plants make these pharmaceutical most frequently 

detected in environmental samples, especially in the water ecosystem. Although the concentrations 

of these compounds are not high, they represent a real risk to the aquatic ecosystem and 

human health. To estimate the degree of pollution and ecotoxicological risk assessment, gas 

and liquid chromatography with mass detection methods are used. Both 

of these techniques require the isolation and pre-concentrate of analytes from environmental 

matrices. Most commonly used is solid-phase extraction, although microextraction techniques 

are tested and adapted. The presented work provides a summary of methods for determining 

β-blockers and β-agonists in environmental samples. 

Key words: β-blockers and β-agonists, gas chromatography, liquid chromatography, mass 

spectrometry, analysis of residues of pharmaceuticals, solid-phase extraction

62 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska 

1. Farmaceutyki jako zanieczyszczenia środowiska 

(Pharmaceuticals as environmental pollution) 

Farmaceutyki to stosunkowo nowe zanieczyszczenia środowiska, których 

obecność, szczególnie w ekosystemach wodnych, jest coraz częściej 

notowana. Pomimo iż ich poziomy stężeń tych związków nie są wysokie 

(rzędu ng/l do μg/l), mogą one stanowić realne zagrożenie dla organizmów 

wodnym i glebowych. Fakt ten potwierdzają badania modelowe QSAR (ang. 

Quantitative Structure – Activity Relationship models), które wykazują efekt 

toksykologiczny farmaceutyków na niektóre organizmy (m.in. Daphnia 

magna, Synechococcus leopoliensis) w stężeniach oznaczanych w środowisku 

[1]. Istnieje niewiele danych na temat toksyczności długoterminowej 

farmaceutyków, stąd badania takie muszą być nadal kontynuowane [2]. 

Obecność tych substancji w wodzie pitnej sprawia, że stanowią one realne 

zagrożenie także dla zdrowia człowieka. Należy podkreślić, że metabolity 

leków oraz produkty ich rozkładu, powstające w procesach oczyszczania 

ścieków lub podczas uzdatniania wody pitnej mogą potencjalnie zwiększać 

ich właściwości toksykologiczne [3]. 

Doniesienia literaturowe wskazują, że farmaceutyki oznaczane są 

głównie w ściekach, wodach odprowadzanych z oczyszczalni ścieków (zarówno 

miejskich jaki i przemysłowych), wodach powierzchniowych, gruntowych 

oraz odciekach ze składowisk odpadów [4]. Monitorować należy zarówno 

miejsca przedostawania się farmaceutyków do środowiska jak i ich 

drogi rozprzestrzeniania się w ekosystemie. Ważnym aspektem badań naukowych 

jest analiza losów środowiskowych farmaceutyków, m.in. podatność 

na rozkład pod wpływem mikroorganizmów, światła, wody, uleganie 

procesom sorpcji do gleb czy osadów. Zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej 

(Dyrektywa 2001/83/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 6 

listopada 2001 r. w sprawie wspólnotowego kodeksu odnoszącego się do 

produktów leczniczych stosowanych u ludzi, Dz. U. L 311 z 28.11.2001) 

badania te są wymagane dla leków wprowadzanych dopiero do użytku [5]. 

Przepisy te zalecają przeprowadzenie takiej oceny także dla farmaceutyków 

obecnych już na rynku, szczególnie, gdy ich produkcja i zużycie jest bardzo 

wysokie. Taką właśnie grupę leków stanowią β-blokery i β-agoniści. 

2. Charakterystyka β-blokerów i β-agonistów oraz ich losy 

środowiskowe 

(Characteristics of β-blockers and β-agonists and their 

environmental fate) 

β-blokery i β-agoniści będące tematem niniejszej pracy (Tabela 1), 

należą do grupy leków nie tylko często przepisywanych pacjentom, ale także 

powszechnie wykrywanych w środowisku. Stosowane są do leczenia chorób 

cywilizacyjnych, których częstość występowania (także w Polsce) stale 

wzrasta. β-blokery są stosowane w kardiologii, m.in. do leczenia choroby 

Vol. 4, No 1/2012 


Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów… 

63 

niedokrwiennej serca, arytmii, nadciśnienia tętniczego oraz guza 

chromochłonnego rdzenia nadnerczego [6, 7]. Wykorzystywane są także 

w terapii stanów lękowych, drżeń, jaskry, bólów migrenowych oraz nadczynności 

tarczycy [8]. β-blokery wykazują właściwości dopingujące [9]. Pomimo, 

iż widnieją na liście substancji zabronionych często stosowane są przez 

sportowców jako środki wspomagające [9, 10]. 

Pierwszym lekiem należącym do grupy β-blokerów (β-adrenolityków) 

wprowadzonym do lecznictwa w połowie lat 60 XX wieku był propranolol 

(Tabela 1) [6, 7]. Obecnie stosowanych jest ponad 20 β-blokerów 

o podobnej strukturze oraz właściwościach fizykochemicznych. Należy podkreślić, 

iż β-blokery charakteryzują się zróżnicowaną polarnością. 

Na Rysunku 1 przedstawiono wybrane leki z omawianej grupy, uszeregowane 

według wzrastającej lipofilowości. 

Lipofilowość 

Lipophilicity 

atenolol, nadolol, acebutolol, metoprolol, pindolol, propranolol 

Rys 1. Uszeregowanie wybranych β-blokerów względem lipofilowości. 

Fig 1. The order of selected β-blockers against to lipophilicity. 

Leki z grupy β-agonistów (β-adrenomimetyczne) od bardzo dawna 

wykorzystywane są do leczenia astmy oskrzelowej. Jako pierwsza - w 1903 

roku - do lecznictwa wprowadzona została epinefryna (adrenalina) [11]. 

Obecnie na 75%-ach recept przepisywanych pacjentom chorującym na to 

schorzenie widnieją leki β-adrenomimetyczne. Najczęściej podaje się 

je w postaci inhalacji. Salbutamol i terbutalina (Tabela 1) podobnie jak leki 

β-adrenolityczne wykazują działanie dopingujące [12]. 

Tabela 1. Charakterystyka wybranych β-blokerów i β-agonistów 

Table 1. Characteristics of selected β-blockers and β-agonists 

Związek 

Compound 

Wzór strukturalny Związek 

Structure 

Compound 

β-blokery 

β-blocers 

Wzór strukturalny 

Structure 

Acebutolol 

336,43 g/mol 

pK a 9,2 

Nadolol 

309,40 g/mol 

pK a 9,7 

Atenolol 

266,34 g/mol 

pK a 9,6 

Pindolol 

248,32 g/mol 

pK a 9,7 

Vol. 4, No 1/2012 



Metoprolol 

267,36 g/mol 

pK a 9,7 

Propranolol 

259,34 g/mol 

pK a 9,5 

β-agoniści 

β-agonists 

Salbutamol 

239,31 g/mol 

pK a 10,3 

Terbutalina 

225,28g/mol 

pK a 10,1 

W latach 1999-2001 odnotowano 50% wzrost przepisywania omawianych 

leków przez francuskich lekarzy. Na przykład w 1999 roku we Francji 

zużyto 35 ton propranololu [13]; podaż tego farmaceutyku wciąż rośnie. 

Szacuje się, że łączne spożycie atenololu i metoprololu w krajach europejskich 

przekracza 80% ogólnej ich konsumpcji. 

Skuteczność usuwania β-blokerów i β-adrenomimetyków w procesach 

oczyszczania ścieków nie jest zadowalająca. Przykładem jest acebutolol, 

którego usunięcie możliwe jest w 64%. Atenolol usuwany jest w 76%, natomiast 

metoprolol jedynie w 10% [14]. W oczyszczonych ściekach stwierdza 

się powszechnie obecność także propranololu i nadololu (0,117±0,318 μg/l i 

0,074±0,204 μg/l) [15]. Najlepsze metody usuwania tych związków to ozonowanie 

oraz zaawansowane procesy utleniania (UV/H 2 O 2, O 3 /H 2 O 2, UV/O 3 ) 

[19]. Warto dodać, że żadna metoda eliminacji nie jest skuteczna w 100%. 

Analizy wód gruntowych wykazują obecność metoprololu, sotalolu 

i bisoprololu (od 10 do 560 ng/l) [16]. W wodach powierzchniowych najczęściej 

wykrywany jest: metoprolol, propranolol, nadolol, atenolol, sotalol oraz 

betaxolol. Do tej pory istnieje niewiele danych dotyczących oceny stopnia 

zanieczyszczenia lekami nasercowymi i przeciwastmatycznymi obszaru 

Polski. Analiza wody rzeki Warty wykazała obecność atenololu 

i metoprololu w stężeniu ppt [17], podczas gdy ilość propranololu była 

poniżej granicy wykrywalności (IDL, ang. Instrumental Detection Limit, 0,05 

μg/l). 

β-blokery i β-adrenomimetyki są związkami biologicznie aktywnymi 

w środowisku. W wyniku procesu fotodegradacji, biotransformacji oraz 

sorpcji ulegają przemianie i rozkładowi [18]. Głównym czynnikiem 

wpływającym na fotodegradację β-blokerów i β-adrenomimetyków jest 

intensywność promieniowania słonecznego związana z porą roku oraz 

szerokością geograficzną [19]. Badania przeprowadzane z użyciem 

wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC) (ang. High- 

Performance Liquid Chromatography) z detektorem UV-VIS dowiodły, 

że β-blokery i β-adrenomimetyki najszybciej ulegają degradacji latem, zaś 

najwolniej zimą. Według danych literaturowych czas potrzebny na 

fototransformację propranololu w okresie letnim wynosi 1,3 dnia, zaś zimą - 

Vol. 4, No 1/2012 



65 

16,8 dnia. Stwierdzono również, że rozkład hydrolityczny propranalolu 

zachodzi stosunkowo szybko, gdyż czas połowicznego rozpadu jest równy 

16 godzin [20]. Dla atenololu i metoprololu czas ten jest o wiele dłuższy i 

wynosi odpowiednio 350 i 630 godzin [20]. 

Leki nasercowe i przeciwastmatyczne w środowisku naturalnym ulegają 

również degradacji pod wpływem mikroorganizmów [21]. Proces ten 

zachodzi dłużej niż fotodegradacja, gdyż propranolol ulega biodegradacji 

w ciągu 6 - 26 dni, zaś atenolol w ciągu 14 - 120 dni [18]. Omawiane związki 

są optycznie czynne. Nie wpływa to na ich działanie farmakologiczne, ale 

może mieć istotny wpływ na ich losy środowiskowe. 

3. Metody oznaczania pozostałości β-blokerów 

i β-agonistów w próbkach środowiskowych 

(Methods for determining of β-blockers and β-agonists 

residues in environmental samples) 

Spośród wszystkich metod analitycznych stosowanych do oznaczania 

β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych najważniejszą rolę 

odgrywają techniki chromatograficzne [22]. Do niedawna wykorzystywano 

głównie chromatografię cieczową połączoną ze spektrometrią mas lub tandemową 

spektrometrią mas [15-18, 21, 26-31, 36-38]. W chwili obecnej coraz 

częściej pomiary wykonuje się za pomocą techniki GC/MS [22-23, 25, 

31,33-35]. W związku z podobną strukturą oraz zbliżonymi właściwościami 

chemicznymi bardzo często obie te grupy leków oznaczane są jednocześnie 

[17, 26, 29, 31]. Przed oznaczeniem wymagane jest jednak wstępne przygotowanie 

próbki. 

3.1. Techniki izolacji i wzbogacania 

(Isolation and concentration techniques) 

W skład próbek środowiskowych wchodzą zarówno związki organiczne 

jak i nieorganiczne, zróżnicowane pod względem polarności. 

Ze względu na bardzo niskie stężenia omawianych związków w środowisku, 

przed przystąpieniem do oznaczenia konieczna jest ich izolacja 

z matrycy pierwotnej oraz wzbogacanie w celu osiągnięcia odpowiedniej 

granicy wykrywalności i oznaczalności [34]. Chociaż stężenia tych leków 

w ściekach są znacznie wyższe (rzędu μg/l) niż w wodach powierzchniowych 

(około ng/l) analizy ekstraktów z takich matryc są znacznie trudniejsze 

(bardziej czaso- i pracochłonna procedura optymalizacji warunków ekstrakcji 

i wzbogacania). Z kolei podczas oznaczania farmaceutyków w wodach powierzchniowych 

proces ekstrakcji jest stosunkowo prosty, ale niskie stężenia 

analitów wymagają stosowania efektywnych procesów wzbogacania. 

Najczęściej wykorzystywaną techniką ekstrakcji β-blokerów 

i β-agonistów z wodnych próbek środowiskowych jest ekstrakcja do fazy 

stałej (SPE) (ang. Solid-Phase Extraction) [26, 28-30, 34-41]. Trwają także 

prace nad wykorzystaniem SPE w trybie on-line (ekstrakcja przeprowadzana 

Vol. 4, No 1/2012 



jest w układzie przepływowym tuż przed analizą końcową) [21, 42, 43]. W 

tym celu stosuje się modyfikację dozownika typu zaworu z pętlą. Izolację 

wykonuje się również stosując ekstrakcję w skali mikro [44, 46] w tym 

mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) (ang. Solid Phase Microextraction) 

[46]. Ekstrakcję z próbek stałych przeprowadza się także przy pomocy techniki 

ciecz-ciecz (LLE) (ang Liquid-Liquid Extraction) [23]. 

3.1.1. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) 

(Solid-phase extraction (SPE)) 

Pierwotnie jako złoże do ekstrakcji β-blokerów i β-agonistów stosowana 

była krzemionka zmodyfikowana ugrupowaniami oktadecylowymi [39]. 

Jednak szybko została ona zastąpiona przez adsorbenty 

z kopolimeru polistyrenu i diwinylobenzenu (PS-DVB) [40], które są stabilne 

w większym zakresie pH oraz bardziej odporne mechanicznie. Złoże takie 

charakteryzuje się znacznie lepszymi właściwościami sorpcyjnymi dla polarnych 

analitów, jakimi są β-blokery i β-agoniści. W celu zwiększenia selektywności 

może być ono dodatkowo zmodyfikowane, na przykład grupami 

jonowymiennymi. W ten sposób tworzy się układ mieszany, gdzie proces 

adsorpcji jest wynikiem działania oddziaływań jonowych i niejonowych. Kolumienką 

ekstrakcyjną działającą na zasadzie złoża kationowymiennego jest 

złoże Strata-X-C (firmy Phenomenex) oraz Oasis-MCX (firmy Waters). Gdy 

w trakcie produkcji do złoża PS-DVB dodawany jest monomer o właściwościach 

polarnych można zwiększyć siłę wiązania związków polarnych. Przykładem 

takiej modyfikacji jest wprowadzenie winylopirolidonu do kopolimeru 

polistyrenu i diwinylobenzenu, w wyniku czego powstaje złoże Strata-X 

(firmy Phenomenex) oraz Oasis HLB (firmy Waters). Kolumienki Oasis HLB 

są obecnie powszechnie stosowane do jednoczesnej ekstrakcji wielu grup 

leków, w tym β-blokerów i β-agonistów [27, 29-30, 41]. Z kolei złoża Oasis 

MCX są używane do selektywnej ekstrakcji farmaceutyków o właściwościach 

zasadowych [32, 37-38]. 

W Tabeli 2 przedstawiono przykładowe procedury ekstrakcji omawianych 

leków z wodnych próbek środowiskowych. Izolację leków 

z użyciem kolumienki Oasis HLB wykonywano przy różnym pH próbki (od 3 

do 10,5) [13-14, 18, 44]. Anality występowały wówczas zarówno w formie 

zjonizowanej (gdy pH próbki było poniżej punktu pK a analitów, Tabela 1) jak 

i obojętnej (pH próbki powyżej punktu pK a analitów). Przy pH 3 zaobserwowano 

niewielki odzyski dla metoprololu i propranololu (odpowiednio 42% i 

57%). Najwyższą skuteczność ekstrakcji β-blokerów uzyskano przy pH od 7 

do 10,5, co świadczy o tym, że wartość pH próbki nie musi przekraczać 

wartości pK a β-blokerów, aby osiągnąć wysoką efektywność procesu ekstrakcji 

do fazy stałej [13-14, 44]. 

Izolacja analitów za pomocą złoża Oasis MCX wymaga, aby występowały 

one w formie zjonizowanej. Ponieważ omawiane związki należą do 

grupy słabych zasad, pH próbki należy doprowadzić do pH poniżej punktu 

pKa analitów, (Tabela 1). Najczęściej pH doprowadzane jest do wartości 

Vol. 4, No 1/2012 



67 

poniżej 3 [18, 28, 30]. Z kolei do wymywania analitów należy użyć roztworu 

zasady w rozpuszczalniku organicznym (stosuje się głównie 5% roztwór 

NH 4 OH w MeOH).Odzysk analitów mieści się w przedziale 40 - 95% (z wyłączeniem 

pindololu, dla którego wynosi poniżej 10 %) [17, 27, 30]. Sytuacja 

wygląda podobnie w przypadku zastosowania kolumienek Oasis HLB. 

Tabela 2. Przykładowe etapy ekstrakcji na wybranych kolumienkach SPE 

Table 2. Examples of extraction steps on selected SPE cartridges 

Etap ekstrakcji 

Extraction step 

Kondycjonowanie 

Conditioning 

Nanoszenie próbki 

Sample loading 

Przemywanie 

Flushing 

Wymywanie 

Elution 

C18 – EC 

[31] 

3 x 2 ml heksan 

3 x 2 ml MeOH 

1 ml H 2O 

o pH = 7,5 

pH = 7,5 

V = 1000 ml 

ścieki 

oczyszczone 

treated 

wastewater 

Brak 

4 x 1 ml MeOH 

Rodzaj kolumienki 

Type of cartidges 

Oasis HLB 

[14] 

2 ml heksan, 

2 ml aceton, 

10 ml metanol, 

10 ml wody 

pH = 10 

woda gruntowa 

ground water 

2 ml 5% MeOH 

4 ml MeOH 

Oasis HLB 

[32] 

Brak 

no step 

pH = 8 

V = 500 ml 

ścieki 

nieoczyszczo 

-ne 

raw 

wastewater 

Brak 

no step 

5 ml MeOH 

Oasis MCX 

[17] 

2 ml MeOH 

2 ml H 2O 

o pH = 2,1 

pH = 3 

V= 1000 ml 

woda 

powierzchniowa 

surface water 

2 ml 2% 

HCOOH w 

H 2O 

1 ml MeOH, 

2 ml 5% 

NH 4OH w 

MeOH 

Odzyski bezwzględne i względne (względem dodanego wzorca) β-blokerów 

uzyskane podczas ekstrakcji próbek ścieków nieoczyszczonych 

i oczyszczonych z zastosowaniem kolumienek Oasis MCX zamieszczono 

w Tabeli 3. Wartości odzysków bezwzględnych są niewielkie w porównaniu 

z wartościami względnymi, szczególnie w przypadku analizy ścieków nieoczyszczonych. 

Spowodowane jest to negatywnym wpływem składników 

matrycy na wydajność ekstrakcji, a także problemami z analizą ilościową 

techniką LC-MS, wynikającą z supresji jonów w źródle, która może sięgać 

nawet 80%. 

Vol. 4, No 1/2012 



Tabela 3. Wartości odzysków bezwzględnych i względnych β-blokerów 

z próbek ścieków nieoczyszczonych i oczyszczonych (SD - 

odchylenie standardowe) [28] 

Table 3. Absolute and relative recoveries of β-blockers from raw and 

treated wastewater (SD - standard deviation) [28] 

Związek 

Compound 

Ścieki nieoczyszczone 

Raw wastewater 

Odzysk 

względny 

Relative 

recovery 

% (SD) 

Odzysk 

bezwzględny 

Absolute 

recovery 

% (SD) 


Treated wastewater 

Odzysk 

bezwzględny 

Absolute 

recovery 

% (SD) 

Odzysk 

względny 

Relative 

recovery 

% (SD) 

Atenolol 20 (2) 111 (4) 40 (1) 99 (3) 

Metoprolol 16 (1) 82 (4) 64 (2) 83 (6) 

Nadolol 43 (2) 94 (5) 59 (1) 77 (8) 

Propranolol 20 (2) 104 (4) 76 (5) 99 (2) 

3.1.2. Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME) 

(Solid phase microextraction (SPME)) 

Ilość prac dotyczących izolacji i wzbogacania β-blokerów techniką 

mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) jest bardzo ograniczona [46, 47], a dla 

β-adrenomimetyków brakuje ich zupełnie. Badania przeprowadzone m. in. 

dla atenololu, pindololu i propranololu dowiodły, że włókno MIP (ang. 

Molecularly Imprinted Polymer) jest efektywniejsze niż NIP (ang. Non- 

Imprinted Polymer) (Rys. 1) [46], gdyż na pierwszym z nich ilość zaabsorbowanego 

analitu była dwukrotnie wyższa. Podczas przeprowadzonych badań 

testowano również włókna PA (poliakrylan), PDMS (polidimetylosiloksan) 

i PDMS/DVB (kopolimer polidimetylsiloksanu z diwinylobenzenem) [46], 

jednak uzyskane wydajności ekstrakcji były dużo niższe, co eliminuje możliwość 

zastosowania tego typu włókna do wydzielania β-blokerów. 

3.2. Metody oznaczeń końcowych 

(Final determination methods) 

3.2.1. Chromatografia cieczowa 

(Liquid chromatography) 

Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas jest jedną 

z najpopularniejszych metod oznaczania ilościowego i jakościowego leków 

nasercowych i przeciwastmatycznych [14, 18, 21, 26-31]. Analizy z użyciem 

innych detektorów, takich jak spektrofotometryczny UV lub fluorescencyjny 

charakteryzują się wyższymi granicami oznaczalności (LOQ, ang. Limit of 

Quantification), z tego względu są rzadko stosowane [47]. Rozdzielenie analitów 

zachodzi na kolumnach działających w odwróconym układzie faz, najczęściej 

na złożu C18 [26, 28-30, 48] z elucją gradientową, podczas której 

zmienia się ilościowy stosunek fazy ruchomej A do fazy ruchomej B. Detek- 

Vol. 4, No 1/2012 



69 

cja analitów prowadzona jest w trybie SIM (ang. Selective Ion Monitoring), 

MRM (ang. Multiple Reaction Monitoring) lub SRM (ang. Selected Reaction 

Monitoring). Do jonizacji związków wykorzystuje się technikę elektrorozpraszania 

(ESI, ang. Electrospray Ionization). Nową techniką oznaczania tych 

leków jest ultraszybka chromatografia cieczowa (UPLC) (ang. Ultra Performance 

Liquid Chromatography) z detekcją masową [18], z tym, że ze 

względu na wysoki koszt aparatury oraz problemy z uzyskaniem prawidłowych 

kształtów sygnałów chromatograficznych wynikających z niekontrolowanych 

efektów termicznych związanych z tarciem fazy ruchomej o ziarna 

wypełnienia kolumny (lub strukturę porowatą w przypadku kolumn monolitycznych), 

jest niezbyt często stosowana. Granice oznaczalności są porównywalne 

do uzyskiwanych z wykorzystaniem standardowej chromatografii 

cieczowej, jednak po zoptymalizowaniu warunków rozdzielenia chromatograficznego 

analiza staje się szybsza i zużywane są mniejsze ilości organicznych 

rozpuszczalników. 

3.2.2. Chromatografia gazowa 

(Gas chromatography) 

Chromatografia gazowa (GC, ang. Gas Chromatography) to technika 

rozdzielania, która ze względu na niższe koszty oraz korzystniejsze parametry 

rozdzieleń chromatograficznych jest coraz częściej wykorzystywana 

do analizy β-blokerów i β-agonistów. Polarny charakter analitów sprawia, że 

przed analizą GC niezbędne jest przeprowadzenie analizowanych związków 

w postać lotnych pochodnych. Pochodne omawianych leków tworzą się 

szybko i są stabilne termicznie. Ze względu na podobną budowę chemiczną 

β-blokerów i β-adrenomimetyków z powodzeniem mogą być równocześnie 

przeprowadzane w lotne pochodne [31]. 

Rozdzielenie leków nasercowych i przeciwastmatycznych przeprowadza 

się głównie na fazach stacjonarnych średniopolarnych, które składają 

się z 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu (kolumny: HP5ms, DB5ms, XTI-5) 

[31, 44, 49-53]. Sporadycznie analizy wykonuje się na fazie niepolarnej zawierającej 

metylopolisiloksan (kolumna HP-ULTRA-1) [33]. Aby osiągnąć 

niskie granice wykrywalności i oznaczalności próbki wprowadza się do dozownika 

ogrzanego do temperatury od 230–280°C najczęściej bez dzielenia 

strumienia (tryb splitless). Rozdział przeprowadza się stosując program 

temperaturowy, przy czym początkowa temperatura mieści się w zakresie 

50–150°C, natomiast końcowa w przedziale 280–320°C. 

Do oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych 

stosowany jest prawie wyłącznie detektor masowy. Jak dotąd brakuje doniesień 

naukowych o zastosowaniu detektorów bardziej selektywnych – fosforowo-azotowego 

(NPD) (ang. Nitrogen Phosphorus Detector) oraz wychwytu 

elektronów (ECD) (ang. Electron Capture Detector). Drugi z wymienionych 

detektorów mógłby być stosowany po przeprowadzeniu analitów w pochodne 

z bezwodnikami kwasów perfluorowanych. 

Vol. 4, No 1/2012 



3.2.2.1. Derywatyzacja 

(Derivatization) 

Spośród wszystkich metod derywatyzacji najczęściej korzysta się z 

trimetylosililowania za pomocą MSTFA (N-metylo-N-trimetylosililo-trifluoroacetamid) 

[49, 51-52] lub BSTFA (N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid) 

[44]. Reakcję prowadzi się najczęściej w temperaturze 60°C w czasie 30 min 

w obecności katalizatora – 33% TMCS (trimetylochlorosilanu). Przykładową 

reakcję metoprololu z odczynnikiem sililującym BSTFA przedstawiono na 

Rysunku 2. Produktem jest lotna pochodna zawierająca w grupie hydroksylowej 

zamiast atomu wodoru grupę trimetylosililową (TMS) (metoprolol O- 

TMS). Dla innych przedstawicieli β-blokerów i β-agonistów tworzą się podobnie, 

podstawione przy atomie tlenu pochodne O-TMS. Jedynie w nielicznych 

przypadkach (jak dla pindololu) możliwe jest tworzenie się pochodnych, 

w których grupa TMS przyłącza się do atomu azotu (pochodne N-TMS) [53]. 

Rys. 2. Schemat reakcji sililowania metoprololu z zastosowaniem odczynnika BSTFA. 

Fig. 2. Metoprolol silylation reaction scheme using BSTFA. 

Można także przeprowadzić sililowanie przy pomocy MTBSTFA (Ntert-butylodimetylosililo-N-metylotrifluoroacetamidu). 

Uzyskuje się wówczas 

pochodne tert-butylodimetylosililowe (pochodne O- i N-TBDMS) [50]. Otrzymywanie 

acetylowych pochodnych leków nasercowych i przeciwastmatycznych 

ogranicza się do zastosowania jako reagenta PFPA (bezwodnika 

kwasu pentafluoropropionowego) w obecności octanu etylu (PFPA: octan 

etylu, 1:1, v/v) [34]. Wykorzystywana jest także derywatyzację sekwencyjną 

z użyciem MSTFA i MBTFA (N-metylo-bis(trifluoroacetamidu) [31]. Pierwszy 

etap tej procedury przebiega z odczynnikiem sililującym. Następnie próbkę 

schładza się, dodaje odczynnik acylujący i ponownie inkubuje. 

Do derywatyzacji β-blokerów i β-agonistów stosowane są także innego 

rodzaju odczynniki spochadniające (np. HMDS, TMSI, TFAA). Porównania 

metod derywatyzacji tych dwóch grup leków dokonano w publikacji 

[53]. 

Vol. 4, No 1/2012 


Tabela 4. Oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych z wykorzysta-.. 

niem techniki GC-MS oraz LC-MS 

Table 4. Determination of β-blockers and β-agonists in environmental samples by GC-MS.. 

and LC-MS technique 

Związki 

Compound 

Metoprolol 

Nadolol 

Propranolol 

Salbutamol 

Terbutalina 

Acebutolol 

Metoprolol 

Nadolol 

Pindolol 

Propranolol 

Salbutamol 

Terbutalina 

Matryca / Kolumna SPE 

Matrix / SPE cartridge 



C18-EC 



Oasis MCX 

Oznaczenie końcowe 

Final determination 

Derywatyzacja: 

MSTFA/MBTFA; GC/MS 

Kolumna: XTI – 5 (30 m x 

0,25 mm x 25 µm) 

Temp. dozownika: 230°C w 

trybie splitless 

Program temp: 2 min w 

50°C, 16°C/min do 180°C, 

4°C/min do 290°C, 7 min w 

temp. 290°C 

LC-MS/MS (SRM) 

Kolumna: SB-C8 (125 mm x 

2,1 mm x 5 µm) 

Faza A: H2O: ACN: HCOOH ( 

94,5:5:0,5, v/v), 

Faza B: ACN: HCOOH 

(99,5:0,5, v/v/v) 

Przepływ: 200 µl/min 

Odzysk 

Recovery 

[%] 

98 

125 

97 

42 

30 

95 

91 

88 

< 5 

91 

87 

81 

LOD/LO 

Q [ng/l] 

25/bd 

25/bd 

25/bd 

25/bd 

50/bd 

9/bd 

8/bd 

9/bd 

bd 

10/bd 

6/bd 

Bd 

Lit. 

31 

27 


71 

3.3. Przykładowe metody oznaczania β-blokerów i β-agonistów w 

próbkach środowiskowych 

(Exemplary methods of the β-blockers and β-agonists 

determination in environmental samples) 

Informacje dotyczące metod oznaczania β-blokerów i β-agonistów w 

próbkach środowiskowych technikami GC-MS oraz LC-MS przedstawiono w 

Tabeli 4. 

Vol. 4, No 1/2012 


Atenolol 

Metoprolol 

Propranolol 

Atenolol 

Metoprolol 

Propranolol 

Salbutamol 

Atenolol 

Acebutolol 

Metoprolol 

Nadolol 

Pindolol 

Propranolol 

Atenolol 

Metoprolol 

Nadolol 

Salbutamol 

Terbutalina 



Oasis HLB 

Woda powierzchniowa 

Surface water 

Oasis MCX 

Ścieki nieczyszczone 

Raw wastewater 

Oasis MCX 

Woda powierzchniowa 

Surface water 

C18-EC 

LC/MS 

Kolumna: RP-C18 (250 mm x 

2 mm x 5 µm) 

Faza A: 20 mmol NH3 w 900 

ml wody zakwaszony kwasem 

octowym do pH = 5,7 i 100 ml 

ACN, Faza B: 40% eluentu A i 

60% ACN 


UPLC/MS 


1 mm x 1,7 µm) 

Faza A : H2O, MeOH, 

CH3COOH (94,5: 5: 0,5, 

v/v/v), 

Faza B: MeOH, CH3COOH 

(99,5: 0,5, v/v) 


LC/MS/MS 


4,6 mm x 5 µm) 

Faza A: H2O, bufor 

HCOONH4 o pH= 3,8, Faza B: 

ACN 


LC/MS 


3 mm x 5 µm) 

Faza A: H2O, ACN 

zawierający 5 mmoli NH4OAc 

o pH = 7,5 

i 10 % ACN, Faza B: 40% 

fazy A i 60% ACN 


112 

42 

57 

90 

55,4 

40 

88,2 

68 

68 

62 

60 

10 

66 

98 

98 

114 

61 

22 

bd/10 – 20 

bd/10 – 20 

bd/10 – 20 

0,2/1 

0,1/0,5 

0,1/0,5 

0,1/0,5 

0,3/bd 

0,4/bd 

0,5/bd 

0,3/bd 

0,3/bd 

0,2/bd 

bd/5 

bd/5 

bd/5 

bd/5 

bd/10 

18 

17 

30 

26 


Vol. 4, No 1/2012 



73 

4. Podsumowanie 

Analityka farmaceutyków w próbkach środowiskowych rozwija się w 

szybkim tempie. Dzięki temu coraz więcej leków (w tym β-blokerów i β-agonistów) 

występujących w środowisku na niskich poziomach stężeń może 

zostać wykryta i oznaczona. Spowodowane jest to z jednej strony znaczącym 

postępem w opracowaniu efektywnych technik ekstrakcji farmaceutyków, 

z drugiej - rozwojem metod analitycznych, szczególnie chromatografii 

cieczowej i chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrem mas 

(układy LC-MS; LC-MS/MS; GC-MS i GC-MS/MS). Zwiększona niezawodność 

oznaczeń wynika przede wszystkim z możliwości zastosowania trybu 

MRM, zwłaszcza podczas analizy próbek wieloskładnikowych. Dzięki temu 

analityka β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych na poziomach 

stężeń ng/l, nie jest kłopotliwa, pod warunkiem, że anality zostały właściwie 

wyizolowane, oczyszczone i wzbogacone. 

Najpopularniejszą techniką izolacji β-blokerów i β-agonistów z wodnych 

próbek środowiskowych jest ekstrakcja do fazy stałej (SPE). β-Blokery i 

β-agoniści są związkami o charakterze zasadowym, zatem mogą być selektywnie 

wychwytywane za pomocą złóż kationowymiennych (np. Strata-X-C, 

Oasis MCX), bądź łącznie z innymi polarnymi związkami z użyciem uniwersalnych 

sorbentów kopolimerycznych (m.in. Strata-X, Oasis HLB). Odzysk β- 

blokerów i β-agonistów z użyciem obu rodzajów złóż jest zadowalający, 

także podczas analizy próbek ścieków. Należy podkreślić, że w literaturze 

prezentowany jest najczęściej odzysk względny, podczas gdy wartość odzysku 

bezwzględnego, szczególnie w przypadku ścieków nieoczyszczonych, 

może być znacznie niższa. 

Duża wartość odzysku nie musi się łączyć z wystarczającym stopniem 

oczyszczenia próbki, stąd mogą pojawić się problemy z analizą ilościową i 

jakościową β-blokerów i β-agonistów w uzyskanych ekstraktach. Negatywne 

efekty matrycowe ujawniają się znacznie częściej w przypadku stosowania 

chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas wyposażonym 

w źródło jonów ESI, niż przy użyciu techniki GC-MS lub GC-MS/MS. 

W związku z tym, zainteresowanie analityków środowiskowych kieruje 

się w stronę chromatografii gazowej z detekcją masową, ponieważ w źródle 

jonów EI efekt supresji jonów praktycznie nie występuje. Ponadto kolumny 

analityczne stosowane w chromatografii gazowej charakteryzują się większymi 

zdolnościami rozdzielczymi niż używane w technice HPLC, a chromatograf 

gazowy może być wyposażony w bardziej czułe i selektywne detektory, 

np. ECD i NPD. Dodatkową korzyścią jest ograniczenie ilości zużywanych 

rozpuszczalników organicznych. 

Zastosowanie chromatografii gazowej wiąże się jednak z koniecznością 

derywatyzacji polarnych analitów. Podczas analizy β-blokerów i β-agonistów 

nie stanowi to jednak problemu gdyż powszechnie dostępny odczynnik 

sililujący BSTFA efektywnie przekształca anality w lotne pochodne, także 

w próbkach środowiskowych. 

Vol. 4, No 1/2012 



Stosując technikę GC-MS oraz LC-MS do oznaczania β-blokerów i β- 

agonistów wykazano ich powszechną obecność w wielu komponentach środowiska. 

Informacje te służą do badania dróg rozprzestrzeniania się tych 

farmaceutyków w ekosystemie, ich stężeń w poszczególnych jego komponentach 

oraz do oceny ryzyka ekotoksykologicznego. W Polsce prowadzone 

są także prace mające na celu usprawnienie analityki tych polarnych zanieczyszczeń 

środowiska oraz oszacowanie ryzyka środowiskowego. 

Summary 

Analytics of pharmaceuticals in environmental samples is developing 

quickly. Thus more drugs (including ß-blockers and ß-agonists) occurring in 

the environment at low concentration levels can be detected and identified. 

This is due to significant progress in developing efficient extraction 

techniques for pharmaceutical as well as the development of analytical 

methods, especially liquid chromatography and gas chromatography with 

mass spectrometer (LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS and GC-MS/MS). 

Increased reliability of determinations results mainly from the possibility to 

use the MRM mode, especially when complex samples are analysed. In this 

way determination of ß-blockers and ß-agonist in environmental at 

concentration levels of ng/L is not troublesome, but analytes have to be 

properly isolated, purified and enriched. 

The most popular technique for isolation of ß-blockers and ß-agonists 

from aqueous environmental samples is solid-phase extraction (SPE). These 

drugs can be selectively trapped by cation-exchange sorbents because of 

their basic character (e.g. Strata-XC, Oasis MCX) or together with other 

polar compounds using the universal copolymer sorbents (including Strata- 

X, Oasis HLB). Recoveries of ß-blockers and ß-agonists with usage of both 

types of sorbents are satisfactory, also for wastewater samples. It should be 

emphasized that recovery is usually presented in relative way. Absolute 

recovery, especially obtained for raw sewage, may be much lower. 

High level of recovery does not have to be associated with sufficient 

sample purification, so there may be problems with quantitative and 

qualitative ß-blockers and ß-agonists analysis. Negative matrix effects show 

up more often in cases of using liquid chromatography coupled with mass 

spectrometer equipped with an ESI ion source, than with usage of GC-MS or 

GC-MS/MS techniques. 

Therefore, environmental analysts’ interest is directed toward the gas 

chromatography with mass detection, because in the EI ion source ion 

suppression practically does not occur. In addition, analytical columns used 

in gas chromatography are characterized by larger separation ability than 

those used in HPLC. Further gas chromatograph can be equipped with more 

sensitive and selective detectors such as ECD and NPD. An additional 

benefit is reduced amount of organic solvent. 

Although gas chromatography involves the necessity of derivatization 

of polar analytes, derivatization of ß-blockers and ß-agonists analysis is not 

Vol. 4, No 1/2012 



75 

a problem. Commonly available silylating reagent BSTFA effectively 

converts the analytes into volatile derivatives, also in environmental 

samples. 

Using the GC-MS and LC-MS techniques for ß-blockers and ß- 

agonists determination can demonstrate common presence of these 

pharmaceuticals in various components of the environment. This knowledge 

can be useful in studying the spread of these pharmaceuticals in the 

ecosystem and accessing the ecotoxicological risk. Also in Poland we are 

working on improving the analysis of polar environmental pollution and 

estimating the risk caused by them. 



Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego 

w ramach projektu badawczego numer N N204 260237 (2009-2012) oraz 

DS 8110-4-0085-1. 

Literatura 

(References) 

1. B.I. Escher, N. Brama, M. Richter, J. Lineret, Comparative 

ecotoxicological hazard assessment of beta-blockers and their human 

metabolites using a mode-of-action-based test battery and QSAR 

approach, Environ. Sci. Technol., 40(2006)7402-7408. 

2. L.H.M.L.M. Santos, A.N. Araújo, A. Fachini, A. Pena, C. Delerue-Matos, 

M.C.B.S.M. Montenegro, Ecotoxicological aspects related to the 

presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. J. Hazard. 

Mater., 175(2010)45-95. 

3. B.I. Escher, K. Fenner, Recent Advances in Environmental Risk 

Assessment of Transformation Products, Environ. Sci. Technol., 

45(2011)3835–3847. 

4. D. Fatta-Kassinos, S. Meric, A. Nikolaou, Pharmaceutical residues in 

environmental waters and wastewater: current state of knowledge and 

future research., Anal. Bioanal. Chem., 399(2011)251–275. 

5. C. Carlsson, A.K. Johansson, G. Alvan, K. Bergman, T. Kühler, Are 

pharmaceuticals potent environmental pollutants Part II: 

Environmental risk assessments of selected pharmaceutical excipients., 

Sci. Total Environ., 364(2006)67-87. 

6. H. Byrtus, G. Chłoń, M. Gorczyca, B. Łucka-Sobstel, B. Malawska, 

J. Obniska, M. Pawłowski, A. Zejc, “Chemia leków dla studentów 

farmacji i farmaceutów”, Chemistry of drugs for pharmacy students and 

pharmacists, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2002. 

7. A. Danysz, R. Gryglewski, pod red., „Farmakologia podręcznik dla 

studentów medycyny”, Pharmacology handbook for medical students, 

Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 1977. 

Vol. 4, No 1/2012 



8. W. Kostowski, S.Z. Herman, pod red., „Farmakologia: podstawy 

farmakologii podręcznik dla studentów medycyny i lekarzy”, 

Pharmacology: Basic pharmacology handbook for students of medicine 

and doctor, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2008. 

9. www.antydoping.pl/plik/2009/File/2009/01/lista_zabroniona_wada_2010 

_pl.pdf 

10. W. Buczko, T.F. Krzemiński, S.J. Czuczwar, „Farmakologia Goodmana 

& Gilmana”, Farmacology of Goldman & Gilman, tom I, Czelej, Lublin, 

2007. 

11. J.K. Podlewski, A. Chwalibogowska-Podlewska, „Leki współczesnej 

terapii, Encyklopedia dla lekarzy i farmaceutów”, Drugs of contemporary 

treatment, Encyclopedia for doctors and pharmacists, wydanie XX, tom 

I i II, Medical Tribune Polska, Warszawa, 2010. 

12. C. Jiménez, R. Ventura, X. de la Torre, J. Segura, Strategies for internal 

quality control in antidoping analyses, Anal. Chim. Acta, 460(2002)389- 

307. 

13. C. Miège, M. Favier, C. Brosse, J. Canler, M. Coquery, Occurence of 

betablockers In effluents of wastewater treatment plants from the Lyone 

area (France) and risk assessment for the downstream rivers, Talanta, 

70(2006)739-744. 

14. N.M. Vieno, T. Tuhkanen, L. Kronberg, Analysis of neutral and basic 

pharmaceuticals in sewage treatment plants and in recipient rivers 

using solid phase extraction and liquid chromatography–tandem mass 

spectrometry detection, J. Chromatogr. A, 1134(2006)101–111. 

15. D.B. Huggett, I.A. Khan, C.M. Foran, D. Schlenk, Determination of betaadrenergic 

receptor blocking pharmaceutical in United States 

wastewater effluent, Environ. Poll., 121(2003)199–205. 

16. F. Sacher, F.T. Lange, H. Brauch, I. Blankenhorn, Pharmaceuticals in 

groundwaters: Analytical methods and results of a monitoring program 

in Baden-Württemberg, Germany, J. Chromatogr. A, 938(2001)199– 

210. 

17. B. Kasprzyk-Hordern, R.M. Dinsdale, A.J. Guwy, Multi-residue method 

for the determination of basic/neutral pharmaceuticals and illicit drugs in 

surface water by solid-phase extraction and ultra performance liquid 

chromatography–positive electrospray ionisation tandem mass 

spectrometry, J. Chromatogr. A, 1161(2007)132–145. 

18. A.C. Alder, C. Schaffner, M. Majewsky, J. Klasmeier, K. Fenner, Fate of 

β-blocker human pharmaceuticals in surface water: Comparison of 

measured and simulated concentrations in the Glatt Valley Watershed, 

Switzerland, Water Res., 44(2010)936-948. 

19. R. Andreozzi, M. Raffaele, P. Nicklas, Pharmaceuticals in STP effluents 

and their solar photodegradation in aquatic environment, Chemosphere, 

50(2003)1319–1330. 

20. Q.T. Liu, H. Williams, Kinetics and degradation products for direct 

photolysis of β-blockers in water, Environ. Sci. Technol., 41(2007)803- 

810. 

Vol. 4, No 1/2012 



77 

21. R.A. Trenholm, B.J. Vanderford, S.A. Snyder, On-line solid phase 

extraction LC-MS/MS analysis of pharmaceuticals indicator in water: 

A green alternative to conventional methods, Talanta, 79(2009)1425- 

1432. 

22. S. Weigel, R. Kallenborn, H. Hühnerfuss, Simultaneous solid-phase 

extraction of acidic, neutral and basic pharmaceuticals from aqueous 

samples at ambient (neutral) pH and their determination by gas 

chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1023(2004)183- 

195. 

23. E. Pujos, C. Cren-Olivé, O. Paisse, M.M. Flament-Waton, M.F. Grenier- 

Loustalot, Comparison of the analysis of β-blockers by different 

techniques, J. Chromatogr. B, 877(2009)4007–4014. 

24. R. Andreozzi, M. Raffaele, P. Nicklas, Pharmaceuticals in STP effluents 

and their solar photodegradation in aquatic environment, Chemosphere, 

50(2003)1319–1330. 

25. T.A. Ternes, Analytical methods for the determination of 

pharmaceuticals in aqueous environmental samples, Trends Anal. 

Chem., 8(2001)419-434. 

26. H. Lee, K. Sarafin, T.E. Peart, Determination of β-blockers and β 2 - 

agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid 

chromatography–tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. 

A, 1148(2007)158–167. 

27. M.D. Hernando, M. Petrovic, A.R. Fernández-Alba, D. Barceló, Analysis 

by liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass 

spectrometry and acute toxicity evaluation for β-blockers and lipidregulating 

agents in wastewater samples, J. Chromatogr. 

A, 1046(2004)133–140. 

28. M. Scheurer, M. Ramil, C.D. Metcalfe, S. Groh, T.A. Ternes, The 

challenge of analyzing beta-blocker drugs in sludge and wastewater, 

Anal. Bioanal. Chem., 396(2009)845-856. 

29. A. Piram, A. Salvador, J. Gauvrit, P. Lanteri, R. Faure, Development 

and optimisation of a single extraction procedure for the LC/MS/MS 

analysis of two pharmaceutical classes residues in sewage treatment 

plant, Talanta, 74(2008)1463–1475. 

30. T.A. Ternes, R. Hirsch, J. Mueller, K. Haberer, Methods for the 

determination of neutral drugs as well as betablockers and β 2 - 

sympathomimetics in aqueous matrices using GC/MS and LC/MS/MS, 

J. Anal. Chem., 362(1998)329-340. 

31. S.L. MacLeod, P. Sudhir, C.S. Wong, Stereoisomer analysis of 

wastewater-derived β-blockers, selective serotonin re-uptake inhibitors, 

and salbutamol by high-performance liquid chromatography–tandem 

mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1170(2007)23–33. 

32. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, „Przygotowanie 

próbek środowiskowych do analizy”, Preparation of environmental 

samples for analysis, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 

2000. 

Vol. 4, No 1/2012 



33. M.K. Angier, R.J. Lewis, A.K. Chaturvedi, D.V. Canfield, Gas 

Chromatographic/Mass Spectrometric Differentiation of Atenolol, 

Metoprolol, Propranolol, and an Interfering Metabolite Product of 

Metoprolol, J. Anal. Toxicol., 29(2005)517–521. 

34. M. Kostopoulou, A. Nikolaou, Analytical problems and the need for 

sample preparation in the determination of pharmaceuticals and their 

metabolites in aqueous environmental matrices, Trends Anal. Chem., 

27(2008)1023-1035. 

35. D. Fatta, A. Nikolaou, A. Achilleos, S. Meriç, Analytical methods for 

tracing pharmaceutical residues in water and wastewater, Trends Anal. 

Chem., 26(2007)515-533. 

36. D.B. Huggett, I.A. Khan, C.M. Foran, D. Schlenk, Determination of betaadrenergic 

receptor blocking pharmaceutical in United States 

wastewater effluent, Environ. Poll., 121(2003)199–205. 

37. J. Stevens-Garmon, J.E. Drewes, S.T. Khan, J.A. McDonald, E.R.V. 

Dickenson, Sorption of emerging trace organic compounds onto 

wastewater sludge solids, Water Res., 45(2011)3417-3426. 

38. K.J. Bisceglia, J.T. Yu, M. Coelhan, E.J. Bouwer, A.L. Roberts, Trace 

determination of pharmaceuticals and other wastewater-derived 

micropollutants by solid phase extraction and gas 

chromatography/mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 217(2010)558– 

564. 

39. M. Gros, T.M. Pizzolato, M. Petrović, M.J.L. de Alda, D. Barceló, Trace 

level determination of β-blockers in waste waters by highly selective 

molecularly imprinted polymers extraction followed by liquid 

chromatography-quadrupole-linear ion trap mass spectrometry, 

J. Chromatogr. A, 1189(2008)374-384. 

40. S. Castiglioni, R. Bagnati, D. Calamari, R. Fanelli, E. Zuccato, 

A multiresidue analytical method using solid-phase extraction and highpressure 

liquid chromatography tandem mass spectrometry to measure 

pharmaceuticals of different therapeutic classes in urban wastewaters, 

J. Chromatogr. A, 1092(2005)206-215. 

41. R. Rodil, J.B. Quintana, P. López-Mahía, S. Muniategiu-Lorenzo, 

D. Prada-Rodríguez, Multi-residue analytical method for the 

determination of emerging pollutants in water by solid-phase extraction 

and liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. 

A, 1216(2009)2958-2969. 

42. J. Bones, K. Thomas, P.N. Nesterenko. B. Paull, Dual gradient LC 

method for the determination of pharmaceutical residues in 

environmental samples using a monolithic silica reversed phase 

column, Talanta, 70(2006)1117-1128. 

43. R.S. Kadam, U.B. Kompella, Cassette analysis of eight beta-blockers in 

bovine eye sclera, choroid-RPE, retina and vitreous by liquid 

chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. 

B, 877(2009)253-260. 

Vol. 4, No 1/2012 



79 

44. C. Basheer, J. Lee, S. Petersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, H.K. Lee, 

Simultaneous extraction of acidic and basic drugs at neutral sample pH: 

a novel electro-mediated microextraction approach, J. Chromatogr. 

A, 1217(2010)6661-6667. 

45. M. Moeder, S. Schrader, M. Winkler, P. Popp, Solid-phase 

microextraction–gas chromatography–mass spectrometry of biologically 

active substances in water samples, J. Chromatogr. A, 873(2000)95- 

105. 

46. X. Hu, J. Pan, Y. Hu, G. Li, Preparation and evaluation of propranolol 

molecularly imprinted solid-phase microextraction fiber for trace 

analysis of β-blockers in urine and plasma samples, J. Chromatogr. 

A, 1216(2009)190-197. 

47. V. Ranta, E. Toropainen, A. Talvitie, S. Auriola, A. Urtti, Simultaneous 

determination of eight β-blockers by gradient high-performance liquid 

chromatography with combined ultraviolet and fluorescence detection in 

corneal permeability studies in vitro, J. Chromatogr. B, 772(2002)81-87. 

48. B. Yilmaz, S. Arslan, V. Akba, Gas chromatography–mass spectrometry 

method for determination of metoprolol in the patients with 

hypertension, Talanta, 80(2009)346–351. 

49. M.J. Paik, D.T. Nguyen, K.R. Kim, GC and MS Properties of β-Blockers 

as tert-Butyldimethylsilyl Derivatives and as Ethoxyxarbonyl/ 

Trimethylsilyl Derivatives, Chromatogr., 64(2006)673-679. 

50. L. Damasceno, R. Ventura, J. Ortuño, J. Segura, Derivatization 

procedures for the detection of β 2 -agonists by gas 

chromatographic/mass spectrometric analysis, J. Mass Spectrom., 

35(2000)1285–1294. 

51. G. Forsdahl , T. Geisendorfer, G. Gnneiner, Identification of isopropyl 

substituted β-blocking agents in human urine by gas chromatography 

and tandem mass spectrometry, Chromatogr., 57(2003)519-524. 

52. W. Liu, L. Zhang, Z. Wei, S. Chen, G. Chen, Analysis of β-agonists and 

β-blockers in urine using hollow fibre-protected liquid-phase 

microextraction with in situ derivatization followed by gas chromatography/mass 

spectrometry, J. Chromatogr. A,1216(2009)5340–5346. 

53. M. Caban, P. Stepnowski, M. Kwiatkowski, N. Migowska, J. Kumirska, 

Determination of β-blockers and β-agonists using gas chromatography 

and gas chromatography-mass spectrometry- a comparative study of 

the derivatization step, J. Chromatogr. A, 1218(2011)8110-8122. 

Vol. 4, No 1/2012 



PRACE ORYGINALNE 

(ORIGINAL PAPERS)



Monika Waksmundzka-Hajnos, Anna Oniszczuk*, Rafał Podgórski 

Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny, 

Katedra Chemii, Zakład Chemii Nieorganicznej, 

ul. Chodźki 4A, 20-093 Lublin, 

*e-mail: aoniszczuk@o2.pl 

Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność 

izolacji wybranych furanokumaryn z owoców gorysza 

wyniosłego (Peucedanum verticillare) 

Streszczenie: Analiza materiału roślinnego jest ważnym zadaniem w poszukiwaniu roślin o 

działaniu farmakologicznym a także w standaryzacji leków roślinnych. Celem każdego procesu 

ekstrakcji jest szybka i skuteczna izolacja związków z matrycy przy użyciu minimalnej ilości 

rozpuszczalnika. Celem przedstawionej pracy był wybór optymalnych warunków do analizy 

materiału roślinnego oraz zbadanie wpływu metody ekstrakcji na wydajność izolacji niektórych 

furanokumaryn z owoców gorysza wyniosłego. Furanokumaryny mają istotne zastosowanie w 

lecznictwie. Są między innymi wykorzystywane w terapii bielactwa i łuszczycy oraz leczeniu 

skórnego T-komórkowego chłoniaka z erytmodermią. 

Zastosowano następujące metody ekstrakcyjne: wyczerpująca ekstrakcja w aparacie Soxhleta, 

ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze 20 i 60 ◦ C oraz ekstrakcja wspomagana 

mikrofalami w układzie otwartym i zamkniętym. Analiza została przeprowadzona metodą wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej z detektorem UV/VIS. Wyniki wskazują, że najwyższą 

wydajność imperatoryny uzyskano w wyniku ekstrakcji ultradźwiękowej 60 ◦ C, natomiast metodą 

najskuteczniejszą do izolacji umbeliferonu okazała się ekstrakcja mikrofalowa w układzie zamkniętym. 

Słowa kluczowe: furanokumaryny, gorysz wyniosły, ekstrakcja ciało stałe – ciecz, 

wysokosprawna chromatografia cieczowa 

Influence of the extraction type on the yield of some 

furanocoumarins from Peucedanum verticillare fruits 

Abstract: Analysis of plant material is an important task in chemotaxonomical investigations, 

particularly, in search of plants with pharmacological activity or in standardisation of plant drugs. 

The goal of every extraction process is rapid and effective isolation of compounds from a matrix 

by use of minimum amount of solvent. The aim of this paper was the choice of optimal conditions 

for the analysis of plant material and effect of extraction method on the yield of some 

furanocoumarins from Peucedanum verticillare fruits. Furanocoumarins have important uses in 

human medicine and exhibit toxicity against a wide range of organisms. This group of compounds 

reveal pharmacological activity. They are important drugs in vitiligo and psoriaris therapy 

and are also used in therapy erythrodermic variants of cutaneous T-cell lymphoma and 

chronic graft-versus-host disease. 

The following extraction methods were used in our experiments: exhaustive extraction in Soxhlet 

apparatus, ultrasound- assisted solvent extraction (USAE) at 20 and 60 ◦ C as well as microwave-assisted 

solvent extraction in open and closed system (MASE). Target compounds analysis 

was performed by high performance liquid chromatography with UV/VIS detector. The results 

indicated that, the highest yield of imperatorin can be obtained by ultrasonification at 60 ◦ C, 

while microwave-assisted solvent extraction in closed system is very efficient in the extraction of 

umbelliferone. 

Keywords: furanocoumarins, peucedanum verticillare, solid-liquid extraction, high performance 

liquid chromatograph

84 M. Waksmundzka-Hajnos, A. Oniszczuk, R. Podgórski 

1. Wstęp 


W całym toku analizy wstępna obróbka surowców jest jednym z bardziej 

czasochłonnych procesów, a szczególnie dotyczy to próbek stałych [1]. 

Techniki ekstrakcyjne nie są bezpośrednio metodami analizy ilościowej, 

ale mają duże znaczenie jako metody przygotowania próbek do analizy. 

Ekstrakcja rozpuszczalnikiem stałej próbki, powszechnie znana jako ekstrakcja 

ciało stałe - ciecz (LSE liquid - solid extraction) lub ługowanie jest 

procesem, jakiemu poddaje się na początku analizowany materiał. Celem 

każdej techniki ekstrakcyjnej jest szybkie i efektywne wyizolowanie pożądanych 

substancji z matrycy, przy użyciu jak najmniejszej ilości rozpuszczalników 

[2]. 

Przedmiotem niniejszych badań były wybrane furanokumaryny pochodzące 

z owoców gorysza wyniosłego (Peucedanum verticillare). Związki kumarynowe 

stanowią rozpowszechnioną w świecie roślinnym grupę metabolitów 

wtórnych, szeroko stosowanych w lecznictwie. Ważne właściwości lecznicze 

posiadają zwłaszcza furanokumaryny. Jest to tzw. działanie fotosensybilizujące, 

wykorzystywane w leczeniu bielactwa nabytego skóry (vitiligo), znane 

już przed setkami lat przez Egipcjan i Indian [3]. Poza działaniem fotouczulającym 

kumaryny posiadają zdolność hamowania syntezy DNA, co w skojarzeniu 

z promieniowaniem UV (324–400 nm i 232–325 nm) wykorzystuje się 

w leczeniu łuszczycy (psoriasis). Spora grupa furanokumaryn wykazuje aktywność 

przeciwgrzybiczną oraz bakteriostatyczną [4, 5]. 

Aktywność biologiczna i farmakologiczna kumaryn jest bardzo zróżnicowana 

i uzależniona od ich struktury chemicznej. W leczeniu chorób układu krążenia 

wykorzystuje się działanie rozkurczające naczynia wieńcowe, obniżające 

ciśnienie krwi oraz stężenie cholesterolu i lipidów we krwi, tonizujące naczynia 

włosowate. Niektóre kumaryny posiadają właściwości blokowania kanałów 

wapniowych w mięśniu sercowym oraz w naczyniach obwodowych 

[4-7]. 

Właściwości spazmolityczne opisywanej grupy związków są wykorzystywane 

w schorzeniach dróg żółciowych. Działają one ponadto żółciopędnie 

i żółciotwórczo. Niektóre z nich posiadają aktywność przeciwbólową, 

przeciwzapalną, przeciwobrzękową i przeciwgorączkową, co związane jest z 

hamującym wpływem na cyklooksygenazę. 

Badania prowadzone w ostatnich latach ujawniły immunosupresyjne, 

diuretyczne [4, 8] oraz ochronne na wątrobę działanie kumaryn. Znane jest 

również działanie kumaryn na OUN. Niektóre z nich (np. 4-metylo-7-hydroksy-8-piperydyno-metylokumaryna) 

działają pobudzająco na ośrodkowy 

układ nerwowy, inne (angelicyna) wykazują działanie sedatywne i hipnotyczne 

[4, 6, 9]. 

Należy również wspomnieć, iż związki te, a zwłaszcza furanokumaryny i 

piranokumaryny, pełnią funkcję ochronną dla roślin [6]. 

W procesie ekstrakcji/ługowania metabolitów wtórnych z materiału 

roślinnego stosowanych jest wiele technik tradycyjnych jak: perkolacja, eks- 

Vol. 4, No 1/2012 


Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność izolacji wybranych… 

85 

trakcja w aparacie Soxhleta, ekstrakcja metodą ogrzewania na łaźni wodnej 

pod chłodnicą zwrotną. Obecnie coraz częściej spotykane są prace z wykorzystaniem 

do tego celu technik nowoczesnych takich jak: ekstrakcja wspomagana 

mikrofalami (MASE), ultradźwiękami (USAE), technika z wymuszonym 

przepływem rozpuszczalnika (ASE lub PLE) czy też ekstrakcja cieczą w 

stanie nadkrytycznym (SFE) oraz ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika 

próbki zmieszanej z wypełniaczem (MSPD) [10-12]. 

Celem niniejszej pracy było porównanie metod ekstrakcyjnych takich 

jak: ekstrakcja w aparacie Soxhleta, ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami 

w temperaturze 20 C i 60 C oraz ekstrakcja wspomagana mikrofalami w 

układzie otwartym i zamkniętym w odniesieniu do wybranych furanokumaryn 

pochodzących z owoców gorysza wyniosłego pod kątem wydajności ekstrakcji, 

powtarzalności wyników, czasu i zużycia rozpuszczalników. 

2. Część eksperymentalna 

(The experimental part) 

2.1. Materiały i odczynniki 

(Materials and reagents) 

Dojrzałe owoce gorysza wyniosłego zebrano w Ogrodzie Farmakognostycznym 

UM w Lublinie. Wzorce kumaryn: umbeliferon i imperatorynę 

zakupiono w firmie Fluka, Buchs, Szwajcaria. Eter naftowy oraz metanol do 

przeprowadzenia ekstrakcji (cz.d.a) pochodziły z firmy POCh, Gliwice, 

Polska, metanol do chromatografii z firmy E. Merck, Darmstadt, Niemcy. 

2.2. Metodyka 

(Methodology) 

2.2.1. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta 

(Soxhlet extraction) 

Odważono 10 g surowca, umieszczono w gilzie z bibuły filtracyjnej i 

poddano wyczerpującej ekstrakcji eterem naftowym w aparacie Soxhleta w 

czasie 15 godzin, a następnie wyczerpującej ekstrakcji metanolem (tę samą 

porcję surowca) również w czasie 15 godzin. 

Uzyskane eterowe i metanolowe ekstrakty odparowano do sucha na 

wyparce próżniowej, a następnie rozpuszczono w metanolu i przeniesiono 

do kolbek miarowych o pojemności 100 ml i poddano analizie HPLC. 

Vol. 4, No 1/2012 



2.2.2. Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze 

pokojowej / w temperaturze 60 C. 

(Ultrasound assisted extraction at room temperature / at 60 C) 

Odważono 5 g surowca, umieszczono w kolbie stożkowej ze szlifem, 

zalano 100 ml eteru naftowego i umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 30 

min; po tym czasie ekstrakt odsączono. Ekstrakcję powtórzono jeszcze dwa 

razy, zalewając surowiec takimi samymi, świeżymi porcjami eteru naftowego. 

Uzyskane eterowe i metanolowe ekstrakty przefiltrowano, odparowano 

do sucha na wyparce próżniowej, a następnie rozpuszczono w metanolu 

i przeniesiono do kolbek miarowych o pojemności 100 ml i poddano 

analizie HPLC. 

2.2.3. Ekstrakcja wspomagana mikrofalami (mikrofale otwarte) 

(Microwave assisted extraction- open microwave) 

Odważono 2 g surowca, umieszczono w naczyniu ekstrakcyjnym i 

zalano 20 ml 80% metanolu w wodzie. Ekstrakcję prowadzono w trzech 

etapach w aparacie Plasmotronika, Uni Clever, BMZ – 1 (Wrocław) o mocy 

600 W: 

- etap pierwszy obejmował ekstrakcję przy 40% mocy generatora, pod 

ciśnieniem atmosferycznym, w ciągu 1 minuty, 

- etap drugi obejmował ekstrakcję przy 60% mocy generatora, pod 

ciśnieniem atmosferycznym, w ciągu 30 minut, 

- etap trzeci to 10 minut oczekiwania. 

Ekstrakt przefiltrowano i uzupełniono metanolem w kolbce miarowej do 

objętości 50 ml i poddano analizie HPLC. 

2.2.4. Ekstrakcja wspomagana mikrofalami (mikrofale zamknięte) 

(Microwave assisted extraction- closed microwave) 

Odważono 2 g surowca, umieszczono w naczyniu ekstrakcyjnym i 

zalano 20 ml 80% metanolu. Ekstrakcję prowadzono w trzech etapach: 

- etap pierwszy obejmował ekstrakcję przy 40% mocy generatora, pod 

ciśnieniem 17–20 atm, w ciągu 1 minuty, 

- etap drugi obejmował ekstrakcję przy 60% mocy generatora, pod 

ciśnieniem 27–30 atm, w ciągu 30 minut, 

- etap trzeci to 10 minut oczekiwania. 

Ekstrakt przefiltrowano i uzupełniono metanolem w kolbce miarowej do 

objętości 50 ml i poddano analizie HPLC. 

2.2.5. Chromatografia analityczna 

(Chromatographic analysis) 

Wysokosprawną chromatografię cieczową stosowano w celu kontroli 

składu izolowanych frakcji (analiza jakościowa) jak też w celu analizy ilo- 

Vol. 4, No 1/2012 



87 

ściowej wybranych kumaryn w ekstraktach roslinnych. Stosowano odwrócone 

układy faz RP-18 / metanol + woda, w systemie gradientowym oraz 

metodę wzorca zewnętrznego [13]. 

Rodzielenie chromatograficzne kumaryn przeprowadzono w temperaturze 

25 C przy użyciu chromatografu Shimadzu LC-10 AT VP HPLC z detektorem 

UV/VIS i dozownikiem próbki Rheodyne 20 μm, na kolumnie Suprelcosil 

TM LC-18 – 150 x 4.6mm, d p = 5 μm. Zastosowano gradient fazy 

ruchomej (woda + metanol: 0-10 min – 45% MeOH, 10-20 min – 45-55% 

MeOH, 20-30 min – 55-70% MeOH, 30-40 min – 70% MeOH) oraz metodę 

wzorca zewnętrznego stosując wzorce substancji oznaczanych – umbeliferonu 

i imperatoryny i wyznaczając krzywe kalibracyjne. Identyfikacja i pomiar 

pików przebiegały przy długości fali λ = 254 nm. Oznaczanie jakościowe 

przeprowadzono chromatograficznie oraz poprzez porównanie widm UV z 

widmami wzorców. Widma dla poszczególnych kumaryn były uzyskiwane 

metodą „stop-flow” w trakcie trwania analizy. 

Współczynniki regresji R 2 wszystkich krzywych kalibracyjnych wzorców były 

większe niż 0,999 (R 2 > 0,9990). Zakresy stężeń krzywych wzorcowych wynosiły: 

dla umbeliferonu 0,0001 mg/ml - 0,01 mg/ml, dla imperatoryny 0,01 

mg/ml - 1 mg/ml. 

Dokładność zastosowanych metod ekstrakcyjnych była sprawdzona za pomocą 

odzysków badanych substancji. Do próbek przed analizą dodano 

znane ilości roztworów wzorcowych (3 stężenia), a następnie przeprowadzono 

takie same czynności jak przy ekstrakcji próbek nie fortyfikowanych 

roztworami wzorców. Wykonano 3 powtórzenia dla każdego stężenia 

wzorca. Odzyski dla zastosowanych metod ekstrakcyjnych były w granicach 

95.34 - 102.00% i 92.67% - 95.65% odpowiednio dla umbeliferonu i imperatoryny. 

3. Wyniki i dyskusja 

(Results and discussion) 

Do izolacji furanokumaryn z owoców gorysza wyniosłego zastosowano 

następujące metody ekstrakcyjne: ekstrakcja w aparacie Soxhleta, 

ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze 20 C i 60 C oraz 

ekstrakcja wspomagana mikrofalami w układzie otwartym i zamkniętym. 

Wyniki, zebrane w tabeli 1 wskazują, iż dobre rezultaty daje ekstrakcja ultradźwiękowa 

w 60 C – metoda prosta i możliwa do zastosowania w wielu laboratoriach. 

Najwięcej imperatoryny wyizolowano właśnie przy zastosowaniu 

ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami w podwyższonej temperaturze 

(60 C), najmniej natomiast podczas ekstrakcji wyczerpującej w aparacie 

Soxhleta. 

Z zastosowanych metod największy stopień odzysku umbeliferonu 

dawała ekstrakcja wspomagana mikrofalami w układzie zamkniętym, następnie 

USAE w 60 C, ekstrakcja w aparacie Soxhleta, USAE w 20 C i na 

końcu MASE w układzie otwartym. 

Vol. 4, No 1/2012 



Dla gorysza obserwujemy opisany już wcześniej przy pasternaku i 

arcydzięglu efekt działania mikrofal w układzie zamkniętym [10, 11]. W 

pierwszym etapie przeprowadzonego eksperymentu zastosowano dwie 

opcje ekstrakcji wspomaganej mikrofalami, a mianowicie MASE w układzie 

zamkniętym i w układzie otwartym. Wydajność ekstrakcji w układzie otwartym 

była dla imperatoryny wyższa niż w układzie zamkniętym. Możliwe jest, 

że podczas ekstrakcji mikrofalowej w układzie zamkniętym niektóre furanokumaryny 

(w przypadku ekstraktów uzyskanych arcydzięgla i pasternaku - 

prawdopodobnie imperatoryna lub felopteryna) podlegają rozkładowi lub 

izomeryzacji pod wpływem mikrofal i wysokiego ciśnienia [10, 11]. Przykładowy 

chromatogram kumaryn wyizolowanych z owoców gorysza przedstawia 

rysunek 1. 

Rys. 1. 

Fig. 1. 

Przykładowy chromatogram HPLC furanokumaryn wyizolowanych z owoców gorysza 

wyniosłego; metoda izolacji – ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w 

podwyższonej temperaturze (60 C). Pik o czasie retencji t R = 16,56 – 

niezidentyfikowany. 

Example of HPLC chromatogram of furanocoumarins isolated from Peucedarium 

verticilare fruits; isolation method – ultrasound assisted extraction at elevated 

temperature (60 C). Peak of t R = 16,56 – unidentified. Applied gradient mobile phase 

(water + methanol: 0-10 min - 45% MeOH, 10-20 min - 45-55% MeOH, 20-30 min - 

55-70% MeOH, 30-40 min - 70% MeOH and the internal standard method. Temp. 

25°C, wavelength λ= 254. 

Vol. 4, No 1/2012 



89 

Tabela 1. Zależność wydajności ekstrakcji (mg/g SD) eterem naftowym i 

metanolem kumaryn z owoców gorysza wyniosłego od techniki 

ekstrakcyjnej 

Table 1. Effect of the extraction type on cumarins isolation efficiency 

(mg/g SD) from Peucedanum verticillare fruits using petroleum 

ether and methanol 

Metoda 

ekstrakcji/ługowania 

(Extraction/leaching 

technique) 

Extrahent 

(Extractant) 

Umbeliferon 

(Umbeliferone) 

(mg/g) 

Imperatoryna 

(Imperatorin) 

(mg/g) 

Eter naftowy 

(Petroleum ether) 

- 1.790 0.009 

Soxhlet 

MeOH 1.231 0.123 - 

Suma 

(Total) 

1.231 1.790 

Eter naftowy 


- 1.890 0.246 

MeOH 

USAE 20 C 

1.189 0.123 0.161 0.005 

Suma 

1.189 2.051 

(Total) 

Eter naftowy 


- 6.678 0.136 

USAE 60 o C 

MeOH 1.793 0.056 - 

Suma 

(Total) 

1.793 6.678 

MASE o 80% MeOH 0.987 0.059 3.599 0.480 

MASE p 80% MeOH 3.478 0.719 2.018 0.846 

4. Wnioski 

(Conclusions) 

Najskuteczniejszą techniką izolacji imperatoryny z owoców gorysza 

wyniosłego była ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w podwyższonej 

temperaturze (60 C), najmniej skuteczną – ekstrakcja w aparacie Soxhleta. 

Największy stopień odzysku umbeliferonu z gorysza daje ekstrakcja wspomagana 

mikrofalami w układzie zamkniętym, najniższy - MASE w układzie 

otwartym. W przypadku owoców gorysza, podobnie jak w przypadku opublikowanych 

już badań nad owocami arcydzięgla i pasternakiu efekt działania 

mikrofal w układzie zamkniętym powoduje spadek zawartości imperatoryny 

w porównaniu z ekstrakcją w układzie otwartym. Ekstrakcja mikrofalowa z 

wysokim ciśnieniem nie jest, więc odpowiednią metodą ekstrakcji imperatoryny 

z owocu gorysza. 

Vol. 4, No 1/2012 



Literatura 

(References) 

1. M.D. Luque de Castro, M.P. Da Silvia, Strategies for solid sample 

treatment, Trends in Analytical Chemistry, 16(1997)16-24. 

2. N. Saim, J.R. Dean, M.P. Abdullah, Z. Zakiria, Extraction of polycyclic 

aromatic hydrocarbons from contaminated soil using Soxhlet extraction, 

pressurized and atmospheric microwave – assisted extraction, 

supercritical fluid extraction and accelerated solvent extraction, J. 

Chromatogr. A, 791(1997)361-366. 

3. P.B. McClelland, P. Morgan, E.E. Leach, J. Shelk, Psoralen 

photochemotherapy, Dermatol. Nurs., 9(1997)403-415. 

4. W. Cisowski, Biologiczne właściwości kumaryn. Cz. I. Działanie na 

rośliny oraz właściwości farmakologiczne i przeciwbakteryjne, The 

biological properties of coumarins. Part I. Effects on plants and 

pharmacological and antibacterial properties, Herba Pol., 24(1983)301- 

314. 

5. F. Hadaček, C. Müller, A. Werner, H. Greger, P. Proksh, Analysis, 

isolation and insectidal activity of linear furanocoumarins and other 

coumarin derivatives from Peucedanum (Apiaceae: Apiodeae), Journal 

of Chemical Ecology, 20(8)(1994)2035-2054. 

6. S. Kohlmünzer, Farmakognozja, Pharmacognosy, PZWL, Warszawa 

1993. 

7. G. Zgórka, T. Dragan, K. Głowniak, E. Basiura, Determination of 

furanochromones and pyranocoumarins in drugs and Ammi visnage 

fruits by combined solid – phase extraction – high perfomance liguid 

chromatography and thin – layer chromatography – high perfomance 

liguid chromatography, J. Chromatogr. A, 797(1998)305-309. 

8. H.C. Huang, S.H. Chus, P.D. Chao, Vasorelaxants from Chinese herbs, 

emodin and scoparone, possess immunosuppressive properties, Eur. J. 

Pharmacol., 198(1991)211-213. 

9. M. Królikowska, Analiza fitochemiczna roślinnych surowców 

leczniczych, Phytochemical analysis of medical plants, AM, Łódź 1988. 

10. M.E. Waksmundzka-Hajnos, A. Petruczynik, A. Dragan (Oniszczuk), D. 

Wianowska, A.L. Dawidowicz, I. Sowa, Influence of the extraction mode 

on the yield of some furanocoumarins from Pastinaca sativa fruits, J. 

Chromatogr. B, 800(2004)181-187. 

11. M.E. Waksmundzka-Hajnos, A. Petruczynik, A. Dragan, D. Wianowska, 

A.L. Dawidowicz, Effect of extraction method on the yield of 

furanocoumarins from fruits of Archangelica officinalis Hoffm, 

Phytochem. Anal., 15(2004)313-319. 

12. G. Romanik, E. Gilgenast, A. Przyjazny, M. Kamiński, Techniques of 

preparing plant material for chromatographic separation and analysis, 

Anal. Bioanal Chem., J. Biochem. Biophys. Methods, 70(2007)253–261. 

Vol. 4, No 1/2012 



91 

13. M. A. Hawrył, E. Soczewiński, T. H. Dzido, Separation of coumarins 

from Archangelica officinalis in high-performance liquid chromatography 

and thin-layer chromatography systems, J. Chromatogr. A, 

886(2000)75-81. 

Vol. 4, No 1/2012 




Bronisław K. GŁÓD, Ewa SZAFRANIUK, Justyna PIJANOWSKA 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny 

w Siedlcach 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, 

e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.uph.siedlce.pl 

Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów 

Streszczenie: Ditiokarbaminiany (DTC) należą do najważniejszych fungicydów, o niskiej 

toksyczności. W pracy opisano chromatograficzne oznaczanie mieszaniny DTC (disiarczków 

bis(dimetylotiokarbamoilu) i bis(dietylotiokarbamoilu), dimetyloditiokarbaminian sodu oraz 

dietyloditiokarbaminian sodu). Przeanalizowano zarówno warunki chromatograficznego ich 

rozdzielenia jak i różnej detekcji. Okazało się, że sole łatwo utleniają się do disiarczków. 

Natomiast disiarczki są nietrwałe, dlatego w mieszaninie dochodzi do wymiany ich ligandów. 

Otrzymane wyniki wskazują na przydatność wysokosprawnej chromatografii cieczowej z 

detekcją spektrofotometryczną oraz elektrochemiczną w badaniach analitycznych i 

fizykochemicznych DTC. 

Słowa kluczowe: ditiokarbaminiany, ED/UV-HPLC, di siarczki, fungicydy 

Application of HPLC to the separation of dithiocarbamates 

Abstract: Dithiocarbamates (DTCs) are the most important fungicides, characterized by low 

toxicity. This paper describes the chromatographic determination of a mixture of DTCs 

(disulfides of bis(dimethylthiocarbamoil) and bis(diethylthiocarbamoil), sodium 

dimethyldithiocarbamate and sodium diethyldithiocarbamate). We analyzed both, the 

chromatographic separation as well as various detection systems. It turned out that salts were 

readily oxidized to disulfides. From the other side, disulfides are unstable. Therefore, their 

mixtures exchanged ligands. The obtained results indicated usefulness of HPLC in analytical 

and physicochemical investigations of DTCs. 

Key Words: dithiocarbamates, ED/UV-HPLC, disulfides, fungicides

94 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska 

1. WSTĘP 


Grupy tiolowe (–SH) zaliczają się do reaktywnych wśród tych, 

występujących w organizmach żywych, np. mięsie [1-3]. Charakteryzują się 

właściwościami antyoksydacyjnymi. Ich redukcja prowadzi do powstawania 

rodników tiolowych i/lub disiarczków. Są słabymi kwasami. Kompleksują jony 

metali. Ditiokarbaminiany (DTC), Rys. 1., należą do najważniejszych 

fungicydów [4, 5]. Charakteryzują się niską toksycznością. Zagrożenie 

człowieka wynika raczej z niewłaściwego ich stosowania. Powodują 

miejscowe podrażnienia i reakcje uczuleniowe, blokują grupy -SH enzymów i 

białek. Znajdują zastosowanie w przemyśle gumowym, rolnictwie, 

medycynie i kosmetologii. 

Do grupy ditiokarbaminianów zaliczamy m.in.: disiarczek 

bis(dietylotiokarbamoilu) (disulfiram, DSF), który jest składnikiem leków 

(Esperal, Antabus) stosowanych w leczeniu alkoholizmu [6]. Zaburza on 

metabolizm alkoholu w organizmie, przez co hamuje działanie enzymu – 

dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). Spowalnia to proces utleniania 

aldehydu octowego do mniej szkodliwego kwasu octowego. Blokada ALDH 

powoduje akumulację aldehydu octowego po spożyciu alkoholu, co prowadzi 

do serii nieprzyjemnych reakcji fizycznych (tzw. reakcja disulfiramowa), m.in. 

duszności, nudności, wymiotów, pulsującego bólu głowy oraz zaburzeń 

psychicznych, skutecznie odstraszających przed spożyciem alkoholu. DSF 

jest inhibitorem β-hydroksylazy, a przez to jest potencjalnym lekiem 

uzależnienia od kokainy. Ponadto okazało się, że obniża on w mózgu 

stosunku noradrenaliny do dopaminy [6-8] i zwiększa stres oksydacyjny oraz 

peroksydację lipidów i białek w komórkach [9]. 

Disiarczek bis(dimetylotiokarbamoilu) (tiuram; TMTD) jest fungicydem 

stosowanym do ochrony upraw przed chorobami pochodzenia grzybowego 

[10], środkiem przeciwgrzybicznym stosowanym w kosmetologii, lekiem 

przeciwświerzbowym i chomosterylatem w opatrunkach i plastikowych 

urządzeniach medycznych, filtrem przeciwsłoneczny, składnikiem mydeł i 

aerozoli oraz ultra-przyspieszaczem w przetwórstwie gumowym [4, 5, 11]. 

Cechuje się niską toksycznością oraz silnym działaniem teratogennym, 

gonadotoksycznym i rakotwórczym. Wywołuje alergie skóry i oczu na skutek 

bezpośredniego kontaktu lub w wyniku narażenia inhalacyjnego. Jest 

metylowym analogiem disulfiramu, który blokuje metabolizm alkoholu 

etylowego, wywołując „szok disulfiramowy”. Wskutek tego uszkadza nerki, 

wątrobę i trzustkę oraz układ nerwowy. Łatwo się wchłania przez układ 

pokarmowy i oddechowy. Szybko ulega metabolizmowi i wydalany jest z 

wydychanym powietrzem i moczem. Organizm metabolizuje TMTD do 

kwasu dimetyloditiokarbaminowego i disiarczku węgla. Toksyczny 

mechanizm działania TMTD może wynikać ze zdolności do chelatowania 

metali i inhibicji niektórych enzymów. Zaburza metabolizm węglowodanów i 

alkoholi oraz gospodarki wapniowej organizmu. Niszczy struktury błon 

komórkowych hepatocytów i wpływa na aktywność cytochromu P-450. 

Vol. 4, No 1/2012 



95 

Ponadto tiuram reaguje z niebiałkowymi i białkowymi grupami tiolowymi. 

Jego cytotoksyczność wynika ze zmian poziomu zredukowanego glutationu, 

indukcji stresu oksydacyjnego w komórkach oraz zaburzeń równowagi stanu 

oksydoredukcyjnego. 

Sole DTC łatwo się utleniają do disiarczków (2RS - -2e→ RSSR), 

odpowiednio do disulfiramu i tiuramu [12]. Utleniane są nawet przez 

stosunkowo słabe utleniacze, jak roztwór jodu czy nadtlenku wodoru. Pod 

względem elektrochemicznym są to reakcje odwracalne [13] (RSSR 

redukuje się do nietrwałego RSSR - , który następnie rozkłada się do RS . i RS - 

[14, 15]). Wykorzystuje się je w produkcji pestycydów tiokarbaminianowych 

oraz jako syntetyczny lek immunomodulujący. Stosuje się je również do 

strącania jonów metali ciężkich z wody, np. w kolektorach do usuwania 

jonów metali ciężkich z ścieków przemysłowych. Przy ich użyciu można 

także usunąć metale z tkanek zwierzęcych, w tym ludzkich, oraz leczyć ostre 

zatrucia arszenikiem. Dlatego wykorzystuje się je również w maściach 

stosowanych w stanach zapalnych [16-18]. Dimetyloditiokarbaminian sodu 

(SDMC) jest inhibitorem wolnych rodników, środkiem biobójczym, stosowany 

jest do garbowanie skór i produkcji papieru [3, 19-21]. W medycynie 

wykorzystywane są jako syntetyczne immunomodulatory, a w lecznictwie 

weterynaryjnym jako leki poprawiające kondycję zwierząt narażonych na 

immunosupresyjne wpływy środowiska. 

Ditiokarbaminiany tworzą również kompleksy stosowane w smarach 

oraz w przetwórstwie gumy i kauczuku. Zwłaszcza kompleksy cynku z 

aminami, jako aktywne przyspieszacze, wykorzystuje się w wulkanizacji 

siarką W medycynie niektóre kompleksy wykazują właściwości 

przeciwnowotworowe np.: blokują grupy tiolowe enzymów i białek [10, 22, 

23]. 

Celem pracy było opracowanie warunków chromatograficznego 

rozdzielenia mieszaniny DTC. Przebadano różne fazy ruchome, do 

monitorowania związków zastosowano detektor amperometryczny oraz 

spektrofotometryczny. 

R 

S 

R 

S 

R 

N 

S 

N 

Na + 

S 

S 

R 

N 

R 

R 

S 

R: -CH 3 ; -C 2 H 5 

Rys. 1. Wzory strukturalne badanych ditiokarbaminianów, (A) – disiarczków 

bis(dialkilotiokarbamoilu), (B) – soli dialkiloditiokarbaminianów. 

Fig. 1. Structures of the investigated dithiocarbamates, (A) - bis(dialkylothiocarbomyl) 

disulfides, (B) – dialkylodithiocarbamate salts. 

Vol. 4, No 1/2012 



2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA 

(Experimental) 

2.1. Aparatura 

(Apparatus) 

W badaniach wykorzystano wysokosprawny chromatograf cieczowy 

(Knauer, Berlin, Niemcy) składający się z butli z eluentami, modułu Smartline 

Manager 5000, pompy dwutłokowej Smartline 1000 (regulacja przepływu 

fazy ruchomej 0,001-50 ml/min), mieszadła magnetycznego fazy ruchomej, 

dozownika pętlicowego D-14163 (objętość pętli 20 μl), termostatu kolumn 

Smartline 4000 z zakresem temperatur 5 ÷ 85 ºC, kolumny analitycznej 

Cosmosil RP-18 AR II (4,6 x 50 mm), detektora spektrofotometrycznego UV 

Smartline PDA 2800 z matrycą diodową DAD (zakres pracy lampy 190-1020 

nm), detektora elektrochemicznego EC3000 (Recipe Chemicals, Munich, 

Niemcy) (elektroda pracująca - węgiel szklisty, elektroda odniesienia - 

Ag/AgCl, elektroda pomocnicza - Pt), programu Clarity Chrom wersja 2.6.2. 

oraz zbiornika eluatu. 

2.2. Odczynniki 

(Reagents) 

W badaniach zastosowano nadchloran tetraetyloamonu (TEAP), 

nadchloran tetrabutyloamonu (TBAP) i metanol czysty do HPLC (Sigma- 

Aldrich, Niemcy), kwas siarkowy(VI) 95% (Polskie Odczynniki Chemiczne, 

Gliwice, Polska) oraz jodek tetrabutyloamonu, TBAI (Chemapol, 

Czechosłowacja). 

2.3. Procedury 

(Procedures) 

Pomiary chromatograficzne mieszaniny DTC przeprowadzono w 

układzie faz odwróconych (RP–C18), w temperaturze 20°C, przy przepływie 

fazy ruchomej 1,0 ml/min. Przed przystąpieniem do analizy 

chromatograficznej kolumnę chromatograficzną stabilizowano w temp. 20 o C 

przez 1 h. W pomiarach zastosowano fazy ruchome przedstawione w 

Tab. 1. 

Mieszaninę DTC przygotowano przez zmieszanie 1 mM roztworów 

TMTD, DSF, SDMC i SDEC o objętości 200 ml. Objętość próbki, 

wstrzykiwanej na kolumnę, wynosiła 20 µl. W pomiarach zastosowano dwa 

typy detektorów: fotometryczny (długość fali 205 i 254 nm) oraz 

elektrochemiczny (w zakresie potencjału -2 V ÷ +1,5 V). Na kolumnę 

nastrzykiwano świeżo przygotowane roztwory. W celu identyfikacji pików i 

przypisania im odpowiednich ditiokarbaminianów, na kolumnę 

chromatograficzną nastrzykiwano związki osobno. Identyfikację 

przeprowadzano w oparciu o czasy retencji i spektrogramy RSSR i RS - . 

Vol. 4, No 1/2012 



97 

Tabela 1. Układy faz ruchomych do rozdziału mieszaniny DTC 

Table 1. Mobile phases used for the separation of DTCs 

Faza ruchoma 

Lp Skład Stosunek v/v 

1 MeOH/H 2O 80:20 

2 MeOH/H 2O 90:10 

3 MeOH:1mM/H 2SO 4 80:20 

4 1 mM TBAI/H 2O 90:10 

5 1 mM TEAP/H 2O 90:10 

6 5 mM TEAP/H 2O 90:10 

7 6,5 mM TEAP/H 2O 90:10 

8 50 mM TEAP/H 2O 90:10 

9 80 mM TEAP/H 2O 90:10 

10 100 mM TEAP/H 2O 90:10 

Rodzaj detektora 

Spektrofotometryczny 

(UV) 

Elektrochemiczny 

(ED) 

Każdy pomiar powtarzano trójkrotnie, a średnia z otrzymanych 

wyników wyznaczała wynik końcowy. Niepewność pomiaru uzyskano testem 

t-Studenta zmiennych zależnych, dla poziomu ufności p

Sygnał [mAU] 

R[mAU] 

R[mAU] 


400 

300 

200 

2500 

2000 

1500 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

100 

3 

1 

0 

200 250 300 350 400 

[nm] 

2 

1;3 

4 

100 

1000 

500 

4 

0 

200 250 300 350 400 

[nm] 

0 

0 1 2 3 4 5 6 7 

t r 

[min] 

Rys. 2. Chromatogram mieszaniny DTC: 1 – SDMC, 2 – TMTD, 3 – SDEC oraz 4 – DSF. 

Warunki chromatograficzne: kolumna – Cosmosil RP-18 AR II (4,6x150mm); faza 

ruchoma – MeOH/H 2O 80/20 v/v; detektor UV – 205 nm, szybkość przepływu – 1.0 

ml/min; nastrzyk – 20µl. W lewym, górnym rogu przedstawione są widma UV 

zarejestrowane w maksimach odpowiednich pików. 

Fig. 2. The HPLC chromatogram of mixture of DTCs: 1 - SDMC, 2 - TMTD, 3 – SDEC and 4 

- DSF. Chromatographic conditions: column - Cosmosil RP-18 AR II (4,6 x 150 mm 

I.D.), mobile phase - MeOH/H 2O 80/20 v/v, detector UV - 205 nm, flow rate - 1.0 ml / 

min, injection volume - 20μl. In the upper left corner the UV spectra recorded in the 

peak maxima are presented. 

Sole, obdarzone ładunkiem w roztworach polarnych, wymywane były 

w pobliżu objętości martwych (Rys. 2). Zmniejszenie ich polarności można 

uzyskać za pomocą związków (jonów tetraalkiloamoniowych) tworzących 

tzw. pary jonowe. Okazało się, że (i) jony czteroalkiloamoniowe zwiększały 

retencję soli, nie wpływając na retencję disiarczków, (ii) wzrost retencji 

proporcjonalny był do długości łańcucha alifatycznego jonu 

czteroalkiloamoniowego i jego stężenia (Rys. 3), (iii) niektóre aniony (np. 

nadchlorany) utleniają badane związki. Przy niskim stężeniu jonów 

tetretyloamoniowych nie zachodzi rozdział soli. Przy stężeniu 6,5 mM TEAP 

zachodzi nieznaczny rozdział poszczególnych składników mieszaniny (Rys. 

4). 

Vol. 4, No 1/2012 


Sygnał [mAU] 

R[mAU] 

R[mAU] 


99 

Rys. 3. 

Fig. 3. 

Wykres zależności czasu retencji DTC: SDMC (■), SDEC (●), TMTD () oraz DSF 

() od stężenia TEAP w układzie metanol/woda 90/10% v/v. Warunki 

chromatograficzne jak na Rys. 2. 

A dependence of the retention time of DTCs: SDMC (■), SDEC (●), TMTD () and 

DSF () on the concentration of TEAP in methanol/water 90/10% v/v. 

Chromatographic conditions as on Fig. 2. 

700 

200 

600 

500 

150 

100 

50 

1 

3 

2 

4 

400 

0 

200 250 300 350 

[nm] 

300 

2500 

2000 

2 

200 

100 

1500 

1000 

500 

4 

0 

200 250 300 350 

[nm] 

1 

3 

0 

0 1 2 3 4 

t r 

[min] 

Rys. 4. 

Fig. 4. 

Chromatogram DTC, 1 - SDMC, 2 - TMTD, 3 – SDEC oraz 4 - DSF. Warunki 

chromatograficzne jak na Rys. 2, za wyjątkiem 6,5 mM TBAI w mieszaninie 

metanol/H 2O 90/10 v/v zastosowanej jako faza ruchoma. W lewym, górnym rogu 

przedstawione są widma UV zarejestrowane w maksimach odpowiednich pików. 

The change of the peaks areas of SDMC and TMTD (A) and SDEC and DSF (B) in 

time. The samples were exposed to the atmospheric oxygen. Chromatographic 

conditions as on Fig. 4. 

Vol. 4, No 1/2012 


A[mAU*min] 

A[mAU*min] 


Grupa tiolowa nadaje ditiokarbaminianom właściwości redukujące 

[12]. Sole DTC utleniają się do disiarczków [24]. Reakcje te przebiegają 

nawet pod wpływem tlenu atmosferycznego. Dlatego po nastrzyku nawet 

czystych soli obserwowaliśmy na chromatografie piki od disiarczków. Na 

Rys. 5 przedstawiono zmiany pól powierzchni pików soli i odpowiadających 

im disiarczków od czasu wystawione próbek na działanie tlenu 

atmosferycznego. Okazało się, że również niektóre składniki fazy ruchomej 

utleniały sole. W szczególności, bardzo silny efekt zaobserwowano dla 

nadchloranu. 

200 

180 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

0 20 40 60 

t[min] 

80 100 

SDMC TMTD 

200 

180 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

0 20 40 60 80 100 

t[min] 

SDEC DSF 

Rys. 5. 

Fig. 5. 

Zmiana pól powierzchni pików SDMC i TMTD (A) i SDEC i DSF (B) w czasie. Próbki 

wystawione były na oddziaływanie tlenu atmosferycznego. Warunki 

chromatograficzne jak na Rys. 4. 

The change of the peaks areas of SDMC and TMTD (A) and SDEC and DSF (B) in 

time. The samples were exposed to the atmospheric oxygen. Chromatographic 

conditions as on Fig. 4. 

Vol. 4, No 1/2012 


h[nA] 


101 

Łatwość utleniania soli bitiokarbaminianów do disiarczków można 

praktycznie wykorzystać do ich detekcji. Na Rys. 6 pokazano dynamicznie 

uzyskane woltamogramy SDMC i TMTD za pomocą detektora 

elektrochemicznego. Odczytać z niego można, że pierwszy ze związków 

utlenia się przy potencjale ok. 0,85 V. Oznacza to, że do jego analizy można 

zastosować detektor amperometryczny. Drugi ze związków nie ulega 

utlenianiu w badanych warunkach. Obserwowany na Rys. 6 sygnał pochodzi 

od utleniania rozpuszczalnika. Niewielki sygnał obserwowany jest w tym 

przypadku dla redukcji. 

3000 

2500 

2000 

1500 

1000 

500 

0 

-2 -1 0 1 2 

E[V] 

Rys. 6. 

Fig. 6. 

Wykres zależności zmiany wysokości sygnału pochodzącego od SDMC (●) i TMTD 

(■), od potencjału. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 4. Faza ruchoma - 0,5 mM 

TEAP w metanol/woda 90/10 v/v. Zakres potencjałów detektora elektrochemicznego – 

-2 ÷ +1,5 V vs Ag/AgCl. 

A plot of the SDMC (●) and TMTD (■) currents in the function of potential. 

Chromatographic conditions as on Fig. 4. Mobile phase - 0.5 mM TEAP in 

methanol/water 90/10 v/v. Electrochemical detector potential range - 2 to 1.5 V vs Ag / 

AgCl. 

Również disiarczki nie są trwałymi związkami. W roztworach ulegają 

rozpadowi na odpowiednie sole. Dlatego po kilkunastu godzinach w 

mieszaninie disiarczków obserwowaliśmy ich mieszane formy [25]. Na 

przykład. z (disiarczków bis(dimetylotiokarbamoilu) i bis(dietylotiokarbamoilu) 

powstawał disiarczek N,N-dietylo-N',N'-dimetylotiuramu. 

4. WNIOSKI 

(Conclusions) 

Badane DTC (disulfiram, tiuram, dimetyloditiokarbaminian sodu oraz 

dietyloditiokarbaminian sodu) mogą być rozdzielane za pomocą 

Vol. 4, No 1/2012 



wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Sole 

DTC łatwo są utleniane tlenem atmosferycznym lub składnikami fazy 

ruchomej. Dlatego faza ruchoma powinna się charakteryzować 

właściwościami redukcyjnymi. Do ich można zastosować detekcję 

elektrochemiczną. W mieszaninie disiarczków zaobserwowano wymianę ich 

alkilowych podstawników. Jony tetraalkiloamoniowe zwiększają retencję soli 

DTC, nie powodując zmiany retencji disiarczków. 

LITERATURA 

(References) 

1. B. Bukowska, Funkcje glutationu oraz czynniki zmniejszające jego 

stężenie, Glutathione functions and factors decreasing its 

concentration, Med. Pracy, 56(2005)69–80. 

2. K. Karolczak, B. Olas, J. Kołodziejczyk, Rola tioli w aktywacji płytek 

krwi, The role of thiols In blood platelet activation, Postępy Biol. 

Komórki, 36(2009)101–120. 

3. A. Bilska, A. Kryczyk, L. Włodek, Różne oblicza biologicznej roli 

glutationu, The different aspects of the biological role of glutatione, 

Postepy Hig. Med. Dośw., 61(2007)438–453. 

4. D. Kurpios-Piec, E. Grosicka-Maciąg, H. Czeczot, M. Szumiło, T. 

Grzela, I. Rahden-Staroń, Ochronny wpływ N-acetylocysteiny na pro 

oksydacyjne i proapoptotyczne działanie tiuramu w komórkach V79 

chomika chińskiego, Bromat. Chem. Toksykol., 43(2010)354–361. 

5. P. Struciński, Tiuram – pył. Dokumentacja dopuszczalnego narażenia 

zawodowego, Principl. Methods Assess Walk Environ., 213(2006)145– 

180. 

6. G.A. Kenna, J.E. McGeary, R.M. Swift, Pharmacotherapy, 

pharmacogenomics and the future of alcohol dependence therapy, 

American Journal of Health-System Pharmacy, 61(21)(2004)2272– 

2279. 

7. S.E. Manahan, Toksykologia środowiska, PWN, Warszawa 2006. 

8. P. Devoto, G. Flore, P. Saba, R. Cadeddu, G.L. Gessa, Disulfiram 

stimulates dopamine release from noradrenergic terminals and 

potentiates cocaine-induced dopamine release in the prefrontal cortex. 

(70 refs.), Psychopharmacology, 219(4)(2012)1153–1164. 

9. E. Grosicka, H. Czeczot, M. Skrzycki, M. Szumiło, M. Podsiad, I. 

Rahden-Staron, Wpływ tiuramu i disulfiramu na stran redox w 

komórkach fibroblastów płuca chomika chińskiego, Bromat. Chem. 

Toksykol., 39(2006)383–390. 

10. B. Łozowicka, P. Kaczyński, Pozostałości ditiokarbaminianów w 

żywności oraz potencjalne ryzyko narażenia konsumentów, Bromat. 

Chem. Toksykol., 42(2009)1155–1160. 

11. S.A. Jatinder, A.K. Malik, R.K. Mahajan, Solid phase microextractionhigh 

pressure liquid chromatographic determination of nabam, thiram 

Vol. 4, No 1/2012 



103 

and azamethiphos in water samples with UV detection. Preliminary 

data, Talanta, 66(2005)266–270. 

12. S.J. Visco, C.C. Mailhe, L.C. De Jonghe, M. Armand, A Novel Class of 

Organosulfur Electrodes for Energy Storage, J. Electrochem. Soc., 

136(1989)661. 

13. M. Liu, S.J. Visco, L.C. De Jonghe, Electrochemical Properties of 

Organic Disulfide/Thiolate Redox Couples, J. Electrochem. Soc., 

136(1989)2570. 

14. M. Liu, S.J. Visco, L.C. De Jonghe, Electrode Kinetics of Organosulfur 

Cathodes for Storage Batteries, J. Electrochem. Soc., 137(1990)750. 

15. E. Potteau, L. Nicolle, E. Levillain, J.P. Lelieur, Electrochemical 

behaviour of RSSR thiuram disulfides, Electrochem. Comm., 

8(1999)360–364. 

16. E. Kucharczak, J. Dębowy, Z. Jope, Rozmieszczenie „endogennego” 

żelaza w tkankach królików po dożylnym podaniu 

dietyloditiokarbaminianu sodowego, Medicina Veterinaria, 

1(2)(2002)59–65. 

17. K.A. Streltsov, D.V. Abryutin, Investigation of regularities of ion flotation 

of copper with the use of sodium diethyldithiocarbamate, Russian 

Journal of Non-Ferrous Metals, 51(2)(2010)85–88. 

18. A.R. Rasnl, J. McC Howell, Further observations on the response of the 

peripheral and central nervous system of the rabbit to sodium 

diethyldithiocarbamate, Acta Neuropath., 24(1973)161–173. 

19. A. Kaars Sijpesteijn, M.J. Janssen, G.J.M. van der Kerk, Investigations 

on organic fungicides. XI. The Role of metals and chelating agents in 

the fungitoxic action of sodium dimethyldithiocarbamate (NaDDC), 

Biochimica et Biophysica Acta, 23(1957)550–557. 

20. H.H. Kamerbeek, A.G. Rauws, M. ten Ham, A.N.P. van Heijst, Prussian 

blue in therapy of thallotoxicosis, an experimental and clinical 

investigation, Acta Medica Scandinavica, 189(1971)321–324. 

21. A. LeHuray, American Chemistry Council, CAS, 128(2003)3–23. 

22. A. Kropidłowska, Związki kompleksowe o rdzeniu bogatym w siarkę 

zawierające dwa różne ligandy S-donorowe - potencjalne prekursory 

siarczków metali, Rozprawa doktorska, Politechnika Gdańska, 2008. 

23. A. Bielański, Podstawy chemii nieorganicznej, PWN, Warszawa 2007. 

24. D. Atanassova, V. Stefanova, E. Russeva, Co-precipitative preconcentration 

with sodium diethyldithiocarbamate and ICP-AES 

determination of Se, Cu, Pb, Zn, Fe, Co, Ni, Mn, Cr and Cd in water, 

Talanta, 47(1998)1237–1243. 

25. R.M. Smith, R.L. Morarji, W.G. Salt, Determination of dit hiocarbama tes 

by liquid chromatography using transition-metal salts as "ion-pair" 

reagents, The Analyst (London), 106(1981)129–134. 

Vol. 4, No 1/2012 



INSTRUKCJE DLA AUTORÓW 

W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie 

publikowane wcześniej) oraz przeglądowe poświęcone różnym działom 

nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane będą listy 

do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, 

reklamy, materiały firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o 

konferencjach. 

Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 

lub nowszym (w formacie .doc lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej 

opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres e-mail: 

psc1@onet.eu. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. 

* * * 

Jan KOWALSKI 1 , Anna KOWALSKA 2* (Arial 10 pkt., bold) 

1 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, 

Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, 

e-mail: psc1@onet.eu 

2 

Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 8 pkt., normal bez boldu) 

Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold 

Streszczenie: (Arial 8 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 8 pkt. kursywa bez boldu. 

Streszczenie polskojęzyczne powinno zawierać około 500 – 700 znaków (ze spacjami). Należy 

w nim krótko wskazać czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie 

wniosków. 

Słowa kluczowe: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą 

Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold - 

kursywa

106 Instrukcje dla autorów 

Abstract: (Arial 8 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 8 pkt. kursywa bez 

boldu, powinno być rozszerzone, o objętości około 1000 – 1200 znaków (ze spacjami). Powinno 

zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie 

wniosków. 

Key words: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą 

* autor do korespondencji 

Podtytuły – Arial 11 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, Wyniki i 

dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska - 

normal i (angielska - kursywą), 

śródtytuły – Arial 10 pkt., bold, wersja polska - normal i (angielska - 

kursywą) 

Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial 

10 pkt., odstępy między wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden 

sposób podziałów wierszy. Marginesy dostosować tak, aby wysokość 

kolumny tekstowej miała 19 cm (bez nr stron), a szerokość 12 cm - zgodnie 

z wymogami zamieszczonymi na stronie: 

http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html 

http://dach.ich.uph.edu.pl/pl/_cs.html 

http://dach.ich.uph.edu.pl/download/cam_sep/CamSep_ww.pdf 

Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane 

przenoszone z tekstem. Wzory napisane w edytorze równań należy 

traktować jako element zdania np.: 

V 

t 

F 

R R 

(1) 

gdzie: 

V R – objętość retencji, 

t R – czas retencji [min.], 

F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s]. 

Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z 

rozmiarem czcionki tekstu rozdziału. Wzory należy numerować kolejno w 

całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do prawej. 

Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i 

zgodne z oznaczeniami używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy 

związków chemicznych stosować zgodnie z nomenklaturą IUPAC, jednostki 

z układu SI. 

W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz 

z tytułami. Powinny one znajdować się w miejscach, w których po raz 

pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i zdjęcia 

zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane 

jako czarno-białe lub w skali odcieni szarości. 

Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu 

(Rys. i Tab. nr arabskie). 

Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim 

(kursywą) jak na przykładzie przedstawionym poniżej: 

Vol. 4, No 1/2012 


Instrukcje dla autorów 

107 

Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów 

działalności. Arial 10 pkt. 

Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of 

activities. Arial 10 pkt. 

Ogółem 

(Total) 

Elektrociepłownie, elektrownie, 

ciepłownie 

(Heat and power plants, power 

stations) 

Cd Pb Cu Zn Ni 

tony 

66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8 

1,9 19,9 12,8 59,2 72,2 

Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie – 18 

cm. Czcionka wewnątrz tabeli – Arial 8 pkt. 

Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może 

przekraczać w pionie – szerokości 12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie – 

szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się jeszcze 

podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z 

rozszerzeniem JPG i przesłany dodatkowo w oddzielnych plikach 

podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd. 

Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 8 pkt. 

Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 8 pkt. 

Literatura 

(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10 

pkt.): 

1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Anal. Chem., 

37(1965)1620. 

Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także 

publikacji, materiału z internetu, opisu patentowego itp. Tytuł w j. 

polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w 

cudzysłowie, tytuł w języku angielskim – kursywą. 

Vol. 4, No 1/2012 



2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j. 

angielski kursywą, PWN, Warszawa 1986. 

(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy 

tytuł oryginalny napisać w języku oryginału, a następnie jego tłumaczenie na 

język angielski - kursywą) 

Wszystkie materiały: 

artykuł (w formacie .doc lub .rtf), 

dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG), 

prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail: 

psc1@onet.eu 

* * * 

Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, 

następnie przekazywany jest dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci 

pozostają anonimowi. 

O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o 

przygotowaną recenzję. Jeśli w jej wyniku zachodzi konieczność 

poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie 

dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z 

publikacji lub gdy artykuł zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie 

ponownej ocenie. 

Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję 

artykułu i właściwy nr CamSep jako egzemplarz autorski. 

Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, 

wcześniej ustaloną, opłatą. 

Przepisy etyczne 

Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla 

wszystkich zaangażowanych w działania publikacji: autora, redaktora 

czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. Redaktorzy i 

recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny 

przychód komercyjny, nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni 

ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego rękopisu do 

kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, 

ujawnione w przedstawionej pracy, nie mogą być używane przez 

redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej zgody 

autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin, 

ilustracji lub obszernych cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za 

posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora. 

Vol. 4, No 1/2012 



109 

Instructions for Authors and Editorial Policy 

Camera Separatoria is a scholarly and peer-reviewed journal (print 

and online) published 2 times per year which was founded in 2009. It is a 

continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in 

Chromatography) devoted to the science, technique and technology of 

separation. It provides a medium for the publication of theoretical and 

experimental studies and reviews related to separation science: 

chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction, 

electroseparation etc. 

Camera Separatoria publishes original (not published previously and 

are not currently under consideration by another journal except in the form of 

an abstract or as part of a published lecture, review, or thesis) and review 

papers from all branches of separation science, technique and technology. 

Additionally letters to the editor; expert opinions; information on 

instrumentation, book reviews and information about conferences as well as 

advertisements are also published. The journal welcomes contributions 

which promote the exchange of ideas and rational discourse between 

practicing educators and material researchers all over the world. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the 

cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided. 

The manuscript should be original, has not been published previously and 

should not be currently being considered by another journal. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the 

cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided. 

Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the 

.doc/.docx format. Detailed rules are presented on 

http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html. It 

should be typed in single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall 

page numbering (at the center of bottom margins). Tables (Arabic 

numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure 

captions (Arabic numeration, in Polish and English, Arial 8p.) and 

references can be placed directly to the text. The main heading appears in 

the following order: 

- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the 

Corresponding Author’s name should be accompanied by an asterisk (*); if 

Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to link 

the Authors’ names and their affiliations, 

- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including 

zip code, city, street, and number; for universities, the faculty or 

department should be given), 

- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as 

English, (in all capital letters, Arial 12p.), 

- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute 

with which each author is affiliated, 

as it is presented below: 

Vol. 4, No 1/2012 



Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT* 

Department of Separation Science, Institute of Chemistry 

ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa 

*e-mail: camera@separatoria.eu 

I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 

1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting 

Body text… 

In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in 

Polish and English, Arial 8p.), keywords (about five, in Polish and English, 

Arial 8p.), introduction (review of literature and formulation the aim of the 

paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results 

and discussion, conclusions, acknowledgments and literature. The SI units 

and nomenclature recommended by IUPAC should be used. References 

should be typed in the forms: 

1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, J. Sep. Sci., 

44(2000)666. 

2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, 

Reymontówka 2000. 

3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text… 

4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting, 

Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18, 1987. 

in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. 

Citation in the text should be denoted by number in square brackets. 

One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can 

be accepted at this stage. Those rejected at this stage are passed on to 2 

experts for review. Acceptance for publication is subject to positive 

recommendation from the referees. The referees remains anonymous 

throughout the process. Reviewers are not supposed to contact the authors 

or to otherwise make their identity known. The referees are asked to 

evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks. 

Authors have three months to correct the article after the reviewing process. 

After this time, the returned article is considered as newly received. The 

authors receive the electronic version of their paper and the proper volume 

of Camera Separatoria free of charge. 

Advertisements may be published according to the prescribed rates. 

Ethical guidelines 

* * * 

It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for 

all involved in the act of publishing: author, editor, reviewer, publisher and 

Vol. 4, No 1/2012 



111 

society. Editors and reviewer are committed to ensuring that advertising, 

reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial 

decisions. They must not disclose any information about a submitted 

manuscript to anyone other than the corresponding author. The unpublished 

materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an 

editor's/referee’s own research without the express written consent of the 

author. The reproduction or adaptation of previously published tables, 

figures, illustrations, or extensive quotations from other sources must obtain 

appropriate written permission. 

Vol. 4, No 1/2012

Camera Separatoria - ZakÅad Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

Camera Separatoria - ZakÅad Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...