POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

SPIS TREŚCIPrzedmowa..................................................................................................... 5Bronisław K. Głód, Iwona Kiersztyn, Paweł PiszczI Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne ..................................................... 7Bronisław K. Głód, Marian KamińskiPolskie Towarzystwo Nauk o Rozdzielaniu.................................................. 15Grzegorz Boczkaj, Marian KamińskiBadania korelacji retencji z właściwościamifizykochemicznymi wybranych grup organicznychzwiązków siarki w podziałowej chromatografii gazowej ............................... 31Grzegorz Boczkaj, Ewelina Gilgenast, Paulina Nowicka,Andrzej Przyjazny, Marian KamińskiProcedura przygotowania próbki do oznaczaniawielopierścieniowych węglowodorów aromatycznychw produktach technicznych .......................................................................... 41Andrzej Bylina, Marian KamińskiPreparatywna chromatografia cieczowa, podstawowezasady efekytywnego stosowania, elementy praktyki.................................. 57Piotr M. SłomkiewiczZastosowanie inwersyjnej chromatografii gazowejw badaniach koadsorpcji .............................................................................. 71Grzegorz Boczkaj, Marian KamińskiWykorzystanie chromatografii gazowej do destylacjisymulowanej (SIMDIS). Aktualny stan wiedzy i nowe perspektywy ............ 89Iwona Kiersztyn, Anita Siłak, Paweł Piszcz, Anna Lamert,Krzysztof Kurzak, Mariusz S. Kubiak, Bronisław K. GłódZastosowanie RP-HPLC z detekcją elektrochemicznądo analizy kompleksów niklu z zasadami Schiffa....................................... 1013

Elżbieta Włodarczyk, Paweł K. ZarzyckiZastosowanie chromatografii w analizie modulatorówhormonalnych występujących w środowisku.............................................. 109Grzegorz Boczkaj, Marek Gołębiowski,Marian Kamiński, Piotr StepnowskiIdentyfikacja lotnych składników ścieków z instalacjioksydacji asfaltów z wykorzystaniem chromatografiigazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS)................................. 131Marian Kamiński, Bogdan KandybowiczMetodyka korekty programu elucji w kolumnowejchromatografii cieczowej – HPLC/UPC...................................................... 139Mariusz S. Kubiak, Magdalena Polak, Paweł PiszczOznaczanie poziomu zawartości B(a)Pw rynkowych przetworach mięsnych z wykorzystaniem HPLC.................. 1534

PRZEDMOWAPostępy chromatografii i innych technik i technologii rozdzielania to monografiapoświęcona rozdzielaniu i analizie w przepływie, wydana przez PolskieTowarzystwo Nauk o Rozdzielaniu i Akademię Podlaską. Adresowanajest przede wszystkim do pracowników nauki, studentów oraz wszystkich, którzyna co dzień zajmują się chromatografią. Autorzy zawarli w tej pozycji praktyczneprzykłady zastosowań z zakresu różnych dziedzin chromatografii.Pragniemy podziękować wszystkim, którzy przyczynili się do powstaniatego opracowania oraz chcemy zachęcić innych, aby w przyszłości stalisię współautorami kolejnych wydań.KOMITET REDAKCYJNY5

Bronisław K. GŁÓD, Iwona KIERSZTYN, Paweł PISZCZInstytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej, Akademia Podlaska,ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlcee-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.plI PODLASKIE SPOTKANIE CHROMATOGRAFICZNE1 ST PODLASIE’S CHROMATOGRAPHIC MEETINGMiejscem spotkania była Reymontówka – Dom Pracy Twórczej, położony20 km na zachód od Siedlec w miejscowości Chlewiska w gminie Kotuń,wśród lasów i łąk Podlasia. Mieści się on w zabytkowym dworku wybudowanymw połowie XIX w. dla rodziny Różańskich. W 1926 r. dworek wrazz 300 ha gruntów kupiła wdowa po Władysławie Reymoncie - Aurelia, przeznaczywszyna ten cel część pieniędzy z nagrody Nobla, jaką otrzymałReymont za powieść Chłopi. Za rządów Aurelii Reymontowej Chlewiskaprzeżywały czasy największej świetności. Od 1.01.1999 r. ich właścicielemjest Starostwo Powiatowe w Siedlcach. W ubiegłym roku w Zakładzie ChemiiAnalitycznej Akademii Podlaskiej zrodził się pomysł zorganizowania konferencjinaukowej właśnie w tym miejscu, w Reymontówce, która stanowi oryginalnąkompozycję przeszłości i teraźniejszości, tradycji i postępu; pielęgnujedziedzictwo kulturowe regionu i jest też otwarta na nowe wyzwaniawspółczesności.I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne odbyło się w Reymontówcew dniach od 20 do 23 września 2009 r. pod honorowym patronatem JM RektoraAkademii Podlaskiej i prezydenta miasta Siedlce. Organizatorem spotkaniabyła Akademia Podlaska (Zakład Chemii Analitycznej). Opiekę merytorycznąi organizacyjną sprawowały osoby:Komitet Naukowy:Tadeusz Dzido – LublinBronisław K. Głód – SiedlceMarian Kamiński – Gdańsk7

Teresa Kowalska – KatowiceMieczysław Sajewicz – KatowiceAndrzej Stołyhwo – WarszawaMonika E. Waksmundzka-Hajnos – LublinZygfryd Witkiewicz – KielcePaweł Zarzycki – KoszalinKomitet Organizacyjny:Bronisław K. GłódIwona KiersztynAnna LamertPaweł PiszczWzięło w nim udział ponad 50 pracowników czołowych polskich ośrodkówakademickich i badawczych. Podczas spotkania wygłoszone zostały wykłady:1. Zasady doboru optymalnych warunków rozdzielania na kolumnowej elucyjnejchromatografii cieczowejMarian Kamiński2. Ciśnieniowa elektrochromatografia planarna - postępy i wyzwaniaTadeusz Dzido, Paweł W. Płocharz, Piotr Ślązak, Adam Chomicki, AnetaHałka-Grysińska, Beata Polak3. Dozownik laserowy do dozowania próbek ciekłych do kolumn pakowanychw chromatografii gazowejPiotr M. Słomkiewicz, Zygfryd Witkiewicz4. Optymalizacja układów chromatograficznych do rozdzielania i wyznaczaniaich parametrów lipofilowości związków zasadowychMonika Waksmundzka-Hajnos, Anna Petruczynik5. Badanie składu wtórnego aerozolu organicznego na podstawie reakcjialfa-pinenu z ozonemKonrad Kowalewski, Tomasz Gierczak6. Wpływ modyfikatora eleuentu na selektywność rozdzielenia substancjiw układach odwróconych wysokosprawnej chromatografii cieczowejAnna Klimek-Turek, Tadeusz Dzido8

7. Application of thermostated micro-thin-layer chromatography for pharmaceuticalanalysis and physicochemical investigationsMagdalena Zarzycka, Paweł Zarzycki, Bronisław K. Głód9. Practical approach to quantification of steroids and related low molecularmass compounds in complex biological samples using temperaturedependentinclusion chromatographyPaweł K. Zarzycki10. Preparatywna i procesowa chromatografia cieczowaMarian Kamiński11. Zastosowanie metod separacyjnych w badaniu enancjomeryzacjiMonika AsztemborskaPodczas sesji posterowej pokazane zostały plakaty ilustrujące osiągnięciabadawcze o tematyce chromatograficznej:1. Wykorzystanie techniki HPLC i LC – MS w badaniach procesów fotodegradacjidoksazosyny i terazosynyJoanna Karpińska, Aneta Sokół, Marta Hryniewicka2. Zastosowanie ekstrakcji micelarnej do chromatograficznej analizy famotydynyBarbara Starczewska, Ilona Kiszkiel, Monika Kasabuła3. Badanie lipofilowości pochodnych kwasu 4-fenylo-1,2,4-triazolo-5--sulfanylooctowego metodą chromatografii cienkowarstwowejAnna Hawrył, Ewelina Pikula, Monika Waksmundzka-Hajnos4. Rozdzielenie glikozydów flawonoidowych metodą chromatografii cienkowarstwowejAnna Petruczynik, Danuta Smolarz, Monika Król, Jakub Kryszeń, MichałHajnos, Monika Waksmundzka-Hajnos5. Zastosowanie chromatografii do badania migracji specyficznej stabilizatorówi środków przeciwstarzeniowych w kompozytach elastomerowychprzeznaczonych do kontaktu z żywnościąTeresa Kleps, Teresa Parys, Aneta Stępkowska, Marta Tomaszewska,Jolanta Popielewska6. Oznaczanie składników preparatu cefalgin metodami chromatografiicienkowarstwowej elektrochromatografii planarnej9

Aneta Hałka-Grysińska, Piotr Ślązak, Grzegorz Zaręba, TadeuszH. Dzido7. HPLC kwasów fenolowych orzecha włoskiegoGrzegorz ChrzanowskI, Bogumił Leszczyński, Paweł Czerniewicz, HenrykMatok, Radosław Matejek8. Oznaczanie wolnej frakcji indometacyny w osoczu ludzkim z wykorzystaniemtechniki HPLC/UV-VISKrzysztof Kondzioła, Andrzej L. Dawidowicz9. Flawonoidy lucerny siewnejSylwia Goławska, Ireneusz Kapusta, Bogdan Janda, Bogumił Leszczyński10. Application HS-SPME/GC-MS for analysis of volatile compounds of walnutinduced by aphid feedingRobert Krzyżanowski, Bogumił Leszczyński11. Ekstrakcja przegrzaną wodą w procedurze chromatograficznego oznaczaniaskładu olejku eterycznego z ziela tymiankuEwelina Rado, Andrzej L. Dawidowicz12. The new method to study molecular interactionsAnna Bielejewska, Andrzej Bylina, Kazimiera Duszczyk13. Chromatograficzne oznaczanie całkowitego potencjału antyoksydacyjnegow oparciu o reakcje rodników hydroksylowych z kwasemp-hydroksybenzoesowymPaweł Piszcz, Agnieszka Beta, Iwona Kiersztyn, B. Krzysztof Głód14. Zastosowanie HPLC do pomiarów całkowitego potencjału antyoksydacyjnegomiodów i miodów pitnychPaweł Wantusiak, Paweł Piszcz, Monika Skwarek, Bronisław K. Głód15. Mechanizm retencji kwasów karboksylowych na różnych kolumnachHPLCMonika Skwarek, Paweł Wantusiak, Paweł Piszcz, B. Krzysztof Głód16. Rozdział kompleksów niklu z zasadami schiffa za pomocą HPLC z detekcjąUV i elektrochemicznąIwona Kiersztyn, Anita Siłak, Paweł Piszcz, Krzysztof Kurzak, BronisławK. Głód17. Chromatograficzne i elektrochemiczne metody wyznaczania całkowitegopotencjału antyoksydacyjnego miodów i miodów pitnychPaweł Wantusiak, Marcin Boruc, Monika Skwarek, Paweł Piszcz, IwonaKiersztyn, Bronisław K. Głód18. pH zależne chromatograficzne pomiary całkowitego potencjału antyoksydacyjnegoEmila Gołdyn, Paweł Piszcz, Bronisław K. Głód19. The degradation by Fenton systemKonrad Żurawski, Paweł Piszcz, Bronisław K. Głód10

Obradom towarzyszyły prezentacje i wykłady firm chromatograficznych:1. Janusz Polkowski, Merck;2. Witold Ryttel, Knauer;3. Lech Rombalski, Varian/Candela;4. John Podgórski, Shimadzu.Materiały konferencyjne zostały wydane w postaci książki abstraktów.Dodatkowo uczestnicy otrzymali dwie monografie: Wysokosprawna chromatografiacieczowa: Podstawy teoretyczne (B.K. Głód, P. Piszcz) i Postępychromatografii (Monografie nr 111, B.K. Głód, red.). Druga z nich pomyślanazostała jako pierwsza z cyklu monografii poświęconych najnowszym trendomw chromatografii, zawierająca prace przeglądowe w języku polskim.Spotkaniu towarzyszyły imprezy dodatkowe, bankiet powitalny,uświetniony występem Piotra Gozdka, ucznia Szkoły Muzycznej w Siedlcachi Mistrza Świata w tańcu oraz koncertem fortepianowym prof. Moniki Waksmundzkiej-Hajnos,ognisko.Zorganizowana wycieczka po Siedlcach i okolicach obejmowała zwiedzaniezabytkowego, XVIII-wiecznego kościoła w Żeliszewie Podkościelnym, Siedlecoraz pałacu Ogińskich w Siedlcach, który obecnie jest siedzibą władzAkademii Podlaskiej. Niewątpliwie w pamięci wszystkich pozostanie wizytaw Muzeum Diecezjalnym w Siedlcach, gdzie podziwiano Ekstazę św. Franciszka,dzieło El Greca.11

Podczas konferencji zaproponowano, aby spotkania odbywały się cyklicznie,corocznie. Następne odbędzie się w dniach 12-15 września 2010 r.Zrodził się również pomysł utworzenia Polskiego Towarzystwa Nauk o Roz-12

dzielaniu. Wydawać ono będzie czasopismo Postępy Chromatografii, w którympublikowane będą artykuły oryginalne w języku angielskim i przeglądowew języku polskim.Organizatorzy I Podlaskiego Spotkania Chromatograficznego dziękująsponsorom: Prezydent Miasta Siedlce, Merc, Polimex Mostostal, Atut,Arche, Carsed, Drosed, MPK Siedlce, Knauer Polska, Chromdes, BrukerPolska, Prima, bez których pomocy zorganizowanie konferencji byłoby niemożliwe.13

Bronisław K. GŁÓD 1 , Marian KAMIŃSKI 21Instytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej, Akademia Podlaskaul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce2e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.plPolitechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, 80-233 Gdańsk,ul. Narutowicza 11/12, e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl; tel. (58) 347-17-29POLSKIE TOWARZYSTWO NAUK O ROZDZIELANIUPOLISH SOCIETY OF THE SEPARATION SCIENCESDeklaracja Założycielska Polskiego Towarzystwa Nauk o RozdzielaniuReymontówka - Kotuń/Chlewiska, 22.09.2009 r.Burzliwy rozwój w okresie ostatnich dziesięcioleci technik i metodchromatografii, a także wielu innych technik i metod rozdzielania, tak w zastosowaniudo przygotowania próbki do analityki i oznaczania składnikówmieszanin, jak i do oczyszczania produktów oraz otrzymywania czystychsubstancji w skali prepratywnej i procesowej, w tym do produkcji wielu rodzajówproduktów przemysłu farmaceutycznego, biotechnologii, biochemiitechnicznej i innych dziedzin wytwórczości, powoduje potrzebę podniesieniaefektywności badań i poszukiwań optymalnych - maksymalnie efektywnychwarunków realizacji rozdzielania, a także wprowadzenia szerokiego nauczanianowoczesnych technik i technologii rozdzielania.Potrzebne jest także organizowanie odpowiednich konferencji, sympozjów,szkoleń oraz redakcja i wydawanie podręczników, a być może teżbyłoby celowe założenie polskiego czasopisma specjalistycznego w zakresierozdzielania - publikacje oryginalne w języku angielskim, z obszernym „opisem”polsko-języcznym, publikacje przeglądowe w języku polskim, z obszernym„opisem” w języku angielskim.Biorąc pod uwagę okoliczność odkrycia kolumnowej chromatografiielucyjnej przez dr. M. Cwieta w Warszawie, wieloletnią tradycję w Polscew zakresie badań teoretycznych, aplikacyjnych, a także prac badawczo--rozwojowych i techniczno-konstrukcyjnych nad aparaturą do nowoczesnychtechnik rozdzielania w Polsce, zainicjowanych i kierowanych przez nieżyjącychjuż naszych nauczycieli, takich jak prof. prof. A. Waksmundzki,W. Kemula, J.S. Kowalczyk, A. Suprynowicz. D. Sybilska i inni, uważamy zacelowe utworzenie i doprowadzenie do aktywnego dzialania Polskie TowarzystwoNauk o Rozdzielaniu, akronim - PT-NoR.Podpisali:Tadeusz Dzido, Bronisław K. Głód, Stanisław Kalembasa, Marian Kamiński,Andrzej Stołyhwo, Monika E. Waksmundzka-Hajnos, Paweł Zarzycki15

STATUT POLSKIEGO TOWARZYSTWA NAUKO ROZDZIELANIUpropozycjaRozdział INazwa, teren, działalność, siedziba władz i charakter prawny§ 1Stowarzyszenie nosi nazwę Polskie Towarzystwo Nauk o Rozdzielaniu,akronim PT-NoR, zwane w dalszej części statutu „Towarzystwem”. Nazwaangielskojęzyczna – Polish Society of Separation Sciences, w skróciePSSS.§ 2Terenem działalności Towarzystwa jest obszar Rzeczypospolitej Polskiej,a siedzibą Dom Pracy Twórczej Reymontówka w Kotuniu.§ 3Towarzystwo jest zarejestrowanym stowarzyszeniem naukowym i naukowo--technicznym, działającym na podstawie obowiązującego prawa o stowarzyszeniachi z tego tytułu posiada osobowość prawną.§ 4Towarzystwo może powoływać Oddziały, podlegające legalizacji przez właściwąterenową władzę administracji ogólnej oraz Koła.§ 5Towarzystwo może być członkiem krajowych i zagranicznych stowarzyszeńo tym samym lub podobnym profilu działania.§ 61. Towarzystwo używa pieczęci okrągłej z napisem w otoku: Polskie TowarzystwoNauk o Rozdzielaniu, z napisem pośrodku: z siedzibą w Reymontówcelub Zarząd Oddziału w ....2. Towarzystwo używa pieczęci podłużnych z nazwą i adresem Towarzystwai jego oddziałów.3. Towarzystwo może posiadać odznakę członkowską na podstawie obowiązującychw tym zakresie przepisów.§ 7Towarzystwo opiera swą działalność na pracy społecznej ogółu członków.16

Rozdział IICele i środki działania§ 8Celem Towarzystwa jest:1. propagowanie postępu nauki, techniki i technologii rozdzielania wśródzajmujących się tym zawodowo lub sporadycznie pracowników nauki,przemysłu oraz innych specjalistów, a także studentów i uczniów szkółśrednich,2. zachęcanie ww. osób do badań, rozwoju i stosowania w praktyce najnowszychosiągnięć w zakresie technik i technologii rozdzielania orazwdrażania tychże do praktyki,3. reklama polskich osiągnięć w zakresie technik i technologii rozdzielaniamieszanin poza granicami Rzeczypospolitej Polskiej.§ 9Towarzystwo realizuje swe cele przez:1. prowadzenie działalności wydawniczej w postaci monografii, periodykóworaz czasopism naukowych i popularnoszkoleniowych,2. prowadzenie kursów szkoleniowych,3. organizowanie zjazdów, konferencji naukowych oraz wystaw,4. opiniowanie i zgłaszanie wniosków w sprawie odznaczeń i nagród państwowychdla członków Towarzystwa,5. wydawanie opinii fachowych dla władz państwowych i organizacji społecznych,6. współpracę i utrzymywanie kontaktów naukowych z pokrewnymi stowarzyszeniamiw kraju i za granicą,7. ogłaszanie konkursów, przyznawanie nagród i udzielanie pomocy na badaniai rozwój o charakterze naukowo-technicznym w zakresie nauko rozdzielaniu.Rozdział IIICzłonkowie, ich prawa i obowiązkiCzłonkowie dzielą się na:1. zwyczajnych,2. wspierających,3. honorowych.§ 10§ 11Członkiem zwyczajnym Towarzystwa może zostać osoba interesująca sięnaukami o rozdzielaniu, która:1. posiada obywatelstwo polskie albo obywatelstwo któregokolwiek z krajówUnii Europejskiej,17

2. Posiada co najmniej średnie wykształcenie ogólnokształcące lub techniczne.§ 12Członek zwyczajny ma prawo do:1. czynnego i biernego wyboru do wszystkich władz Towarzystwa,2. udziału w zebraniach i posiedzeniach, zjazdach, konferencjach naukowych,kursach oraz wycieczkach krajowych i zagranicznych organizowanychprzez Towarzystwo zgodnie z regulaminem uchwalonym przez ZarządGłówny,3. korzystania z bibliotek i zbiorów Towarzystwa,4. działania w sekcjach naukowych zgodnie z posiadaną specjalizacją bądźzainteresowaniem,5. noszenia odznaki Towarzystwa.§ 13Członków zwyczajnych przyjmuje właściwy terenowo Zarząd Oddziału napodstawie pisemnej deklaracji podpisanej przez dwóch członków wprowadzających.§ 141. Członkiem wspierającym może być osoba prawna lub fizyczna zainteresowanamerytoryczną działalnością Towarzystwa, która zadeklaruje poparciefinansowe lub rzeczowe dla Towarzystwa.2. Członków wspierających - osoby prawne, przyjmuje na podstawie pisemnejdeklaracji, Zarząd Główny; członków wspierających, osoby fizyczne,przyjmuje Zarząd Oddziału.3. Członek wspierający ma prawo do korzystania z pomocy Towarzystwa nazasadach określonych w regulaminie uchwalonym przez Zarząd Główny.4. Członkowie wspierający, osoby prawne, działają w Towarzystwie poprzezswoich przedstawicieli.§ 151. Członkostwo honorowe nadaje na wniosek Zarządu Głównego WalneZgromadzenie Delegatów osobom, które położyły wybitne zasługiw dziedzinie nauk o rozdzielaniu albo szczególne zasłużyły się Towarzystwu.2. Członek honorowy posiada wszystkie prawa i obowiązki członka zwyczajnego,a ponadto jest zwolniony od obowiązku płacenia składekczłonkowskich.§ 16Członek zwyczajny jest zobowiązany do:1. przestrzegania postanowień statutu, regulaminów i uchwał władz Towarzystwa,2. aktywnego udziału w realizacji celów statutowych Towarzystwa,18

3. przestrzegania norm współżycia społecznego i etyki zawodowej,4. regularnego opłacania składek członkowskich w wysokości ustalonejprzez Walne Zgromadzenie Delegatów Towarzystwa.§ 17Członkostwo zwyczajne ustaje na skutek:1. dobrowolnego wystąpienia członka zgłoszonego na piśmie ZarządowiOddziału,2. skreślenia przez Zarząd Oddziału z powodu zalegania z opłatą składekczłonkowskich za okres jednego roku, pomimo dwukrotnego pisemnegoupomnienia,3. wykluczenia za działalność na szkodę Towarzystwa bądź poważne naruszeniezasad etyki, na podstawie prawomocnego orzeczenia Sądu Koleżeńskiegolub w przypadku skazania wyrokiem sądu powszechnego nakarę dodatkową utraty praw publicznych.§ 18Od prawomocnego orzeczenia Sądu Koleżeńskiego, o którym mowa w § 17pkt. 3, dotyczącego wykluczenia członka z Towarzystwa, przysługuje członkowiprawo odwołania się do Walnego Zgromadzenia Delegatów.§ 191. Członkostwo członka wspierającego - osoby prawnej ustaje na skutek:1) dobrowolnej rezygnacji zgłoszonej na piśmie Zarządowi Głównemu,2) skreślenia na podstawie uchwały Zarządu Głównego w związkuz utratą osobowości prawnej.2. Członkostwo członka wspierającego - osoby fizycznej ustaje na skutek:1) dobrowolnej rezygnacji zgłoszonej na piśmie Zarządowi Oddziału,2) uchwały Zarządu Oddziału podjętej w związku z niewypełnianiemprzyjętych zobowiązań finansowych bądź rzeczowych.Rozdział IVWładze Towarzystwa§ 201. Władzami Towarzystwa są:1) Walne Zgromadzenie Delegatów,2) Zarząd Główny,3) Główna Komisja Rewizyjna,4) Sąd Koleżeński.2. Kadencja wszystkich władz trwa trzy lata, a wybór odbywa się w głosowaniujawnym lub tajnym, w zależności od uchwały Walnego ZgromadzeniaDelegatów.3. Członkowie władz pełnią swe funkcje honorowo na zasadzie działalnościspołecznej.19

4. O ile postanowienia statutu nie stanowią inaczej, uchwały władz Towarzystwapodejmowane są zwykłą większością głosów przy obecności conajmniej połowy osób uprawnionych do głosowania.§ 211. Najwyższą władzą Towarzystwa jest Walne Zgromadzenie Delegatówzwoływane przez Zarząd Główny.2. Walne Zgromadzenie Delegatów może być zwyczajne lub nadzwyczajne.§ 22Do kompetencji Zwyczajnego Walnego Zgromadzenia Delegatów należy:1. podejmowanie uchwał wytyczających główne kierunki działalności merytoryczneji finansowej Towarzystwa,2. rozpatrywanie i przyjmowanie sprawozdań z działalności ZarząduGłównego, Głównej Komisji Rewizyjnej i Sądu Koleżeńskiego,3. udzielanie absolutorium ustępującemu Zarządowi Głównemu na wniosekGłównej Komisji Rewizyjnej,4. wybór prezesa Zarządu Głównego spośród członków zwyczajnych, posiadającychtytuł profesora lub stopień naukowy doktora habilitowanegoalbo jego odpowiednik,5. wybór członków Zarządu Głównego, członków Głównej Komisji Rewizyjneji ich zastępców oraz członków Sądu Koleżeńskiego,6. zatwierdzanie regulaminu Zarządu Głównego, Głównej Komisji Rewizyjneji Sądu Koleżeńskiego oraz regulaminu obrad Walnego ZgromadzeniaDelegatów,7. zatwierdzanie sprawozdań finansowych oraz wytycznych do planówfinansowych,8. uchwalanie wysokości składek członkowskich oraz zasad podziałuwpływów ze składek członkowskich pomiędzy Zarząd Główny i Oddziały,9. nadawanie i pozbawianie członkostwa honorowego oraz innych godnościhonorowych,10. podejmowanie uchwały o przystąpieniu lub wystąpieniu ze stowarzyszeń,o których mowa w § 5,11. rozpatrywanie odwołań od orzeczeń Sądu Koleżeńskiego, o którychmowa w § 35,12. podejmowanie uchwał o zmianie statutu,13. podejmowanie uchwał o przyjęciu i zmianach zasad etyczno--deontologicznych,14. podejmowanie uchwały o rozwiązaniu się Towarzystwa albo zmiany jegonazwy,15. podejmowanie uchwał w sprawach wniesionych przez Zarząd Główny,Główną Komisję Rewizyjną lub Zarządy Oddziałów Towarzystwa.20

§ 23Uchwały Walnego Zgromadzenia Delegatów zapadają zwykłą większościągłosów przy obecności co najmniej połowy delegatów w pierwszymterminie, w drugim terminie bez względu na liczbę obecnych delegatów.§ 241. W Walnym Zgromadzeniu Delegatów z głosem stanowiącym biorą udziałdelegaci Oddziałów wybrani na Walnych Zebraniach Członków Oddziałówwedług klucza wyborczego ustalonego każdorazowo przez ZarządGłówny.2. W Walnym Zgromadzeniu Delegatów z głosem doradczym biorą udział:1) członkowie ustępujących władz, jeżeli nie zostali wybrani delegatami,2) członkowie honorowi, jeżeli nie zostali wybrani delegatami,3) goście zaproszeni przez Zarząd Główny.§ 25O terminie i miejscu obrad Zwyczajnego Walnego Zgromadzenia DelegatówZarząd Główny zawiadamia Zarządy Oddziałów co najmniej na trzy miesiąceprzed zwołaniem Walnego Zgromadzenia z podaniem proponowanego porządkuobrad.§ 261. Nadzwyczajne Walne Zgromadzenie Delegatów może być zwołane przezZarząd Główny:1) z własnej inicjatywy,2) na wniosek Głównej Komisji Rewizyjnej,3) na wspólny wniosek Zarządów co najmniej trzech Oddziałów Towarzystwazgłoszony na piśmie Zarządowi Głównemu.2. Nadzwyczajne Walne Zgromadzenie Delegatów jest zwoływane przezZarząd Główny w terminie trzech miesięcy od daty podjęcia uchwałybądź zgłoszenia wniosku i obraduje nad sprawami, dla których zostałozwołane. W Nadzwyczajnym Walnym Zgromadzeniu delegatów biorąudział delegaci wybrani na ostatnie Zwyczajne Walne Zgromadzenie Delegatów.3. O miejscu i terminie Nadzwyczajnego Walnego Zgromadzenia DelegatówZarząd Główny zawiadamia delegatów za pośrednictwem Zarządów Oddziałówprzynajmniej na 45 dni przed ustalonym terminem zgromadzenia,podając porządek obrad.§ 271. Zarząd Główny składa się co najmniej z pięciu członków wybranychprzez Walne Zgromadzenie Delegatów, w tym: prezesa, dwóch wiceprezesów,sekretarza i skarbnika oraz członków Zarządu wchodzącychw skład Zarządu Głównego „z urzędu” - prezesów wszystkich OddziałówTowarzystwa. Przy czym Walne Zgromadzenie wybiera prezesa i pozostałychczłonków Zarządu Głównego, nie wchodzących z urzędu do Za-21

ządu. Poszczególne funkcje w ramach Zarządu Głównego są stanowionezwykłą większością głosów na wniosek Prezesa Zarządu Głównegopodczas pierwszego posiedzenia Zarządu, które powinno mieć miejscepodczas trwania Walnego Zgromadzenia.2. Prezes i funkcyjni członkowie Zarządu Głównego wybrani zgodnie z ust. 1tworzą Prezydium Zarządu Głównego.3. W przypadku rezygnacji z pełnienia funkcji, utraty zdolności do jej sprawowanialub śmierci prezesa, jego obowiązki do końca kadencji przejmujejeden z wiceprezesów powołany przez Zarząd Główny.4. W przypadku, o którym mowa w ust 3, w odniesieniu do skarbnika, lubsekretarza, jego obowiązki przejmuje członek Zarządu powołany przezZarząd Główny.5. Zarząd Główny ma prawo dokooptować nowych członków wchodzącychw skład Zarządu Głównego spośród członków zwyczajnych Towarzystwaw miejsce tych, którzy ustąpili w czasie trwania kadencji, z tym że liczbadokooptowanych nie może przekroczyć dwóch osób.§ 28Do kompetencji Zarządu Głównego należy:1. reprezentowanie Towarzystwa na zewnątrz i działanie w jego imieniu,2. kierowanie działalnością Towarzystwa zgodnie z postanowieniami statutuoraz uchwałami i wytycznymi Walnego Zgromadzenia Delegatów,3. uchwalanie okresowych planów działalności naukowej, naukowo--technicznej i organizacyjnej,4. powoływanie i rozwiązywanie Oddziałów Towarzystwa, sekcji naukowychi ich zespołów, komisji problemowych stałych i okresowych orazsprawowanie nadzoru nad ich działalnością,5. uchwalanie regulaminów działalności Prezydium Zarządu Głównego,Oddziałów Towarzystwa, kół, sekcji naukowych oraz innych regulaminówwewnętrznych,6. powoływanie prezesa i skarbnika w przypadku, o którym mowa w § 27ust. 3 i 4,7. przyjmowanie i skreślanie członków wspierających - osób prawnych,8. ustalanie terminu i miejsca Zwyczajnego Walnego Zgromadzenia Delegatów,9. występowanie z wnioskiem do Walnego Zgromadzenia Delegatówo nadanie lub o pozbawienie członkostwa honorowego oraz innychgodności honorowych,10. występowanie z wnioskami do Walnego Zgromadzenia Delegatówo przystąpienie do stowarzyszeń krajowych i zagranicznych,11. ustalanie terminu, miejsca oraz zasad organizacyjnych zjazdów naukowychTowarzystwa,12. powoływanie przewodniczącego Rady Programowej zjazdu naukowegoTowarzystwa,13. ogłaszanie konkursów, przyznawanie nagród i udzielanie pomocy nabadania,22

14. opiniowanie i zgłaszanie wniosków w sprawie odznaczeń państwowychdla farmaceutów - członków Towarzystwa,15. przyznawanie odznaczeń honorowych Towarzystwa w trybie zatwierdzanymprzez Walne Zgromadzenie Delegatów,16. uchwalanie budżetu i zatwierdzanie sprawozdań finansowych Towarzystwa,17. zarządzanie majątkiem i funduszami Towarzystwa przez przyjmowaniedarowizn i zapisów,18. podejmowanie uchwał o nabywaniu i obciążaniu majątku nieruchomegoTowarzystwa,19. występowanie do Sądu Koleżeńskiego o wszczęcie postępowaniaw sprawach będących w kompetencji tego Sądu,20. powoływanie i odwoływanie dyrektora Biura Zarządu Głównego orazzatwierdzanie regulaminu Biura Zarządu Głównego,21. nadzór nad działalnością wydawniczą Towarzystwa.§ 291. Posiedzenia Zarządu Głównego odbywają się w miarę potrzeby, nie rzadziejjednak niż raz na pół roku.2. Uchwały Zarządu Głównego zapadają zwykłą większością głosów przyobecności co najmniej połowy członków, w tym prezesa lub jednegoz wiceprezesów. W razie równej liczby głosów rozstrzyga głos przewodniczącegozebrania.§ 301. W skład Prezydium Zarządu Głównego wchodzą: prezes, dwóch wiceprezesów,sekretarz i skarbnik. W razie takiej potrzeby, Zarząd może rozszerzyćPrezydium o dwóch członków zarządu.2. Wiceprezesów, sekretarza i skarbnika wybiera Zarząd Główny, na wniosekprezesa, z listy członków Zarządu.§ 311. Prezydium Zarządu Głównego kieruje działalnością Towarzystwa w okresiepomiędzy posiedzeniami Zarządu Głównego zgodnie z regulaminemPrezydium uchwalonym przez Zarząd Główny.2. Posiedzenia Prezydium odbywają się w miarę potrzeby, nie rzadziej jednakniż raz na 3 miesiące.3. Uchwały Prezydium Zarządu Głównego zapadają zwykłą większościągłosów przy obecności co najmniej połowy członków Prezydium, w tymprezesa lub jednego z wiceprezesów i podlegają zatwierdzeniu na najbliższymposiedzeniu Zarządu Głównego.23

§ 32Główna Komisja Rewizyjna składa się z 3 członków i 2 zastępców członków.Komisja wybiera przewodniczącego spośród członków.§ 331. Główna Komisja Rewizyjna jest powołana do przeprowadzenia co najmniejraz w roku kontroli całokształtu działalności Towarzystwa, zeszczególnym uwzględnieniem gospodarki finansowej.2. Główna Komisja Rewizyjna ma prawo występowania do Zarządu Głównegoz wnioskami wynikającymi z ustaleń kontroli oraz żądania wyjaśnień.3. Przewodniczący i członkowie Głównej Komisji Rewizyjnej mogą braćudział w posiedzeniach Zarządu Głównego i Prezydium z głosem doradczym.§ 34Szczegółowy zakres działania Głównej Komisji Rewizyjnej określa regulaminGłównej Komisji Rewizyjnej zatwierdzony przez Walne Zgromadzenie Delegatów.§ 351. Sąd Koleżeński składa się z 3 członków. Spośród członków Sąd Koleżeńskiwybiera przewodniczącego i sekretarza.2. Do zadań Sądu Koleżeńskiego należy rozpatrywanie spraw naruszaniaprzez członków Towarzystwa statutu Towarzystwa, uchwał władz Towarzystwa,zasad deontologii, a także rozpatrywanie sporów wynikłych pomiędzyczłonkami Towarzystwa.3. Sąd Koleżeński orzeka jedno-instancyjnie.4. Orzeczenia Sądu Koleżeńskiego podlegają zaskarżeniu do ZarząduGłównego, którego rozstrzygnięcia są ostateczne.5. Szczegółowy tryb postępowania Sądu Koleżeńskiego określa regulaminSądu Koleżeńskiego zatwierdzony przez Walne Zgromadzenie Delegatów.Rozdział VOddziały Terenowe Towarzystwa§ 361. Oddziały Terenowe Towarzystwa powstają na podstawie uchwały ZarząduGłównego na terenie, na którym zamieszkuje bądź pracuje co najmniej25 członków Towarzystwa.2. Teren działalności Oddziału i miejsce siedziby ustala Zarząd Główny.24

§ 371. Władzami Oddziału są:1) Walne Zebranie Członków Oddziału,2) Zarząd Oddziału,3) Komisja Rewizyjna Oddziału.2. Przepisy § 20 ust 2 do 4 stosuje się odpowiednio do władz Oddziału.§ 381. Najwyższą władzą Oddziału jest Walne Zebranie Członków Oddziałuzwoływane przez Zarząd Oddziału.2. Walne Zebranie Członków Oddziału może być zwyczajne lub nadzwyczajne.§ 39Do kompetencji Walnego Zebrania Członków Oddziału należy:1. uchwalanie kierunków działalności merytorycznej i finansowej Oddziałuzgodnie z postanowieniami statutu oraz uchwałami i wytycznymi władzTowarzystwa,2. rozpatrywanie i przyjmowanie sprawozdań z działalności Zarządu Oddziałuna wniosek Komisji Rewizyjnej Oddziału,3. udzielanie absolutorium ustępującemu Zarządowi Oddziału na wniosekKomisji Rewizyjnej Oddziału,4. wybór prezesa i członków Zarządu Oddziału,5. wybór członków i zastępców członków Komisji Rewizyjnej Oddziału,6. wybór delegatów na Walne Zgromadzenie Delegatów Towarzystwa,7. uchwalanie wniosków i dezyderatów dotyczących działalności Towarzystwa.§ 40Uchwały Walnego Zebrania Członków Oddziału zapadają zwykłą większościągłosów przy obecności co najmniej połowy członków Oddziału w pierwszymterminie, w drugim terminie bez względu na liczbę obecnych.§ 411. Nadzwyczajne Walne Zebranie Członków Oddziału może być zwołanez inicjatywy Zarządu Głównego, Zarządu Oddziału, na wniosek KomisjiRewizyjnej Oddziału lub 1/5 liczby członków Oddziału.2. Nadzwyczajne Walne Zebranie Członków Oddziału zwołuje Zarząd Oddziałuw terminie 30 dni od daty zgłoszenia wniosku i obraduje nad sprawami,dla których zostało zwołane.§ 421. O terminie, miejscu i porządku obrad Walnego Zebrania Członków OddziałuZarząd Oddziału zawiadamia członków Oddziału co najmniej na14 dni przed zwołaniem zebrania.25

2. W Walnym Zebraniu Członków Oddziału biorą udział z głosem stanowiącymwszyscy członkowie Oddziału, a z głosem doradczym zaproszenigoście.§ 431. Zarząd Oddziału składa się z nie więcej niż 9 członków, w tym prezesa,wiceprezesa, sekretarza i jego zastępcy oraz skarbnika.2. Zarząd Oddziału ma prawo kooptacji nowych członków w miejsce tych,którzy ustąpili w czasie trwania kadencji, z tym że liczba dokooptowanychnie może przekroczyć 1/3 liczby członków Zarządu Oddziału pochodzącychz wyboru.§ 44Do kompetencji Zarządu Oddziału należy:1. reprezentowanie Oddziału na zewnątrz i działanie w jego imieniu naswoim terenie,2. kierowanie działalnością Oddziału zgodnie z postanowieniami statutui uchwałami władz Towarzystwa,3. przyjmowanie członków zwyczajnych i kandydatów na członków zwyczajnych,4. przyjmowanie i skreślanie członków wspierających - osób fizycznych,5. przyjmowanie i skreślanie członków – osób prawnych,6. powoływanie i rozwiązywanie kół Towarzystwa i sekcji naukowych oraznadzorowanie ich działalności,7. uchwalanie budżetu i zatwierdzanie bilansu Oddziału,8. zarządzanie majątkiem Oddziału w ramach uprawnień przyznanychprzez Zarząd Główny,9. składanie okresowych sprawozdań Zarządowi Głównemu,10. zgłaszanie Zarządowi Głównemu wniosków o nadanie godności członkahonorowego Towarzystwa,11. zgłaszanie Zarządowi Głównemu wniosków o przyznanie nagródi odznaczeń państwowych dla członków Oddziału,12. występowanie do Sądu Koleżeńskiego o wszczęcie postępowaniaw sprawach o naruszenie przez członka Oddziału statutu Towarzystwa,uchwał władz Towarzystwa bądź zasad deontologii.§ 451. Posiedzenia Zarządu Oddziału odbywają się w miarę potrzeby, nie rzadziejniż raz na kwartał.2. Uchwały Zarządu Oddziału podejmowane są zwykłą większością głosówprzy obecności co najmniej połowy członków, w tym prezesa lub wiceprezesa.W razie równości głosów rozstrzyga głos przewodniczącego zebrania.26

§ 461. Do zadań Komisji Rewizyjnej Oddziału należy kontrola całokształtu działalnościOddziału, ze szczególnym uwzględnieniem gospodarki finansowej,co najmniej raz w roku.2. Komisja Rewizyjna Oddziału ma prawo występowania do Zarządu Oddziałuz wnioskiem z ustaleń kontroli.3. Członkowie Komisji Rewizyjnej Oddziału mogą brać udział w posiedzeniachZarządu Oddziału z głosem doradczym.4. Komisja Rewizyjna Oddziału obejmuje swoją działalnością koła istniejącena terenie Oddziału.Rozdział VIKoła Towarzystwa§ 471. Koła Towarzystwa powstają na podstawie uchwały Zarządu Oddziału.2. Teren działalności Koła i jego siedzibę ustala Zarząd Oddziału.3. Do powołania Koła wymagana jest liczba co najmniej 7 członków Towarzystwa.Władzami Koła są:1. Zebranie Członków Koła,2. Zarząd Koła.§ 48§ 491. Najwyższą władzą Kola jest Zebranie Członków Koła.2. Do kompetencji Zebrania Członków Koła należy:1) uchwalanie kierunków działania na danym terenie, zgodnie z wytycznymii uchwałami władz Oddziału,2) rozpatrywanie i przyjmowanie sprawozdań z działalności ZarząduKoła,3) udzielanie absolutorium ustępującemu Zarządowi Koła na wniosekKomisji Rewizyjnej Oddziału,4) wybór Zarządu Koła.3. W Walnym Zebraniu Członków Koła mogą brać udział z głosem doradczymprzedstawiciele Zarządu Oddziału i Komisji Rewizyjnej Oddziałuoraz zaproszeni goście.§ 501. Zarząd Koła składa się z nie więcej niż 3 członków, spośród których wybieraprzewodniczącego, jego zastępcę i sekretarza. Zastępca przewodniczącegopełni jednocześnie funkcję skarbnika Koła.27

2. Zarząd Koła realizuje statutowe cele Towarzystwa na obszarze objętymjego działalnością:1) kieruje działalnością Koła,2) składa Zarządowi Oddziału roczne sprawozdanie ze swej działalności.Rozdział VIIBiuro Zarządu Głównego§ 511. Działalność administracyjno-organizacyjną Towarzystwa prowadzi BiuroZarządu Głównego.2. Biurem Zarządu Głównego kieruje dyrektor powoływany i odwoływanyzgodnie z § 28 pkt 20 statutu.3. W skład Biura Zarządu Głównego wchodzą działy i inne jednostki organizacyjneustalone w jego regulaminie, zatwierdzanym przez Zarząd Główny.4. Działem finansowym Biura Zarządu Głównego kieruje księgowy.5. Do pracowników Biura Zarządu Głównego nie stosuje się § 7 statutu.Rozdział VIIIMajątek i fundusze Towarzystwa§ 52Majątek Towarzystwa stanowią nieruchomości i fundusze.§ 53Na fundusze Towarzystwa składają się:1. składki członkowskie,2. dochody z majątku nieruchomego i ruchomego Towarzystwa,3. dotacje, darowizny i zapisy,4. wpływy z wydawnictw i zjazdów naukowych osiągnięte w ramach realizacjizadań statutowych,5. wpływy z własnej działalności związanej z realizacją zadań statutowych.§ 541. Do składania oświadczeń w zakresie praw i obowiązków majątkowychTowarzystwa upoważnieni są prezes i skarbnik łącznie.2. Prezes Towarzystwa może upoważnić do składania oświadczeń, o którychmowa w ust 1, wiceprezesów i dyrektora Biura Zarządu Głównego,a skarbnik - głównego księgowego.3. W przypadku opisanym w § 27 ust 4. prawo składania oświadczeńw zakresie praw i obowiązków majątkowych Towarzystwa uzyskuje członekPrezydium powołany przez Zarząd Główny.4. Osoby upoważnione przez prezesa i skarbnika działają w granicachudzielonego pełnomocnictwa.28

Rozdział IXZmiana statutu i rozwiązanie Towarzystwa§ 55Uchwałę w sprawie zmiany statutu podejmuje Walne Zgromadzenie Delegatówwiększością 2/3 głosów przy obecności co najmniej połowy osób uprawnionychdo głosowania.§ 561. Uchwałę o rozwiązaniu się Towarzystwa podejmuje Walne ZgromadzenieDelegatów większością 2/3 głosów przy obecności co najmniej połowyosób uprawnionych do głosowania.2. Uchwała o rozwiązaniu się Towarzystwa określa sposób likwidacji orazcel, na jaki ma być przeznaczony majątek Towarzystwa. Majątek Towarzystwapowinien być przekazany pokrewnej instytucji, której działalnośćjest zgodna z niniejszym statutem.3. W sprawach nie uregulowanych niniejszym statutem mają zastosowaniepostanowienia prawa o stowarzyszeniach.Tekst statutu zgodny z uchwałąWalnego Zgromadzenia Członków Założycieli Polskiego Towarzystwa Nauko Rozdzielaniuz dnia 22 września 2009 r.29

Grzegorz BOCZKAJ 1 , Marian KAMIŃSKI 2Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 1 , mknkj@chem.pg.gda.pl 2 ,tel. (58) 347-17-29BADANIA KORELACJI RETENCJIZ WŁAŚCIWOŚCIAMI FIZYKOCHEMICZNYMIWYBRANYCH GRUP ORGANICZNYCH ZWIĄZKÓW SIARKIW PODZIAŁOWEJ CHROMATOGRAFII GAZOWEJZastosowanie podziałowej chromatografii gazowej z niepolarną ciekłą faząstacjonarną pozwala na elucję analitów zgodnie z ich temperaturą wrzenia. Na tejpodstawie powstała metoda symulowanej destylacji, w której wykorzystuje się chromatografięgazową i wzorce temperatury wrzenia w postaci n-parafin do wyznaczaniakrzywych destylacji produktów naftowych. Zależności korelacyjne wynikającez możliwości przewidzenia oddziaływań, a zatem retencji analitów dla określonejgrupy związków wykorzystano w budowie modeli obliczenia retencji na podstawiebudowy i właściwości fizykochemicznych wielu grup związków.W niniejszej pracy zbadano możliwość wyznaczenia wzorów korelacyjnychdla obliczania wartości czasu retencji lotnych i średnio lotnych związków siarki (tioli,siarczków, disiarczków, alkilo-tiofenów) na podstawie ich podstawowych własności fizykochemicznych.Zbadano korelację wartości czasu retencji z temperaturą wrzeniaoraz masą cząsteczkową analizowanych grup związków siarki. Analizę przeprowadzonodla dwóch programów temperatury.Stwierdzono wysoką liniową korelację dla n-tioli, siarczków, disiarczków oraztiofenu i alkilo-tiofenów. Dla zależności wartości czasu retencji od masy cząsteczkowej(R 2 = 0,9992-0,9181) oraz od temperatury wrzenia (R 2 = 1,0-0,9658). Znaczneodchylenia retencji wykazywały natomiast di-tiole, dla których, korelacja wartościczasu elucji z temperaturą wrzenia nie wykazują zgodności względem innych analizowanychzwiązków oraz wykazują wyższą korelację wartości czasu retencji względemmasy cząsteczkowej niż temperatury wrzenia.WSTĘPAnalityka lotnych związków siarki, stanowi ważny aspekt współczesnejchemii analitycznej [1]. Dotyczy to zarówno zagadnień związanych z ich emisjąi wysoką odorowością [2, 3], jak również ich limitowanej zawartościw produktach ropopochodnych (m.in. benzyna, olej napędowy) oraz związanejz tym kontroli procesowej odsiarczania frakcji naftowych [4].Zastosowanie chromatografii gazowej z selektywną detekcją związkówsiarki pozwala na szczegółową analizę ich zawartości w analizowanychstrumieniach ciekłych lub gazowych. W większości przypadków identyfikacjidokonuje się na podstawie wartości czasu retencji substancji wzorcowychlub indeksów retencji. Niekiedy w identyfikacji wykorzystuje się równieżspektrometrię mas jako dodatkowe potwierdzenie identyfikacji [5].31

Jednocześnie od wielu lat prowadzone są badania nad możliwościądodatkowej identyfikacji, bez konieczności posiadania wszystkich potrzebnychsubstancji wzorcowych. Wiele prac dotyczy możliwości obliczenia(przewidzenia) retencji na podstawie struktury związków [6, 7], m.in. wielopierścieniowychwęglowodorów heterocyklicznych siarki [6, 7, 9, 11], orazich właściwości fizykochemicznych. Większość wyników uzyskiwana jestw postaci indeksów retencji [8-11].W niniejszej pracy zbadano możliwość dodatkowej identyfikacji lotnychzwiązków siarki na podstawie korelacji wartości czasu retencji z właściwościamifizykochemicznymi, tj. temperatura wrzenia i masa cząsteczkowa.METODYKAMateriały:Wykorzystane w pracy odczynniki (n-pentan) i wzorce miały czystośćpowyżej 96% m/m.W pracy wykorzystano następujące substancje wzorcowe:- n-tiole: etanotiol, 1-propanotiol, 1-pentanotiol, 1-heksanotiol, 1-heptanotiol,1-dekanotiol,- ditiole: 1,2- etanoditionl, 1,3-propanoditiol, 1,4-butanoditiol.- siarczki organiczne: siarczek dimetylu, siarczek dietylu, siarczekdi(n-propylu), siarczek di(n-butylu).- disiarczki: disiarczek węgla, disiarczek dimetylu, disiarczek di(n-propylu),disiarczek di(tert-butylu).- tiofen i alkilotiofeny: 2-metylotiofen, 3-metylotiofen, 2-etylotiofen.Wyposażenie:Chromatograf gazowy HP 6890 (Hewlett-Packard, USA) z detektorem PFPDmodel 5380 (OI Analytical), kolumna kapilarna do chromatografii gazowej60 m x 0,32 mm x 1,0 µm HP1 (Hewlett-Packard, USA).Metody postępowania:Sporządzenie mieszanin wzorcowychWykonano szereg mieszanin wzorców związków siarki (zgodnie z analizowanymigrupami związków) w n-pentanie. Mieszaniny sporządzono w wynikudodania do 10 ml n-pentanu za pomocą mikrostrzykawki 1 µl poszczególnychwzorców siarki, następnie mieszaniny były rozcieńczane w celuuzyskania stężeń związków siarki na poziomie 1 ppm. Mieszaniny wzorcówbyły dozowane do kolumny kapilarnej gazowego chromatografu, w objętości0,2 µl w trybie „split” 100:1.Wyznaczenie wartości czasu retencjiŚrednie wartości czasu retencji wyznaczono na podstawie pięciu rozdzielań.Warunki chromatograficzneTryb dozowania - split 100:1. Temperatura dozownika 300 o C.Przepływ gazu nośnego: 1,2 ml/minProgram temperatury (1): 40 o C utrzymywana 7 minut - przyrost temperatury25°/min do temperatury końcowej 300 o C utrzymywanej 7 minut.32

Program temperatury (2): 40 o C utrzymywana 7 minut - przyrost temperatury5 o /min do 260 o C - przyrost 30 o /min do temperatury końcowej 300 o C utrzymywanej5 minut.Parametry pracy detektora PFPDNapięcie fotopowielacza – 600 V, Range - 10 µA/V, Natężenie prądu w zapalniku- 3,1 ATemperatura detektora - 220 o CMieszanina w komorze spalania:• Wodór 21,0 psig• Powietrze 12,6 psigGaz ściankowy:• Powietrze 14,8 psigCzęstotliwość pracy PFPD – 3,57 HzWYNIKI I DYSKUSJACelem niniejszej pracy było zbadanie możliwości wyznaczenia zależnościkorelacyjnych wartości czasu retencji od właściwości fizykochemicznychposzczególnych grup związków siarkoorganicznych.Należy mieć świadomość, że zastosowanie korelacji wartości czasuretencji z masą cząsteczkową związku może mieć jedynie znaczenie uzupełniającewzględem korelacji z temperaturą wrzenia. Dla izomerów tegosamego związku obliczona na podstawie zależności korelacyjnej z masącząsteczkową wartość czasu retencji będzie taka sama, pomimo że w rzeczywistościosiągalne jest ich pełne rozdzielenie.W tabeli 1 zestawiono właściwości fizykochemiczne [12] i wyznaczonewartości czasu retencji dla analizowanych związków siarki dla dwóch wykorzystywanychprogramów temperatury. Jak wynika z otrzymanych wyników,zastosowana w pracy kolumna kapilarna z niepolarną fazą stacjonarną pozwalana elucję analitów zgodnie z ich temperaturą wrzenia. Stwierdzonojednak, w przypadku ditioli, wyjątki od tej reguły.Zastosowane programy temperatury (1) i (2) pozwoliły na elucjęwszystkich analizowanych związków przed końcem gradientu temperatury.Dzięki takiemu doborowi programów temperatury czynnikiem różnicującymretencję na kolumnie była jedynie szybkość narostu temperatury - w programie(1) – 5 o C/minutę, a w (2) – 25 o C/minutę. Na podstawie danych zestawionychw tabeli 1, sporządzono wykresy 1 i 2 – przedstawiające uzyskanązbieżność wartości czasu retencji z temperaturą wrzenia. Nawykresach widoczne są również odchylenia, które wykazuje retencja ditioli.33

Tabela 1. Zestawienie właściwości fizykochemicznych oraz wyznaczonychwartości czasu retencjiZwiązekwartość czasuretencjiprogramtemperatury(1)R T [min]wartość czasuretencjiprogramtemperatury(2)R T [min]n-TioleTemperaturawrzeniaT w [°C]Masa cząsteczkowaM [g/mol]Etanotiol 8,486 8,797 35 62,131-propanotiol 10,809 12,671 67,5 76,161-pentanotiol 14,375 22,391 126 104,211-heksanotiol 15,452 26,618 152 118,241-heptanotiol 16,3 30,42 175 132,271-dekanotiol 18,299 39,997 240 174,35Siarczki organiczneSiarczek dimetylu 8,845 9,308 38 62,13Siarczek dietylu 12,644 17,015 91 90,19Siarczek di(n-propylu) 15,195 25,395 142,5 118,24Siarczek di(n-butylu) 16,732 32,557 188,5 146,29Disiarczki organiczneDisiarczek dimetylu 13,343 18,848 109 94,2Disiarczek di(npropylu)16,963 33,236 195,5 150,31Siarczek di(tert-butylu) 17,148 34,008 200,5 178,36Disiarczek węgla 9,325 9,928 46 76,14Tiofen i alkilo-tiofenyTiofen 12,051 15,47 84 84,142-metylotiofen 13,841 20,371 113 98,173-metylotiofen 13,947 20,695 115 98,172-etylotiofen 14,977 24,448 133 112,19Ditiole1,2-etanoditiol 14,322 21,974 145 94,21,3-propanoditiol 15,539 26,648 169 108,231,4-butanoditiol 16,063 28,65 196 122,2534

Wykres 1. Zależność wartości czasu retencji od temperatury wrzenia dla analizowanych grupzwiązków siarki. Program temperatury (1).Wykres 2. Zależność wartości czasu retencji od temperatury wrzenia dla analizowanych grupzwiązków siarki. Program temperatury (2).Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że w przypadkuzastosowania mniejszego gradientu temperatury uzyskano lepszą zbieżnośćwartości czasu retencji z temperaturą wrzenia związków siarkoorganicznych.Jak widać na powyższych wykresach, ditiole wykazują znaczneodchylenia od przewidywanej uniwersalnej własności retencji stosowanejw pracy kolumny z niepolarną ciekłą fazą stacjonarną.Dla wszystkich związków, poza ditiolami, stwierdzono elucję zgodnąz temperaturą wrzenia. Zestawienie kolejności elucji przedstawiono w tabeli 2.W tabeli zamieszczono przedział wartości czasu retencji, w zakresie któregoeluowane są ditiole. W pozostałym zakresie kolejność elucji była zgodnaz temperaturą wrzenia.35

Tabela 2. Zestawienie kolejności elucji analizowanych związków siarki dlaprogramów temperatury (1) i (2)Program temperatury (1) Program temperatury (2)ZwiązekT W [°C]R T [min]R T [min]Siarczek di(n-propylu) 142,5 15,195 25,3951,2-etanoditiol 145 14,322 21,9741-heksanotiol 152 15,452 26,6181,3-propanoditiol 169 15,539 26,6481-heptanotiol 175 16,3 30,42Siarczek di(n-butylu) 188,5 16,732 32,557Disiarczek di(n-propylu) 195,5 16,963 33,2361,4-butanoditiol 196,3 16,063 28,65Disiarczekdi(n-tertbutylu)200,5 17,148 34,008Jak wynika z tabeli 2, niezgodność elucji z temperaturą wrzenia występujedla 1,2-etanoditiolu i 1,4-butanoditiolu. Odchylenia odnotowane dladitioli wynikają najprawdopodobniej z ich budowy, tj. obecności dwóch polarnychgrup umiejscowionych symetrycznie po obu stronach łańcucha węglowego.W wyniku występowania grup -SH, oddziaływania z niepolarną faząstacjonarną są ograniczone, co skutkuje niższą retencją.Korelacja wartości czasu retencji z temperaturą wrzenia i masą cząsteczkowąposzczególnych grup związków siarkiAnaliza danych zestawionych tabeli 1 pozwoliła na zbadanie korelacjiwłasności fizykochemicznych z wartościami czasu retencji.Jak przedstawiono na wykresach 1 i 2, wartości czasu retencji silniekorelują z temperaturą wrzenia (z analizy wyłączono ditiole). Wypadkowakrzywa wyznaczona na podstawie regersji liniowej dla zależności wartościczasu retencji od temperatury wrzenia analitów może, w zależności od zastosowanegoprogramu temperatury, być opisana równaniem linii prostej:Program temperatury (1):R T = 0,0488T W + 7,7154, ze współczynnikiem korelacji R² = 0,961,Program temperatury (2):R T = 0,1557T W + 2,8599, R² = 0,9976Analogiczna analiza wartości czasu retencji z masą molekularną wykazaładużo słabszą korelację:Program temperatury (1):R T = 0,079M + 5,1492, R² = 0,874Program temperatury (2):R T = 0,258M – 5,9755, ze współczynnikiem korelacji R² = 0,95,W tabeli 3 zestawiono wyniki analogicznej analizy, szczegółowo– w rozbiciu na poszczególne grupy związków siarki.36

Tabela 3. Porównanie korelacji wartości czasu retencji z temperaturą wrzenia(Tw) i masą cząsteczkową (M) dla poszczególnych grup związków siarkiDisiarczkiorganiczneGrupa Program temperatury (1) Program temperatury (2)związków Równanie R 2 Równanie R 2n-TioleR T = 0,0482T W + 7,5529 0,9658 R T = 0,1549Tw + 2,9245 0,9986R T = 0,0869M+ 4,2836 0,9268 R T = 0,2839 M - 8,0936 0,9905Siarczki organiczneR T = 0,0524Tw + 7,3318 0,9745 R T = 0,1553Tw + 3,213 0,9995R T = 0,0934 M + 3,6165 0,9641 R T = 0,2785 M - 7,9542 0,9992Bez uwzględniania disiarczkuwęgla:R T = 0,0417Tw + 8,7981Z uwzględnianiem disiarczkuwęgla:R T = 0,0494Tw + 7,385610,9886R T = 0,166Tw + 0,7586R T = 0,1574Tw + 2,316510,9986Bez uwzględniania disiarczkuwęgla:R T = 0,048 M + 9,0563Z uwzględnianiem disiarczku0,91810,8683R T = 0,191 M + 1,7697R T = 0,2365 M - 5,50370,91920,9311węgla:R T = 0,0721 M + 5,203R T = 0,0599Tw + 7,0364 0,9994 R T = 0,1813Tw + 0,0814 0,9955Tiofen i alkilo-tiofenyR T = 0,1043M + 3,4633 0,9662 R T = 0,3201M - 11,175 0,9907DitioleR T = 0,0336 Tw + 9,5924 0,9324 R T = 0,1288 Tw + 3,8413 0,9318R T = 0,0621 M + 8,5903 0,9499 R T = 0,238 M - 0,0022 0,9494Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 3 – wartości czasu retencjinajsilniej korelują z temperaturą wrzenia analitów, a silniejszą korelacjęuzyskano dla programu temperatury (2). Wolniejszy narost temperaturypozwala na większe zróżnicowanie retencji poprzez lotność (temperaturęwrzenia) związków.Tym niemniej dla n-tioli i siarczków organicznych również w przypadkuodniesienia wartości czasu retencji do masy cząsteczkowej uzyskano bardzosilną korelację – odpowiednio R 2 = 0,9905 i 0,9992.Dla disiarczków przeanalizowano korelację z i bez dwusiarczku węglaw serii danych. Wyniki wskazują, że retencja disiarczku nie koreluje z innymidisiarczkami. Wynika to najprawdopodobniej z innej budowy cząsteczki –centralnie zlokalizowanego atomu węgla w cząsteczce, a nie, jak ma to miejscew pozostałych disiarczkach, w których centralnie zlokalizowane są dwaatomu siarki. Disiarczki wykazywały również najniższą z analizowanych grupkorelację wartości czasu retencji z masą cząsteczkową.Dla ditioli lepszą korelację uzyskano dla zależności wartości czasu retencjiod masy cząsteczkowej, dla programu temperatury (1).W przypadku uzyskania ściśle liniowej zależności czasu retencji odtemperatury wrzenia, z dużym prawdopodobieństwem można przewidzieć/obliczyćz równania linii prostej czas retencji innych związków należącychdo tej samej grupy czy szeregu homologicznego. Poniżej w tabeli 4 zestawionoanalizowane związki, ich własności fizykochemiczne orazprzewidywane wartości czasu retencji. Dla związków z grupy siarczków obliczonowartości czasu retencji zarówno dla symetrycznych siarczków, jak37

ównież dla niesymetrycznych. Wyniki uzyskane dla siarczków niesymetrycznychmogą być obarczone większym błędem w związku z możliwościąwystępowania odstępstw od liniowości retencji w funkcji temperatury wrzeniawyznaczoanej dla siarczków symetrycznych – zakres posiadanych substancjiwzorcowych nie pozwolił na empiryczną weryfikację tej hipotezy.Tabela 4. Zestawienie danych fizykochemicznych oraz obliczone wartościczasu retencjiGrupaTioleNazwa związkuT wrzenia[°C]Masacząst.[g/mol]1-butanotiol 98 901-oktanotiol 198 1461-nonanotiol 220 1601-undekanotiol - 188 -R T na podstawietemp.wrzenia[min](Prog.Temp.1)12,28(Prog.Temp.2)18,10(1) 17,10(2) 33,59(1) 18,16(2) 37,00R T na podstawieciężarucząst.[min](1) 12,10(2) 17,46(1)16,97(2) 33,36(1) 18,19(2) 37,33(1) 20,62(2) 45,28Różnicapomiędzyobliczonąwartością napodstawieTw i M[s]10,3138,847,5314,331,8414,33-Etylometylosiarczek66,5 76,16(1) 10,82(2) 13,54(1) 10,73(2) 13,265,1917,05Tert-butylometylosiarczek101,5 104,21(1) 12,65(2) 18,98(1) 13,35(2) 21,0741,95125,54Siarczekdiizopropylu120 118,24(1) 13,62(2) 21,85X* -SiarczkiSiarczekdisec-butylu165 146,29(1) 15,98(2) 28,84X* -Siarczekdiizoamylu215,35 174,35(1) 18,62(2) 36,66X* -Siarczekdipentylu210 174,35(1) 18,34(2) 35,83X* -DisiarczkiSiarczekdiheksylu230 202,4Dietylo disiarczek 152 122,25Dibutylo disiarczek331 178,36(1) 19,38(2) 38,93(1) 15,14(2) 25,99(1) 22,60(2) 55,70(1) 22,52(2) 48,41(1) 14,92(2) 25,12188,17568,9312,7352,27X* -* Dla tych związków nie obliczano wartości czasu retencji na podstawie wyznaczonych równańkorelacyjnych, ponieważ związki te są izomerami związków, na podstawie których wyznacznorównanie.38

Przedstawione wyniki wskazują, w przypadku niektórych związków, nawysoką zbieżność wyznaczonych wartości czasu retencji, szczególnie dlakrótszego programu temperatur (1) – w przypadku 1-nonanotiolu różnicapomiędzy wartościami wyznaczonymi na podstawie temperatury wrzeniai masy cząsteczkowej związku wyniosła 1,82 s, a etylo-metylo siarczku5,19 s. Stosunkowo dobrą zbieżność uzyskano dla 1-oktanotiolu (7,53 s).W programie temperatury (2) rozbieżności były nieco większe. W obu programachtemperatury największą zbieżnością wyników charakteryzowały sięte same związki. Największą rozbieżność uzyskano dla siarczku diheksylu(odpowiednio 188,17 s i 568,93 s), co może wynikać z faktu zastosowaniaekstrapolacji poza zakres wyznaczonych korelacji.PODSUMOWANIEPrzedstawione wyniki wskazują na możliwość wykorzystania metodkorelacyjnych do dodatkowej identyfikacji analitów. We wszystkich analizowanychgrupach związków, za wyjątkiem ditioli, stwierdzono kolejność elucjizgodną z temperaturą wrzenia analitów. W wielu przypadkach przedstawionametoda dodatkowej identyfikacji może posłużyć jako cenne źródło informacji,np. do analiz GC-MS niezidentyfikowanych związków.PODZIĘKOWANIAAutorzy pragną podziękować Zarządowi i Pracownikom Lotos LABSp. z o.o. (Grupa LOTOS S.A.) za udostępnienie aparatury do badań.LITERATURA1. Pandey S.K., Kim K.H.: A Review of Methods for the Determination ofReduced Sulfur Compounds (RSCs) in Air. Environ. Sci. Technol. 2009,3020 (43).2. Huber J.F.K., Kenndler E., Reich G., Hack W., Wolf J.: Optimal Selectionof Gas Chromatographic Columns for the Analytical Control ofChemical Warfare Agents by Application of Information Theory to RetentionData, Anal. Chem., 65 (1993), 2903-2900.3. Kim K.H., Jeon E.C., Choi Y.J., Koo Y.S.: The emission characteristicsand the related malodor intensities of gaseous reduced sulfur compounds(RSC) in a large industrial complex. Atmos. Environ. 2006,4478 (40).4. Du H., Ring Z., Briker Y., Arboleda P.: Prediction of gas chromatographicretention times and indices of sulfur compounds in light cycleoil, Catalysis Today, 98 (2004), 217-225.5. Sinninghe Damsté J.S., Kock-Van Dalen A.C., De Leeuw J.W.,Schenck P.A.: Identification of homologous series of alkylated thiophenes,thiolanes, thianes and benzothiophenes present in pyrolysatesof sulphur-rich kerogens, J. Chromatogr. A, 435 (1988), 435-452.39

6. Schade T., Andersson J.T.: Speciation of alkylated dibenzothiophenesthrough correlation of structure and gas chromatographic retention indexes,J. Chromatogr. A, 1117 (2006) 206-213.7. Xua H.Y., Zoub J.W., Jiang Y.J., Hub G.X., Yu Q.S.: Quantitative structure–chromatographicretention relationship for polycyclic aromatic sulfurheterocycles, J. Chromatogr. A, 1198 (2008) 202-207.8. Miller K.E., Bruno T.J.: Isothermal Kova´ts retention indices of sulfurcompounds on a poly(5% diphenyl–95% dimethylsiloxane) stationaryphase, J. Chromatogr., 1007 (2003) 117-125.9. Can H., Dimoglo A., Kovalishyn V.: Application of artificial neural networksfor the prediction of sulfur polycyclic aromatic compounds retentionindices, Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 723 (2005)183-188.10. Engkvist O., Borowski P., Bemgard A., Karlstrom G., Lindh R.,Colmsjo A.: On the Relation between Retention Indexes and the Interactionbetween the Solute and the Column in Gas-Liquid Chromatography,J. Chem. Inf. Comput. Sci., 36 (1996), 1153-1161.11. Mossner S.G., Lopez de Alda M.J., Sander L.C., Lee M.L., Wise S.A.:Gas chromatographic retention behavior of polycyclic aromatic sulfurheterocyclic compounds, (dibenzothiophene, naphtho[b]thiophenes,benzo[b]naphthothiophenes and alkylsubstituted derivatives) on stationaryphases of different selectivity, J. Chromatogr. A, 841 (1999)207-228.12. www.sigmaaldrich.com40

Grzegorz BOCZKAJ 1 , Ewelina GILGENAST 1 , Paulina NOWICKA 1 ,Andrzej PRZYJAZNY 2 , Marian KAMIŃSKI 1*1Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej,80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12, mknkj@chem.pg.gda.pl2Chemistry & Biochemistry Department, Kettering University,1700 West Third Avenue, Flint, MI 48504, USA.PROCEDURA PRZYGOTOWANIA PRÓBKIDO OZNACZANIA WIELOPIERŚCIENIOWYCHWĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCHW PRODUKTACH TECHNICZNYCHW pracy opisano nową metodę przygotowania próbki w celu oznaczania śladowychzawartości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)w wysokowrzących produktach naftowych. Wartości granicy oznaczalności dla badanychWWA w materiałach tego typu mieściły się w przedziale od kilkudziesięciu ng/kgdo poniżej dwudziestu ug/kg. Badania wykazały, że w celu oddzielenia większościzanieczyszczeń od analitów, bez ich znaczących strat, konieczne jest, w pierwszymetapie przygotowania próbki, zastosowanie chromatografii wykluczania (ang. Sizeexclusion chromatography - SEC) w skali semipreparatywnej albo preparatywnej.W kolejnym etapie zastosowano chromatografię adsorpcyjną w układzie faz normalnych,korzystnie, także w skali semipreparatywnej lub preparatywnej. Zastosowanieprocedury rozdzielania ortogonalnego opisanego w pracy pozwala na wyizolowaniez badanego materiału jedynie grupy niepodstawionych węglowodorów aromatycznychw ściśle określonym zakresie masy molekularnej. Im niższa jest wymaganagranica oznaczalności (LOQ) WWA, tym większą skalę preparatywnej chromatografiicieczowej należy zastosować w obu etapach wzbogacania próbki. Korzystne jestrównież zastosowanie metody dodatku wzorca, zapewniające analizę ilościową, skorygowanąo stopień odzysku WWA podczas etapu przygotowania próbki. Oznaczeniekońcowe może być wykonane techniką HPLC-FLD albo GC-MS, przy czymw przypadku przygotowania próbki z zastosowaniem kolumn do preparatywnejchromatografii cieczowej, można do identyfikacji śladowych zawartości WWA, a takżedo wykonania oznaczenia, zastosować detektor UV-VIS/DAD, otrzymując widmaUV-VIS oznaczanych analitów i dodatkową możliwość ich identyfikacji na tej podstawie.WSTĘPPrzygotowanie próbki w celu oznaczenia śladowych zawartości analitóww złożonych matrycach na ogół zawiera dwa etapy: ekstrakcję analitówlub ekstrakcję z matrycy, a następnie oczyszczanie [1]. Pierwszy etap ma nacelu selektywną izolację analitów z jednoczesnym uproszczeniem matrycy.Najczęściej wykorzystywane w tym celu procedury to ekstrakcja ciecz-ciecz,adsorpcja-desorpcja, hydroliza (np. zmydlanie) i precypitacja. Ekstrakcjęmożna przeprowadzać poprzez kompleksowanie analitów, w celu uzyskaniaróżnicy w rozpuszczalności pomiędzy frakcją izolowaną a matrycą. Etap41

wzbogacania/oczyszczania jest często wykonywany z wykorzystaniem ekstrakcjido fazy stałej (SPE, ang. Solid Phase Extraction).W pracy opisano nową procedurę, pozwalającą na oznaczanie WWAw złożonych matrycach tj. frakcje wysokowrzących produktów naftowych(pozostałość próżniowa, asphalt). Wielopierścieniowe węglowodory aromatycznemogą powstawać podczas procesów produkcji/destylacji wysokowrzącychproduktów naftowych w wyniku krakingu termicznego. OznaczanieWWA w produktach naftowych, jak również innych produktach, jest ważnew związku z ich karcinogenną i teratogenną naturą oraz wszechobecnościąw środowisku, związaną z emisją pyłów, spalania paliw i innych rodzajówzanieczyszczeń. Problem oznaczania WWA na niskim poziomie stężeń jestcoraz bardziej znaczący z uwagi na ostatnie ograniczenia prawne dotyczącemaksymalnej dopuszczalnej zawartości WWA w różnych produktach. Przykładowo,w 2006 roku NIOSH przyjął limit zawartości wynoszący 10 ug/kgdla WWA i 1 ug/kg dla benzo [a] pirenu w produktach technicznych.Główny problem stanowi oznaczanie zawartości WWA na niskich lubśladowych poziomach stężeń w skomplikowanych matrycach zawierającychWWA podstawione grupami alifatycznymi i alicyklicznymi.Standardowa metoda oznaczania zawartości frakcji policyklicznychzwiązków aromatycznych, w tym WWA, została opisana przez Institute ofPetroleum w normie IP346, która jest szeroko stosowana na całym świecie[2]. Procedura opiera się na oznaczaniu grawimetrycznym frakcji rozpuszczalnejw sulfotlenku dimetylowym (DMSO) w temperaturze pokojowej. Tymniemniej procedura nie jest dostatecznie selektywna do efektywnego przygotowaniapróbki produktów naftowych w celu oznaczania śladowych zawartościWWA, ponieważ przygotowany ekstrakt zawiera zbyt wiele węglowodorówaromatycznych.Literatura fachowa opisuje wykorzystanie w celu przygotowania próbkichromatografii wykluczania (SEC). To podejście pozwala na izolację frakcjio określonym zakresie masy molekularnej. SEC znalazła wiele zastosowańw przygotowaniu próbki do oznaczania wielu niskomolekularnych zanieczyszczeń,tj. pestycydy, pozostałości leków i WWA w żywności, produktachnaftowych, próbkach środowiskowych i wielu innych matrycach [3-5]. Nerini Domeño stosowali chromatografię żelową podczas etapu przygotowaniapróbki do oznaczania zawartości WWA w przemysłowych olejach odpadowych[6]. Wyizolowana frakcja nadal zawierała jednak lipidy o niskich masachcząsteczkowych.Technika ekstrakcji do fazy stałej (SPE, ang. Solid Phase Extraction)jest szeroko wykorzystywana w przygotowaniu próbki do oznaczania WWA,szczególnie w wodzie pitnej [7-9]. Technika SPE znalazła również zastosowanieprzy oznaczaniu WWA w smole koksowniczej, co opisano w polskiejnormie PN-C-82056 [10]. Wykorzystuje się szklaną kolumnę wypełnioną aktywowanymtlenkiem glinu oraz żelem krzemionkowym, a do elucji frakcjizawierającej WWA stosuje się benzen. Alternatywnie stosuje się procedury,w których fazę stacjonarną stanowi Florisil lub Sphadex LH-20 i odpowiedniobenzen lub metanol jako eluent. Nerín and Domeño używali pakowanych ko-42

lumn szklanych wypełnionych tlenkiem glinu oraz mieszaniny heksanui dichlorometanu (95:5 v/v) jako eluentu, w celu oczyszczenia frakcji uzyskanejz chromatografii wykluczania [6]. Tym niemniej metody wykorzystująceadsorpcję w sposób „klasyczny”, ze szklanymi kolumnami o niskiej sprawnościsą żmudne, czasochłonne oraz charakteryzują się niską dokładnościąi precyzją. Również wysokie zużycie toksycznych rozpuszczalników orazwymagane każdorazowe wypełnianie kolumn porcją aktywowanego sorbentustanowi o minusach tych metod.W literaturze technicznej istnieją także procedury przygotowaniapróbki oparte na zastosowaniu techniki SPE do wyodrębnienia grupy WWAz ropy naftowej. Proponuje się zastosowanie Florisilu, jako fazy stacjonarneji heksanu jako eluentu [11]. Technika SPE z zastosowaniem mikrokolumienekma wiele zalet, do najistotniejszych należą: znaczne zredukowanie ilościużywanych rozpuszczalników, prostota wykonania, a także łatwość automatyzacji(połączenie on-line z HPLC lub GC). Jednakże w przypadku próbek oskomplikowanej matrycy pojawia się problem niskiego stopnia odzysku analitóworaz małej powtarzalności rezultatów, wywołane nieselektywną orazniecałkowitą desorpcją. Niska sprawność kolumienek SPE powoduje nakładaniesię frakcji składników przeszkadzających w analizie na frakcję analitów,szczególnie w przypadku bardzo złożonej matrycy.Wady kolumienek SPE oraz klasycznych kolumn szklanych nasuwająwniosek, że techniką potencjalnie zdolną do zapewnienia zadowalającegostopnia rozdzielania grupowego skomplikowanych mieszanin może byćtechnika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych(NP-HPLC). Fazy stacjonarne w układach faz normalnych stosowanychw wysokosprawnej chromatografii cieczowej (NP-HPLC) do rozdzielaniagrupowego produktów naftowych to przede wszystkim: żel krzemionkowy,tlenek glinu [12-14], mieszanina żelu krzemionkowego [13] i tlenku glinu [14],Florisil [15] i fazy związane, takie jak: żel krzemionkowy modyfikowany grupamicyjanopropylowymi (CN) [16], aminopropylowymi (NH 2 ) [17] i okadecylowymi(C18) [18].Saravanabhavan i wsp. zaproponowali metodykę przygotowaniapróbki do jednoczesnego oznaczenia niepodstawionych i podstawionychłańcuchami alkilowymi WWA w „ciężkich” olejach napędowych (o temperaturzewrzenia 287-481 o C). Pierwszym etapem analizy była precypitacja parafiny,a następnie podzielenie pozostałej frakcji na 5 grup z wykorzystaniemtechniki adsorpcyjnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych.Poszczególne grupy węglowodorów aromatycznych oznaczano następniez wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych(19). Na początku lat 80. Wise i wsp. (20-21) zaproponowali wykorzystanieHPLC w układzie faz normalnych na etapie przygotowania próbki dooznaczania śladowych zawartości WWA w omułkach.Zastosowanie techniki NP-HPLC podczas drugiego etapu przygotowaniapróbki powinno zapewnić dobrą powtarzalność wyników, możliwość zastosowaniaprzepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej orazmożliwość monitowania procesu chromatograficznego z pomocą detektora.43

Nasze badania wstępne wykazały brak w normach i w literaturze naukowejefektywnych procedur przygotowania próbki do analizy śladowychzawartości WWA w wysokowrzących produktach naftowych. Zastosowaniew tym celu dotychczas opisanych procedur przygotowania próbki do oznaczaniaWWA okazało się całkowicie nieskuteczne.W odróżnieniu od efektywnych metod przygotowania próbki, metodykakońcowego oznaczania WWA jest stosunkowo dobrze opanowana podwarunkiem, że próbka nie zawiera praktycznie pochodnych alifatycznychi alicyklicznych WWA. Można wtedy zastosować albo metody znormalizowane[7, 9], albo ich modyfikacje, opisane w literaturze naukowej. Obecnie najczęściejstosowanymi technikami są: chromatografia gazowa sprzężona zespektrometrią mas (GC-MS) lub z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym(GC-FID), albo wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją fluorescencyjną(RP-HPLC/FLD). Możliwość jednoczesnej identyfikacji WWA,kosztem jednak wyższej granicy oznaczalności (LOQ), daje zastosowaniedetektora UV z matrycą fotodiodową (RP-HPLC/UV-DAD). RozdzielanieWWA techniką HPLC wykonuje się w warunkach układu faz odwróconych.Fazą stacjonarną jest z reguły oktadekan, związany z żelem krzemionkowym(średnica ziaren wypełnienia 3 µm albo 5 µm), natomiast fazą ruchomą mieszaninyacetonitrylu (AcCN) albo metanolu (MeOH) z wodą w różnych proporcjach.Elucję wykonuje się zwykle w sposób gradientowy. Najnowszymrozwiązaniem jest detekcja za pomocą spektrometru mas (LC-MS). W literaturzebrakuje jednak danych dotyczących zależności granicy oznaczalnościanalitów z grupy WWA od warunków przygotowania próbki oraz warunkówoznaczania i detekcji. Ten problem będzie przedmiotem kolejnej pracy, będącejobecnie w przygotowaniu.W konsekwencji opracowano nową, dwuetapową procedurę przygotowaniapróbki, z wykorzystaniem najpierw - kolumnowej chromatografii wykluczania(GPC/SEC) i kolejno - rozdzielania grupowego z zastosowaniemelucyjnej, kolumnowej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych(NP-HPLC), która jest przedmiotem niniejszej pracy.CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNAMateriałyRozpuszczalniki i eluenty wykorzystane w pracy miały czystość odpowiedniądo pracy z HPLC. Roztwory wzorcowe sporządzono w oparciuo substancje wzorcowe o czystości powyżej 98%. Próbki asfaltów i produktówz destylacji ropy naftowej wyprodukowane w Grupie LOTOS S.A..Kolumny chromatograficzne i kolumienki SPE: Kolumny preparatywne250x25 mm LiChrogel PSMIX, 10 μm, (MERCK, Niemcy), 200x16.8 mmLichrosorb Si60, 10 μm, (MERCK, Niemcy); Kolumny analityczne 250x4.6 mmSpherisorb PAH, 5 μm, kolumienka typu SPE z wypełnieniem Florisil – 1000 mg(Macherey – Nagel, Niemcy).44

Aparatura i wyposażenie:• Gradientowy chromatograf cieczowy LaChrom (Merck-Hitachi, Niemcy)wyposażony w czterokanałowy system elucji gradientowej z zaworamiproporcjonującymi (tzw. gradient niskociśnieniowy), pompę L-6200, zawórdozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą 100 μl, kolumnęchromatograficzną, termostat, detektor UV - DAD 7450A, detektor fluorescencyjnyF 1050, oprogramowanie HSM oraz, dodatkowo, w sześciodrogowydwupołożeniowy zawór V 7226 (Knauer, Niemcy), do zmianykierunku przepływu fazy ruchomej w kolumnie (backflash);• Gradientowy chromatograf cieczowy (Merck-Hitachi) wyposażony w czterokanałowysystem elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi(tzw. gradient niskociśnieniowy), pompę L-6200, zawór dozujący RheodyneRh-7161 z pętlą dozującą 1 ml, kolumnę chromatograficzną, termostat,detektor UV - DAD L-3000, detektor refraktometryczny 1037A,oprogramowanie HSM oraz, dodatkowo, w sześciodrogowy dwupołożeniowyzawór V 7226 (Knauer, Niemcy), do zmiany kierunku przepływu fazyruchomej w kolumnie (backflash);• Zestaw do odparowywania nadmiaru rozpuszczalnika w strumieniu azotu,w skład którego wchodzą: butla z gazem obojętnym (N2), pokrywa firmyJ.T. Baker wykonana z poliamidu wyposażona w igły oraz podłączeniegazu;METODYKAIzolacja frakcji (grupy) o niskim zakresie masy cząsteczkowejZastosowano preparatywną kolumnę typu PS MIX (250x25 mm, d p == 10 μm), dichlorometan, jako eluent oraz szeregowo połączone detektory:refraktometryczny i UV - DAD. Granice elucji grupy WWA wyznaczonow oparciu o wartości czasu retencji koronenu i benzenu. Roztwór asfaltuw dichlorometanie zmieszano w stosunku objętościowym 1:1 z roztworemwzorców koronenu i benzenu o stężeniu 0,025 g/ml w dichlorometanie. Rozdzielaniuw warunkach wykluczania poddano roztwór asfaltu z i bez dodatkuwzorców benzenu i koronenu. Wszystkie mieszaniny rozdzielano w temperaturze20 o C. Objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej wynosiło4,5 ml/min, objętość dozowana 550 μl. W zakresie elucji koronenu oraz benzenuzbierano niskomolekularną frakcję zawierającą anality z grupy WWAmogące potencjalnie występować w badanym materiale.Izolacja frakcji (grupy) w zakresie polarności WWA techniką wysokosprawnejchromatografii cieczowej w układzie faz normalnych(NP-HPLC)Frakcję uzyskaną w warunkach wykluczania odparowano do suchaw strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuszczono w 550 µl n-heksanui poddano analizie z wykorzystaniem techniki wysokosprawnej, adsorpcyjnejchromatografii cieczowej w warunkach układu faz normalnych. Zastosowanopreparatywną kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym oraz szeregowo45

połączone detektory UV-DAD (długość fali λ = 254 nm) i refraktometryczny.Granice elucji analitów z grupy WWA wyznaczono w oparciu o czas elucjikoronenu i benzenu. W zakresie elucji początku piku koronenu oraz końcapiku benzenu (w czasie 6,5÷8,4 od momentu dozowania) zbierano odpowiedniąfrakcję. Temperatura: 20 o C, eluent: n-heksan. Objętościowe natężenieprzepływu fazy ruchomej - 4,5 ml/min, objętość dozowana 500 μl. Poczasie 10 min przełączono zawór przepływu zwrotnego (backflush), zapewniającw ten sposób elucję z kolumny wszystkich wielopierścieniowych węglowodorówaromatycznych przed przełączeniem zaworu przepływu zwrotnegoi umożliwiono elucję wszystkich wysokopolarnych składników próbkisilnie sorbowanych na powierzchni fazy stacjonarnej w warunkach przepływuzwrotnego, w postaci pojedynczego piku.Izolacja frakcji (grupy) w zakresie polarności WWA techniką ekstrakcjido fazy stałej (SPE)Frakcję uzyskaną w warunkach chromatografii wykluczania odparowanodo sucha w strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuszczonow 550 µl n-heksanu i poddano adsorpcji z zastosowaniem techniki SPE.Etap ten realizowano zgodnie z procedurą opisaną w aplikacji Macherey-Nagel (11). W badaniach zastosowano kolumienki SPE wypełnione Florisilem(180 µl frakcji adsorbowano na 1 g Florisilu). Kolumienki uprzednio kondycjonowano20 ml metanolu, suszono, a następnie kondycjonowano 20 mln-heksanu i ponownie suszono. Anality ze złoża sorbentu eluowano za pomocą25 ml n-heksanu. Uzyskaną w ten sposób frakcję - po wymianie rozpuszczalnika,z jednoczesnym zatężeniem - poddawano analizie chromatograficznej(punkt II. 2. 4).Rozdzielanie, identyfikacja i oznaczanie zawartości WWA techniką wysokosprawnejchromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych(RP-HPLC)Frakcję wzbogaconą w anality z grupy WWA uzyskaną zgodniez metodyką przygotowania próbki opisaną w punktach II. 2. 1, II. 2. 2, II. 2. 3odparowano do sucha w strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuszczonow 70 μl acetonitrylu. W badaniach zastosowano dwa szeregowo połączonedetektory: UV-DAD (w zakresie długości fali 220÷450 nm) oraz fluorescencyjny.Długość fali wzbudzenia λ ex wynosiła 275 nm, natomiast długość faliemisji λ em – 375 nm (dla naftalenu, acenaftenu, fluorenu i fenantrenu), a następnie410 nm (dla pozostałych analitów z grupy WWA). Temperatura:20°C; objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej: 1 ml/min; objętośćdozowana: 50 μl. Warunki rozdzielania zamieszczono w tabeli 1.Tabela 1. Warunki rozdzielania zastosowane do końcowego oznaczaniaWWAKolumna chromatograficznaSpherisorb PAH, 5μm, 250x4.6mm i.d.Eluent / Program elucji0-40min ACN:H 2 O=80:20 v/v40,1-70min ACN46

Identyfikacji WWA dokonano na podstawie:• Porównania czasu retencji odpowiednich pików na chromatogramachz wartością czasu retencji substancji wzorcowych• Porównania widm w zakresie 220 nm do 450 nm, w tym długości falimaksimum widm poszczególnych pików z widmami wzorców WWA.Kalibrację zawartości WWA wykonano metodą krzywej kalibracyjnej(external standard method) w oparciu o sygnał detektora UV-DAD orazfluorescencyjnego. W przypadku kalibracji na podstawie sygnału detektoraUV-DAD program długości fali był następujący: 270 nm dla naftalenu,315 nm - acenaftylen, 265 nm - acenaften i fluoren, 254 nm – fenantren,antracen i fluoranten, 270 nm - piren, 285 nm - benzo(a)antracen i chryzen,287 nm - benzo(b)fluorantenu, 293 nm - benzo(k)fluorantenu, benzo(a)pirenu,290 nm - dibenzo(a,h)antracen, indeno(1,2,3-cd)piren,benzo(g,h,i)perylen, benzo(e)piren, benzo(j)fluoranten. Wykonano5-punktowe krzywe kalibracyjne o stężeniach poszczególnych związkówz grupy WWA w zakresie: 50÷1000 ng/ml – dla detektora UV-DAD oraz0,5÷32,0 ng/ml - dla detektora fluorescencyjnego. Podczas analizy próbekrzeczywistych po zakończeniu elucji analitów z grupy WWA kolumnęprzełączano do trybu elucji wstecznej.Wyznaczenie stopnia odzysku analitów z grupy WWA zawartychw badanych materiałachDo roztworu asfaltu drogowego 50/70 o stężeniu 0,05 g/ml w dichlorometaniedodano 10 µl roztworu mieszaniny wzorców WWA o stężeniu200 μg/ml w dichlorometanie. Następnie próbki przygotowano zgodniez procedurą przygotowania próbki opisaną w punktach II. 2. 1, II. 2. 2, II. 2. 3.Stopień odzysku wyznaczono z zależności:R = C i (kal.) / C i (rzecz.) x 100%gdzie:C i (kal.) - stężenie i-tego analitu wyznaczone w oparciu o krzywą kalibracyjną,C i (rzecz.) - stężenie rzeczywiste i-tego analitu, który został wprowadzony doanalizowanego roztworu.Jako granicę oznaczalności (LOQ) przyjęto stężenie odpowiadające5-krotności poziomu szumów detektora pomniejszone o wartość stopnia odzysku.Każdy eksperyment, którego rezultat został zamieszczony w pracy,był wykonywany co najmniej dwukrotnie. Przedstawione wyniki są wartościamiśrednimi.47

WYNIKI I DYSKUSJAChromatografia wykluczania w skali preparatywnej (P-GPC/P-SEC) jakopierwszy etap przygotowania próbki do analizy śladowych zawartościWWA w materiałach naftowychW pierwszym etapie przygotowania próbki wykorzystano technikęchromatografii wykluczania w celu selektywnego wydzielenia frakcji, potencjalniezawierającej WWA i różniącej się masą molekularną od zdecydowanejwiększości pozostałych składników niskolotnych produktów naftowych.Etap ten umożliwił oczyszczenie próbki ze składników produktów naftowycho wyższych masach cząsteczkowych niż WWA, eluowanych wcześniej niżWWA. Zakres elucji grupy WWA wyznaczono posługując się mieszaniną koronenuoraz benzenu. Koronen posiada masę molekularną nieco wyższą(C 24 H 12 , M = 300Da) od masy molekularnej związków należących do grupyWWA (dibenzo(a,h)antracen C 22 H 14 posiada najwyższą masę molekularnąw obrębie grupy WWA i wynosi ona 278 Da). Natomiast benzen (M C 6 H 6 == 78 Da), wyznacza dolną granicę elucji, jego masa molekularna jest niższaod naftalenu (M C 10 H 28 , M = 128 g/mol). W celu obniżenia granicy oznaczalnościWWA powiększono skalę procesu przygotowania próbki poprzez zastosowaniepreparatywnej kolumny do chromatografii wykluczania (d c == 25 mm, L c = 250 mm, d p = 10 µm). Zastosowanie chromatografii w skalipreparatywnej umożliwiło wyizolowanie w jednym etapie rozdzielania znaczniewiększych ilości frakcji bogatej w anality z grupy WWA, niż by to było możliwez zastosowaniem kolumny analitycznej. Na rysunku 1 przedstawiono przykładychromatogramów obrazujących efekt rozdzielania w warunkach chromatografiiwykluczania roztworu asfaltu drogowego 50/70 – Grupa LOTOS S.A.z (rys. 1A) i bez (rys. 2A) dodatku wzorców koronenu i benzenu).Rysunek 1. Przykład chromatogramów otrzymanych podczas przygotowania próbki asfaltu drogowego50/70, z dodatkiem (część A) i bez dodatku (część B) roztworu wzorca benzenu i koronenuw warunkach rozdzielania z zastosowaniem preparatywnej kolumny wykluczania. Kolumna:preparatywna PS-MIX o wymiarach 250x25 mm, 10 μm, Eluent: dichlorometan,Objętościowe natężenie przepływu: 4,5 ml/min., Objętość dozowana: 550 µl, Detektor: RID,Oznaczenia: 1 - komponenty asfaltu, 2 - benzen+koronen; strzałkami zaznaczono zakres zbieraniafrakcji zawierającej WWA48

Na podstawie rys. 1 można stwierdzić, że w tym etapie przygotowaniapróbki wyizolowana frakcja bogata w anality z grupy WWA została pozbawionazasadniczej części wysokomolekularnych składników asfaltu. Komponentywyizolowane w tym etapie przygotowania próbki to WWA, inne węglowodoryoraz substancje organiczne zawierające różnego rodzajupodstawniki o masach molekularnych zbliżonych do WWA.Podczas pierwszego etapu przygotowania próbki do analizy śladowychzawartości WWA wykorzystano jako fazę stacjonarną kopolimer styren - diwinylobenzeno ściśle określonym zakresie wielkości porów – od 50 do 50000 Å.Ze względu na znaczny koszt preparatywnej kolumny chromatograficznejz wypełnieniem styren - diwinylobenzen podjęto próbę zastąpienia tejfazy stacjonarnej tradycyjnymi fazami stacjonarnymi dla układu faz normalnych,bądź odwróconych. Aby wyeliminować oddziaływania sorpcyjne i zapewnićmechanizm wykluczania, dla każdej ze stosowanych kolumn wykorzystanofazy ruchome o bardzo wysokich siłach elucyjnych. Zbadanomożliwość zastosowania do przygotowania próbki faz stacjonarnych: CN,DIOL, NH 2 z polarnymi fazami ruchomymi, takimi jak: dichlorometan: metanol1:1, tetrahydrofuran:metanol 7:3 oraz fazę stacjonarną typu C18 z niepolarnąfazą ruchomą, taką jak n-heksan. Badania wykonano w skali kolumnanalitycznych. Na podstawie tych badań można stwierdzić, że mimo zastosowaniaeluentu o wysokiej sile elucyjnej nie udało się wyeliminować oddziaływańsorpcyjnych między fazą stacjonarną stosowaną w warunkach NPa polarnymi, niskocząsteczkowymi komponentami badanych materiałóworaz analogicznie między fazą stacjonarną stosowaną w warunkach RPa niepolarnymi komponentami badanych materiałów. W obu wariantach (fazystacjonarne typu NP oraz RP) podobną jak benzen i koronen objętościąelucji charakteryzowała się duża część wyżej molekularnych składników badanychmateriałów. Świadczy to o mieszanym mechanizmie rozdzielania,mimo stosowania eluentów o wysokich siłach elucji. Konieczne jest więc zastosowaniekopolimeru styren – di winylobenzen, jako fazy stacjonarnej doprzygotowania próbki w warunkach wykluczania.Adsorpcja w układzie faz normalnych jako kolejny etap przygotowaniapróbki do analizy śladowych zawartości WWA w materiałach naftowychZastosowanie chromatografii wykluczania jako etapu przygotowaniapróbki do analizy śladowych zawartości WWA w materiałach technicznychokazało się niewystarczające. We frakcji uzyskanej w warunkach chromatografiiwykluczania znajdowała się ogromna ilość substancji o masie zbliżonejdo masy WWA, i o podobnej albo wyższej polarności. To uniemożliwia wykonanieoznaczenia końcowego z zastosowaniem RP-HPLC. Do dalszegooczyszczania próbki wykorzystano adsorpcję. Potencjalnie możliwe jest równieżzastosowanie techniki ekstrakcji do fazy stałej (SPE), albo w warunkachukładu faz odwróconych, albo w warunkach układu faz normalnych (rozdzielaniagrupowe pod względem polarności grup funkcyjnych). W przypadku bardzoskomplikowanego składu pozostałej jeszcze we frakcji uzyskanej w warunkachwykluczania matrycy analitycznej lepszym rozwiązaniem wydaje się49

zastosowanie techniki kolumnowej chromatografii cieczowej niż SPE. Jest torozwiązanie bardziej kosztowne i trudniejsze do automatyzacji, jednak zapewniawyższą selektywność rozdzielania i znacznie lepszą powtarzalność rezultatów.Dodatkowo, dzięki stosowaniu detektora (refraktometr, fluorescencyjny,UV) istnieje możliwość precyzyjnego wyznaczenia zakresu elucji interesującejfrakcji. Zastosowanie, natomiast kolumny semipreparatywnej albo preparatywnejzapewnia możliwość obniżenia granicy oznaczalności.Na rysunku 2 przedstawiono przykład typowego chromatogramuoczyszczania frakcji asfaltu 50/70 bogatej w WWA uzyskanej w warunkachwykluczania i rozdzielania w kolejnym etapie przygotowania próbki, z wykorzystaniemadsorpcji w warunkach układu faz normalnych.Rysunek 2. Przykład chromatogramów otrzymanych podczas II etapu przygotowania próbkiz zastosowaniem techniki NP-HPLC w skali preparatywnej dla roztworu wzorców benzenu i koronenu(część A) oraz dla frakcji asfaltu 50/70, uzyskanej w warunkach chromatografii wykluczania (część B).Kolumna: preparatywna o wymiarach 200 x 16,8 mm, 10 µm, wypełniona żelem krzemionkowymSi60, Eluent: n-heksan, Objętościowe natężenie przepływu: 4,5 ml/min, Objętość dozowana: 500 µl,Detektor: UV 254 nm, Oznaczenia: 1 - benzen, 2 - koronen, 3, 4 - komponenty produktów naftowych,odpowiednio niżej i wyżej polarne, BF - punkt przełączenia zaworu przepływu zwrotnego eluentuw kolumnie, strzałkami zaznaczono zakres zbierania frakcjiJak widać z rys. 2B, we frakcjach uzyskanych w warunkach chromatografiiwykluczania znajduje się znaczna ilość polarnych substancji o niskichmasach molekularnych, które byłyby eluowane z większym albo znaczniewiększym czasem retencji, z powodu wyższych energii oddziaływań z powierzchniąfazy stacjonarnej, a dzięki zastosowaniu przepływu zwrotnego sąeluowane w postaci pojedynczego piku o czasie dwukrotnie wyższym odpunktu backflushu. Substancje te mogą także zostać wyeluowane z kolumnychromatograficznej w warunkach elucji skokowej z zastosowaniem fazy ruchomejo wyższej od n-heksanu sile elucyjnej. W przypadku zastosowaniaelucji skokowej należy liczyć się ze znaczną czasochłonnością etapu rekondycjonowaniaaktywności sorpcyjnej kolumny chromatograficznej w warunkach50

układu NP, tj. doprowadzenia powierzchni sorpcyjnej do stanu równowagiz rozpuszczalnikiem o niskiej sile elucyjnej. W konsekwencji zastosowanieprzepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej okazało się postępowaniemznacznie korzystniejszym, tym bardziej że znaczną część eluentumożna zawrócić. Możliwe jest też zwiększenie natężenia przepływu eluentuw okresie trwania przepływu zwrotnego, co umożliwia skrócenie czasu elucjizwrotnej. Należy dodać, że stosowanie przepływu zwrotnego jest skutecznetylko w przypadku zastosowania bardzo dobrze wypełnionych stabilnych kolumnchromatograficznych HPLC.W tabeli 2 zestawiono wartości stopni odzysku analitów z grupy WWAuzyskane przy zastosowaniu opisanej w tej pracy dwuetapowej proceduryprzygotowania próbki, z zastosowaniem chromatografii wykluczania -w pierwszym etapie oraz kolejno adsorpcji w warunkach układu faz normalnych- w drugim etapie, realizowanego techniką NP-HPLC lub SPE.Na podstawie danych zawartych w tabeli 2 widać, że z zastosowaniemchromatografii wykluczania - w pierwszym etapie oraz adsorpcji w warunkachukładu faz normalnych - w drugim etapie, z wykorzystaniem wysokosprawnychkolumn chromatograficznych uzyskuje się zadowalające,przekraczające 80% wartości stopnia odzysku (za wyjątkiem składników lotnych,tzn. naftalenu, acenaftenu, acenaftylenu i fluorenu).Tabela 2. Zestawienie wartości stopni odzysku (R) analitów z grupy WWATechniki stosowane podczas przygotowania próbkiAnalitI etap / II etapI etap / II etapGPC/NP-HPLCGPC/NP-SPER [%]n=3RSD[%]R [%]n=3RSD[%]naftalen ? ? ? ?acenaften ? ? ? ?acenaftylen ? ? ? ?fluoren 58 2,0 11 5,0fenantren 85 3,6 12 7,3antracen 96 3,3 15 4,0fluoranten 87 2,8 22 4,2piren 94 3,1 46,6 9,6benzo(a)antracen 100 5,0 42 7,1chryzen 100 3,9 38 4,3benzo(j)fluoranten 92 2,5 52 7,0benzo(e)piren 98 2,7 37 9,4benzo(b)fluoranten 100 3,4 56 4,1benzo(k)fluoranten 94 2,8 57 7,1benzo(a)piren 100 4,1 66 4,7dibenzo(a,h)antracen 100 3,9 46 10,2indeno(1,2,3-cd)piren 91 3,0 48 9,7benzo(g,h,i)perylen 100 3,5 39 5,1? – W związku ze znaczną lotnością tych WWA (sublimacja), wartości stopni odzysku tych analitów,najczęściej nieobecnych w badanych materialach, są niskie – na poziomie od 7-25 %, zależnieod warunków zastosowanych podczas odparowywania poprzedniego eluentu; Wykonanierzetelnego oznaczenia tych analitów wymaga zastosowania metody dodatku wzorca.51

Próbka (50 mg) + dichlorometan (1 ml)Filtracja (0,45 μm, PTFE)Chromatografiawykluczania w skali preparatywnejFrakcjonowanieWysokomolekularnekomponenty badanychmateriałówNiskomolekularne komponentybadanych materiałówOdparowanie do sucha i rozpuszczeniew 550 μl n-heksanuAdsorpcja w warunkach układufaz normalnychNP-HPLC (wyższy stopień odzyskui lepsza powtarzalność)SPE (wyższy stopień odzyskui gorsza powtarzalność)FrakcjonowanieNiskopolarneskładniki o masach zbliżonych do WWAWysokopolarne składnikio niskich masach molekul.Odparowanie do sucha – N 2 i rozpuszcz.w AcCN-RP-HPLC / CS 2 GC-MSRysunek 3. Schemat procedury przygotowania próbki do oznaczania WWAw materiałach technicznych zaproponowany w niniejszej pracy52

Zastosowanie NP-HPLC w drugim etapie przygotowania próbki prowadzido znacznie wyższych wartości stopni odzysku. Niższe wartości stopni odzyskuanalitów z grupy WWA uzyskane podczas realizacji adsorpcji techniką SPE spowodowanesą najprawdopodobniej niższą sprawnością kolumienek SPE w stosunkudo kolumn chromatograficznych i nakładaniem się frakcji analitów na frakcjeskładników bardziej polarnych. Ograniczeniem zaprezentowanej metodyki jestbrak możliwości oznaczania lotnych węglowodorów - naftalenu, acenaftenu i acenaftylenu.Wynika to z konieczności wykonywania wymiany rozpuszczalnika pokażdym etapie przygotowania próbki. Na rys. 3 zamieszczono blokowy schemat2-etapowej procedury przygotowania próbki do oznaczania śladowych zawartościWWA w materiałach technicznych, opisanej w niniejszej pracy.Wyniki końcowego oznaczenia zawartości WWA techniką RP-HPLCOznaczenia końcowego WWA dokonano, posługując się zmodyfikowanąprocedurą opisaną w normie PN-EN ISO 17993 [7]. Celem modyfikacji było rozszerzeniezakresu zastosowań procedury opisanej w normie o dodatkowe2 węglowodory – benzo(j)fluoranten oraz benzo(e)piren, których dopuszczalnypoziom stężeń w materiałach technicznych jest również limitowany przepisamiprawnymi. Dodatkowym argumentem dla stosowania warunków elucji skokowejbyło dążenie do maksymalizacji powtarzalności wartości czasu retencji, któryw przypadku stosowania detektora fluorescencyjnego jest parametrem identyfikacyjnym.Powtarzalność czasu retencji jest wyższa w warunkach elucji skokowejniż gradientowej, co wynika z ciągle jeszcze niedoskonałej synchronizacjicyklicznej pracy zaworów proporcjonujących pomp, w aparatach HPLC z tzw.niskociśnieniowym systemem gradientowym. Optymalizacji poddano typ fazystacjonarnej, skład fazy ruchomej oraz program elucji. Najkorzystniejsze okazałosię zastosowanie wypełnienia Spherisorb PAH oraz elucji skokowej z mieszaninąacetonitrylu i wody, jako fazy ruchomej. Granice oznaczalności, uzyskanew warunkach badań tej pracy z zastosowaniem detektorafluorescencyjnego albo detektora UV-DAD, przedstawiono w tabeli 3.Tabela 3. Zestawienie granic oznaczalności analitów z grupy WWA w asfalcieAnalit RP-HPLC-UV-DAD [ppb] RP-HPLC-FLD [ppb]Fluoren 18,82 2,12Fenantren 4,17 0,09Antracen 2,08 0,22Fluoranten 21,84 0,20Piren 13,83 0,05Benzo(a)antracen 8,00 0,23Chryzen 6,00 0,04Benzo(j)fluoranten 38,04 7,05Benzo(e)piren 53,06 1,03Benzo(b)fluoranten 34,31 7,31Benzo(k)fluoranten 32,98 0,27Benzo(a)piren 33,00 0,23Dibenzo(a,h)antracen 24,75 1,32Indeno(1,2,3-cd)piren 37,36 0,89Benzo(g,h,i)perylen 51,96 10,0253

Rysunek 4. Chromatogramy detektora UV-DAD z programowaniem długości fali (część A) i detektorafluorescencyjnego, (część B) otrzymane podczas rozdzielania 18 wzorców WWA (A)i (B) oraz podczas oznaczania frakcji zawierającej WWA otrzymanej dla asfaltu drogowego50/70, zgodnie z procedurą przygotowania próbki opisaną w pracy (część C); Warunki rozdzielaniaw tabeli 1. Warunki detekcji – patrz „Metodyka”; Piki chromatograficzne: 1 - naftalen,2 - acenaftylen, 3 - acenaften, 4 - fluoren, 5 - fenantren, 6 - antracen, 7 - fluoranten, 8 - piren,9 - benzo(a)antracen, 10 - chryzen, 11 - benzo(b)fluoranten, 12 - benzo(k)fluoranten, 13 - benzo(a)piren,14 - dibenzo(a,h)antracen, 15 - indeno(1,2,3-cd)piren, 16 - benzo(g,h,i)perylen,17 - benzo(j)fluoranten, 18 - benzo(e)piren, 19 - wysokopolarne składniki asfaltu 50/70 eluowanew przepływie zwrotnym, BF - punkt przełączenia zaworu przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie.54

WNIOSKI KOŃCOWEPraca prezentuje metodykę przygotowania próbki niskolotnych produktównaftowych, szczególnie pochodzących z destylacji próżniowej, dooznaczania śladowych zawartości WWA.Stosowanie techniki chromatografii wykluczania z zastosowaniem kolumnyHPLC w skali preparatywnej jako I etapu przygotowania próbki doanalizy śladowych zawartości WWA w produktach naftowych jest konieczne,ale niewystarczające.Zastosowanie, dodatkowo, etapu adsorpcji w warunkach układu faznormalnych w drugim etapie przygotowania próbki zapewnia możliwośćoznaczenia bardzo niskich zawartości WWA z dobrym i powtarzalnym stopniemodzysku.Badania wykazały, że podczas pierwszego etapu przygotowaniapróbki nie ma możliwości zastąpienia wypełnienia w postaci kopolimeru styren– diwinylobenzen, tradycyjnymi fazami stacjonarnymi, stosowanymiw warunkach NP lub RP.Korzyści wynikające z zastosowania techniki NP-HPLC podczas drugiegoetapu przygotowania próbki to:- wysoka sprawność i dobra powtarzalność sprawności i selektywnościkolumn chromatograficznych (znacznie lepsza niż kolumienekSPE);- możliwość monitorowania przy użyciu detektora (refraktometr, detektorUV albo fluorescencyjny) zakresu zbierania frakcji;- możliwość zastosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumniechromatograficznej do elucji składników wysoko polarnych, co zapewniaskrócenie czasu trwania analizy i zachowanie stałej aktywnościsorpcyjnej kolumny;- wyższy stopień odzysku analitów z grupy WWA i niższe wartościRSD.W celu obniżenia granicy oznaczalności podczas obu etapów przygotowaniapróbki celowe jest powiększenie skali przygotowania próbki poprzezzastosowanie techniki preparatywnej chromatografii cieczowej (PLC).Końcowe oznaczenie WWA dokonano techniką RP-HPLC z detekcjąUV-DAD oraz fluorescencyjną.LITERATURA1. Moret S., Conte L.S.: J. Chromatogr. A 2000, 882, 245-253.2. Standard IP 346/92, Determination of polycyclic aromatics in unusedlubricating base oils and asphaltene free petroleum fractions - Dimethylsulphoxide extraction refractive index method.3. Furusawa N., Ozaki A., Nakamura M., Morita Y., Okazaki K.: J. Chromatogr.A 1999, 830, 473-476.4. Rimkus G.R., Rummler M., Nausch I.: J. Chromatogr. A 1996, 737,9-14.55

5. Venkatesan M.I., Northrup T., Phillip Ch.R.: J. Chromatogr. A 2002,942, 223-230.6. Nerin C., Domeno C.: The Analyst 1999, 124, 67-70.7. Polish standard PN–EN ISO 17993 “Jakość wody. Oznaczanie 15 Wielopierścieniowychwęglowodorów aromatycznych (WWA) w wodzie metodąHPLC z detekcją fluorescencyjną po ekstrakcji ciecz-ciecz” (Waterquality. Determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) inwater using HPLC with fluorimetric detection following liquid-liquid extraction).8. Chen Y., Zhu L., Zhou R.: J. Hazard. Mater. 2007, 141, 148-155.9. Pillai I., Ritchie L., Heywood R., Wilson G., Pahlavanpour B., SetfordS., Saini S.: J. Chromatogr. A 2005, 1064, 205-212.10. Polish standard PN–C–82056: 2000, Produkty węglopochodne – Oznaczaniezawartości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych(WWA) w smole koksowniczej metodą cieczowej chromatografii kolumnowej(Coal derived products – Determination of the content of polycyclicaromatic hydrocarbons (PAHs) in high-temperature tar by columnliquid chromatography).11. Macherey – Nagel, SPE Application Guide, Germany 2006.12. Snyder L.R.: Anal. Chem. 1961, 33, 1527-1532.13. Lancas F.M., Carniho E., Deane G.H.N., Camilo M.C.F.: HRC 1989,12,368-395.14. Rashid H.A., Fakhn N.A., Dekran S.B., Abdulla N.I.: Fuel Sci. Technol.Int. 1989, 7, 281-289.15. Aceves M., Grimalt J., Albaiges J., Broto F., Comellas L.: Gassiot M.,J. Chromatogr. 1988, 436, 503-515.16. Baumeister W., Zens B., Viene O., Fresenius Z.: Anal Chem. 1989,333, 710-718.17. Karlesky L., Rollie M.E., Warner M.: Anal. Chem. 1989, 58, 1187- 1193.18. Obuchi A., Aoyama H., Obuchi H.:, J. Chromatogr. 1984, 312, 247-258.19. Saravanabhavan G., Helferty A., Hodson P.V., Brown R.S.: J. Chromatogr.A. 2007, 1156, 124-133.20. Wise S.A., Chesler S.N., Hertz H.S., May W.E., Guenther F.R.,Hilpert L.R.: Analytical Techniques for Sample Preparation (1980) 41.21. Wise S.A., Chesler S.N., Hertz H.S., Hilpert L.R., May W.E.,Parris R.M.: Anal. Chem., 52 (1980) 1828.56

Andrzej BYLINA 1 , Marian KAMIŃSKI 21emeryt TZF POLFA S.A., 03-176 Warszawa, ul. Fleminga 2,2Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, 80-2333 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12Adresy do korespondencji:Andrzej Bylina,Marian Kamińskiul. Siwińskiego 3 m 16 ul. Narutowicza 11/1205-120 LEGIONOWO 80-233 GDAŃSKe-mail: andrzej.bylina@gmail.come-mail: mknkj@chem.pg.gda.plTel. (22) 7749349 Tel. (58) 3471729, albo 601401824PREPARATYWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA,PODSTAWOWE ZASADY EFEKYTYWNEGO STOSOWANIA,ELEMENTY PRAKTYKIPreparatywna chromatografia cieczowa jest techniką używaną do wyodrębnianiapojedynczej, lub kilku substancji z mieszaniny kilku, albo bardzo wielu substancji,szczególnie o bardzo zbliżonych strukturach molekularnych, w tym, także dorozdzielania i otrzymywania izomerów optycznych. W pracy zamieszczono ogólnezasady optymalnego stosowania. Szczególną uwagę zwrócono na wybór sorbentu,ekonomię i problem rozpuszczalności próbki. Te problemy zostały opisane w oparciuo rzeczywiste procedury rozdzielania, stosowane w praktyce w laboratorium przemysłufarmaceutycznego.Słowa kluczowe: preparatywna chromatografia cieczowa, zasady ogólne stosowania,dobór sorbentu, rozpuszczalność próbki.PREPARATIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY, PRINCIPLESAND EXAMPLES OF APPLICATION IN PRACTICEPreparative liquid chromatography has been used as a tool for isolation of puresubstances from a crude material first of all for separation of very complex mixturesand mixtures of similar compounds, e.g. isomers, optical isomers etc.. The generalprinciples of PLC application, sorbent selection, economy and sample solubilityproblems are described based on the fragments of the real experiments and procedures.Key words: preparative liquid chromatography, general principles of application, sorbentselection, sample solubility.WSTĘPTeoria preparatywnej chromatografii, została sformułowana wiele lattemu. Podstawy tej dziedziny zawarte są w godnej polecenia monografii [1].Jest też kilka innych publikacji o fundamentalnym znaczeniu, a wśród nichprace Hupe i Lauera [2]. Z polskich autorów należy wymienić, nieżyjących57

już - inicjatora rozwoju polskiej aparatury i opracowania metod wykorzystaniapreparatywnej chromatografii cieczowej, prof. Jerzego S. Kowalczyka [3]i dr Barbarę Śledzińską [4].Ogólne zasady postępowania w celu maksymalizacji efektywnościwykorzystania chromatografii do rozdzielania i otrzymywania użytkowych ilościsubstancji, w tym, szczególnie substancji o aktywności farmaceutycznej,zostały m.in. opisane w cytowanych powyżej pracach [1-6]. Najważniejszewnioski tam zawarte można streścić w następujący sposób:- Produktywność kolumn o jednakowej długości jest proporcjonalna do powierzchniprzekroju poprzecznego wypełnienia. Stąd n-krotne zwiększenieśrednicy kolumny powoduje ok. n 2 -krotny wzrost produktywności.- Ze względów ekonomicznych wszystkie parametry procesu rozdzielanianależy optymalizować w skali kolumny modelowej o średnicy dc 4-8 mm,o długości (Lc) i wypełnionej takim samym sorbentem, jak kolumna preparatywna.W warunkach kolumny modelowej należy dobrać optymalnie:układ chromatograficzny, tzn. rodzaj fazy stacjonarnej i skład eluentu,długość kolumny (Lc), wielkość ziaren wypełnienia (dp), prędkość przepływueluentu (u), objętość dozowania (Vinj), stężenie roztworu dozowanego(Cinj), rodzaj rozpuszczalnika wsadu (najkorzystniejsze jest stosowanieeluentu jako rozpuszczalnika wsadu), punkty kolekcji frakcji,zapewniające określoną czystość produktu, a także warunki detekcji zapewniającewystarczającą czułość oraz liniowość odpowiedzi detektora.- Najważniejsze znaczenie dla uzyskania wysokiej produktywności kolumnyma maksymalizacja selektywności układu chromatograficznego przyjak najwyższej sprawności kolumny oraz utrzymanie wartości współczynnikaretencji rozdzielanych składników szybciej eluowanych z kolumny– w zakresie od 1 do 5 oraz składników najpóźniej eluowanych z kolumny– w zakresie od 5 do 12;- Należy preferować elucję izokratyczną, tzn. z zastosowaniem eluentuo stałym składzie. Tylko w przypadku rozdzielania peptydów i białek, koniecznejest z reguły wykorzystywanie elucji gradientowej, ponieważ elucjaizokratyczna nie zapewnia najczęściej dostatecznej selektywnościrozdzielania tych substancji.- Gdy to tylko możliwe, należy dążyć do stosowania warunków, tzw. przeładowaniastężeniowego kolumny (wysokie stężenie i mała objętość dozowania),a nie objętościowego (niskie stężenie i wysoka objętość dozowania,konieczne niestety, gdy rozpuszczalność rozdzielanych substancjiw eluencie jest bardzo niska). Korzystny jest więc taki dobór eluentu, abybył on dobrym rozpuszczalnikiem wszystkich składników wsadu do kolumnyi najkorzystniej jest dozować mieszaninę substancji rozdzielanychrozpuszczoną w eluencie.- W praktyce istnieje optymalna wartość długości kolumny preparatywnej(Lc) oraz linowej prędkości przepływu eluentu (u), zapewniająca maksymalnąproduktywność kolumny preparatywnej. Optymalna wartość Lc jesttym mniejsza, a optymalna prędkość przepływu eluentu oraz produktywnośćkolumny, a także konieczne maksymalne ciśnienie pompowania58

eluentu - tym większe, im mniejsza jest średnica ziaren wypełnienia kolumny.W dalszej części niniejszej pracy opisano kilka problemów praktycznychzwiązanych z optymalnym stosowaniem cieczowej chromatografii preparatywnejdo rozdzielania i otrzymywania czystych substancji i podanooptymalne, uzyskane w rezultacie badań, ich rozwiązania.Każde zadanie zaczynające się od słów „należy wyodrębnić …, o czystościnie gorszej niż …”, posiada wiele uwarunkowań lokalnych, poczynającod szczegółów syntezy, własności wyodrębnianej substancji, po warunkitechniczne, jakimi dysponuje zamawiający opracowanie. Wspomaganiekomputerowe doświadczeń [8, 9] oraz ocena elementów ekonomicznychchromatograficznego procesu przemysłowego [10] są niezbędne przy realizacjipostawionego zadania. Celem niniejszej pracy jest zwrócenie uwagi naniektóre elementy postępowania (dobór sorbentu, rachunek ekonomiczny)i trudności, z jakimi spotyka się eksperymentator (np. słaba rozpuszczalnośćskładników próbki (wsadu)). W opisie przytoczono niektóre wyniki uzyskanew praktyce.Pierwsze polskie wdrożeniaDr B. Śledzińska i współpracownicy [4,7] opracowali optymalne warunkitechnologii otrzymywania lanatozydu C z ekstraktu alkoholowego digitalislanata (z brunatnicy wełnistej), a potem proscylarydyny otrzymywanejz ekstraktu alkoholowego, z tzw. cebuli morskiej. Obie technologie zostaływdrożone i stosowane w latach 80. ubiegłego wieku w KZF POLFA w Kutnie.Warto przy tym zwrócić uwagę, że zastosowano wówczas chromatografięw układzie faz normalnych z dynamicznie generowaną fazą stacjonarnąbogatą w wodę. „Nośnik” stanowił żel krzemionkowy typu H60, a fazę ruchomąmieszanina metanolu i chlorku metylenu w stosunku objętościowym94/6, zawierającą ok. 0.12% wody (poniżej granicy rozpuszczalności wodyw układzie CH 2 Cl 2 -MeOH). W tych warunkach ma miejsce kondensacja kapilarnaroztworu wody i metanolu w porach wypełnienia kolumny i typowe warunkichromatografii podziałowej [4]. Tego typu układy chromatograficznecharakteryzują się szczególnie wysoką pojemnością sorpcyjną i wysoką wydajnościąkolumny. Są też one szczególnie odporne na występujące w śladowychstężeniach zanieczyszczenia wsadu, silnie sorbowane do powierzchniżelu krzemionkowego. Są szczególnie przydatne do rozdzielaniai otrzymywania, także w skali procesowej, glikozydów i alkaloidów.BuprenorfinaNależało odzyskać cenny produkt - buprenorfinę (lek przeciwbólowy),a także nieprzereagowany cenny substrat z mieszaniny poreakcyjnej, gdyw czasie reakcji pojawiły się produkty rozkładu buprenorfiny (MS). Podczasjednego rozdzielania i wyodrębniania, z zastosowaniem odpowiedniej kolumnypreparatywnej, zdołano otrzymać 1500 mg czystego krystalicznegoproduktu w pierwszej zebranej frakcji oraz czysty substrat reakcji, zawarty59

w drugiej frakcji. Nie była to ogromna masa, ale był to surowiec na prawie4000 tabletek leku (WZF POLFA).2-CDAWilgotne kryształy o brunatnym zabarwieniu były surowcem, z któregopo syntezie [11] wyodrębniano czystą substancję nazywaną w skrócie2-CDA (2-chlorodeoxyadenozyna, lek przeciw białaczce kosmatokomórkowej).Wykorzystano kolumnę produkcji Merck (Niemcy) o wymiarachLc x dc – 20 x 5 cm, wypełnioną sferycznym sorbentem C18, o ziarniedp = 7 µm. W fazie ruchomej (ACN / MeOH / bufor), używanej do oznaczeńanalitycznych, zamieniono bufor fosforanowy o pH = 2.50 na roztwór H 2 SO 4w wodzie o takim samym pH. Wyniki rozdzielania wykonanego w warunkachbraku przeładowania kolumny (w warunkach „analitycznych”) z zastosowaniemkolumny preparatywnej (dozowanie 3 ml roztworu, zawierającego30 mg surowca rozpuszczonego w fazie ruchomej, przepływ 30 ml/min, detekcja254 nm), były następujące: zanieczyszczenie 1 (k 1 = 3.8, N 1 = 11560),zanieczyszczenie 2 (k 2 = 6.27), 2-CDA (k 3 = 7.67, α 32 = 1.22), dalsze zanieczyszczeniak>15. Po symulacjach z wykorzystaniem programu Craiga ustalonooptymalne warunki rozdzielania preparatywnego (w warunkach stężeniowegoprzeładowania kolumny). Wykonano następującą procedurę: dokolumny dozowano roztwór wsadu o objętości 2.6 V 0 , tzn. 2.6-krotność tzw.objętości martwej kolumny (500 ml surowca rozpuszczonego w wodzie,w tym około 5 g 2-CDA), z kolei, po wprowadzeniu mieszaniny substancjizaadsorbowanych na powierzchnię wypełnienia kolumny, procedura elucjibyła następująca: 7.7 V 0 fazy ruchomej, 1.5 V 0 metanolu (tzw., „mycie” kolumny,tzn. elucja silnie sorbowanych zanieczyszczeń wsadu w formie jednejstrefy), 1.5 V 0 (reaktywacja zdolności sorpcyjnej kolumny z zastosowaniemeluentu). W opisanym postępowaniu, po wprowadzeniu do kolumny rozdzielanegoroztworu (wsadu), ciśnienie w układzie wzrastało powoli od poziomu800 psig, nie przekraczając dopuszczalnej dla kolumny wartości 1400 psig,aż do momentu, gdy zanieczyszczenie 1 opuściło kolumnę. W wycieku z kolumny(eluacie) można było zauważyć „nietrwałą mgiełkę” wytrąconej substancji.Po tym momencie ciśnienie szybko wracało do pierwotnego poziomu.Było to następstwo „szoku stężeniowego” wywołanego zmianą fazywodnej, którą stanowił roztwór dozowany do kolumny, na duże stężenie rozdzielanychsubstancji w fazie ruchomej, przewyższające stężenie roztworunasyconego. Wystąpiła krystalizacja, jednak nie blokująca całkowicie kolumnychromatograficznej.Frakcja główna była kierowana na grawitacyjną kolumnę jonitową.Odkwaszony roztwór służył do wyodrębnienia czystej substancji (odzysk> 90%, zanieczyszczenia poniżej 0.2% ww.). Wydajność procesu chromatograficznego:3 g krystalicznej substancji 2-CDA/godz. lub 4.5 g podczaskażdego cyklu rozdzielania. Wartość dwóch chromatograficznych rozdzielańzwracała zakup kolumny. Obecnie parametry tego procesu chromatograficznegosą już inne, składniki fazy ruchomej zostały zastąpione innymi substancjami,wydajność jest nieco mniejsza, zaś ryzyko niepowodzenia pod-60

czas rozdzielania zostało sprowadzone do minimum, a 2-CDA służy do wytwarzanialeku (BIOTON).Analog prostaglandynyZ zastosowaniem siedmiu wybranych sorbentów (handlowe analitycznekolumny wypełnione 5 μm sorbentem, w tym przypadku pełniące funkcjękolumn modelowych), przeprowadzono pomiar współczynników pojemnościowychproduktu i najbliższych sąsiadujących zanieczyszczeń (z1, z2), wyliczonoselektywność kolumny (α), sprawność badanych kolumn (N) orazoceniono względną pojemność sorbentów w stosunku do produktu (k 2X /k 2G ).Pomiary prowadzono stosując wcześniej dobraną fazę ruchomą w układziefaz normalnych (NP). Przy doborze składu fazy ruchomej obserwowanozmniejszanie się selektywności rozdzielania ze wzrostem udziału moderatorafazy. Wyniki pokazano w tabeli 1.Tabela 1. Badanie sorbentówKolumnaanalitycznawypełnionasorbentemk 1z1k 2produktk 3z2α 21 α 32 N 2WzględnapojemnośćA (silica gel) 12.25 13.66 16.17 1.12 1.18 8900 2.28B (silica gel) 7.40 8.14 9.56 1.10 1.17 6500 1.36C (silica gel) 9.42 10.32 12.19 1.096 1.18 8100 1.73D (silica gel) 8.94 9.74 11.53 1.089 1.18 9000 1.63E (silica gel NH 2 ) 10.13 11.17 12.62 1.10 1.13 10500 1.87F (silica gel CN) 4.36 4.85 5.37 1.11 1.11 12300 0.81G (silica gel) 5.27 5.98 6.88 1.14 1.15 10200 1.00Im mniejsza selektywność sorbentu tym mniejsza wydajność otrzymywaniaczystej substancji. Im większe k-tym większe zużycie fazy ruchomej.Wybrano kolumnę analityczną wypełnioną sorbentem G i wykonanochromatogram w warunkach przeładowania kolumny. Dozowano 500 µL roztworusurowca (10 mg/mL) w heptanie. Każde dozowanie zostało poprzedzonedozowaniem do kolumny 500 μl czystego heptanu, przepływ fazy ruchomej0.5 ml/min, chromatograf Shimadzu LC-6A pracował w warunkachizokratycznych. Na rysunku 1 pokazano chromatogram z tego doświadczenia.Zebrano frakcję główną poczynając od maksimum piku do 1/3 wysokościrejestrowanego piku. Odebrany roztwór został poddany pomiarom HPLCna rutynowej kolumnie analitycznej i kolumnach stereospecyficznych z uwagina strukturę analogu prostaglandyny. Dalsze doświadczenia były prowadzonena większej kolumnie wypełnionej 5 µm sorbentem G.61

Rysunek 1. Preparatywny chromatogram surowca po syntezie analogu prostaglandyny wykonanyz zastosowaniem kolumny analitycznej (modelowej) wypełnionej 5 µm sorbentem GAZTPrzykładem opisu doboru warunków i oceny wielkoskalowego procesuwyodrębniania na kolumnie 10x25 cm było otrzymanie AZT (azydotymidyna,lek o działaniu anty-HIV) z surowca po syntezie, zawierającego ok. 90%AZT. Doświadczenia wykonano z wykorzystaniem kolumny mikropreparatywnej1x25 cm wypełnionej sorbentem sferycznym DAISOGEL C8,o dp = 13 µm, firmy DAISO CO LTD, na chromatografie Shimadzu LC-6Aoraz BIO-RAD, z fazą ruchomą MeOH/H 2 O = 20/80 (v/v). Planowanie rozdziałówpreparatywnych było poprzedzone wyliczeniami opartymi na modeluidealnej chromatografii. Na rys. 2 przedstawiono chromatogram z analitycznymnaniesieniem wykonany na mikropreparatywnej kolumnie (20 µl wodnegoroztworu surowca o stężeniu 10 mg/ml, roztwór prawie nasycony).Porównanie chromatogramów uzyskanych z analitycznego i preparatywnegonaniesienia wykonanych na tej samej kolumnie przedstawiono narys. 3. Oba chromatogramy są tak złożone, że czasy końca zastrzyku sąwspólne. Tam, gdzie znajduje się koniec etapu dozowania, pojawia się w kolumniechromatograficznej prawie zerowe stężenie substancji i ten punkt„wędruje” wzdłuż kolumny tak samo wolno jak strefa substancji dozowanaw warunkach braku przeładowania. Oba takie punkty opuszczają kolumnęw tym samym czasie liczonym od końca czasu dozowania mieszaniny do kolumny.62

Rysunek 2. Chromatogram AZT po syntezie, kolumna 1x25 cm, faza ruchomaMeOH/H 2 O = 20/80, przepływ 1.2 ml/min, detekcja 265 nm, ciśnienie ok. 3 bary, V 0 = 12.76 ml,chromatografia izokratyczna do 140 minuty, potem 20-minutowa elucja gradientowa do 100%MeOH i dalej 100% MeOH.Rysunek 3. Chromatogram preparatywny (a) i analityczny (b) zostały tak zestawione, aby pokryłsię czas końca dozowania. Przepływ 2.5 ml/min, detekcja 300 nm (a), 265 nm (b), ciśnienieokoło 17 bar, objętość dozowania V inj = 80 ml (800 mg) (a), V inj = 20 µl (0.2 mg) (b). Regeneracjękolumny (a) włączono około 107 minuty.63

Opracowana procedura miała następujące parametry: przepływ5 ml/min, długość fali detekcji 300 nm, cienienie około 35 bar, objętość dozowaniaV inj = 120ml (V inj /V 0 = 9.40, czas iniekcji 24 min, masa 1200 mg,120 mg surowca na 1 g sorbentu). Objętość fazy ruchomej pompowana dowystąpienia frontu piku AZT wynosiła 25 ml (V front /V 0 = 1.96, czas 5 min).Frakcję główną odbierano pomiędzy absorbancją 2.56 (sygnał detektora pozazakresem pomiarowym), a absorbancją 0.5 (koniec frakcji). Była to objętośćV frakcja = 69 ml (V frakcja /V 0 = 5.4, czas 13.8 min). Regeneracja kolumny:26 ml MeOH (V MeOH /V 0 = 2.04, czas 5.2 min), regeneracja wodą: 13 ml(V H2O /V 0 = 1.02, czas 2.6 min). Całkowity czas rozdzielania z regeneracjąkolumny wynosił 51 minut. Po odparowaniu do sucha frakcji głównej i pokrystalizacji pozostałości z wody, uzyskano 1.02 g AZT.Wykonano 5 różnych chromatogramów, a ich wyniki posłużyły do wyznaczeniapojemności stężeniowej kolumny C 0 [M]. Posłużono się zależnością opisującąw modelu idealnej chromatografii czas pojawienia się frontu przeładowanegopiku (rys. 3):tfrontt0= 1+vinj+ gfront(1)oraz zależnością wiążącą bezwymiarową masę m inj dozowanego AZTz współczynnikiem pojemnościowym g front charakteryzującym położenie frontupiku AZT na chromatogramie pojedynczej substancji w przypadku izotermyLangmuira:minjC[ M ] ⋅Vinj inj= cinj⋅ vinj== 10C [ M ] ⋅V0−gkfrontAZT(2)Wyniki zestawiono w tabeli 2 i na rysunku 4. Wyznaczona metodą najmniejszychkwadratów stężeniowa pojemność kolumny wynosi C 0 = 0.78 [M], a tooznacza, że 1 litr badanej kolumny posiada 0.78*V 0 /V geom = 0.51 mola miejscaktywnych do adsorpcji AZT.Tabela 2. Położenie frontu przeładowanego piku AZT na chromatogramieF [ml/min] V inj [ml] t front [min] v inj =V inj /V 0 g front m inj1,2 0,02 90,9 0,002 7,55 6,77E-051,2 30 79 2,35 4,08 0,1022,5 80 46 6,27 1,74 0,2715,0 80 22,5 6,27 1,55 0,2715,0 120 29 9,40 0,96 0,40664

Rysunek 4. Zależność zastrzykniętej masy AZT od położenia frontu pikuNależy zwrócić uwagę na stężenie AZT w maksimum piku chromatograficznegookoło 30 mg/mL. Jest to stężenie dużo wyższe niż w roztworzedozowanym, wyższe niż rozpuszczalność AZT w wodzie, lub fazie ruchomej.Taki „szok stężeniowy” ma miejsce w czasie kontaktu fazy ruchomej z substancjązaadsorbowaną z fazy bogatszej w wodę niż faza ruchoma. Tenszokowy wzrost stężenia jest następstwem bilansu masy i równowagi termodynamicznejobowiązującej substancję adsorbującą się pomiędzy powierzchniąsorbentu i fazą ruchomą. W tym przypadku ustala się równowagaprocesu adsorpcji–desorpcji pomiędzy powierzchnią sorbentu bogategow AZT zaadsorbowany z fazy wodnej roztworu dozowanegoAZT AZT( k >> k ), a fazą MeOH/HH 2 O faza2 O = 20/80, dając w efekcie stężenie AZTw fazie ruchomej dużo wyższe niż w roztworze nasyconym. Trwałość roztworuprzesyconego zależy od wielu czynników, dlatego w takich postępowaniachwymagana jest daleko posunięta ostrożność i ciągła kontrola ciśnieniomierzachromatografu.Badanie czystości produktu na płytce TLC (fluorescencja) wykazała obecnośćjednego zanieczyszczenia, którego zawartość oceniono na mniej niż0.5%. Było to zanieczyszczenie zawierające rdzeń tyminy, nie należące dozanieczyszczeń wymienianych przez farmakopee. Na wykonanym wg farmakopeichromatogramie stwierdzone zanieczyszczenie znajduje się nakońcu zbocza piku AZT.Taka sytuacja wymaga dodatkowych badań. Są to: wyodrębnienie zanieczyszczenia,aby stwierdzić jego strukturę (MS, NMR), sprawdzenie, czynie jest to produkt reakcji zanieczyszczenia, któregoś z głównych substratów,procesu otrzymywania AZT, podziału frakcji głównej na dwie frakcje,65

z których jedna poddana byłaby dodatkowej obróbce, itp. Wykonanie takichbadań wymaga pracy na większej kolumnie z wykorzystaniem większej ilościmateriału po syntezie.Tabela 3. Dane kolumny mikropreparatywnej, prognoza dla kolumny preparatywnejWyszczególnienieKolumna mikroKolumnapreparatywna produkcyjnaMasa sorbentu w kolumnie 10 [g] 1.01 [kg]Objętość geometryczna złoża 19.6 [ml] 2.00 [l]Objętość własna kolumny V 0 12.76 [ml] 1.30 [l]Przepływ fazy przez kolumnę 5.0 [ml/min] 0.51 [l/min]Objętość dozowania V inj 120 [ml] 12.24 [l]Dozowana masa M inj 1.2 [g] 0.122 [kg]Objętość fazy r. do frontu AZT 25.0 [ml] 2.55 [l]Objętość frakcji głównej 69.0 [ml] 7.04 [l]Masa odzyskanego AZT 1.02 [g] 0.104 [kg]Regeneracja metanolem 25.5 [ml] 2.60 [l]Regeneracja wodą 12.8 [ml] 1.30 [l]Czas całkowity 1 cyklu rozdzielania 51 [min] 51 [min]Wyniki doświadczeń przeliczono i zestawiono niektóre parametry kolumny1x25 cm i procesu z kolumną (oferowaną) 10.1x25 cm wypełnionąbadanym sorbentem (tabela 3). Sporządzono ocenę udziału różnych czynnikóww koszcie chromatograficznego oczyszczania 1 kg AZT na drodze preparatywnejchromatografii na jednej kolumnie 10.1x25 cm, pracującej 5000godzin w ciągu roku (praca trzyzmianowa). Ocena została sporządzona dodyskusji w kierownictwie firmy, w warunkach ekonomicznych roku 1998 przykursie: 3.54 pln/USD. Wynik przedstawiono na rysunku 5.Rysunek 5. Rozkład różnych udziałów w cenie uzyskania 1 kg AZT oczyszczonego w procesiechromatografii preparatywnej66

Wzorce EMCProdukcja erytromycyny A (EMC A, antybiotyk) w TZF POLFA, dokontroli postępu biosyntezy i procesu oczyszczania produktu wymagała wieluanaliz dziennie. Cały proces technologiczny otrzymywania EMC A byłkontrolowany metodami chromatograficznymi korzystającymi z wzorców(HPLC metoda farmakopealna w środowisku obojętnym, trwająca 60 minut,HPLC w środowisku alkalicznym 20 minut, HPLC z detekcją elektrochemiczną10 minut i TLC). Sprawdzano obecność EMC innych niż EMC A.Proces technologiczny charakteryzują następujące stwierdzenia. ErytromycynaB powstaje obok EMC A w warunkach niedotlenienia hodowli Sterptomyceserythreus. Przyjmuje się, że EMC C jest prekursorem EMC A, EMC Djest prekursorem EMC B, EMC F jest prekursorem EMC E. Anhydro EMC A(EMC P), enoloeter EMC A (EE), enoloeter pseudo-EMC A (EMC X) powstająw wyniku kwaśnej hydrolizy EMC A [12, 13]. Na rysunku 6 przytoczonoprzykładowy chromatogram pokazujący położenia pików zanieczyszczeń.Rysunek 6. Chromatogram EMC w środowisku alkalicznym (20 mM K 2 HPO 4 /ACN = 1/1,pH = 10.5, kolumna Suplex PKB-100), pokazujący rozkład zanieczyszczeń EMC A [14]Te lokalne wzorce o czystości powyżej 95% czystej substancji otrzymywanona drodze preparatywnej chromatografii z odpadów po krystalizacjiprzeznaczonych do utylizacji. Były to wzorce EMC: C, E, F, N-demetylo-EMC A (NdA). Do otrzymania wzorców EMC A i EMC B wykorzystywanohandlową EMC A oraz 70% substancje z doświadczalnej produkcji EMC B.Substancje EMC P, EE, EMC X otrzymywano na drodze prostych przekształceńchemicznych EMC A [12,13] z wykorzystaniem preparatywnejchromatografii po syntezie.Opis warunków wyodrębniania EMC z odpadów: chromatograf DeltaPrep Waters, przepływ 25 ml/min, detekcja 270 nm, droga optyczna 0.2 cm,zakres 2.0 AUFS, kolumna DAN Process 25x5 cm wypełniona sorbentemDaisogel C8, dp = 13 µm, faza ruchoma: 38% bufor (0.1 M (NH 4 )HCO 367

o pH = 10.0) oraz 62% MeOH (v/v), dozowanie 200 ml przesyconego roztworu10 g rodanku EMC (postępowanie wg specjalnej procedury), fazaregenerująca kolumnę: 20 mM NaHSO 4 /EtOH = 25/75, faza „postojowa”podczas przechowywania kolumny: H 2 O/EtOH = 30/70. Przykładowy chromatogrampreparatywny oraz wynik analizy TLC otrzymanych frakcji pokazanona rysunku 7.Rysunek 7. Chromatogram preparatywny. Markery: 1-2 zakres dozowania, 3-4 frakcja 1 (60 ml;65 mg), 4-5 frakcja 2 (125 ml; 375 mg), 5-6 frakcja 3 (100 ml; 424 mg), 6-7 frakcja 4 (180 ml;1100 mg), marker 8: początek zrzucania fazą regenerującą, 7-9 frakcja 5 (200 ml; 1000 mg).Marker 10 koniec regeneracji i początek stabilizacji kolumny fazą ruchomą (2 V 0 ). ChromatogramTLC: frakcje od 1 do 5 i materiał wyjściowyZ każdej odebranej frakcji usuwano MeOH na wyparce próżniowejw temperaturze 50 o C, a produkt ekstrahowano chlorkiem metylenu z wodnegoroztworu.Otrzymane frakcje, po uzyskaniu odpowiedniej masy substancji, rechromatografowanoraz, dwa lub trzy razy w warunkach podobnych do opisanych.Produkt końcowy krystalizowano otrzymując dwu-wodzian konkretnejEMC. Otrzymanie 1 g spodziewanej EMC F, do analiz identyfikacyjnychMS i NMR i jako wzorca, wymagało wielu powtórzeń. Łączne otrzymanie np.100 g wzorców wg wybory laboratorium Kontroli Jakości wymagało pracy3 osób i czasu około 3 miesięcy. Stosowano też naniesienie 30 g rodankuEMC oraz fazę ruchomą o składzie 45%bufor/55%MeOH. Erytromycyna Acharakteryzuje się słabą rozpuszczalnością i ujemnym współczynnikiemtemperaturowym rozpuszczalności w wodzie i wodno metanolowych roztworach.We wszystkich postępowaniach z EMC, roztwór do naniesienia na kolumnębył roztworem silnie przesyconym, sporządzanym wg następującejprocedury. Naważka preparatu była rozpuszczana w MeOH, sączona68

i schładzana do -23 o C. Ten zimny roztwór był mieszany z podobnie schłodzonymroztworem buforu, tak by końcowe objętościowe stężenie metanolubyło niższe niż w danej fazie ruchomej (np. 50% MeOH). Sporządzony roztwórbył natychmiast wprowadzany na kolumnę chromatograficzną, a osobawykonująca tę czynność pilnowała, aby żaden mały pojawiający się kryształeknie został zassany do pompy chromatografu.Ujemny współczynnik temperaturowy rozpuszczalności EMC wskazujena możliwość istnienia termodynamicznie nietrwałej formy krystalograficznej[15]. Takie podejrzenia potwierdzały różniące się rentgenogramy proszkowewykonane w roztworze będącym zawiesiną wytrąconych w niskiejtemperaturze kryształów oraz po wysuszeniu ich na powietrzu. Stwierdzonoteż, że wodny roztwór EMC A otrzymany z frakcji głównej, po usunięciu metanoluna wyparce, nie krystalizował, choć jego stężenie w 50 o C sięgało140 mg/ml, zaś stwierdzona rozpuszczalność (równowaga roztworu z kryształamipreparatu wyjściowego) wynosiła w tych warunkach mniej niż1 mg/ml. Świadczy to o trudnościach w powstawaniu znanej struktury ortorombowejkryształu dwu-wodzianu erytromycyny A [16, 17], pod nieobecnośćinnych podobnych związków lub śladów kwasów tłuszczowych z procesubiosyntezy.Pik X doksycyklinyNa początku farmakopealnego chromatogramu doksycykliny (antybiotyk)występuje tzw. pik X. Wyodrębnienie tej substancji z odpadów po produkcjiformy leku dla potrzeb Kontroli Jakości było beznadziejnym przedsięwzięciem.Na podstawie sugestii o tym, co powoduje powstanie tejsubstancji i kilku prób, wykonano poniższe doświadczenie. W wodnym roztworze(200 ml) rozpuszczono 10 g doksycykliny (hyclate), 50 g Na 2 SO 4 ,100 mg Na 2 S 2 O 5 (przeciwutleniacz). Roztwór umieszczono na 48 h w temperaturze50 o C. Do roztworu dodano 50 ml fazy ruchomej (woda/EtOH == 80/20) i wprowadzono na kolumnę 5x25 cm wypełnioną sorbentem DaisogelC8. Z otrzymanej frakcji głównej (2 V 0 ) usunięto etanol na wyparce,a roztwór wodny poddano liofilizacji. Otrzymano 500 mg brązowawej substancjizawierającej wg HPLC 95.3% substancji X. Pomiar MS pokazał identycznośćdoksycykliny i substancji X. Na podstawie 13 C NMR potwierdzonowniosek z MS. Na podstawie 1 H NMR stwierdzono, że podwojone sygnały6-CH 3 należą do dwóch epimerów doksycykliny. Pik X jest mieszaniną4-epidoksycykliny i 4,6-epidoksycykliny.To opracowanie poświęcamy pamięci tragicznie zmarłej Pani mgr Grażyny Osmólskiej,Kierowniczki Laboratorium Badawczo-Rozwojowego Insuliny TZF POLFA,a także nieżyjącym już pionierom praktycznego stosowania preparatywnej chromatografiido otrzymywania farmakopealnie czystych leków nasercowych – Pani dr BarbarzeŚledzińskiej i twórcy w roku 1964 pierwszego w Polsce semi-preparatywnegowysokociśnieniowego chromatografu cieczowego - Panu prof. Jerzemu S. Kowalczykowi.69

LITERATURA1. Guiochon G., Golshan-Shirazi S., Katti A.: Fundamentals of Preparativeand Nonlinear Chromatography. Academic Press (1994).2. Hupe K.P., Lauer H.H.: Optimization of Preparative LC Separation,J. Choromatogr., 203, (1981), 41-57.3. Kowalczyk J.S., Gazda K., Kamiński M., Klawiter J., Makuch B.: Cieczowachromatografia preparatywna i produkcyjna, Chem. Anal. (Warsaw),33, (1988), 237-257.4. Kamiński M., Śledzinska B., Klawiter J.: Studies on the Optimization ofParameters of Preparative Liquid Chromatographic Columns for Productionof Cardiac Glycosides, J. Chromatogr. 367, (1986) 45-58.5. Kamiński M.: Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowejjako techniki otrzymywania substancji. Praca habilitacyjna, PolitechnikaGdańska, Gdańsk, (1981).6. Kamiński M., Reusch J.F.: Preparative HPLC Under Infinite DiameterConditions, Preparative Chromatography, 1, (1991), 367-402.7. Śledzińska B., Kamiński M., Klawiter J., Majer Z., Klauze M.: PatentPRL nr 135 728 i patent dodatkowy nr 137, 576, p.t., Sposób otrzymywanialanatozydów A, B i C z ich mieszanin, zgł. (1982).8. Makowiecka A., Kaczorek P., Złamański T., Bylina A.: Online simulationfor preparative liquid chromatography using the Craig algorithm withLangmuir competitive isotherm. ABiD, 5-19, (2008).9. http://plc.uksw.edu.pl Symulacja komputerowa preparatywnej chromatografii.10. Katti A.M. and Jagland P., Development and optimization of industrialscale chromatography for use in manufacturing; ANALUSIS MAG. 26,M38-45, (1998).11. Kazimierczuk Z. and Kamiński J.: Patent PL No 194162 B1, (1999).12. Wiley P.F., Gerzon K., Flynn E.H., Sigal M.V., Weaver O., Quarck U.C.,Chauvette R.R., Monahan R.: Erythromycin. X. Structure of erythromycin.J. Am. Chem. Soc. 79, 6062-70, (1957).13. Kibwage I.O., Busson R., Janssen G., Hoogmartens J., Vanderhaeghe H.,Bracke J.: Translactonization in erythromycins. J. Org. Chem. 52,990-6, (1987).14. Gwóźdź E., Holska W. i Kulińska A.: Application of highly alkaline pH inerythromycin separation by high performance liquid chromatography;Chem. Anal. (Warsaw), 36, 219, (1991).15. Brzozowski S.: Klatraty jako sorbenty chromatograficzne. Rocz. Chem.47, 617, (1973).16. Stephenson G.A., Stowell J.G., Pascal H.T., Pfeiffer R.R., Byrn S.R.: Solidstateinvestigations of erythromycin A dihydrate: structure, NMR spectroscopy,and hygroscopicity. J. Pharm. Sci.; 86: 1239-1244, (1997).17. Mirza S., Miroshnyk I., Heinämäki J., Christiansen L., Karjalainen M.,Yliruusi J.: Influence of Solvents on the Variety of Crystalline Forms ofErythromycin. AAPS Pharm. Sci. (2), 5, (2003).70

Piotr M. SŁOMKIEWICZZakład Fizyki Chemicznej, Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego,Kielce, ul. Świętokrzyska 15 G, 25-406 KielceZASTOSOWANIE INWERSYJNEJ CHROMATOGRAFIIGAZOWEJ W BADANIACH KOADSORPCJIZbudowano dozownik chromatograficzny z dwiema komorami dozymetrycznymido pomiarów koadsorpcji metodą inwersyjnej chromatografii gazowej.Wykonano pomiary adsorpcji dla metanolu i izobutenu, a koadsorpcji dla izobutenuna powierzchni adsorbenta pokrytej metanolem. Jako adsorbenta użyto sulfonowanegokopolimeru styrenowo-diwinylobenzenowego o symbolu Amberlyst 15. Wyznaczonostałe równowagi adsorpcji i koadsorpcji oraz entalpie adsorpcji i koadsorpcji.WSTĘPInwersyjna chromatografia gazowa jest szybką i dokładną metodą wykonywaniacharakterystyk adsorpcyjnych. Badania adsorpcji, wykonywaneza pomocą tej metody, polegają na wprowadzeniu próbki adsorbatu na adsorbentumieszczony w kolumnie chromatograficznej i analizie otrzymanegochromatogramu. Na podstawie wielkości charakterystycznych dla położeniai kształtu profilu piku chromatograficznego można obliczyć fizykochemiczneparametry procesu adsorpcji. Zwykle do pomiaru wykonywanego metodąinwersyjnej chromatografii używa się typowego chromatografu gazowegowyposażonego w dozownik, kolumnę zawierającą adsorbent oraz detektor.Za pomocą takiego urządzenia można badać układ jeden adsorbat – jedenadsorbent. Nie jest możliwe wykonanie pomiarów adsorpcyjnych z użyciemdwóch adsorbatów, na przykład w celu określenia ich wzajemnego oddziaływaniana powierzchni adsorbenta. Należałoby wówczas w krótkim czasiekolejno wstrzykiwać do dozownika dwa adsorbaty, co sprawiłoby trudnościz dokładnym określeniem ich czasów retencji. Także nie zawsze jest możliwesporządzenie mieszanin dwóch adsorbatów ze względu na ich różnewłaściwości fizykochemiczne, w celu ich równoczesnego dozowania do kolumnychromatograficznej.W niniejszym artykule opisano metodę dozowania różnej wielkościpróbki dwóch adsorbatów o różniących się właściwościach fizykochemicznych(gazowych i ciekłych). Pomiar adsorpcji może być wykonywany na czystejpowierzchni adsorbenta, jak i na powierzchni adsorbenta pokrytej adsorbatem.Zastosowane rozwiązanie konstrukcyjne dozownika polegającena zmianie długości przewodu gazowego łączącego dwie komory dozymetryczne,umożliwia wykonanie pomiaru w taki sposób, że pierwszy adsorbatjest adsorbowany na adsorbencie w kolumnie chromatograficznej, a następniena powierzchnię adsorbentu pokrytą pierwszym adsorbatem zostaje71

wprowadzony drugi adsorbat w możliwym do wyznaczenia czasie dozowania.Pomiary adsorpcji wykonano dla metanolu i izobutenu, a pomiarykoadsorpcji dla izobutenu na powierzchni adsorbatu pokrytej metanolem.Jako adsorbentu użyto sulfonowanego kopolimeru styrenowo-diwinylobenzenowegoo symbolu Amberlyst 15 [1, 2]. Ten sulfonowany kopolimerjest stosowany, jako kwasowy katalizator do syntez eterów (np. eteru metylowo-tert-butylowegoMTBE z metanolu i izobutenu).PODSTAWY TEORETYCZNEMetodę obliczania wielkości adsorpcji i ciśnienia parcjalnego adsorbatówopisaną w pracach [3, 4] zmodyfikowano w pracy [5], tak aby wzory stosowanedo tych obliczeń uwzględniły komputerową metodę określania powierzchnipiku chromatograficznego. Zachowując ich sens fizyczny,modyfikacja polegała na wstawieniu do tych wzorów wartości charakteryzującychpowierzchnię piku chromatograficznego w jednostkach iloczynu napięcia(mV) i czasu rejestracji (s) chromatogramu (mVs). Równocześnieusuniętoz tych wzorów wielkości stosowane przy rejestracji chromatogramów na rejestratorachanalogowych.Wielkość adsorpcji a i substancji i gdy stężenie równowagowe tego adsorbatuw fazie gazowej wynosi c i może być wyrażona równaniem:dadci=iVRm(1)gdzie:a i – ilość moli zaadsorbowanej substancji i (mol/g),c i – równowagowe stężenie substancji i w fazie gazowej (mol/cm 3 ),m – masa adsorbenta (g),V R – objętość retencji (cm 3 ).Równanie (1) można przekształcić do postaci:c i1ai=m∫0V dcRi(2)Objętość retencji V R może być wyrażona jako:VR=tRF(3)gdzie:F – przepływ gazu nośnego (cm 3 /s),t R – czas retencji (s).72

Stałą detektora k (mol/cm 3·mV) wyraża następujące równanie:cik=(4)hgdzie:h – wysokość piku (mV).Całkowita powierzchnia adsorpcyjna S s (mV·s) to powierzchnia zawarta pomiędzypunktami ABCD na rysunku 1 i może być wyrażona równaniem:gdzie:t 0 – czas retencji substancji nie zatrzymywanej (s),t D – czas rejestracji piku (s).Po wstawieniu równania (3) i równania (4) przekształconego do postacidc i = kdh do równania (2) otrzymuje się:aiS=skFmh( t t )= ∫ −0h∫0D( t − t )D0Po scałkowaniu równania (6) i wstawieniu równania (5) otrzymuje się równanie:kFai= S sm(7)Zależność pomiędzy liczbą moli n dozowanej substancji i a odpowiadającejjej powierzchnią piku chromatograficznego (rys. 1) jest wyrażona równaniem:0dhdh(5)(6)dozowanieadsorbatugaznieadsorbującyB(a)CdozowanieadsorbatugaznieadsorbującyBC(b)napęcie (mV)S shnapęcie (mV)S phAt0czas (min)DtDAt0Rys. 1. Wyznaczanie danych adsorpcyjnych z piku chromatograficznego:(a) całkowita powierzchnia adsorpcyjna S s ,(b) całkowita powierzchnia piku chromatograficznego S p .czas (min)DtD73

n = kF∫hdt = kFSp0gdzie:n – liczba moli dozowanej substancji i na adsorbent (mol),S p – całkowita powierzchnia piku chromatograficznego (mV·s).t(8)Wyznaczając stałą detektora k z równania (8) i wstawiając ją do równania (7)otrzymuje się:nSai=mSspRównanie (9) może być stosowane do wyznaczania ilość moli zaadsorbowanejsubstancji z chromatogramu w określonej temperaturze.(9)Wyznaczając stałą detektora k z równania (8) i wstawiając ją do równania (4)otrzymuje się:nhci=(10)FSpktóre umożliwia obliczenie ciśnienia równowagowego po przekształceniuw postać:nhpi = RT(11)FSpgdzie:p i – ciśnienie parcjalne substancji i (Pa),R – stała gazowa (cm 3 ·Pa/K·mol),T - temperatura pomiaru (K).Zastosowanie metody podziału piku wymaga podzielenia całkowitej powierzchniadsorpcyjnej S s na części równoległe do linii podstawowej chromatogramu(rys. 2) i zmierzenia pola powierzchni każdego segmentu.Powierzchnie poszczególnych segmentów spełniają zależność:= ∑IS sS Is1(12)gdzie:S Is – powierzchnia segmentu I całkowitej powierzchni adsorpcyjnej.Wielkość adsorpcji a iI substancji i może być obliczona na podstawie równania:74

an(13)które otrzymano po wstawieniu równania (12) do równania (9).Odpowiadające wielkości adsorpcji a iI substancji i ciśnienie parcjalne p iI jestobliczone przez podzielenie wysokości piku chromatograficznego na I części(rys. 2) zgodnie z równaniem:I∑1iI=mSSDo obliczania powierzchni adsorpcyjnej, powierzchni jej poszczególnychsegmentów, powierzchni piku adsorpcyjnego i czasu retencji, zastosowanoprogram Komputerowy System Przetwarzania Danych (KSPD) [6].Program ten umożliwia wybranie liczby segmentów, na jakie może być podzielonapowierzchnia adsorpcyjna. Obliczenia prężności parcjalnej p iI orazilość zaadsorbowanego adsorbatu a iI wykonywano na podstawie danych popIsnapęcie (mV)dozowanieadsorbatugaznieadsorbującyABI10I 9I8II76I 5I 4I 3I 2I 1t0C(a)S sczas (min)S IshDtDnapęcie (mV)dozowanieadsorbatugaznieadsorbującyBAt0C(b)czas (min)I10I 9I8I 7I6I 5I 4I3I2I 1Rys. 2. Ilustracja sposobu podziału chromatogramu do wyznaczania izoterm adsorpcji metodąprofilu piku.(a) dzielenie całkowitej powierzchni adsorpcyjnej S s na segmenty, gdzie S Is oznacza powierzchnięsegmentu I,(b) dzielenie całkowitej wysokości h piku adsorpcyjnego na segmenty, gdzie I oznacza wysokośćsegmentu.hDtDIh = ∑h I1gdzie:h I – wysokość I części piku (mV).Po wstawieniu równania (14) do równania (11) otrzymuje się:pnI∑1iI=FS(14)(15)hpIRT75

działu profilu piku zestawionych w bazie danych programu KSPD. W rezultacieotrzymano zależność a i = f (p i ) będącą funkcją izotermy adsorpcji.Liczba punktów określających tę izotermę zależy od wybranej liczby podziałupowierzchni adsorpcyjnej na I-segmentów.Powyżej przedstawione równanie izotermy adsorpcji a i = f (p i ) można wyrazićw postaci a i /a s = f (p i ), (gdzie: a S – całkowita liczba moli grup sulfonowychzawartych w sulfonowanym kopolimerze styrenowo-diwinylobenzenowym,mol/g), która odpowiada równaniu adsorpcji Langmuira.W pracy [7] stwierdzono, że adsorpcja cząsteczki metanolu przezgrupy sulfonowe kopolimeru przebiega według jednocentrowego mechanizmusorpcji i równanie adsorpcji Langmuira ma postać:(16)gdzie:K M – stała równowagi adsorpcji metanolu (kPa -1 ).Natomiast równanie Langmuira wyrażające adsorpcję izobutenu przez grupysulfonowe kopolimeru ma postać:(17)gdzie:K IB – stała równowagi adsorpcji izobutenu (kPa -1 ).Równanie to wyraża adsorpcję cząsteczki izobutenu bez dysocjacji przezdwie grupy sulfonowe kopolimeru.OPIS DOZOWNIKAaaIBSaaMS=KMpM= 1+ K p2KMPodstawowym elementem dozownika do pomiarów adsorpcyjnych [8]jest prostopadłościenny korpus 1 wykonany ze stali kwasoodpornej, będącyobudową komór dozymetrycznych (rys. 3). Wewnątrz tego korpusu znajdująsię dwie cylindryczne komory dozymetryczne 2 i 3. Każda z komór od góryjest zamknięta przez korek 4 i 5, w których są umieszczone membranyz gumy silikonowej 6 i 7. Przez membrany wprowadza się próbki do komórdozymetrycznych za pomocą strzykawek. Membrany są dociśnięte nakrętkamiz radiatorem 8 i 9. Wewnątrz każdej z komór dozymetrycznych są zamontowanewymienne wkładki 10 i 11 ze stożkowymi zwężkami. Do dozownikagaz nośny jest doprowadzony wlotem, a następnie przepływa przezkomorę dozymetryczną 2. Z boku komory dozymetrycznej pomiędzy jejścianką boczną a wkładką ze zwężką jest kanalik 12 połączony z wylotem b,który służy do odprowadzenia z niej gazu nośnego. Gaz nośny z wylotu bprzepływa do kanalika 13 o kształcie niepełnego okręgu, który jest umieszczonyna płaszczyźnie podrotorowej zaworu dozownika. Równolegle do kanalika13 zaworu jest także umieszczony kanalik 14 o kształcie niepełnegopMIB IB( 1+1+4Kp ) 2IBIB76

okręgu. Te dwa kanaliki te są połączone rowkiem 15 znajdującym się w rotorzezaworu. Z kanalika 14 wlotem c gaz przepływa do komory dozymetrycznej3 i przez wylot d opuszcza dozownik.Rys. 3. Schemat ideowy dozownika do pomiarów adsorpcyjnych1 – prostopadłościenny korpus; 2, 3 – komory dozymetryczne; 4, 5 – korek; 6, 7 – membranyz gumy silikonowej; 8, 9 – nakrętki z radiatorem; 10, 11 – wymienne wkładki;12, 13, 14 – kanalik; 15 – rowek w rotorze; a, c – wlot; b, d – wylot.Dozownik w celu odparowywania wstrzykiwanych cieczy oraz w celuuniknięcia wykraplania pobieranych par cieczy jest ogrzewany i termostatowanygrzałką elektryczną /niezaznaczoną na schemacie/.Zawór jest umieszczony na tylnej ściance korpusu dozownika (rys. 4).Rotor zaworu do płaszczyzny podrotorowej jest dociskany przez trzpień 16,na który działa sprężyna oporowa 17. Obrót rotora zaworu sprawia, żezmienia się odległość połączenia rowkiem 15 dwóch równoległych kanalikówzaworu 13 i 14 (rys. 3). Ze zmianą tej odległości zmienia się długość przewodówgazowych rozdzielających komory dozymetryczne 2 i 3, co sprawia,że zmienia się także czas, po jakim próbka z komory dozymetrycznej 2 popróbce z komory dozymetrycznej 3 zostanie wprowadzona do kolumnychromatograficznej.Na schemacie (rys. 5) przestawiono dozownik do pomiarów adsorpcyjnychpołączony z trójpozycyjnym zaworem sześciodrożnym 18 w pozycjidozowania próbek do komór dozymetrycznych. Wlot a dozownika do pomiarówadsorpcyjnych jest połączony z wylotem f zaworu sześciodrożnego i wylotd dozownika z wlotem g tego zaworu.W tej pozycji gaz nośny chromatografu, którego wielkość przepływureguluje się zaworem 19, przepływa przez wlot h i przez wylot j jest kierowanydo kolumny chromatograficznej. Zaworem 20 reguluje się wielkość prze-77

pływu gazu pomocniczego. Gaz ten przepływa przez wlot k i przez wylot ltrójpozycyjnego zaworu sześciodrożnego. Dozownik jest odłączony od torugazu nośnego chromatografu i od toru gazu pomocniczego. Wówczas możnaza pomocą strzykawek 21 i 22 wprowadzić próbki adsorbatów do komórdozymetrycznych dozownika.Rys. 4. Zawór umieszczony z tyłu dozownika3 – komora dozymetryczna; 15 – rowek w rotorze; 16 – trzpień; 17 – sprężyna oporowa;c – wlot; b – wylot.Rys. 5. Dozownik do pomiarów adsorpcyjnych połączony z trójpozycyjnym zaworemsześciodrożnym w pozycji wprowadzania próbek do kolumny chromatograficznej2, 3 – komory dozymetryczne; 18 – trójpozycyjny zawór sześciodrożny; 19, 20 – zawór;21, 22 – strzykawka; a, g, h, k – wlot; d, f, j, l – wylot.78

Przestawienie zaworu sześciodrożnego w pozycję wprowadzaniapróbek adsorbatów do kolumny chromatograficznej (rys. 6) sprawia, że są połączonewlot h i wylot f oraz wlot g i wylot j. Wówczas gaz nośny jest doprowadzonydo wlotu a dozownika i próbki znajdujące się w komorach dozymetrycznychdozownika, przez wylot d, wlot g i wylot j zaworu, wraz gazem nośnymprzepływają do kolumny chromatograficznej. Wlot k i wylot l gazu pomocniczegosą połączone i gaz przepływa przez zawór sześciodrożny.Rys. 6. Dozownik do pomiarów adsorpcyjnych połączony z trójpozycyjnym zaworemsześciodrożnym w pozycji wprowadzania próbek do kolumny chromatograficznej(oznaczenia, jak na rys. 5)Trzecia pozycja zaworu sześciodrożnego służy do przepłukiwania gazempomocniczym komór dozymetrycznych (rys. 7). Gaz pomocniczy przepływaprzez wlot k i wylot f do wlotu a dozownika przepłukując komory dozymetrycznei następnie przez wylot d, wlot g i wylot l. Równocześnie gaz nośny przepływaprzez wlot h i wylot j do kolumny chromatograficznej i praca chromatografu niejest zakłócona.Rys. 7. Dozownik do pomiarów adsorpcyjnych połączony z trójpozycyjnym zaworemsześciodrożnym w pozycji przepłukiwania gazem pomocniczym komór dozymetrycznych(oznaczenia, jak na rys. 5)79

SPOSÓB PRZEPROWADZENIA DOŚWIADCZEŃAmberlyst 15 jest aktywnym katalizatorem reakcji dimeryzacji i izomeryzacjialkenów, dlatego w pracy [3] sprawdzano w trakcie pomiaru adsorpcyjnegorównocześnie nie przebiega katalityczna dimeryzacja i izomeryzacjaalkenów. Pomiary adsorpcji wykonywano wyłącznie w tych temperaturach,w których w składzie gazów po desorpcji nie stwierdzano obecności produktówkatalitycznych reakcji lub ich zawartość w gazach nie przekraczała 5%.W tej pracy [3] zaobserwowano także, że pomiary adsorpcji metanoluna Amberlyście 15 można wykonywać do temperatury 333 K. Powyżej tejtemperatury powstający eter dimetylowy może zniekształcać pik adsorpcyjnyi powodować błędy pomiarowe.Zgodnie z tymi cytowanymi powyżej faktami, pomiary adsorpcji metanoluwykonano w zakresie temperatur 303-333 K a dla izobutenu w zakresietemperatur 273-303 K.Pomiary adsorpcyjne wykonywano w zmodyfikowanym chromatografiegazowym N-505 INCO z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID),szczegóły rozwiązań aparaturowych opublikowano w [9].Rurka sorpcyjna o średnicy wewnętrznej 4 mm i długości 10 cm zawierała5 g Amberlystu 15. Przed pomiarami adsorpcji złoże suszono w próżniw temp. 115 o C przez 12 godzin, a następnie bezpośrednio przed pomiaremw kolumnie chromatograficznej, w strumieniu helu 10 cm 3 /min, w temp. 115 o Cprzez 24 godziny. Termostat rurki adsorpcyjnej utrzymywał zadaną temperaturępomiaru ±0,2 o C. Wielkość próbki dozowanego metanolu nie przekraczała wartości0,5 (stosunek ilości milimoli dozowanego metanolu do całkowitej ilości milimoligrup sulfonowych zawartych w próbce), a wielkość próbki dozowanegoizobutenu nie przekraczała wartości 0,3 (stosunek ilości milimoli izobutenu docałkowitej ilości milimoli grup sulfonowych zawartych w próbce Amberlystu 15).WYNIKI I ICH OMÓWIENIEWykonując serię pomiarów adsorpcyjnych różniących się wielkościąprzepływu gazu nośnego, wielkością próbek adsorbatu i masą Amberlystu15 sprawdzono, czy pomiar adsorpcji metodą podziału piku nie jest błędnyz powodu wpływu efektów dyfuzyjnych. Punkty wyrażające omawianą powyżejzależność a i /a s = f (p i ), otrzymane w wyniku serii pomiarów adsorpcyjnych(rys. 8) tworzyły jedną izotermę adsorpcji, co potwierdziło, że pomiaryadsorpcji nie są zakłócane przez efekty dyfuzyjne.Przykład dopasowania krzywych wyrażonych równaniami Langmuira dowyników pomiarów adsorpcji metanolu i izobutenu przedstawiono na rys. 9.W tabeli 1 zestawiono porównanie wartości stałych równowagi adsorpcji obliczonychz przybliżenia metodą najmniejszych kwadratów Levenberga-Marquardta równań Langmuira do wyników pomiarów adsorpcji z użyciemprogramu Origin Microcal [10]. Te dane wskazują na dużą korelację pomiędzywynikami pomiarów adsorpcyjnych oraz krzywymi opisującymi zastosowanerównania Langmuira.80

0,0 2,0 4,0 6,0 8,00,800,600,400,200,000,400,300,200,100,000,0 1,0 2,0 3,0 4,0Rys. 8. Izotermy adsorpcji metanolu na Amberyście 15 w temperaturze 333K otrzymane dla:A – różnych objętości próbek metanolu i różnych wielkości przepływu gazu nośnego:() objętość próbki metanolu 0,3 mm 3 , przepływ gazu nośnego 30 cm 3·min -1 ,(•) objętość próbki metanolu 0,8 mm 3 , przepływ gazu nośnego 40 cm 3·min -1 ,(•) objętość próbki metanolu 1,2 mm 3 , przepływ gazu nośnego 45 cm 3·min -1 .B – różnych średnic ziaren jonitu:() 0,42-0,60 mm, (◦), 0,25-0,30 mm, (), 0,14-0,16 mm,(–) krzywa równanie Langmuira (16) dopasowana do wyników pomiarów adsorpcji metodąnajmniejszych kwadratów.ciśnienie parcjalne izobutenu p IB (kPa)81

0,0 1,0 2,0 3,0 4,00,500,100,400,080,300,060,200,040,100,020,000,000,0 1,0 2,0 3,0 4,0Rys. 9. Obliczanie stałej równowagi adsorpcji metanolu K M na podstawie równania (16) i stałej równowagiadsorpcji izobutenu K IB na podstawie równania (17) metodą najmniejszych kwadratów: - pomiar adsorpcji metanolu na Amberlyście 15 w temperaturze 333 K,(–) krzywa równania Langmuira (16) dopasowana do wyników pomiarów adsorpcji metodąnajmniejszych kwadratów,◦ - pomiar adsorpcji izobutenu na Amberlyście 15 w temperaturze 303 K,(---) krzywa równania Langmuira (17) dopasowana do wyników pomiarów adsorpcji metodąnajmniejszych kwadratów.Tabela 1. Porównanie wartości stałych równowagi adsorpcji obliczonychz przybliżenia metodą najmniejszych kwadratów Levenberga-Marquardtarównań Langmuira do wyników pomiarów adsorpcjimetanolrównanie (16)izobutenrównanie (17)Stała równowagi adsorpcji K (kPa -1 ) 0,251 0,0821Błąd ± 0,0013 ± 0,000679Przedział ufności 0,0029 0,0014χ 2 minimalizacja 1,968G10 -5 1,908G10 -6Poziom ufności 0,95 0,95Współczynnik regresji 0,998 0,998Suma różnicy kwadratów między danymi i wartościamiobliczonymi2,952G10 -4 2,862G10 -5Na rys. 9 zilustrowano sposób wyznaczania powierzchni piku koadsorpcyjnegoizobutenu z różnicy piku chromatograficznego metanolui izobutenu i piku metanolu. W tabeli 2 zestawiono wartości stałych równowagiadsorpcji metanolu, wyznaczone doświadczalnie i z danych literaturowych.W obu przypadkach te wyniki są porównywalne. W tabeli 3 porównanowartości stałych równowagi adsorpcji izobutenu na sulfonowanym82

kopolimerze Amberlyst 15 z danymi literaturowymi. Także i w tym przypadkudane są zgodne. Interesująco przedstawiają się wartości stałych równowagikoadsorpcji izobutenu z metanolem. Metanol jest silnie adsorbowany przezsulfonowany kopolimer, stałe równowagi adsorpcji izobutenu (tab. 3) są okołodziesięć razy mniejsze niż stałe równowagi adsorpcji metanolu (tab. 2).W przypadku, na powierzchni kopolimeru są obecne zaadsorbowanecząsteczki metanolu adsorpcja izobutenu jest utrudniona i wartości stałychrównowagi są mniejsze niż w przypadku adsorpcji izobutenu przez czystykopolimer.Tabela 2. Porównanie wartości stałych równowagi adsorpcji metanolu K M nasulfonowanym kopolimerze Amberlyst 15 z danymi literaturowymiwyniki pomiarów dane literaturowe [3]T(K) 10 -2 GK M (kPa -1 )303 94,22 95,21313 60,67 62,75323 38,54 39,29333 26,01 25,15Tabela 3. Porównanie wartości stałych równowagi adsorpcji izobutenu K IBna sulfonowanym kopolimerze Amberlyst 15 z danymi literaturowymidanewyniki pomiarówliteraturowe [3]T(K) 10 -2 GK IB (kPa -1 )wyniki pomiarów*273 111,85 110,12 81,22283 41,14 43,32 32,07293 17,55 15,65 11,37303 8,21 7,45 5,40* - pomiar koadsorpcji izobutenu na jonicie z zaadsorbowanym metanolemNa podstawie tych stałych równowagi adsorpcji metanolu, izobutenui koadsorpcji izobutenu z metanolem obliczono entalpie adsorpcji (tab. 4).Entalpia adsorpcji metanolu na Amberlyście 15 wynosi –39,7 kJ/mol, izobutenu–60,2 kJ/mol, a koadsorpcji izobutenu z metanolem –64,2 kJ/mol(tab. 4). Poprawność wykonanych pomiarów i obliczeń określono stosującreguły Boudarta [11]. Z tego zestawienia wynika, że obliczone z wyznaczonychentalpii adsorpcji, entropia adsorpcji metanolu spełnia wszystkie czteryreguły. Natomiast obliczona entropie adsorpcji izobutenu i koadsorpcji izobutenuz metanolem spełniają wymagania trzech pierwszych reguł. Jednak niespełnia czwartej reguły, której spełnienie jako równania empirycznego niejest ściśle wymagane.83

100napięcie [mV]806040A2000 100 200 300 400czas [s]100napięcie [mV]806040B2000 100 200 300 400czas [s]100napięcie [mV]806040C2000 100 200 300 400czas [s]Rys. 10. Wyznaczanie powierzchni piku koadsorpcyjnego izobutenu z piku chromatograficznego:A – koadsorpcyjny pik chromatograficzny metanolu i izobutenu,B – pik chromatograficzny metanolu, C – pik chromatograficzny izobutenu wyznaczony z różnicysygnałów (mV) i czasu rejestracji (s) chromatogramu piku A i piku B.84

Tabela 4. Weryfikacja za pomocą reguł Boudarta wyznaczonych wartościentalpii adsorpcji dla metanolu i izobutenu na sulfonowanym kopolimerzeAmberlyst 15metanol izobuten izobuten*Entalpia adsorpcjiΔH a (kJ/mol)–39,7 –60,2 –64,2Standardowa entropiaadsorpcji–92,8 –180,6 –194,3oΔ S a (J/mol K 1 )Standardowa entropia aoS 298(J/mol K)237,4 293,4 293,4Reguły Boudarta boΔ S a < 0 –22,2

Zależność ta wynika ze zmiany objętości molowej (v g ) cząsteczek w faziegazowej kondensujących na powierzchni adsorbentu i zajmujących objętośćrówną objętości krytycznej v c . Zmiana entropii jest równa:0⎛ vg⎞ΔS= − ln⎜⎟ ≅ −10(cal mol -1 K -1 aR)⎝ vc⎠4. Bezwzględna wartość entropii adsorpcji (przeliczona do warunków standardowych)powinna spełniać zależność:0ΔS a< 12,2 – 0,0014 ΔH a (21)Zależność (21) została wyznaczona jako równanie empiryczne, na podstawiepomiarów adsorpcji oraz pomiarów kinetyki reakcji katalitycznych. Wynikaona z liniowej zależności pomiędzy entalpią, a entropią adsorpcji.PODSUMOWANIEZastosowane rozwiązanie konstrukcyjne dozownika i opracowanametoda pomiarowa umożliwia wykonywanie pomiarów adsorpcji i koadsorpcjimetodą inwersyjnej chromatografii gazowej, co wykazano w niniejszejpracy na przykładzie adsorpcji i koadsorpcji metanolu i izobutenu na Amberlyście15.LITERATURA1. Albright R.L., Jakovac I.J.: Catalysis by Fuctionalized Porous OrganicPolymers, IE 287-6/1985 Rohm & Haas, Philadelphia, PA.19105.2. Kunin R., Meitzner E., Oline J., Fisher S.A.: Characterization of Amberlyst15, Ind. Eng. Chem. Prod. Res.Dev., 1 (1962) 140-144.3. Paryjczak T.: Chromatografia gazowa w badaniach adsorpcji i katalizy,PWN, Warszawa 1986.4. Wigdegrauz M.S.: Raztchety w gazovoj chromatografii, Izd. Khimija,Moskwa, 1978.5. Słomkiewicz P.M.: Determination of adsorption equilibrium of alcoholsand alkenes on a sulfonated styrene divinylbenzene copolymer,Adsorption Science & Technology, 24/3 (2006) 239-256.6. Lech A.: Program komputerowy KSPD, Metroster, Toruń 1999.7. Słomkiewicz P.M.: Determination of the adsorption model of alkenesand alcohols on sulfonic copolymer by inverse gas chromatography,Journal of Chromatography A. 1034 (2004) 169-174.8. Słomkiewicz P.M.: Dozownik do pomiarów adsorpcyjnych, szczególniemetodą inwersyjnej chromatografii gazowej, zgłoszenie patentowe,czerwiec 2010.86

9. Słomkiewicz Piotr M.: Zastosowanie chromatografii gazowej w badaniachkinetyki katalitycznej syntezy eterów z alkenów i alkoholi, (monografia)Wydawnictwo Akademii Świętokrzyskiej, Kielce 2007.10. Origin User`s Manual, Microcal Software. Inc., Northampton MA, USA,1997.11. Boudart M., Mears D.E., Vannice M.A.: Kinetics of heterogeneous catalyticreactions, Ind. Chim. Belge 32 Special No, Vol. I (1967) 281-284.87

Grzegorz BOCZKAJ 1 , Marian KAMIŃSKI 2Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 1 , mknkj@chem.pg.gda.pl 2 ,tel. (58) 347-17-29WYKORZYSTANIE CHROMATOGRAFII GAZOWEJDO DESTYLACJI SYMULOWANEJ (SIMDIS).AKTUALNY STAN WIEDZY I NOWE PERSPEKTYWYChromatografia gazowa (GC) zajmuje szczególne miejsce w analityce przemysłurafineryjnego i petrochemicznego. Początki chromatografii gazowej i jej dalszyrozwój wielokrotnie podyktowane były potrzebami w zakresie analityki naftowej. Jednymz ważnych zastosowań GC jest możliwość wykonywania destylacji symulowanej(SIMDIS, ang. Simulated Distillation). Na podstawie wartości czasu retencji mieszaninywzorcowych n-parafin o znanej temperaturze wrzenia, wyznacza się na podstawiechromatogramu analizowanej próbki jej rozkład temperatury destylacji.Stosowane w metodzie SIMDIS kolumny chromatograficzne (pakowane i kapilarne)nie zapewniają, pomimo zastosowania niskopolarnej fazy stacjonarnej, pełnejzgodności kolejności elucji dla bardziej polarnych składników próbki. Problem stanowirównież niewystarczająca stabilność fazy stacjonarnej w końcowej temperaturzeelucji i związany z tym wzrost sygnału detektora.Przedstawiono możliwość zastąpienia dotychczas stosowanych kolumn doSIMDIS pustą rurką z topionej krzemionki (z ang. Fused silica) o dezaktywowanejpowierzchni wewnętrznej. Porównano krzywe destylacji uzyskane badaną metodąoraz metodą SIMDIS dla frakcji z destylacji próżniowej ropy naftowej. Wykazano stosunkowodużą zbieżność wyników. Porównano wartości temperatury elucji dla niektórychn-parafin uzyskiwane obiema metodami.Słowa kluczowe: SIMDIS, chromatografia gazowa, GC, destylacja symulowana,rozkład temperatury destylacji, analityka produktów naftowych.WSTĘPRozkład temperatury destylacji produktów i frakcji naftowych jest ważnymparametrem procesowym i użytkowym. Wykonuje się go również dlamieszanin innego typu, tj. mieszaniny długołańcuchowych alkoholi, kwasóworganicznych, lipidów, wosków. Informuje o typie ropy naftowej – zawartościposzczególnych frakcji klasyfikowanych na podstawie temperatury wrzenia,optymalnych warunkach procesu i efektywności rozdzielenia na frakcjew wyniku destylacji atmosferycznej i próżniowej. Jest jednym z parametrówjakościowych wielu produktów naftowych i chemicznych.Metodą powszechnie stosowaną do czasów opracowania metodySIMDIS, stosowaną m.in w przemyśle rafineryjnym, jest metoda klasycznejdestylacji atmosferycznej [1-2] i próżniowej [3]. W metodzie tej zapisuje sięobjętość zebranego destylatu wraz z temperaturą wskazaną przez termo-

metr w momencie odczytywania poszczególnych objętości zebranego destylatu.Wyniki przedstawiane są w formie tabelarycznej lub graficznej - tzw.krzywej destylacji – jako procent objętościowy zebranego destylatu w funkcjitemperatury destylacji. Metoda ta jest jednak czasochłonna oraz wymagadużej ilości próbki.Obecnie rozkład temperatury destylacji wykonuje się standardowometodą destylacji symulowanej (SIMDIS). W destylacji symulowanej wykorzystujesię technikę gazowej chromatografii (GC) [4-13]. Stosowana jest niskopolarnaciekła faza stacjonarna, najczęściej polidimetylosilikon, polidimetylosiloxan(PDMS) [4, 5], który ze względu na swoją niską polarnośćpowinien umożliwić rozdzielanie analitów zgodnie z ich temperaturą wrzenia.Przy wykorzystaniu mieszaniny kalibracyjnej wzorcowych n-parafin o znanychtemperaturach wrzenia, oznacza się na podstawie uzyskanego chromatogramubadanej frakcji jej rozkład temperatury destylacji - procent masowyzebranego destylatu w funkcji temperatury wrzenia. Zakłada się tuliniową zależność wartości czasu retencji rozdzielanych związków od ichtemperatury wrzenia. Uzyskaną krzywą destylacji można na podstawiewspółczynników przeliczyć na krzywą destylacji klasycznej – procent objętościowyzebranego destylatu w funkcji temperatury wrzenia. Jak podaje normaASTM D 2887 [7] osiągnięcie pełnej zbieżności z destylacją klasycznąpod ciśnieniem atmosferycznym zgodną z ASTM D85 i próżniową zgodnąz D1160 nie jest możliwe. Destylacja klasyczna charakteryzuje się zbyt małą„sprawnością”. Zgodność wyników SIMDIS uzyskuje się z metodą ASTMD2892 [2] – z kolumną destylacyjną o sprawności ok. 15 półek teoretycznych.Wykorzystywane w SIMDIS detektory to detektor płomieniowojonizacyjny(FID, ang. Flame Ionization Detector) lub (rzadziej) cieplnoprzewodnościowy(TCD, ang. Thermal Conductivity Detector). W przypadku wyznaczaniarozkładu temperatury destylacji związków siarki w badanych materiałach,najczęściej stosowany jest detektor chemiluminescencji siarki(SCD, ang. Sulfur Chemiluminescence Detector). Jednoczesną rejestracjęprzebiegu destylacji symulowanej dla kilku pierwiastków jednocześnie zapewniadetektor emisji atomowej (AED, ang. Atomic Emission Detector).Porównanie wyników uzyskiwanych obiema metodami (klasycznąi symulowaną destylacją) w wielu przypadkach wskazuje na pewne, a czasemnawet znaczne rozbieżności w kształcie krzywych destylacji oraz wyznaczonychtemperaturach początku i końca destylacji. Związane jest toz oddziaływaniami analitów z fazą stacjonarną oraz zawartością w mieszaniniebardziej polarnych składników, które nie są eluowane zgodnie z temperaturąwrzenia względem n-parafin. Przy wysokim udziale związków polarnychw próbce, kształt krzywej destylacji SIMDIS wykazuje znaczneodchylenia od krzywej uzyskanej klasyczną destylacją [14-15]. Z tego powodudla wielu mieszanin średnio i wysoko polarnych metoda SIMDIS nie jeststosowana i w wielu przypadkach pomimo dostępności aparatury do metodySIMDIS, wykonuje się klasyczną destylację. W celu sprawdzenia i re-kalibracjirozkładu temperatury destylacji wyznaczonych metodą SIMDIS stosuje sięmateriały referencyjne o znanym rozkładzie temperatury destylacji.90

Kolumna, a przede wszystkim faza stacjonarna do GC stosowanaw metodzie SIMDIS musi być stabilna w temperaturach 350-410 o C, ponieważw tej temperaturze eluowane są długołańcuchowe węglowodory wchodzącew skład cięższych frakcji naftowych, dla których m.in. wykonuje siękrzywą destylacji. Obecnie stosowane kolumny kapilarne z ciekłą fazą stacjonarną(w kolumnach pakowanych ten problem był znacznie bardziej wyraźny)nie zapewniają dostatecznie wysokiej stabilności w końcowej temperaturzeanalizy, co skutkuje ujściem fazy stacjonarnej z kolumny (tzw.krwawienie kolumny ang. column bleeding). Jest to zjawisko niekorzystne.Obecne trendy na świecie, zmierzają w kierunku opracowania faz stacjonarnychstabilnych termicznie w temperaturach powyżej 350 o C. Ma to wyeliminowaćwystępujące w metodzie SIMDIS niedoskonałości – ujście fazy stacjonarnejw końcowej temperaturze rozdzielania, związany z tym wzrostsygnału i spadek czułości detekcji wysokowrzących składników próbki orazkońcowej temperatury destylacji, a także zmiany wartości czasu retencji.Zmniejsza to również „żywotność” kolumny i wymusza częstsze wymiany nanowe (w przypadku opcji „HT” – z przebiegiem do temperatury 410 o C kolumnęwymienia się średnio co 150 analiz [15]). Ubocznie, w związku z wysokątemperaturą rozdzielania część chromatografowanych związków możeulegać rozkładowi termicznemu.Obecnie stosowanym rozwiązaniem jest prowadzenie częstej rekalibracjiwartości czasu retencji substancji wzorcowych (n-parafin) oraz rejestrowanieprzebiegu linii bazowej po zadozowaniu czystego rozpuszczalnika(tzw. „pusty przebieg”), a następnie odejmowanie sygnału od sygnału zarejestrowanegodla próbki. W przypadku analiz cięższych frakcji naftowychoraz ropy naftowej wymagana jest rejestracja pustego przebiegu przed każdąanalizą. W przypadku elucji związków w temperaturze powyżej 350 o C,zachodzi również częściowy ich rozkład termiczny. Problem stanowi, takżeniecałkowita elucja ciężkich związków obecnych w próbce ze względu na niskąlotność oraz oddziaływania z fazą stacjonarną [15, 16]. W związku z występowaniemoddziaływań z fazą stacjonarną retencja substancji w zależnościod ich polarności jest w pewnym stopniu zależna od tych oddziaływań.Stąd przed przystąpieniem do wykonywania analiz, należy sprawdzić wielkośćodchyleń wyznaczonej krzywej destylacji dla tzw. oleju referencyjnego.W związku z powyższym metoda SIMDIS jest mimo wszystko stosunkowoczasochłonna i kosztowna ze względu na konieczność częstej wymianykolumn.W niniejszej pracy przedstawiono możliwość zastąpienia dotychczasstosowanych w metodzie SIMDIS kolumn, pustą rurką z topionej krzemionki(FST ,ang. Fused Silica Tubing) o powierzchni dezaktywowanej grupami metylowymi.Opracowane rozwiązanie proponuje się określać akronimemEC-GC (ang. Empty Column Gas Chromatography).91

METODYKAMateriały:- Mieszanina wzorcowa SIMDIS 2887 Extended - n-parafiny od C 5 – C 60(AC Analytical Controls).- Frakcje naftowe z destylacji próżniowej ropy naftowej (B-D) – otrzymanez Grupy LOTOS S.A.- dwusiarczek węgla (>99% (GC), Fluka Analytical)Aparatura:SIMDIS – badania wykonano w Lotos LAB Sp. z o.o. (Grupa LOTOS S.A.)- Chromatograf gazowy Hewlett Packard 5890 Series II,- Oprogramowanie HP 3365 GC ChemStationEC-GC:- Chromatograf gazowy Perkin Elmer 8500,- Oprogramowanie Turbochrom ver. 6.1.1Przygotowanie roztworu wzorcowego i badanych próbekRoztwór wzorcowych n-parafin oraz roztwory badanych materiałów sporządzonopoprzez rozpuszczenie naważki w dwusiarczku węgla w stosunkumasowym ok. 1:100.Warunki analizy:Próbki dozowano ręcznie za pomocą mikrostrzykawki w objętości 1 μl. Dlakażdej z próbek wykonano dwie analizy.SIMDIS:- Gaz nośny: Hel 19 ml/min;- Kolumna: SGE (BPX 1) 10 m x 0.53 mm x 0.9 μm;Program temperatury: temperatura początkowa: 35 o C, narost 10 o C/mindo 375 o C, temperatura końcowa: 375 o C utrzymywana 3 min;- Dozownik on-column typu PTV (ang. programmable temperature vaporization):temperatura początkowa: 100 o C, narost 70 o C/min do 375 o C,temperatura końcowa: 375 o C;- Temperatura detektora FID: 375 o C.EC-GC:- Gaz nośny: Hel 10 ml/min;- Kolumna: pusta rurka z topionej krzemionki (FST, Restek), powierzchniawewnętrzna dezaktywowana grupami metylowymi, 30,0 m x 0,32 mm(ID);Program temperatury: temperatura początkowa: 35 o C utrzymywana10 minut, narost 4 o C/min do 300 o C, temperatura końcowa: 300 o C utrzymywana20 min;- Dozownik typu Split/splitless, w trybie splitless: temperatura początkowa:35 o C utrzymywana 10 minut, narost 20 o C/min do 300 o C, temperaturakońcowa: 300 o C; - Temperatura detektora FID: 345 o C.92

Wyznaczenie krzywej destylacji:Przed analizą każdej z badanych frakcji, zarejestrowano tzw. pustyprzebieg, tj. Dozowano czysty dwusiarczek węgla w identycznych warunkachchromatograficznych jak dla badanych materiałów naftowych.Dla otrzymanych chromatografów frakcji B-D wykonano kompensacjętła, tj. od chromatogramu danej frakcji odjęto chromatogram zarejestrowanydla czystego rozpuszczalnika. Na podstawie uzyskanego chromatogramuwyznaczono krzywą destylacji - % masowy oddestylowanej próbki w funkcjitemperatury destylacji.W celu wykonania krzywej destylacji, podzielono otrzymany pik chromatograficznyna części, tak aby każda część stanowiła 5% całego piku.W celu uzyskania zakresu od 5% do 95% pola powierzchni całego piku, dodawanodo siebie kolejne części piku. Z chromatogramu odczytano wartościczasu retencji odpowiadające granicy każdej z części. Odczytano równieżwartość czasu retencji, w którym uzyskano 0,5% pola powierzchni piku –wartość ta odpowiada wartości początkowej temperatury destylacji (ang. Initialboiling point - IBP) oraz wartość czasu retencji, w którym uzyskano99,5% wartości pola powierzchni piku – wartość ta odpowiada wartości końcowejtemperatury destylacji (ang. Final boiling point - FBP). W celu wyznaczeniakrzywej destylacji wykonano wykres zależności % pola powierzchnipiku (poprzez sumowanie kolejnych powierzchni oraz podzielenie otrzymanychsum przez pole powierzchni piku, a następnie pomnożenie przez100%) w funkcji temperatury wrzenia odpowiadającej wartości czasu retencjigranicy odciętej części piku. Przeliczenie wartości czasu retencji na temperaturęwrzenia wykonano, poprzez interpolację temperatury wrzenia dla odczytanejwartości czasu retencji w oparciu o kalibrację zależności temperaturywrzenia wzorców n-parafin od wartości czasu retencji.WYNIKI I DYSKUSJANa rysunkach 1-3 przedstawiono chromatogramy uzyskane odpowiedniometodą SIMDIS oraz EC-GC.Rysunek 1. Chromatogramy frakcji B wykonane metodą SIMDIS (po lewej) i EC-GC (po prawej)93

Rysunek 2. Chromatogramy frakcji C wykonane metodą SIMDIS (po lewej) i EC-GC (po prawej)Rysunek 3. Chromatogramy frakcji D wykonane metodą SIMDIS (po lewej) i EC-GC (po prawej)W tabeli 1 przedstawiono zestawienie punktów krzywej destylacji frakcjiB, C i D z destylacji próżniowej ropy naftowej. Dla każdej krzywej obliczonoróżnice w temperaturze destylacji pomiędzy SIMDIS a EC-GC dla każdegopunktu krzywej.Jak wynika z tabeli 1, osiągnięto stosunkowo dużą zbierzność wyników.Różnice wyznaczonej temperatury początku destylacji destylacji (IBP)wyniosły od 0,37 do 2 o C, a temperatury końca destylacji (FBP) – od 0,9 do2 o C. Różnice temperatur destylacji dla poszczególnych interwałów procentumasowego wyniosły od 0,87 do 8,5 o C (Fr. B), od 1,8 do 8,9 o C (Fr. C) orazod 0,9 do 10,4 o C (Fr. D).94

Tabela 1. Wyznaczone wartości procentu masowego destylatu w funkcjitemperatury destylacji (wartości średnie, n=2) oraz różnica wyznaczonychtemperatur%mas.dest.SIMDISWgASTM2887ET SIMDISFrakcja B Frakcja C Frakcja DSI-SI-MDISMDISWgWgASTM EC-ASTM EC-EC-GC Różnica 2887E GC Różnica 2887E GC RóżnicaT EC-GC temp. T SIMDIS T EC-GC temp. T SIMDIS T EC-GC temp.[°C] [°C] ΔT [°C] [°C] ΔT [°C] [°C] ΔT0,5(IBP)352,5 352,13 0,37 387,5 384,7 2,8 425,5 424,5 15 387,5 379 8,5 432 423,1 8,9 468,5 458,1 10,410 398,5 391,2 7,3 444,5 436,1 8,4 483 473,2 9,815 405 398,4 6,6 451,5 442,7 8,8 492,5 484,7 7,820 410 404,1 5,9 457,5 449,9 7,6 499,5 489,7 9,825 414 408,3 5,7 462,5 454,7 7,8 505 496,6 8,430 418 411,3 6,7 467 459,8 7,2 510 501,2 8,835 421,5 415,9 5,6 471 462,9 8,1 514,5 506 8,540 424,5 418,6 5,9 475 468,9 6,1 518,5 510 8,545 427 422,5 4,5 479 472 7 522 513,8 8,250 430 425,7 4,3 482,5 476,1 6,4 525,5 517,9 7,655 432,5 427,4 5,1 486,5 480,3 6,2 529 522,2 6,860 435 430,4 4,6 490,5 484 6,5 532 525 765 437,5 432,4 5,1 495 488,1 6,9 535 528 770 440 434,7 5,3 499 492,2 6,8 538 531,3 6,775 442,5 437,2 5,3 503,5 496,4 7,1 541,5 534,4 7,180 445,5 440,1 5,4 508 500,7 7,3 545 537 885 448 443,8 4,2 513,5 505 8,5 548 541,1 6,990 451,5 447,6 3,9 520,5 511,8 8,7 553 548 595 456,5 451,1 5,4 529,5 521,9 7,6 559,5 554 5,599,5(FBP)470,5 472,5 -2 548,5 550,3 -1,8 579 578,1 0,9∆T= T SIMDIS (% masowy i ) – T ZR (% masowy i )95

Na podstawie danych z tabeli 1 wyznaczono graficzne krzywe destylacjiprzedstawione na poniższym rysunku 4.Rysunek 4. Krzywe destylacji Frakcji B, C i DPo wykonanych analizach porównano chromatogramy pustych przebiegówzarejestrowanych po analizie próbki każdej z frakcji. Nie stwierdzonowzrostu sygnału linii bazowej. Po zakończeniu analiz frakcji próbek naftowych,wykonano ponowną kalibrację wartości czasu retencji w funkcji temperaturywrzenia. Nie stwierdzono zmian wartości czasu retencji względemwykonanej uprzednio kalibracji.Wykorzystanie pustej rurki z topionej krzemionki posiada wiele zaletwymienionych we wstępie do niniejszej pracy. Jedną z głównych zalet jestmaksymalne ograniczenie oddziaływań rozdzielanych związków z fazą stacjonarną.Brak oddziaływań pozwala w maksymalny sposób uzależnić retencjęskładników próbki od ich temperatury wrzenia. Z tego powodu zastosowanieniniejszego rozwiązania posiada ograniczenia w postaci zbyt niskiejretencji niskowrzących substancji. Stąd w temperaturach początkowych, pozwalającychna możliwie szybkie schłodzenie pieca chromatografu po analizie(bez stosowania czynników chłodzących typu dwutlenek węgla czy ciekłyazot), tj. 35 o C, zadowalające rozdzielenie osiągalne jest dla n-parafin o temperaturzewrzenia powyżej 151 o C (n-nonan). W przypadku n-nonanu osiągniętocałkowite rozdzielenie (do podstawy) od dwusiarczku węgla – waru-96

nek ten (powrót sygnału detektora po elucji rozpuszczalnika do poziomu liniibazowej) jest konieczny w przypadku wykonywania symulowanej destylacji.W celu przedstawienia „efektywności” obniżenia temperatury elucjiw EC-GC porównano (tabela 2) wartości uzyskiwane „typowo” w SIMDISw wartościami temperatury elucji uzyskanymi z zastosowaniem warunkówEC-GC.Tabela 2. Porównanie temperatury elucji długołańcuchowych n-parafin dlatrzech typów kolumn dedykowanych destylacji symulowanejn-alkanKolumnapakowanado SIMDIS* [17]Temperatura elucji [°C]Kolumnakapilarna doSIMDIS** [17]EC-GC***C20 208 182 102C24 242 215 110C28 271 245 124C32 298 274 150C36 320 300 173C40 340 320 192C44 350 320 209* Chromosorb P AW, 20”x1/8”, 10% UCW-982, Program temp.: od -20 o C do 350°C (utrzymywana5 minut) 20 o C/min, gaz nośny: hel, 30 ml/min,** Petrocol 2887, 5,0 m x 0,53 mm ID x 0,5 µm, Program temp.: od -20 o C do 320°C (utrzymywana5 minut) 20 o C/min, gaz nośny: azot, 6 ml/min,*** Podano w części metodyka.Jak wynika z tabeli 2, osiągane obniżenie temperatury elucji w przypadkuEC-GC względem SIMDIS wynosi od 60 o C dla eikozanu (n-C20) do128 o C dla tetrakontanu (n-C40). Stanowi to istotny aspekt praktycznyw przypadku rozdzielania wysokowrzących mieszanin. Przewiduje się, żeEC-GC może znaleźć zastosowanie również w rozdzielaniu związków niestabilnychtermicznie.Oprócz zastosowań stricte „analitycznych”, technika EC-GC stanowirównież warte odnotowania, możliwe do wdrożenia „narzędzie” w skali semipreparatywneji preparatywnej. Warta uwagi, jest możliwość zastosowaniakolumn pakowanych przy założeniach techniki EC-GC do preparatywnegowydzielania frakcji.PODSUMOWANIEW pracy przedstawiono możliwość wykonywania symulacji destylacjiz zastosowaniem pustej rurki z topionej krzemionki. Uzyskane rezultatywskazują na duży potencjał EC-GC, zarówno do zastosowań analitycznychprzedstawionych w pracy, jak również potencjalnie do zastosowań preparatywnych.97

PODZIĘKOWANIAAutorzy pragną podziękować Zarządowi i pracownikom Lotos LAB Sp. z o.o.(Grupa LOTOS S.A.) za pomoc w realizacji niniejszej pracy.LITERATURA1. ASTM D86: Test Method for Distillation of Petroleum Productsat Atmospheric Pressure.2. ASTM D2892: Test Method for Distillation of Crude Petroleum(15-Theoretical Plate Column).3. ASTM D1160: Test Method for Distillation of Petroleum Productsat Reduced Pressure.4. Green L.E., Worman J.C.: Simulated Distillation of High Boiling PetroleumFractions, Anal. Chem., 37, 1620 (1965).5. Green L.E., Schumauch L.J., Worman J.C.: Simulated Distillation byGas Chromatography, Anal. Chem., 36, 1512 (1964).6. US Patent 4,786,475 (22.11.1988): Trestianu S., Manuri F., SaravelleC., Equipment for the simulated distillation by means of gas chromatographywith non vaporizing direct injection.7. ASTM D2887: Standard Test Method for Boiling Range Distribution ofPetroleum Fractions by Gas Chromatography.8. ASTM D3710: Test Method for Boiling Range Distribution of Gasolineand Gasoline Fractions by Gas Chromatography.9. ASTM D5307: Standard Test Method for Determination of Boiling RangeDistribution of Crude Petroleum by Gas Chromatography.10. ASTM D7096: Standard Test Method for Determination of the BoilingRange Distribution of Gasoline by Wide-Bore Capillary Gas Chromatography.11. ASTM D6352: Standard Test Method for Boiling Range Distributionof Petroleum Distillates in Boiling Range from 174 to 700 o C by GasChromatography.12. ASTM D7169: Standard Test Method for Boiling Point Distributionof Samples with Residues Such as Crude Oils and Atmospheric andVacuum Residues by High Temperature Gas Chromatography.13. ASTM D7213: Standard Test Method for Boiling Range Distributionof Petroleum Distillates in the Boiling Range from 100 to 615 o C by GasChromatography.14. Roussis S.G., Fitzgerald W.P.: Gas Chromatographic Simulated Distillation-MassSpectrometry for the Determination of the Boiling Point Distributionsof Crude Oils, Anal. Chem., 72 (2000), 1400-1409.15. Durand J.P., Bré A., Béboulène J.J., Ducrozet A., Carbonneaux S.: Improvementof Simulated Distillation Methods by Gas Chromatography inRoutine Analysis, Oil & Gas Science and Technology – Rev. IFP, 54(1999), 431-438.98

16. Reddy K.M., Wei B., Song C.: High-temperature simulated distillationGC analysis of petroleum resids and their products from catalyticupgrading over Co-Mo/Al 2 O 3 catalyst, Catalysis Today, 43 (1998),187-202.17. Supelco Bulletin 864A: Simulated Distillation of Petroleum Products byPacked Column and Capillary Column GC.99

100

Iwona KIERSZTYN 1 , Anita SIŁAK 1 , Paweł PISZCZ 1 , Anna LAMERT 1 ,Krzysztof KURZAK 1 , Mariusz S. KUBIAK 2 , Bronisław K. GŁÓD 11Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska,ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce2e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.plKatedra Procesów i Urządzeń Przemysłu Spożywczego, Wydział Mechaniczny,Politechnika Koszalińska, KoszalinZASTOSOWANIE RP-HPLC Z DETEKCJĄELEKTROCHEMICZNĄ DO ANALIZY KOMPLEKSÓWNIKLU Z ZASADAMI SCHIFFAKompleksy metali z zasadami Schiffa znane są od końca XIX wieku. Związkite wzbudzają zainteresowanie ze względu na obecność ugrupowania iminowegoRCH=NR’ w chemii koordynacyjnej oraz w badaniach procesów metabolicznych zachodzącychw organizmach żywych. Zasady Schiffa tworzą z metalami grup przejściowychkompleksy o różnej strukturze, stabilizując różne stopnie utleniania tychżemetali.W pracy przedyskutowano rozdział kompleksów niklu (II) z pięcioma ligandami,zasadami Schiffa. Zostały one rozdzielone w układzie faz odwróconych. Z danychliteraturowych wiadomo, że zarówno jon centralny jak i ligandy badanych kompleksówulegają reakcją utleniania i redukcji. Okazało się jednakże, że w niektórychprzypadkach detektor elektrochemiczny charakteryzował się dużą niepewnością pomiarui/lub małą czułością. Elektrochemiczne własności kompleksów zbadano zapomocą woltamperometrii cyklicznej. Okazało się, że niektóre z nich adsorbowały sięna elektrodzie i/lub tworzyły przewodzące polimery na powierzchni elektrody, w rozpuszczalnikacho niskiej liczbie donorowej.WPROWADZENIEKompleksy metali z zasadami Schiffa znane są od ponad 100 lat.Przedmiotem badań niniejszej pracy są kompleksy niklu (II) z czterodonorowymizasadami Schiffa, pochodnymi acetyloacetonu, aldehydu naftalowegoi aldehydu salicylowego (rys. 1) [1-6]. Zarówno jon centralny jak i ligandyulegają reakcją utleniania, jak również redukcji [7]. W pracy pokazano możliwośćanalizy kompleksów rozdzielonych w układzie faz odwróconych. Domonitorowania związków zastosowano detektor amperometryczny.101

CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNAAparaturaPomiary chromatograficzne przeprowadzono na zestawie HPLCz dwoma detektorami, fotometrycznym i elektrochemicznym. W jego skład(Knauer, Berlin, Niemcy) wchodził system naboru danych (Interface Box),czterokanałowy odgazowywacz K-5004, podstawka na zbiorniki eluentuK-1500, mieszadło eluentu (Dynamic Mixing Chamber), gradientowa pompaHPLC K-1001, detektor spektrofotometryczny (DAD) K-2600, detektor amperometryczny(Recipe, Berlin, Niemcy) ClinLab EC 3000, oprogramowanieClarityChrom, autosampler Basic+ marathon (Spark Holland, Emmen,Holandia), termostat powietrzny (Industrial Electronics, Langenzersdorf,Austria) oraz kolumna Kromasil 100 RP-18 5 μm, 250x4 mm I.D. (Besta--Technik, Wilhelmsfeld, Niemcy).Właściwości elektrochemiczne kompleksów zbadano używając potencjostatuAutolab PGSTAT 20 (ECO Chemie, Utrecht, Holandia). Pt o powierzchni0,0314 cm 2 użyto jako elektrody pracującej, drut platynowy stanowiłelektrodę pomocniczą. Potencjały mierzono względem elektrody Ag/AgCl(1 mol dm -3 KCl).OdczynnikiW badaniach stosowano odczynniki – metanol HPLC grade, acetonitryl,DMSO, DMF, nadchloran czterobutyloamoniowy (TBAP) i nadchloranczteroetyloamoniowy (TEAP) pochodziły z Sigma (St. Louis, MO, USA), aceton,chlorek metylenu i chloroform z Chempur (Piekary Śląskie, Polska). Pozostałeodczynniki (Sigma, St. Louis, USA; Fluka, Buchs, Switzerland;i POCh, Gliwice, Poland), czyste do analizy, były stosowane bez dalszegooczyszczania. Do przygotowywania roztworów stosowano czterokrotnie destylowanąz kwarcu wodę.ProceduryBadane kompleksy (rys. 1) ([Ni(acacen)]·0,5 H 2 O - N,N`-bis(acetyloacetonato)-etylenodiaminanikiel (II); [Ni(Brsalen)] - N,N`-bis(5-bromo-2--hydroksybenzylideno)-etylenodiamina niklu (II); Ni(napen)]]·0,5H 2 O kompleksN,N`-bis(2-hydroksynaftalideno)-etylenodiamina niklu (II); [Ni(nappn)]·0,5 H 2 O -N,N`-bis(2-hydroksynaftalideno)-propano-1,3-diamina niklu (II); [Ni(salpn)]N,N`-bis(2-hydroksybenzylideno)-propano-1,3-diamina niklu (II)) zostały otrzymanezgodnie z procedurami opisanymi w literaturze [8].Do pomiarów elektrochemicznych sporządzano roztwory o stężeniu10 -3 mol/dm 3 . Przed każdym pomiarem elektroda pracująca była czyszczona(polerowana) na tlenku glinu o grubości ziaren 0,05 mm. Wszystkie pomiarybyły prowadzone w środowisku bezwodnym, w obecności elektrolitu podstawowegoi w temperaturze pokojowej. Objętość badanych roztworóww naczyniu elektrolitycznym zawsze wynosiła 10 ml. Przed wykonaniem pomiarówroztwory zostały odtlenione poprzez przepuszczenie strumienia102

H 3C CH 3C O O CH CNiC HC N N CHHH 2C CH 2N,N`-bis(acetyloacetonato)-etylenodiamino nikiel(II), [Ni(acacen)]·0,5 H 2 OCONNiH H(CH 2) 3N,N`-bis(2-hydroksybenzylideno)-propano-1,3-diamino nikiel(II), [Ni(salpn)]ONCO ONiC N N CHHH 2C CH 2N,N`-bis(2-hydroksynaphthalideno)-etylenodiamino nikiel(II), [Ni(napen)]·0,5 H 2 OCONNiH(CH H2) 3N,N`-bis(2-hydroksynaftalideno)-propano-1,3-diamino nikiel(II), [Ni(nappn)]·0,5 H 2 OBrO OBrNiC N N CHHH 2C CH 2N,N`-bis(5-bromo-2-hydroksybenzylideno)-ethylenodiamino nikiel(II), [Ni(Brsalen)]Rys. 1. Wzory strukturalne badanych kompleksów niklu z zasadami SchiffaONC103

argonu (5 minut w roztworze i 5 minut nad roztworem). Krzywe woltamperometrycznezostały zarejestrowane przy różnych szybkościach polaryzacjii w różnych zakresach potencjału.Wszystkie pomiary chromatograficzne były przeprowadzane w układziefaz odwróconych przy przepływie 1 ml/min, w temperaturze 20 o C. Przedprzystąpieniem do analizy chromatograficznej kolumnę chromatograficznąstabilizowano w temp. 20 o C w przepływie fazy ruchomej przez 1 h. Jako fazęruchomą w pomiarach chromatograficznych stosowano roztwór 0,1 M NaClO 4w metanolu lub mieszaninie metanol/woda 80/20% obj./obj. 20 μl próbki byłowstrzykiwane na kolumnę za pomocą autosamplera. Detektor amperometrycznybył czyszczony elektrochemicznie poprzez potencjału z utleniającego(+0,8 V) na redukujący (-1,1 V) przez 2 s, a raz na tydzień rozbieranyi czyszczony był pastą diamentową na papierze wodnym.StatystykaKażdy pomiar był trójkrotnie powtarzany, a średnia z uzyskanychpomiarów stanowiła wynik ostateczny. Niepewność pomiaru wyznaczono testemt-Studenta zmiennych zależnych, dla poziomu ufności p

6,0x10 -64,0x10 -62,0x10 -60,0-2,0x10 -6i[A]-4,0x10 -6-6,0x10 -6-8,0x10 -6-1,0x10 -5-1,2x10 -5-2,0 -1,5 -1,0E[V]100 mV s -150 mV s -120 mV s -110 mV s -1Rys. 2. Krzywe woltamperometryczne (a) [Ni(salpn)] w 10 mM roztworze ACN/TBAP, zarejestrowanez różnymi szybkościami polaryzacji: 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 Vs -1 , zakres polaryzacji elektrody[0; -2,0 V].-40.4x10-40.3x100.2x10 -40.1x10 -4i [A]0-0.1x10 -4-4-0.2x10-4-0.3x10-4-0.4x10-0.5x10 -40 0.3 0.5 0.8 1.0 1.3 1.5E [V]Rys. 3. Krzywe woltamperometryczne, [Ni(salpn)] w 10 mM roztworze ACN/TBAP, zakres polaryzacjielektrody [0; 1,5 V]Okazało się, że kompleksy niklu z zasadami Schiffa mogą być rozdzielanew układzie faz odwróconych. Ze względu na to, że są to związkielektroaktywne zastosowano detekcję elektrochemiczną w zakresie potencjałówzarówno utleniania (rys. 4) jak i redukcji (rys. 5). Z badań elektrochemicznychwynikało, że badane kompleksy są nietrwałe (ulegają hydrolizie)w roztworach wodnych. Z kolei w rozpuszczalnikach o niskich wartościachliczb donorowych nieodwracalnie adsorbują się na elektrodzie bądź ulegają105

elektropolimeryzacji. Dlatego też jako fazę ruchomą zastosowano czysty metanol(LD = 19 kcal/mol). Jako elektrodę pracującą zastosowano elektrodęplatynową, ponieważ jest ona bardziej stabilna w roztworach niewodnych.Okazało się, że w dodatnim (utleniającym) zakresie potencjałów możnaoznaczać wszystkie badane kompleksy (rys. 4), w ujemnym (rys. 5) ujemnypik zaobserwowano dla acacenu, niewielkie dodatnie dla napenu i salpnu.Rys. 4. Chromatogram kompleksów niklu z zasadami Schiffa (wymienionymi w kolejności pojawianiasię na chromatogramie) - salen (1), acacen (2), nappn (3), napen (4) i salpn (5). Warunkichromatograficzne: kolumna - Kromasil 100 C18, 5 μm, 250 x 4.0 mm I.D.; faza ruchoma– 0,1 M NaClO 4 w metanol/woda 80/20 v/v.; detektor – elektochemiczny, 0,8 V, (GC, vs.Ag/AgCl); szybkość przepływu – 1.0 ml/min.; nastrzyk – 20 μlRys. 5. Chromatogram HPLC kompleksów niklu z zasadami Schiffa. Warunki chromatograficznetakjak na rys. 4, z wyjątkiem potencjału elektrody pracującej: -0,4 VWNIOSKISalenowe kompleksy niklu (II) mogą być rozdzielane za pomocą wysokosprawnejchromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Związkimogą być monitorowane za pomocą detektora amperometrycznego z platynowąelektrodą pracującą w zakresie potencjałów utleniania. Jako fazę ru-106

chomą zastosowano metanol. W wodzie kompleksy ulegały hydrolizie, natomiastw rozpuszczalnikach o niskich wartościach liczby donorowej utleniałysię tworząc elektropolimery, co zostało potwierdzone badaniami woltametrycznymi.LITERATURA1. Shirley D.A.: Chemia organiczna, WNT, Warszawa 1967.2. Khalil M.E.: J. Coord. Chem., 54(2000)12.3. Osman A.H.: Transit. Met. Chem., 31(2006)35.4. Sallam S.A.: Transit. Met. Chem., 31(2006)46.5. Cindrić M., Strukan N., Vrdoljak V., Kajfež T., Kamenar B.: CroaticaChim. Acta., 76(2003)157.6. Sousa C., Freire C., de Castro B.; Molecules, 8(2003)894.7. Vilas-Boas M., Freire C., de Castro B., Hillman A.R.: J. Phys. Chem.B 1998, 102, 8533-8540.8. Gonciarz A.: Thesis, AP 2007.107

108

Elżbieta WŁODARCZYK, Paweł K. ZARZYCKIZakład Toksykologii i Bioanalityki, Politechnika Koszalińska,ul. Śniadeckich 2, 75-453 Koszaline-mail: ewlod@wbiis.tu.koszalin.plZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFIIW ANALIZIE MODULATORÓW HORMONALNYCHWYSTĘPUJĄCYCH W ŚRODOWISKUModulatory hormonalne (Endocrine Disrupting Compounds; EDCs) są to egzogennesubstancje chemiczne, naturalne, jak i syntetyczne, zakłócające aktywnośćhormonów, głównie sterydowych, u ludzi i zwierząt. Stanowią one niejednorodnągrupę związków o różnej budowie chemicznej, właściwościach i wywoływanym efekciebiologicznym. Do substancji tych zalicza się między innym: pestycydy, fenole, ftalany,wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, polichlorowane bifenyle, dioksynyoraz sterydy, w szczególności naturalne i syntetyczne estrogeny. W pracyprzedstawiono przegląd literatury dotyczący zastosowania chromatografii w oznaczaniuilościowym substancji typu EDCs w próbkach środowiskowych, ze szczególnymuwzględnieniem ekosystemów wodnych.PROBLEM MODULATORÓW HORMONALNYCH W ŚRODOWISKUModulatory hormonalne (Endocrine Disrupting Compounds; EDCs) sąto egzogenne substancje chemiczne, naturalne, jak i syntetyczne, zakłócająceaktywność hormonów, głównie sterydowych, u ludzi i zwierząt. Stanowiąone niejednorodną grupę związków o różnej budowie chemicznej, właściwościachi wywoływanym efekcie biologicznym. Do substancji tych zaliczasię między innym:1. pestycydy [1-14],2. fenole [3, 10],3. alkilofenole [1, 2, 7, 8, 15, 16, 17, 18],4. nonylfenole [19, 20, 21, 22, 23, 24],5. polietoksynonylofenole [18],6. ftalany [2, 3, 4, 7, 9, 10, 17],7. estry ftalowe [19, 20, 23, 25],8. wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne [1, 8],9. plastyfikatory ftalanowe [1, 8],10. polichlorowane bifenyle (PCB) [1-5, 8, 13, 15, 19, 20, 23],11. dioksyny [1-4, 6, 8, 13, 15, 19, 20, 23],12. polibromowane etery fenylowe [3],13. środki powierzchniowoczynne [4, 5, 12, 13, 17],14. bisfenol A [2, 12, 15, 21, 22, 24, 26],15. plastyfikatory [6, 13],16. fitoestrogeny [1, 2, 4, 5, 10, 12, 14, 15, 19, 20, 23],17. naturalne i syntetyczne estrogeny [1, 2, 5, 7, 8, 12, 13, 15, 16, 18, 19,21, 23, 26].109

Przyjmuje się, że do substancji o najsilniejszym działaniu modulującymsystemy hormonalne należą związki pochodzące z przemysłu chemicznego(bisfenol A, alkilofenole, polichlorowane bifenyle, estry ftalowe, pestycydym.in. DDT, metoksychlor, chlordekon) [7, 27] oraz z przemysłu farmaceutycznego.Te ostatnie wchodzą w skład środków antykoncepcyjnych [2, 4, 7,28, 29], jak również preparatów leczniczych stosowanych w zmniejszaniuniekorzystnych efektów występujących w menopauzie [1, 2, 4, 10, 28, 29]oraz postmenopauzie [1, 10, 29]. Preparaty o silnym działaniu hormonalnymstosowane są powszechnie przy leczeniu bezpłodności [10, 28, 29], rakaprostaty [1, 2, 4, 10, 29], raka piersi [1, 2, 4, 10, 28, 29], trzonu macicy [28],śluzówki macicy, endometriozie [1, 10, 29], zaburzeń menstruacyjnych[1, 28, 29] oraz w fizjologicznej terapii zastępczej [1, 10, 29] i w stanach awitaminozy[10, 29].Związki typu EDCs dostają się do organizmów żywych wraz ze środkamifarmakologicznymi, pokarmem i wodą pitną [6, 19]. Większość z nichjest rozpuszczalna w tkankach i strukturach niepolarnych (tłuszcze, tkankanerwowa) i w minimalnym stopniu ulega rozkładowi, przez co ma skłonnośćdo kumulowania się w organizmach [6]. Główne drogi ekspozycji środowiskowejna estrogeny i progestageny zostały przedstawione na rysunku 1.Rysunek 1. Drogi ekspozycji środowiskowej estrogenów i progestagenów [10]Podstawowymi źródłami, z których związki te przenikają do środowiska i zasilająsystemy wodne oraz łańcuchy pokarmowe, są wypływy z oczyszczalniw postaci wycieków nieoczyszczonych oraz ścieków oczyszczonych, jakrównież spływów nawozu (obornika, gnoju) oraz osadów ściekowych wykorzystywanychw rolnictwie [2, 10, 29, 30]. Istotnym źródłem estrogenów110

i progestagenów w środowisku są odchody ludzkie, a w szczególności mocz.Zawarte w nim sterydy, zarówno naturalne (estron, 17β-estradiol, estriol), jaki syntetyczne (etynyloestradiol), wydalane są z organizmu człowieka główniew formie sprzężonej, najczęściej jako glukuroniany i siarczany [2, 10, 19,31-36] oraz w mniejszych ilościach jako wolne estrogeny [10, 33, 35]. Dziennewydalanie estrogenów przez kobiety wynosi 24-100 μg, zależnie od cyklumenstruacyjnego i może wzrastać nawet do 30 mg pod koniec ciąży [10].Przyjmuje się, że średnia dzienna produkcja estrogenów w przeliczeniu najedną osobę wynosi 2,7 mg/L moczu [37].Po przedostaniu się wyżej wymienionych substancji do wód powierzchniowych,ulegają one różnym procesom biologicznym oraz fizykochemicznym,włączając w to fotolizę i sorpcję na osadach. Ten ostatni procesprzyczynia się do czasowego wyeliminowania sterydów ze środowiskawodnego. Należy zwrócić uwagę na fakt, iż zaadsorbowane substancje sterydowei ich metabolity stanowią wtórne źródło zasilania wód modulatoramihormonalnymi [29]. Przyjmuje się, że poważnym zagrożenie dla zdrowia ludzii zwierząt są wolne sterydy i substancje pochodne obecne w wodzie napoziomie ng/L [2, 6, 8, 28, 38, 39]. Substancje te po przeniknięciu do organizmówwyższych mogą się kumulować w tkankach niepolarnych i po osiągnięciuodpowiedniego stężenia zaburzać prawidłowe działanie systemówhormonalnych. Związane jest to z ich podobną budową chemiczną,w szczególności strukturalną, a przez to możliwością działania antagonistycznegow stosunku do czynnych biologicznie substancji endogennych[2, 6, 28, 38]. Substancje typu EDCs mogą również wpływać na syntezęi metabolizm naturalnych hormonów oraz modyfikować poziom receptorówhormonalnych [8, 38]. Modulatory hormonalne wpływają również niekorzystniena funkcjonowanie systemu odpornościowego [3, 4, 6]. W literaturze opisanotakże przypadki nieprawidłowości w rozwoju [3, 4, 6, 26, 37, 40], rozmnażaniu[4, 6, 26, 28, 37], we wzroście [4, 6, 26] oraz zachowaniu osobników[6, 40] poddanych ekspozycji na substancje EDCs. Wśród innych obserwowanychobjawów niekorzystnych oraz chorobowych, mogących mieć związekz pojawieniem się tych substancji w organizmie, należy wymienić: spadekilości plemników w spermie [4, 5, 8, 12, 19, 33, 38-43], guzy złośliwe [6],wzrost liczby zachorowań na raka jąder [5, 19, 23, 39-43], prostaty [5, 38,40-43], raka piersi [5, 8, 23, 38, 40-42], śluzówki macicy [38], dróg rodnych,endometriosis, a także spadek płodności u mężczyzn [1, 4, 19, 23, 29, 37,39], spadek libido, impotencję [38], zmniejszenie ilości androgenów we krwi[38], deformacje dróg rodnych u kobiet [38], obniżenie wieku dojrzewania[42], hermafrodytyzm [1, 4, 29, 30, 37], feminizację [1, 4, 9, 29, 30, 37, 39,43] oraz nieprawidłowy rozwój płodu [23].Znaczna część współczesnych badań poświęconych substancjomEDCs dotyczy organizmów żyjących bezpośrednio w wodzie oraz ekosystemachzwiązanych z wodą [32, 44]. Przyjmuje się, że naturalne i syntetyczneestrogeny wykazują aktywność fizjologiczną wobec tych organizmów w zakresiestężeń od ng do μg w litrze wody [24, 29, 32, 34, 45]. W szczególnościstwierdzono, iż niekorzystne zmiany w prawidłowym funkcjonowaniu sys-111

temów hormonalnych u ryb stają się widoczne, gdy stężenie w wodzie, np.17β-estradiolu i 17α-etynyloestradiolu waha się od 0,1 do 10 ng/L [2, 28, 34,46, 47]. Zauważono również, że obecność tych związków w środowiskuwodnym zakłóca prawidłowe rozmnażanie pstrąga, płoci oraz flądry [44],prowadzi do pojawienia się osobników obupłciowych u płoci i homarów,a także indukcji witelogeniny u pstrąga tęczowego [48]. Opisano możliwośćfeminizacji u niektórych gatunków ryb [37], spadku rozwoju gonad oraz redukcjipłodności [49, 50], a także nieprawidłowych proporcji płci u widłonogówdennych i żółwi [11].W chwili obecnej przyjmuje się, że głównym źródłem modulatorówhormonalnych w środowisku są ścieki bytowe. W związku z tym znacznaczęść badań dotyczy oceny zdolności różnych procesów oczyszczania ściekóww kierunku eliminowania z nich substancji EDCs. Liu Z. [51] w pracyprzeglądowej z roku 2009 podaje, iż do usuwania tych substancji możnaz powodzeniem wykorzystywać już istniejące procesy technologiczne opartena metodach fizycznych, w tym na klasycznej adsorpcji na węglu aktywnym.Badania laboratoryjne i prowadzone w pełnej skali w oczyszczalniach ściekówwykazały, iż węgiel aktywny posiada dużą zdolność do usuwania EDCs.Jako skuteczne uznaje się również procesy membranowe, dla których efektywnośćusuwania modulatorów hormonalnych szacuje się od 10% do niemal100%, w przypadku procesów technologicznych wykorzystującychosmozę odwróconą. Ponadto, modulatory hormonalne można efektywnieusuwać ze ścieków, stosując biodegradację poprzez organizmy zasiedlająceosad czynny oraz metody chemiczne wykorzystujące głównie procesy utlenianiaz użyciem perhydrolu oraz aktywnych form chloru i żelaza. W praktycewiększość współczesnych oczyszczalni ścieków nastawionych jestprzede wszystkim na usuwanie fosforu i azotu oraz redukcję ogólnej zawartościsubstancji organicznych. Większość spośród badanych EDCs posiadamasy cząsteczkowe poniżej 1000 i dlatego nie jest całkowicie eliminowanaw trakcie procesu oczyszczania ścieków. Substancje te przechodzą do frakcjiścieków oczyszczonych, a następnie po ich uwolnieniu do środowiskaprzedostają się bez problemu do wód powierzchniowych, podziemnych,a nawet wody pitnej. Jak wykazano, mała skuteczność w usuwaniu estrogenówcharakteryzuje większość systemów oczyszczania pracujących z konwencjonalnymosadem czynnym [24]. Jednocześnie stwierdzono, że doefektywnego usuwania estrogenów przyczyniają się w dużej mierze procesynitryfikacji w osadzie czynnym [52]. Przyjmuje się, iż naturalne i syntetyczneestrogeny występują w ściekach oczyszczonych na poziomie ng/L, co wskazujena niezbyt wysoką sprawność ich eliminacji w procesie oczyszczania[34]. Według D’Ascenzo G. [32] oczyszczalnie z osadem czynnym usuwają95% estriolu, 87% estradiolu, 85% etynyloestradiolu i 61% estronu. Badaniaprowadzone na terenie oczyszczalni miejskich zlokalizowanych w Niemczechwykazały, iż zakłady te redukują ponad 98% naturalnych estrogenów(estron, 17beta-estradiol) i więcej niż 90% 17α-etynyloestradiolu, główniepodczas oczyszczania osadem czynnym [53]. Usuwanie tych związków z fazyciekłej jest kombinacją degradacji oraz sorpcji na cząsteczkach osadu.112

Badania przeprowadzone przez Heberera T. [47] w oczyszczalni ściekóww Berlinie pokazały, że syntetyczne (17α-etynylestradiol, menstranol) oraznaturalne (estriol, 17β-estradiol, estron) sterydy wydalane z organizmu człowiekaznajdowane były na poziomie ng/L w ściekach dopływających dooczyszczalni, natomiast w „odpływach” z oczyszczalni ich stężenie byłoznacznie niższe na poziomie lub też poniżej limitu detekcji. Natomiast jakpodaje Cargouët M. [7] oczyszczalnie ścieków we Francji usuwają 50% całkowitejilości estrogenów dopływających wraz ze ściekami, w tym 53,5% naturalnychestrogenów i 40% 17α-etynyloestradiolu. Tak małe ilości usuwanegosztucznego sterydu są efektem słabego procesu degradacji tegozwiązku przeprowadzanego przez mikroorganizmy podczas procesuoczyszczania ścieków. Steryd ten może również powstawać podczas przekształcaniainnych sterydów (np. noretisteronu) przez mikroorganizmy.Większość ścieków w Wielkiej Brytanii oczyszczana jest za pomocą filtrówbiologicznych lub osadu czynnego. Oczyszczalnie z osadem czynnym sąpowszechnie wykorzystywane w dużych miastach. Szacuje się, że usuwająone 91% 17β-estradiolu, 78% estronu i 76% etynyloestradiolu [18]. W tabelach1 oraz 2 zamieszczono zestawienie zawartości wybranych substancjitypu EDCs występujących w wodzie pitnej, wodach powierzchniowych orazściekach, jak również wartości odzysku analitów uzyskane na podstawieprzeglądu współczesnej literatury.Tabela 1. Przegląd literaturowy poziomów stężeń wybranych EDCs w próbachśrodowiskowychNazwa związkuStężenie(ng/L)Miejsce poborupróbRodzaj próbyEstriol 80,00 Włochy ścieki surowe [91]Estriol 57,00 Rzym, Włochy ścieki surowe [92]Estriol

Estriol

17β-Estradiol 0,20-4,10 Kalifornia, USA ścieki oczyszczone [103]17β-Estradiol

Etynyloestradiol

Estron 44,00 Rzym, Włochy ścieki surowe [32]Estron 9,60-17,60 Paryż, Francja ścieki surowe [7]Estron 15,00-60,00 Włochy ścieki surowe [8]Estron 19,00-78,00 Kanada ścieki surowe [36]Estron 16,00-49,00 Kanada ścieki surowe [99]Estron 14,00-31,00 Japonia ścieki surowe [93]Estron 1,40-76,00 Wielka Brytania ścieki oczyszczone [63]Estron

Estron 0,20-6,60 JaponiaEstron 1,10-3,00 FrancjaEstron 5,00-12,00 WłochyEstron 1,20 Massachusetts, USAwoda powierzchniowa(rzeka)woda powierzchniowa(rzeka)woda powierzchniowa(rzeka)woda powierzchniowa(morze)Mestranol

Estron 93-108 81-93 89-99 39,6-116 83-108 100 78-8617α-HydroksyprogesteronLewonorgestrel 89NorgestrelDietylostilbestrol 61-78 88-101 7020α-HydroksyprogesteronProgesteron 91-94TetrahydrokortyzolTetrahydrokortyzonFtalan dimetylud-EkwileninaMetylotestosteronEkwilina4-tert-ButylofenolMedroksyprogesteronNazwa związku [111] [105] [112] [73] [37] [14] [50] [62]Estetrol 95,4Estriol 69 101 99,3 101 75-79 94,6Kortyzol 99,1 94,3Kortyzon 98,8 95Bisfenol A 75-78 96,517β-Estradiol 11,1 117 92 99,7 85,26 71-77 99,5Testosteron 83 97,4 94,3Noretindron 96,717α-Estradiol 16,1 106 93,6Etynyloestradiol 14,8 109 92 79,51 65-70 96,47,8-Dimetoksyflawon 99,9 95,4Estron 24,6 119 90 95,4 82,22 90 78-84 96,617α-Hydroksyprogesteron99,0 95,7LewonorgestrelNorgestrel 37,4 95,6Dietylostilbestrol 46,5 85-88 77,820α-Hydroksyprogesteron85,2 92,8Progesteron 67,1 90 85,3 90,2Tetrahydrokortyzol 96,3Tetrahydrokortyzon 87,5Ftalan dimetylu 82,3d-Ekwilenina 89,7Metylotestosteron 93,6Ekwilina 89,74-tert-Butylofenol 30,2Medroksyprogesteron 89,7WYKORZYSTANIE METOD CHROMATOGRAFIICZNYCHDO OZNACZANIA SUBSTANCJI TYPU ENDOCRINE DISRUPTINGCOMPOUNDS, ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM CIECZOWEJCHROMATOGRAFII INKLUZYJNEJAnalizując zawartości substancji typu EDCs w próbkach środowiskowych(woda pitna i powierzchniowa, gleba, ścieki), stosuje się zasadniczodwa różne podejścia metodologiczne: biologiczne oraz fizykochemiczne.Wybór pomiędzy nimi zależy w dużej mierze od wyznaczonych uprzedniocelów podejmowanych badań. Metody biologiczne stosuje się główniew oznaczeniu, np. aktywności estrogennej pojedynczych związków, mieszaninlub próbek o nieznanym składzie. Techniki fizykochemiczne umożliwiają119

oznaczenie ilościowe znanych uprzednio związków chemicznych, jak równieżidentyfikację nieznanych substancji [54, 55, 56]. Ze względu na fakt, iżwiększość próbek środowiskowych ma charakter wieloskładnikowy o niezwykledużym stopniu różnorodności, większość procedur fizykochemicznychwymaga dodatkowo użycia chromatograficznych technik separacyjnyh[1, 57]. Z chromatograficznego punktu widzenia sterydy są bardzo niejednorodnągrupą analitów i dlatego stosując typowe wysokosprawne układy rozdzielczez gazową lub ciekłą fazą ruchomą, trudno jest w pełni rodzielić wieloskładnikowemieszaniny tych związków [58, 59]. Z tego powodujednoczesne oznaczanie różnorodnych form sterydów i małocząsteczkowychzwiązków organicznych typu EDCs występujących w środowisku, stanowiciągle istotny i nierozwiązany do końca problem analityczny [17, 43, 60,61, 62].Większość istniejących obecnie procedur chromatograficznych opracowanychw celu jednoczesnego oznaczania ilościowego dużej ilości sterydóworaz organicznych związków małocząsteczkowych w próbkach środowiskowychoparta jest na technice chromatografii gazowej z detekcją typuspektrometria masowa (GC-MS) [63-66, 42] (tabela 3). Jednakże bezpośrednieoznaczanie tego typu związków przy zastosowaniu technologiiGC-MS jest silnie ograniczone lotnością analitów. Drugim czynnikiem utrudniającymoznaczenia jest mała stabilność większości tych związków w wysokichtemperaturach powyżej 100 o C. Z tego punktu widzenia chromatografiacieczowa (LC) umożliwia bezpośrednie oznaczanie sterydów bezwzględu na ich lotność. W tabeli 3 przedstawiono limity detekcji dla proceduroznaczania modulatorów hormonalnych w różnych próbkach środowiskowych,ze szczególnym uwzględnieniem chromatografii gazowej oraz cieczowej.W praktyce analitycznej typowy chromatograf cieczowy HPLC, wyposażonyw relatywnie prosty i tani detektor skanujący UV-Vis typu diode array,może być bardzo użytecznym narzędziem w oznaczaniu szerokiej gamy sterydówi zanieczyszczeń obecnych w próbkach środowiskowych [1, 4, 16](tabela 4).Tabela 3. Limity detekcji (LOD) dla procedur oznaczania wybranych substancjitypu EDCs występujących w różnych próbach środowiskowychNazwa zw.LOD(ng/L)Detekcja Miejsce wyst. Rodzaj próby Lit.Estriol 90,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Estriol 2,50 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Estriol 7,00 LC-MS-MS Włochy ścieki surowe [8]Estriol 0,50 LC-MS-MS Włochy ścieki oczyszczone [8]Estriol 0,30 LC-MS-MS Włochy woda powierzchniowa (rzeka) [8]Estriol 5,04 LC-MS Hiszpania woda powierzchniowa (rzeka) [33]Estriol 0,20 LC-ESI-MS Chiny woda powierzchniowa (rzeka) [110]Estriol 0,10 ELISA/LM-MS Jordania woda powierzchniowa (rzeka) [113]Estriol 0,50 LC-MS-MS Japonia ścieki [93]Bisfenol A 3,00 LC-MS-MS Włochy ścieki surowe [8]Bisfenol A 1,00 LC-MS-MS Włochy ścieki oczyszczone [8]Bisfenol A 0,20 LC-MS-MS Włochy woda powierzchniowa (rzeka) [8]Bisfenol A 5,30 GC-MS Wielka Brytaniawoda powierzchniowa (rzeka,morze)[43]120

Bisfenol A 6,30 LC-MS Hiszpaniaścieki oczyszczone,woda pitna[33]17β-Estradiol 0,30-0,60 GC-MS-MS Holandiawody powierzchniowe (rzeki,estuarium)[100]17β-Estradiol 1,00 GC-MS-MS Niemcy ścieki oczyszczone [19]17β-Estradiol 1,00 GC-MS-MS Kanada ścieki oczyszczone [19]17β-Estradiol 0,50 GC-MS-MS Niemcy woda powierzchniowa (rzeki) [19]17β-Estradiol 2,00 LC-MS-MS Francja woda mineralna (Evian) [5]17β-Estradiol 90,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]17β-Estradiol 10,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]17β-Estradiol 1,90 LC-MS-MS Włochy ścieki surowe [8]17β-Estradiol 0,80 LC-MS-MS Włochy ścieki oczyszczone [8]17β-Estradiol 0,20 LC-MS-MS Włochy woda powierzchniowa (rzeka) [8]17β-Estradiol 3,40 GC-MS Wielka Brytaniawoda powierzchniowa (rzeka,morze)[43]17β-Estradiol 2,50 LC-MS Hiszpania woda powierzchniowa (rzeka) [33]17β-Estradiol 4,10 LC-MS-MS Dania woda pitna [52]17β-Estradiol 0,10 LC-ESI-MS Chiny woda powierzchniowa (rzeka) [110]17β-Estradiol 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]17β-Estradiol 1,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]17β-Estradiol 0,30 RIA Jordania woda powierzchniowa (rzeka) [113]17β-Estradiol 0,50 LC-MS-MS Japonia ścieki [93]Testosteron 0,30 RIA Jordania woda powierzchniowa (rzeka) [113]Noretindron 200,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Noretindron 2,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]17α-Estradiol 0,10-0,30 GC-MS-MS Holandiawody powierzchniowe (rzeki,estuarium)[100]17α-Estradiol 0,10-1,20 GC-MS-MS Holandia ścieki oczyszczone [100]17α-Estradiol 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]17α-Estradiol 1,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Etynyloestradiol 0,10-0,30 GC-MS-MS Holandiawody powierzchniowe (rzeki,estuarium)[100]Etynyloestradiol 0,30-1,80 GC-MS-MS Holandia ścieki oczyszczone [100]Etynyloestradiol 1,00 GC-MS-MS Niemcy ścieki oczyszczone [19]Etynyloestradiol 1,00 GC-MS-MS Kanada ścieki oczyszczone [19]Etynyloestradiol 0,50 GC-MS-MS Niemcy woda powierzchniowa (rzeki) [19]Etynyloestradiol 2,00 LC-MS-MS Francja woda mineralna (Evian) [5]Etynyloestradiol 90,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Etynyloestradiol 10,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Etynyloestradiol 1,60 LC-MS-MS Włochy ścieki surowe [8]Etynyloestradiol 1,10 LC-MS-MS Włochy ścieki oczyszczone [8]Etynyloestradiol 0,40 LC-MS-MS Włochy woda powierzchniowa (rzeka) [8]Etynyloestradiol 0,80 GC-MS Wielka Brytaniawoda powierzchniowa (rzeka,morze)[43]Etynyloestradiol 3,22 LC-MS Hiszpania woda powierzchniowa (rzeka) [33]Etynyloestradiol 4,40 LC-MS-MS Dania woda pitna [52]Etynyloestradiol 0,10 LC-ESI-MS Chiny woda powierzchniowa (rzeka) [110]Etynyloestradiol 100,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Etynyloestradiol 1,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Etynyloestradiol 0,10 ELISA/LM-MS Jordania woda powierzchniowa (rzeka) [113]Estron 0,20-0,30 GC-MS-MS Holandiawody powierzchniowe (rzeki,estuarium)[100]Estron 0,30-1,00 GC-MS-MS Holandia ścieki oczyszczone [100]Estron 1,00 GC-MS-MS Niemcy ścieki oczyszczone [19]Estron 1,00 GC-MS-MS Kanada ścieki oczyszczone [19]Estron 0,50 GC-MS-MS Niemcy woda powierzchniowa (rzeki) [19]Estron 1,00 LC-MS-MS Francja woda mineralna (Evian) [5]Estron 100,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Estron 5,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Estron 1,20 LC-MS-MS Włochy ścieki surowe [8]Estron 0,80 LC-MS-MS Włochy ścieki oczyszczone [8]Estron 0,10 LC-MS-MS Włochy woda powierzchniowa (rzeka) [8]Estron 1,70 GC-MS Wielka Brytaniawoda powierzchniowa (rzeka,morze)[43]Estron 2,50 LC-MS Hiszpania woda powierzchniowa (rzeka) [33]Estron 3,70 LC-MS-MS Dania woda pitna [52]121

Estron 0,10 LC-ESI-MS Chiny woda powierzchniowa (rzeka) [110]Estron 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Estron 1,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Estron 0,30 RIA Jordania woda powierzchniowa (rzeka) [113]Estron 0,50 LC-MS-MS Japonia ścieki [93]Lewonorgestrel 90,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Lewonorgestrel 2,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Norgestrel 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Norgestrel 0,60 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Dietylostilbesterol 250,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Dietylostilbesterol 2,50 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Dietylostilbesterol 1,64 LC-MS Hiszpania woda powierzchniowa (rzeka) [33]Dietylostilbesterol 25,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Dietylostilbesterol 0,60 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Progesteron 200,00 LC-MS Portugalia woda powierzchniowa (rzeka) [28]Progesteron 2,00 μg/kg LC-MS Portugalia osady [28]Progesteron 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Progesteron 0,30 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Mestranol 1,00 GC-MS-MS Niemcy ścieki oczyszczone [19]Mestranol 1,00 GC-MS-MS Kanada ścieki oczyszczone [19]Mestranol 0,50 GC-MS-MS Niemcy woda powierzchniowa (rzeki) [19]Mestranol 50,00 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Mestranol 0,30 μg HPLC-DAD Portugalia woda [111]Tabela 4. Limity detekcji (LOD) dla wybranych analitów w próbach wód powierzchniowych,uzyskane przy użyciu detektora UV-Vis typu DAD pracującegoz chromatografem HPLC [62]Analizowana substancja Długość fali [nm]Limit detekcjiOdchylenie[ng/1000 mL]standardoweEstetrol 200 - 280 0,37 - 3,60 ±0,02 - ±0,2Estriol 200 - 280 0,22 - 1,90 ±0,02 - ±0,1Kortyzol 240 0,37 ±0,03Kortyzon 240 0,49 ±0,03Tetrahydrokortyzol 200 1,75 ±0,04Tetrahydrokortyzon 200 3,80 ±0,3Ftalan dimetylu 200 - 280 0,23 - 2,80 ±0,01 - ±0,1Bisfenol A 200 - 280 0,28 - 1,81 ±0,02 - ±0,0817β-Estradiol 200 - 280 0,51 - 4,70 ±0,03 - ±0,2Testosteron 240 0,33 ±0,02Noretindron 240 0,44 ±0,0217α-Estradiol 200 - 280 0,47 - 4,50 ±0,02 - ±0,2d-Ekwilenina 230 - 280 0,20 - 3,80 ±0,02 - ±0,3Metylotestosteron 240 0,56 ±0,04Ekwilina 200 - 280 0,86 - 7,40 ±0,08 - ±0,6Etynyloestradiol 200 - 80 1,64 - 25,60 ±0,08 - ±0,77,8-Dimetoksyflawon 200 - 260 - 312 0,95 - 0,59 - 0,74 ±0,06 - ±0,04 - ±0,05Estron 200 - 280 0,79 - 9,60 ±0,05 - ±0,617α-Hydroksyprogesteron 240 1,07 ±0,064-tert-Butylofenol 200 - 280 0,52 - 2,29 ±0,01 - ±0,09Toluen 207 - 261 1,20 - 24,30 ±0,2 - ±4,1Norgestrel 240 1,41 ±0,08Dietylostilbestrol 200 - 240 0,52 - 1,00 ±0,04 - ±0,1Ciekawą alternatywą dla wielu złożonych procedur analitycznych wykorzystującychtechnikę HPLC w układzie gradientowym, jest pracującaw systemie izokratycznym (niegradientowym) zależna od temperatury chromatografiainkluzyjna wykorzystująca chiralne substancje makrocykliczne,122

np. cyklodekstryny [67, 68]. Cyklodekstryny (CD), zwane również cykloamylozami,cyklomaltozami oraz dekstrynami Schardingera, odkryte zostałyprzez Villiersa w 1891 roku [69, 70, 71]. Są to cykliczne oligosacharydy składającesię z monomerów D-glikozy, związanych w pozycji α-1,4 [69, 72, 73].Powszechnie stosowane są naturalne cyklodekstryny zawierające 6, 7 i 8jednostek w pierścieniu makrocyklicznym i są odpowiednio nazywane α-CD,β-CD oraz γ-CD [69, 70, 74]. Niezwykłe właściwości cyklodekstryn wynikająz ich unikatowej budowy przestrzennej. Mają one kształt torusa, któregownętrze ma charakter chiralny i mniej polarny niż ich część zewnętrzna.Dzięki temu są dość dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach polarnych,np. w wodzie lub DMSO, jak również w większości mieszanin binarnych wodyz cieczami organicznymi, takimi jak acetonitryl lub alkohole. WłaściwościCD pozwalają na specyficzne wiązanie z substratem zależnie od jego rozmiarów,geometrii, ilości oraz rozmieszczenia ugrupowań polarnych i niepolarnych[75, 76]. Tworzenie trwałego kompleksu cząsteczki „gospodarzgość”możliwe jest m.in. dzięki działaniu sił Van der Waalsa oraz wiązaniomwodorowym [68, 70, 74]. CD wykazują zdolności do tworzenia trwałych kompleksówinkluzyjnych z licznymi stałymi, ciekłymi, a także gazowymi składnikami.Do potencjalnych „gości” należy szereg różnorodnych związków, włączającw to: gazy (acetylen), aldehydy, ketony, alkohole, kwasy organiczne,kwasy tłuszczowe, węglowodory aromatyczne, sterydy i aminy, a także szeregizomerów optycznych w/w substancji [69, 77]. Zdolność cyklodekstryn dotworzenia kompleksów inkluzyjnych zależy nie tylko od wielkości i budowyprzestrzennej potencjalnej cząsteczki „gościa”. Również istotne jest stężenieCD w fazie ciekłej, rodzaj i pH rozpuszczalnika oraz temperatura [77-82].W przypadku wykorzystywania właściwości inkluzyjnych w technikach separacyjnychcyklodekstryny mogą występować w postaci związanej chemicznie(wiązania kowalencyjne) lub fizycznie (oddziaływania elektrostatyczne) napowierzchni chromatograficznej fazy stacjonarnej, jak również mogą byćbezpośrednio rozpuszczone w fazie ruchomej. Obecnie cyklodekstryny sąpowszechnie stosowane we wszystkich technikach separacyjnych wykorzystującychjako fazy ruchome zarówno gazy, jak i ciecze, a także w technikachelektroseparacyjnych. Poza zastosowaniami analitycznymi CD są szerokostosowane w rolnictwie, przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznymoraz spożywczym, głównie w celu zwiększenia rozpuszczalności i trwałościsubstancji czynnych [69, 74]. Mając na względzie ich właściwości fizykochemiczneoraz praktycznie brak toksyczności w przypadku spożycia, należyprzypuszczać, iż w przyszłości będą one odgrywać ważną rolę w naukachśrodowiskowych. Zastosowanie ich może przyczynić się do usunięcia silnietoksycznych substancji z przemysłowych ścieków wskutek tworzenia kompleksówinkluzyjnych [69].Wykorzystująca opisane powyżej właściwości cyklodekstryn, zależnaod temperatury chromatografia inkluzyjna umożliwia jednoczesną analizęilościową kluczowych hormonów sterydowych oraz ich izomerów optycznychw wieloskładnikowych próbkach biologicznych, takich jak ekstrakty z tkanek,krew oraz mocz [59, 73, 83]. W przeciwieństwie do istniejących procedur123

opartych głównie na gradiencie ciekłej fazy ruchomej, w/w procedura umożliwiajednoczesne rozdzielenie wielu sterydów charakteryzujących się dużymiróżnicami w polarności w trakcie prostego jednoetapowego procesu rozdzielaniaizokratycznego [1, 59, 68, 82, 84-86]. Na uwagę zasługuje fakt, iżmetodykach z wykorzystaniem substancji makrocyklicznych, udaje sięw prosty sposób uzyskać całkowite rozdzielenie analitów nawet w obecnościdużej ilości interferujących substancji matrycy biologicznej badanej próby.Zasada działania tej metody oparta jest na technice izokratycznej wysokosprawnejchromatografii cieczowej, w której retencja analitów jest kontrolowanapoprzez oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy makrocyklicznymimodyfikatorami inkluzyjnymi fazy ruchomej a badanymi analitami [87, 88,89]. Ponieważ oddziaływanie cyklodekstryn z analitami zależy silnie od temperatury,dlatego proces chromatografowania w obecności cyklodekstrynw fazie ruchomej może być efektywnie sterowany zmianami temperaturykolumny, w wąskim zakresie temperatur od 0 do 80 o C [67, 68, 80]. Z praktycznegopunktu widzenia całkowity czas analizy, potrzebny do rozdzieleniawieloskładnikowych mieszanin sterydów charakteryzujących się dużymi różnicamiw polarności, może być zredukowany z kilku godzin (stosując klasycznesystemy chromatograficzne z binarnym układem faz ruchomych) do zaledwiekilkunastu minut, przy zastosowaniu izokratycznego systemu z cyklodekstrynąw fazie ruchomej, w odpowiedniej temperaturze prowadzenia procesu chromatograficznego.Daje to możliwość praktycznego zastosowania tej metodydo analizy dużej ilości złożonych próbek pobranych ze środowiska przyrodniczego,szczególnie z ekosystemów wodnych [68, 90] (rysunek 2).Rysunek 2. Porównanie ekstraktów próbek środowiskowych (jezioro Lubiatowo, województwozachodniopomorskie) dla analitów w zakresie polarności od estetrolu do progesteronu, uzyskanychz użyciem procedury SPE na kolumienkach C-18 bez (A) oraz z wykorzystaniem cieczyczyszczącej (B), o składzie metanol/woda (30%, v/v). Chromatogramy wykonano za pomocąchromatografu HPLC z detektorem skanującym DAD UV-Vis, przy zastosowaniu fazy ruchomejacetonitryl:woda z dodatkiem β-cyklodekstryny (10mM) oraz kolumny z wypełnieniem typuC-18, pracującej w temperaturze 47 o C [61, 62].124

LITERATURA1. López de Alda M.J., Barceló D., J. Chromatogr. A, 892(2000)391.2. Petrovic M., Eljarrat E., López de Alda M.J., Barceló D., Trends Anal.Chem, 20(2001)637.3. Rhind S.M., Domestic Animal Endocrinology. 23(2002)179.4. Diaz-Cruz M.S., López de Alda M.J., López R., Barceló D., J. MassSpectrom., 38(2003)917.5. Ingrand V., Herry G., Beausse J., de Roubin M.-R., J. Chromatogr.A, 1020(2003)99.6. Hong C.C., Shimomura-Shimizu M., Muroi M., Tanamoto K.-I., Biol.Pharm. Bull., 27(2004)1136.7. Cargouët M., Perdiz D., Mouatassim-Souali A., Tamisier-Karolak S.,Levi Y., Sci. Total Environ., 324(2004)55.8. Lagana A., Bacaloni A., De Leva I., Faberi A., Fago G., Marino A., Anal.Chim. Acta, 501(2004)79.9. López-Roldan P., López de Alda M.J., Barceló D., Anal. Bioanal.Chem.,378(2004)599.10. Barceló D., Emerging organic pollutants in waste waters and sludge.Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005.11. Zhang Y., Zhou J.L., Water Res., 39(2005)3991.12. Campbell C.G., Borglin S.E., Green B., Grayson A., Wozi E., StringfellowW.T., Chemosphere, 65(2006)1265.13. Esperanza M., Suidan M.T., Marfil-Vega R., Gonzalez C., Sorial G.A.,McCauley P., Brenner R., Chemosphere, 66(2007)1535.14. Kim S.D., Cho J., Kim I.S., Vanderford B.J., Snyder S.A., Water Res.,41(2007)1013.15. Petrovic M., Eljarrat E., López de Alda M.J., Barceló D., J. Chromatogr.A, 974(2002)23.16. López de Alda M.J., Díaz-Cruz S., Petrovic M., Barceló D., J. Chromatogr.A, 1000(2003)503.17. Petrovic M., Eljarrat E., López de Alda M.J., Barceló D., Anal. Bioanal.Chem.,378(2004)549.18. Johnson A., Williams R.J., Simpson P., Kanda R., Environ. Pollut.,147(2007)194.19. Ternes T.A., Stumpf M., Müeller J., Haberer K., Wilken R.-D., ServosM., Sci. Total Environ., 225(1999)81.20. Schäfer A.I., Mastrup M., Jansen R., Desalination, 147(2002)243.21. Wintgens T., Gallenkemper M., Melin T., Desalination, 146(2002)387.22. Suzuki Y., Maruyama T., Water Res., 40(2006)1061.23. Ma M., Rao K., Wang Z., Environ. Pollut., 147(2007)331.24. Ren Y.X., Nakano K., Nomura M., Chiba N., Nishimura O., Water Res.,41(2007)2341.25. Petrovic M., Sole M., Lopez de Alda M.J., Barcelo D., Environ. Toxicol.Chem., 21(2002)2146.26. Li C., Li X.Z., Graham N., Gao N.Y., Water Res., 42(2008)109.125

27. Liu B., Liu X., Sci. Total Environ., 320(2004)269.28. Céspedes R., Petrovic M., Raldúa D., Saura U., Piña B., Lacorte S.,Viana P., Barceló D., Anal. Bioanal.Chem., 378(2004)697.29. Kuster M., López de Alda M.J., Barceló D., Trends Anal. Chem.,23(2004)790.30. López de Alda M.J., Barceló D., J. Chromatogr. A, 938(2001)145.31. Ying, G.G. Kookana R.S., Ru Y.J., Environ. Int., 28(2002)545.32. D’Ascenzo G., Di Corcia A., Gentili A., Mancini R., Mastropasqua R.,Nazzari M., Samperi R., Sci. Total Environ., 302(2003)199.33. Rodriguez-Mozaz S., López de Alda M.J., Barceló D., J. Chromatogr.A, 1045(2004)85.34. Shi J., Fujisawa S., Nakai S., Hosomi M., Water Res., 38(2004)2323.35. Li F., Yuasa A., Obara A., Mathews A.P., Water Res., 39(2005)2065.36. Servos M.R., Bennie D.T., Burnison B.K., Jurkovic A., McInnis R., NeheliT., Schnell A., Seto P., Smyth S.A., Terne T.A. s, Sci. Total Environ.,336(2005)155.37. Zuo Y., Zhang K., Deng Y., Chemosphere, 63(2006)1583.38. Sonnenschein C., Soto A.M., J. Steroid Biochem. Mol. Biol.,65(1998)143.39. Arukwe A., Mar. Pollut. Bull., 42(2001)643.40. Nghiem L.D., Manis A., Soldenhoff K., Schäfe A.I. r, J. Membr. Sci.,242(2004)37.41. Menditto A., Turrio-Baldassarri L., Chemosphere, 39(1999)1301.42. Xiao X.Y., McCalley D.V., McEvoy J., J. Chromatogr. A, 923(2001)195.43. Liu R., Zho J.L. u, Wilding A., J. Chromatogr. A, 1022(2004)179.44. Auriol M., Filali-Meknassi Y., Tyagi R.D., Adams C.D., Surampalli R.Y.,Process Biochem., 41(2006)525.45. Bodzek M., Dudziak M., Desalination, 198(2006)24.46. López de Alda M.J., Barceló D., Fresenius J. Anal. Chem.,371(2001)437.47. Heberer T., J. Hydrol., 266(2002)175.48. Svenson A., Allard A.S., Ek M., Water Res., 37(2003)4433.49. Sumpter J.P., Toxicol. Lett., 82/83(1995)737.50. Pojana G., Gomiero A., Jonkers N., Marcomini A., Environ. Int.,33(2007)929.51. Liu Z., Kanjo Y., Mizutani S., Sci. Total Environ., 407(2009)731.52. Andersen H.R., Hansen M., Kjølholt J., Stuer-Lauridsen F., Ternes T.,Halling-Sørensen B., Chemosphere, 61(2005)139.53. Leusch F.D.L., Chapman H.F., van den Heuvel M.R., Tan B.L.L., GooneratneS.R., Tremblay L.A., Ecotoxicol. Environ. Saf., 65(2006)403.54. Buszewski B., Buszewska T., Szumski M., Siepak J., Chem. Anal.(Warsaw), 48(2003)13.55. Siepak J., Państwowy Zakład Higieny. Warszawa 2003.56. Kobiella B., Zerbe J., Lis S., Siepak J., Ekologia i Technika,6(2004)196.126

57. Buszewska T., Siepak J., Buszewski B., Chemia i Inżynieria Ekologiczna,12(1998)1099.58. Lamparczyk H., Ochocka R.J., Zarzycki P.K., Zielinski J., J. Planar.Chromatogr., 3(1990)34.58. Lamparczyk H., CRC Press. Boca Raton 1992.59. Kowalkowski T., Zbytniewski R., Szpejna J., Buszewski B., Water Res.,40(2006)744.60. Zarzycki P.K., Włodarczyk E., Baran M.J., J. Chromatogr.A, 1216(2009)7602.61. Zarzycki P.K., Włodarczyk E., Baran M.J., J. Chromatogr.A, 1216(2009)7612.62. Desbrow C., Routledge E.J., Brighty G.C., Sumpter J.P., Waldock M.,Environ. Sci. Technol., 32(1998)1549.63. Jahr D., Chromatographia, 47(1998)49.64. Routledge E.J., Sheahan D., Desbrow C., Brighty G.C., Waldock M.,Sumpter J.P., Environ. Sci. Technol., 32(1998)1559.65. Szymański K., Siebielska I., Ochrona Środowiska, 76(2000)15.66. Zarzycki P.K., Lamparczyk H., Chromatographia, 48(1998)377.67. Zarzycki P.K., Smith R., J. Chromatogr. A, 912(2001)45.68. Singh M., Sharma R., Banerjee U.C., Biotechnol. Adv., 20(2002)341.69. Del Valle E.M., Process Biochem., 39(2004)1033.70. Loftsson T., Duchêne D., Int. J. Pharm., 329(2007)1.71. Sybilska D., Żukowski J., rozdział w Chiral separation. (Krstulovic A.M.red.) Wiley. New York 1989.72. Zarzycki P.K., Kulhanek K.M., Smith R., Clifton V.L., J. Chromatogr.A, 1104(2006)203.73. Schneiderman E., Stalcup A.M., J. Chromatogr. B, 745(2000)83.74. Saenger W., Jacob J., Gessler K., Steiner T., Hoffmann D., Sanbe H.,Koizumi K., Smith S.M., Takaha T., Chem. Rev., 98(1998)1787.75. Asztemborska M., Nowakowski R., Sybilska D., J. Chromatogr.A, 902(2000)381.76. Sybilska D., Żukowski J., Bojarski J., J. Liq. Chromatogr., 9(1986)591.77. Sybilska D., Lipkowski J., Wójcikowski J., J. Chromatogr.A, 253(1982)95.78. Lamparczyk H., Zarzycki P.K., J. Pharm. Biomed. Anal., 13(1995)543.79. Zarzycki, P.K. Lamparczyk H., J. Chem. Educ., 73(1996)459.80. Nowakowski R., Bielejewska, A. Duszczyk K., Sybilsk D. a, J. Chromatogr.A, 782(1997)1.81. Zarzycki P.K., Wierzbowska M., Lamparczyk H., J. Pharm. Biomed.Anal., 15(1997)1281.82. Clifton V.L., Bisits A., Zarzycki P.K., J. Chromatogr. B, 855(2007)249.83. Lamparczyk H., Zarzycki P.K., Nowakowska J., Ochocka R.J., Chromatographia,38(1994)168.84. Zarzycki P.K., Wierzbowska M., Lamparczyk H., J. Pharm. Biomed.Anal., 14(1996)1305.127

85. Zarzycki P.K., Kulhanek K.M., Smith R., J. Chromatogr.A, 955(2002)71.86. Armstrong D.W., Nome F., Spino L.A., Golden T.D., J. Am. Chem. Soc.,108(1986)1418.87. Fujimura, K. Ueda T., Kitagawa M., Takayanagi H., Ando T., Anal.Chem., 58(1986)2668.88. Sybilska D., Cyclodextrins as mobile-phase components of separationby isomers by reversed-phase high performance liquid chromatography.w Ordered media in chemical separation. (Hinze W.L, Armstrong D.W.red.) American Chemical Society. Symposium Series 1987, 342,218-234.89. Dudziak M., Bodzek M., Ochrona Środowiska, 1(2005)35.90. Baronti C., Curini R., D'Ascenzo, G. Di Corcia A., Gentili A., SampeliR., Environ. Sci. Technol., 34(2000)5059.91. Johnson A.C., Belfroid, A. Di Corcia A., Sci. Total Environ.,256(2000)163.92. Hashimoto T., Onda K., Nakamura Y., Tada K., Miya A., Murakami T.,Water Res., 41(2007)2117.93. Kuch H.M., Ballschmiter K., Environ. Sci. Technol., 35(2001)3201.94. Majima, K. Fukui T., Yuan J., Wang G., Matsumoto K., Anal. Sci.,18(2002)869.95. Larsson D.G.J., Adolfsson-Erici M., Parkkonen J., Pettersson M., Berg,H. Olsson P.-E., Förlin L., Aquat. Toxicol., 42(1999)91.96. Behnish P.A., Fujii K., Shiozaki K., Kawakami I., Sakai S.-I., Chemosphere,43(2001)977.97. Fawell J.K., Sheahan D., James H.A., Hurst M., Scott S., Water Res.,35(2001)1240.98. Lishman L., Smyth S.A., Sarafin K., Kleywegt S., Toito J., Peart T., LeeB., Servos M., Beland M., Seto P., Sci. Total Environ., 367(2006)544.99. Belfroid A.C., van der Horst A., Vethaak A.D., Schäfer A.J., Rijs G.B.J.,Wegener J., Cofino W.P., Sci. Total Environ., 225(1999)101.100. Snyder S.A., Keith T.L., Verbrugge D.A., Snyder E.M., Gross T.S.,Kannan K., Giesy J.P., Environ. Sci. Technol., 33(1999)2814.101. Nasu M., Goto M., Kato H., Oshima Y., Tanaka H., Water Sci. Technol.,43(2001)101.102. Huang C.-H., Sedlak D.L., Environ. Toxicol. Chem., 20(2001)133.103. Spengler P., Körner W., Metzger J.W., Environ. Toxicol. Chem.,20(2001)2133.104. Isobe T., Shiraishi, H. Yasuda M., Shinoda A., Suzuki H., Morita M.,J. Chromatogr. A, 984(2003)195.105. Danish Environmental Protection Agency (DEPA). Degradation of estrogensin sewage treatment processes. Environmental Project No. 899.Danish Environmental Protection Agency, Danish Ministry of the Environment;2004.106. Tabata A., Kashiwada S., Ohnishi Y., Ishikawa H., Miyamoto N., ItohM., Magara Y., Water Sci. Technol., 43(2001)109.128

107. Boyd G.R., Reemtsma H., Grimm D.A., Mitra S., Sci. Total Environ.,311(2003)135.108. Quintana J.B., Carpinteiro J., Rodríguez I., Lorenzo R.A., Carro A.M.,Cela R., J. Chromatogr. A, 1024(2004)177.109. Hu J., Zhang H., Chang H., J. Chromatogr. A, 1070(2005)221.110. Almeida C., Nogueira J.M.F., J. Pharm. Biomed. Anal., 41(2006)1303.111. Trenholm, R.A. Vanderford B.J., Holady J.C., Rexing D.J., Snyder S.A.,Chemosphere, 65(2006)1990.112. Barel-Cohen K., Shore L.S., Shemesh M., Wenzel A., Müeller J., Kronfeld-SchorN., J. Environ. Manage., 78(2006)16.129

130

Grzegorz BOCZKAJ 1 , Marek GOŁĘBIOWSKI 2 ,Marian KAMIŃSKI 3 , Piotr STEPNOWSKI 41,3Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 1 , mknkj@chem.pg.gda.pl 3 ,2,4tel. (58) 347-17-29Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska80-952 Gdańsk, e-mail: sox@chem.univ.gda.plIDENTYFIKACJA LOTNYCH SKŁADNIKÓW ŚCIEKÓWZ INSTALACJI OKSYDACJI ASFALTÓWZ WYKORZYSTANIEM CHROMATOGRAFII GAZOWEJSPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)W pracy przedstawiono wyniki badań nad identyfikacją lotnych związków organicznychwystępujących w ściekach z instalacji oksydacji asfaltów. Ścieki poddanodeemulgacji, w celu usunięcia fazy organicznej, a następnie ekstrakcji dichlorometanem,w celu wyizolowania pozostałych w ściekach związków organicznych. Zidentyfikowano30 związków organicznych oraz szereg n-alkanów, które pozostały w ściekachpomimo zastosowanej deemulgacji. W ściekach zidentyfikowano główniezwiązki aromatyczne oraz ketony, aldehydy oraz węglowodory nienasycone. W celupotwierdzenia identyfikacji związków aromatycznych wykonano analizy GC-MSw trybie SIM.Słowa kluczowe: ścieki, lotne związki organiczne, LZO, VOC, chromatografia gazowa,spektrometria mas, asfaltWSTĘPMinimalizacji wpływu działalności przemysłowej na środowisko, stanowijedno z wielu wyzwań współczesnej technologii chemicznej. Jedenz problemów stanowi emisja lotnych związków organicznych (LZO) do atmosfery.Często, równocześnie ma miejsce wysoki poziom złowonności emitowanychsubstancji. Główne drogi ograniczenia emisji do atmosfery opierająsię na hermetyzacji procesów technologicznych, oraz odprowadzaniaoparów poprzez systemy odsysu i dalszej ich neutralizacji z wykorzystaniemróżnorodnych operacji sozotechnicznych - tj. adsorpcja [1], absorpcja [2-6],spalanie [7], metody biologiczne [8-12], inne - nie termiczne metody utleniania[13]. W wyniku takich procesów powstają często ścieki, które jeśli jest tokonieczne, powinny być poddawane, dalszej obróbce w celu ograniczeniatoksyczności, jak również złowonności.Badania emisji lotnych związków organicznych prowadzi się z bardzoczęsto z wykorzystaniem chromatografii gazowej. W zależności od potrzebi możliwości, z wykorzystaniem uniwersalnej lub selektywnej detekcji. Najpopularniejszymdetektorem stosowanym w analityce lotnych związków or-131

ganicznych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). W przypadku oznaczanialotnych związków siarki, powszechnie stosowany był dotychczas, detektorpłomieniowo-fotometryczny (FPD, jednak nie zapewnia on dostateczniewysokiej czułości i selektywności, co skłania do wykorzystania bardziejnowoczesnych rozwiązań [14-16], tj. pulsacyjnego detektora płomieniowo--fotometrycznego (PFPD) [17-19], detektora chemiluminescencji siarki(SCD) lub detektora emisji atomowej (AED), jak również, spektrometrii mas(MS). Oznaczanie związków azotu prowadzi się przy wykorzystaniu detektoraazotu i fosforu (NPD) [20] oraz detektorów wykorzystujących zjawiskochemiluminescencji 14, 15]. Dostępny na rynku detektor PFPD pozwalarównież na oznaczanie związków azotu, jednak jego czułość dla azotu niejest już tak wysoka jak dla siarki. Coraz częściej wykorzystywane są równieżurządzenia oparte na zestawie sensorów, tzw. nosy elektroniczne [21-24].Podjęte w niniejszej pracy zagadnienie, dotyczy identyfikacji lotnychzwiązków organicznych w ściekach z instalacji oksydacji asfaltów. Najpowszechniejsząmetodą uzyskiwania asfaltów jest utlenianie gorącym powietrzempozostałości próżniowej, czasem blending z tzw. asfaltem propanowymlub pentanowym, a niekiedy również z ekstraktami deasfaltyzatu. Doreaktora wprowadza się wsad w temperaturze 170-180 o C. W przeciwprądzie(lub z zastosowaniem systemu turbin) wdmuchuje się powietrze. Z reguły,króćcem w dolnej części reaktora odbiera się gotowy asfalt. Gazy odlotowepowstające w trakcie procesu są oczyszczane w skruberze i kierowane dopieca dopalającego.Zarówno na etapie destylacji próżniowej ropy naftowej, jak równieżw reaktorze utleniania pozostałości próżniowej w wytwórni asfaltów, mamiejsce w różnym stopniu kraking termiczny. Przyczyną jest przegrzewaniesurowca na powierzchni elementów grzejnych. Pierwotnie powstają węglowodorynienasycone (olefiny). Dalsze przemiany, którym ulegają olefiny to -kondensacja, addycja do wiązania podwójnego, utlenianie. To skutkuje powstawaniemcałej gamy związków organicznych, przede wszystkim ketonówi aldehydów, a także związków siarko-organicznych, WWA i innych. Aldehydy,w większości, szybko ulegają utlenieniu do kwasów karboksylowych.Znaczna cześć powstałych w ten sposób lotnych związków chemicznych jestusuwana w wyniku „mycia” gazów odlotowych w skruberze. Jednak niewielkaich ilość pozostaje rozpuszczona w asfalcie. Obecność w ściekach pooksydacyjnychtego typu ubocznych produktów powstających podczas produkcjiasfaltu stanowi duży problem, przede wszystkim z powodu ich niezwyklenieprzyjemnego zapachu, a także wysokiego poziomu ekotoksyczności.Problem dotyczy, zarówno emisji ze ścieków z instalacji utleniania asfaltów,jak również emisji towarzyszącej nalewowi asfaltu do cystern.Ścieki z instalacji oksydacji asfaltów są kierowane do oczyszczalniścieków. Procedura oczyszczania różni się w zależności od rodzaju ścieków,tym niemniej główne etapy obejmują separację fazy olejowej, flokulację,oczyszczanie biologiczne oraz klarowanie.W szczególności z powodu biotoksyczności ścieków oraz ich wysokiejzłowonności istnieje, potrzeba wstępnego preoczyszczania tego typu ście-132

ków przed ich wprowadzeniem do oczyszczalni ścieków. To, z kolei wymagaopracowania efektywnej technologii pre-oczyszczania ścieków, zapewniającejznaczną redukcję złowonności i bio-toksyczności. W celu odpowiedniegodoboru technologii oczyszczania ścieków istotna jest identyfikacja głównychgrup LZO obecnych w ściekach.W pracy przedstawiono wyniki badań nad identyfikacją głównych grupLZO obecnych w ściekach pooksydacyjnych z wykorzystaniem kapilarnejchromatografii gazowej w sprzężeniu ze spektrometrią mas.METODYKAMateriały:- Ścieki z instalacji oksydacji asfaltów- Przemysłowy deemulgator zastosowany w celu deemulgacji fazy organicznej- Dichlorometan (HPLC Grade, POCH)- Hel (4,8 N; Linde Gas)Aparatura:Chromatograf gazowy 5890 II sprzężony ze spektrometrem mas SSQ 710Finningan Mat.Kolumna kapilarna do chromatografii gazowej wym. 30,0 x 0,25 mm x1,5 μm, RTX 5 (Restek)Przygotowanie próbek do badań - deemulgacja ścieków i ekstrakcja ciecz--cieczDeemulgacjaŚcieki w objętości 300 ml zmieszano w rozdzielaczu z deemulgatorem (sporządzonympoprzez rozpuszczenie koncentratu w wodzie zgodnie z instrukcjąproducenta). Po pięciu minutach mieszania ręcznego, ściek pozostawionow celu rozdzielenia faz. Następnie ściek pozbawiony fazy organicznejprzeniesiono do drugiego rozdzielacza.Ekstrakcja ciecz-cieczŚcieki w objętości 250 ml (po ok. 25 ml „dolnej” oraz „górnej” części ściekówz etapu deemulgacji odrzucono, w celu maksymalnego ograniczenia możliwościprzejścia fazy organicznej do etapu ekstrakcji) ekstrahowano trzykrotnieporcjami dichlorometanu w objętości 5 ml. Czas ustalenia rozdziału fazprzyjęto 15 min. Ekstrakty połączono.Warunki analizy:Ekstrakt ścieków w dichlorometanie dozowano przy pomocy mikrostrzykawkiw objętości 1 μl.Warunki rozdzielaniaPrzepływ gazu nośnego (Hel): 1,5 ml/min, tryb dozowania Split 10:1, temperaturadozownika 275 o C.133

Program temperatury: 35 o C (izotermicznie 5 min) - narost 4 o C/min – 260(izotermicznie 20 min).Parametry spektrometruTemperatura źródła jonów (EJ, 70 eV) 200 o C, temperatura linii 200 o C.Tryb SCAN do 300 m/z, tryb SIM w zakresie 77-91 m/z. Czas skanowania 0,5 s.WYNIKI I DYSKUSJANa rysunkach 1-3 przedstawiono chromatogram uzyskany w trybieSCAN. Na rysunku zaznaczono pogrubionymi cyframi zidentyfikowane związki.Rysunek 1. Identyfikacja: (1) heksanal; (2) 2-metylocyklopentanon; (3) benzaldehyd; (4) heptanol;(5) 1-okten; (6) cykloheptanon; (7) keton 2-furylo-metylowy; (8) 3-oktanon; (9) 2,3 dimetylocyklopent-2-en-1-on;(10) o-krezol; (11) 2-izopropylocykloheksanol; (12) keton metylo-fenylowy;(13) 1-dekanal; (14) 1-etylocykloheksen; (15) m-krezol; (16) 2,3,4 – trimetylocyklopent-2 -en--1-on; (17) – 2,3 – dimetylo fenol; (18) 2 – formylotiofenRysunek 2. Identyfikacja: (19) cykloheksylometyloketon; (20) 2,4- dimetylofenol;(21) 2,6-dimetylofenol; (22) 3-vinylocykloheksanon; (23) 3-etylo-5-metylofenol; (24) 1,2,4,5 – tetrametylobenzen;(25) 3-metoksy,4-propoksyfenol ; (26) 2,3,5-trimetylofenol; (27) styren;(28) dekadienal; (29) 2,3,5-timetylobenzaldehyd134

Rysunek 3. Identyfikacja: (30) 2-metylofenantrenWśród zidentyfikowanych związków stwierdzono znaczną grupęzwiązków aromatycznych, w tym kilka związków z grupy fenoli. W celu dodatkowejidentyfikacji wykonano analizę ekstraktu ścieków w trybie SIMw zakresie 77-91 m/z (selektywnie dla związków aromatycznych). Na rysunku4 przedstawiono chromatogram wraz z identyfikacją, wykonany w trybieSIM.Rysunek 4. Chromatogram wykonany techniką GC-MS w trybie SIM w zakresie 77-91 m/z135

W celu sprawdzenia skuteczności deemulgacji, przeanalizowano dodatkowochromatogram GC-MS wykonany w trybie SCAN pod kątem występowaniaw ekstrakcie węglowodorów nasyconych (rysunek 5).Rysunek 5. Identyfikacja n-alkanów w ekstrakcie ścieku, chromatogram GC-MS zarejestrowanyw trybie SCANRysunek 5 wskazuje na obecność, pomimo deemulgacji, n-alkanóww ściekach. Jest to zjawisko niekorzystne, ponieważ obecność fazy węglowodorowejznacznie zwiększa zawartość LZO w ściekach. Dotyczy to głównieniskopolarnych i średniopolarnych związków, które rozpuszczają sięw węglowodorach zemulgowanych w fazie wodnej ścieków. Dodatkowo występowaniefazy organicznej, znacznie zawyża ilość utleniacza potrzebnegona redukcję ChZT ścieków.W przypadku stosowania biologicznego oczyszczania ścieków, zbytduży „ładunek” substancji organicznych w ściekach pooksydacyjnych wywołujepienienie osadu czynnego w początkowym etapie oczyszczania.Uzyskane wyniki wskazują na występowanie szeregu podstawionych związkówaromatycznych, w tym głownie fenoli, stosunkowo odpornych na stosowanepowszechnie technologie oczyszczania ścieków. Zidentyfikowanorównież związki o charakterze odorowym, tj. aldehydy i ketony oraz związkinienasycone – co jak opisano na we wstępie do niniejszej pracy związanejest m.in. z procesami krakingu termicznego utlenianego asfaltu.PODSUMOWANIEW pracy przedstawiono metodykę identyfikacji lotnych związków organicznychw ściekach z instalacji oksydacji asfaltów. Zidentyfikowano 30związków organicznych, innych niż n-alkany. Znaczną część stanowiłyzwiązki aromatyczne, w tym fenole podstawione grupami alkilowymi. Wynikiidentyfikacji posłużą opracowaniu technologii oczyszczania ścieków ukierunkowanejna zidentyfikowane grupy związków.PODZIĘKOWANIAAutorzy pragną podziękować Grupie LOTOS S.A. za pomoc w realizacji niniejszejpracy.136

LITERATURA1. Miura K., Nakanishi A., Hashimoto K., Treatment of the poisonous gasremaining after fumigation by use of an activated carbon adsorber, Ind.Eng. Chem. Process Des. Dev., 22 (1983), 469.2. Borgwardt R.H., Combined Flue Gas Desulfurization and Water Treatmentin Coal-Fired Power Plants, Environ. Sci. Technol., 14 (1980), 294.3. Lianga C., Chena Y.J., Chang K.J., Evaluation of persulfate oxidative wetscrubber for removing BTEX gases, J. Hazard. Mater., 2 (2009), 164.4. Bokotko R.P., Hupka J., Miller J.D., Flue Gas Treatment for SO2 Removalwith Air-Sparged Hydrocyclone Technology, Environ. Sci. Technol.,39 (2005), 1184.5. Kaiser S., Weigl K., Spiess-Knafl K., Aichernig C., Friedl A., Modelinga dry-scrubbing flue gas cleaning process, Chem. Eng. Process.,39, 425 (2000).6. Yassin L., Lettieri P., Simons S.J.R., German Study of the Process Designand Flue Gas Treatment of an Industrial-Scale Energy-from-WasteCombustion Plant, Ind. Eng. Chem. Res., 46, (2007), 2648.7. Stulir R., Stehlik P., Oral J., Fabikovic V., Fully integrated unit for thermaltreatment of gas wastes, Appl. Therm. Eng., 21 (2001), 1883.8. Burgess J.E., Parsons S.A., Stuetz R.M., Developments in odour controland waste gas treatment biotechnology: a review, Biotechnol. Adv.,19 (2001), 35.9. Rappert S., Muller R., Microbial degradation of selected odorous substances,Waste Manage., 25 (2005), 940.10. Philip L., Deshusses M.A., Sulfur Dioxide Treatment from Flue GasesUsing a Biotrickling Filter−Bioreactor System, Environ. Sci. Technol.,37 (2003), 1978.11. Leson G., Winer A.M., Biofiltration: an innovative air pollution controltechnology for VOC emissions, J. Air Waste Manage. Assoc.,41 (1991), 1045.12. Pandey R.A., Mudliar S.N., Borgaokar S., Treatment of waste gas containingdiethyldisulphide (DEDS) in a bench scale biofilter, Bioresour.Technol., 100 (2009), 131.13. Fino D., Russo N., Saracco G., Specchia V., Multifunctional Filter forTreatment of the Flue Gases from Municipal Waste Incinerators, Ind.Eng. Chem. Res., 44 (2005), 9542.14. Yan X., Unique selective detectors for gas chromatography: Nitrogenand sulfur chemiluminescence detectors, J. Sep. Sci., 29 (2006), 1931.15. Yan X., Detection by ozone-induced chemiluminescence in chromatography,J. Chromatogr. A, 842 (1999), 267.16. Van Stee L.L.P., Brinkman U.A.Th., Developments in the application ofgas chromatography with atomic emission (plus mass spectrometric)detection, J. Chromatogr. A, 1186, (2008), 109.17. Dagan S., Comparison of gas chromatography–pulsed flame photometricdetection–mass spectrometry, automated mass spectral deconvolu-137

tion and identification system and gas chromatography–tandem massspectrometry as tools for trace level detection and identification,J. Chromatogr. A, 868 (2000), 229.18. Amirav A., Jing H., Pulsed Flame Photometer Detector for Gas Chromatography,Anal. Chem., 67 (1995), 3305.19. Jing H., Amirav A., Pulsed flame photometric detector – a step forwardtowards universal heteroatom selective detection, J. Chromatogr.A, 805 (1998), 177.20. Buttler B., Gas Chromatographic Determination of Propiconazole andEtaconazole in Plant Material, Soil, and Water, J. Agric. Food Chem.,31 (1983), 4.21. Dewettinck T., Van Hege K., Verstraete W., The electronic nose asa rapid sensor for volatile compounds in treated domestic wastewater,Wat. Res., 35 (2001), 2475.22. Di Francesco, F., Lazzerini, B., Marcelloni, F., Pioggia, G., An electronicnose for odour annoyance assessment, Atmos. Environ., 35 (2001),1225.23. Che Harun F.K., Taylor J.E.; Covington J.A., Gardnem J.W., An electronicnose employing dual-channel odour separation columns withlarge chemosensor arrays for advanced odour discrimination, Sens.Actuators B., 141 (2009), 134.24. Capelli L., Sironi S., C´entola P., Del Rosso R., Grande M.I., Electronicnoses for the continuous monitoring of odours from a wastewater treatmentplant at specific receptors: Focus on training methods, Sens.Actuators B. 131 (2008), 53.138

Marian KAMIŃSKI, Bogdan KANDYBOWICZPolitechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemiczneji Procesowej, 80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,e-mail: mknkj@chem.pg.gda.plMETODYKA KOREKTY PROGRAMU ELUCJIW KOLUMNOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ– HPLC/UPCUżytkownik aparatu HPLC / UPC oczekuje zgodności przebiegu programuelucji na wlocie do kolumny z zaprogramowaną jego postacią. W praktyce - szczególniez zastosowaniem modułów zasilania kolumny eluentem o programowanymskładzie, wyposażonych w tzw. zawory proporcjonujące - mają miejsce odchyleniaprzebiegu programu elucji od wymaganej postaci. Ich amplituda mierzona w funkcjiczasu, zależy od wartości opóźnienia transportowego (delay volume), od zastępczejobjętości mieszania cieczy na drodze zawory proporcjonujące – wlot do kolumny(mixing volume) oraz od natężenia przepływu eluentu (flow rate) i jest względnie tymwiększa, im mniejsza jest skala rozdzielania oraz im większe wartości ww. objętości.W aparatach różnych producentów wartości te są zróżnicowane, co powoduje problemyz uzyskaniem odtwarzalności parametrów retencji uzyskiwanych z zastosowaniemtej samej kolumny i tych samych warunków rozdzielnia, lecz różnych aparatówHPLC/UPC.W pracy przedstawiono zastępczy model fizyczny gradientowego modułu zasilaniaeluentem kolumny HPLC/UPC, matematyczny opis modelu, zasadyi sposoby doświadczalnego wyznaczania parametrów modelu oraz wykazano teoretyczniei potwierdzono doświadczalnie, że zastosowanie skorygowanej postaci programuelucji umożliwia całkowitą eliminację opisanych problemów z odtwarzalnościąparametrów retencji otrzymywanych w warunkach elucji gradientowej. Korekta polegaprzede wszystkim na uwzględnieniu opóźnienia transportowego, co ostatnio zostałozaimplementowane do oprogramowania nowoczesnych aparatów UPC. Dodatkowonależy uwzględnić tzw. zastępczą objętość mieszania cieczy na drodze zaworyproporcjonujące – kolumna i dokonać odpowiedniej modyfikacji postaci programuelucji, wprowadzonego do sterownika zaworami proporcjonującymi programatorazmian składu eluentu. Wykazano doświadczalnie, że w taki sposób zaprogramowanakorekta programu elucji zapewnia uzyskiwanie powtarzalnych i odtwarzalnych wynikówrozdzielania w warunkach elucji gradientowej, z zastosowaniem aparatów chromatograficznycho różnych parametrach w zakresie opóźnienia transportowego i objętościmieszania. Zwrócono też uwagę, że obowiązkiem producenta aparatuHPLC/UPC powinno być podawanie tych parametrów w specyfikacji technicznej aparatuchromatograficznego.WSTĘPKażdy użytkownik aparatu HPLC/UPC oczekuje, by program elucji nawlocie do kolumny chromatograficznej był zgodny z przebiegiem zaprogramowanym.Przy czym wydaje się, że program elucji wprowadzony do ste-139

ownika powinien zostać dokładnie zrealizowany na wlocie do kolumny. Tooczekiwanie jest z gruntu błędne w przypadku stosowania aparatury wyposażonejw tzw. niskociśnieniowy system programowania składu eluentu (systemz zaworami proporcjonującymi umieszczonymi po stronie ssącej pompyaparatu). Program wprowadzony do sterownika jest wówczas realizowanywłaśnie na wylocie z zaworów proporcjonujących i w sposób istotny jest oninny od otrzymywanego na wlocie do kolumny [1-15]. Dodatkowo, aparatyróżnych producentów charakteryzują się różnymi wartościami objętości mieszaniacieczy w przestrzeni między wylotem z układu programowania składucieczy i wlotem do kolumny chromatograficznej, co powoduje, że ten samprogram elucji wprowadzony do sterownika programatora składu eluentuaparatów chromatograficznych różnych producentów prowadzi do otrzymywaniana wlocie do kolumny HPLC różnych funkcji przebiegu programu elucjii różnych w konsekwencji wartości czasu retencji tych samych substancjirozdzielanych z zastosowaniem tej samej kolumny.Można ogólnie stwierdzić, że w gradientowej aparaturze HPLC z zaworamiproporcjonującymi przebieg programu elucji na wlocie do kolumnychromatograficznej często odbiega od programu oczekiwanego [1-16]. Jeślisynchronizacja cyklicznej pracy pompy i zaworów proporcjonujących jest zapewniona[1, 4], to rozbieżność między zaprogramowanym i zrealizowanymprogramem elucji jest spowodowana przez opóźnienie transportowe oraz –dodatkowo - mieszanie cieczy w elementach aparatu [1-6]. W konsekwencji,otrzymuje się istotne odchylenia wartości czasu retencji pików rozdzielanychsubstancji od wartości przewidywanych, np. obliczonych z zależności teoretycznych[1, 6], lub wyznaczonych przez oprogramowanie optymalizująceprogram elucji [4, 5]. Szczególnie ważne znaczenie ma w związku z tym problemuzyskiwania dobrej odtwarzalności wyników rozdzielania, z zastosowaniemaparatów różnych producentów i konkretnej procedury analitycznej[1-8]. Wynika to stąd, że aparaty HPLC/UPC różnych producentów charakteryzująsię z reguły różnymi wartościami opóźnienia transportowego oraz objętościmieszania na drodze zawory proporcjujące – wlot do kolumny. Immniejsze są wymiary stosowanej kolumny i względnie większe wartości ww.parametrów aparatu, tym omawiane odchylenia są względnie większe.W praktyce mogą dochodzić do kilku minut w zakresie wartości czasu retencjirozdzielanych substancji [4-6].Wcześniejsze studia i badania teoretyczne, wykazały, że można zastosowaćtakie procedury sterowania modułem wykonawczym systemu programowaniaskładu eluentu, że następuje eliminacja odchylenia programuelucji otrzymanego na wlocie do kolumny od żądanej postaci programu[15-17]. Korekta powinna zapewnić nie tylko powtarzalność programu elucji,która zależy głównie od powtarzalności działania modułu programowaniaskładu cieczy, ale także odtwarzalność wartości czasu retencji i innych parametrówrozdzielania. Wytwarzanie na wlocie do kolumny programu elucji,dokładnie o żądanej postaci, powinno zapewnić efektywne stosowanie istniejącychnarzędzi doboru optymalnego programu elucji oraz możliwość weryfikacjiskuteczności tych narzędzi.140

CZĘŚĆ TEORETYCZNAPrzeprowadzono analizę teoretyczną kilku wariantów, przedstawionegona rys. 1 w formie uogólnionej - aktualnego dla gradientowego aparatuchromatograficznego z zaworami proporcjonującymi, umieszczonymi postronie niskiego ciśnienia pompy - zastępczego modelu mieszania cieczyw elementach gradientowego aparatu chromatograficznego.A0 1 2 3 4 5 6zBzP M Ma VoRA+BRysunek 1. Zastępczy model przyjęty dla matematycznego opisu zmian składu eluentu w układziezasilania eluentem kolumny chromatograficznej. Oznaczenia: A, B – składniki eluentu,Z – zawory proporcjonujące, P – pompa, M – mieszalnik o objętości V, Ma – mieszalnik o objętościV a zastępujący mieszanie cieczy w aparacie poza mieszalnikiem M, Vo – pojemność o tłokowymprofilu przepływu zastępująca opóźnienie transportowe, R – opór powodujący podwyższoneciśnienie pracy pompy, 1-6 – przekroje rozpatrywane w pełnym opisie modelu.Model na rys. 1 może zostać też zastosowany opisu mieszania cieczyw gradientowym aparacie chromatograficznym z zaworami proporcjonującymi,zarówno, umieszczonymi po stronie wysokiego, jak i niskiego ciśnienia,a także dla aparatu, w którym programowanie składu cieczy odbywa sięna drodze sterowania kilkoma równocześnie pracującymi pompami (tzw. wysokociśnieniowysystem programowania składu cieczy). Jednak, ścisły opismatematyczny uwzględniający wszystkie elementy modelu na rys. 1 jest stosunkowoskomplikowany.Do analizy teoretycznej problemu, zastosowano uproszczony model,który pozwala łatwo otrzymać ścisły opis teoretyczny [15-17]. Otrzymanewyniki okazały się, jednocześnie, w zadowalającym stopniu przydatne praktycznie.Model ten składa się z połączonych wzajemnie szeregowo elementów:”Z” (programator programu elucji, generujący w przekroju „1” określonąfunkcję programu elucji), mieszalników „M i Ma”, które zastąpiono jednymmieszalnikiem „M” o objętości Vz oraz elementu Vo, zastępującego opóźnienietransportowe (które zawsze ma miejsce na drodze: programator programuelucji – kolumna chromatograficzna). Model składa się, więc, tylkoz jednego mieszalnika o objętości Vz = V+Va, zastępującego mieszanie cieczyw przestrzeni między elementami wykonawczymi programatora składueluentu oraz z elementu (Vo), zastępującego opóźnienie transportowe międzywylotem z programatora składu eluentu i wlotem do kolumny chromatograficznej.141

Analiza teoretyczna takiego modelu, w przypadku liniowego programuelucji, żądanego na wlocie do kolumny chromatograficznej (w przekroju „5”),prowadzi do następujących wniosków (czytelnik może samodzielnie wyprowadzićodpowiednie zależności, jeżeli ma chęć „poćwiczyć” układanie i rozwiązywaniedość prostych równań różniczkowych, mających praktyczne zastosowanie):- Gdy programator składu eluentu realizuje w przekroju „1” liniową funkcjęprogramu elucji (1) w postaci:X = at + b (1)- to w stanie ustalonym (t >> TA = Vz/w), otrzymamy na wylocie z mieszalnikaVz (w przekroju „4”) następujący przebieg (2) funkcji programu elucji :X 1 (t) = a⋅ t + b + a⋅TA (2)Analiza równań, prowadzących do otrzymania zależności (2) w okresie,zarówno stanu ustalonego, jak i w stanie nieustalonym, sugeruje możliwośćtakiego przekształcenia programu sterowania elementami wykonawczymiurządzenia gradientowego (zaworami proporcjonującymi, lubrównolegle pracującymi pompami), aby na wlocie do kolumny otrzymywaćpożądany program elucji, zgodny z równaniem (1).W przypadku liniowego programu elucji, przebieg skorygowany programuprzedstawia się następująco:X k (t) = (at + b) + TA · a + δ(t) · TA · [b –X 1 (0)] (3)gdzie:w – objętościowe natężenie przepływu eluentu w kolumnie;δ(t) – delta Diraca;X 1 (0) – początkowa zawartość składnika B w mieszalniku Vz w czasie t=0(w praktyce wartość b), a więc ostatni składnik zależności (3) wynosi zero.W konsekwencji, gdy do programatora składu eluentu, w przypadkużądania otrzymywania liniowego programu elucji w kolumnie, zostaniewprowadzona skorygowana funkcja programu o postaci zależności (3),i, gdy jednocześnie zostanie skorygowany moment wprowadzenia próbki dokolumny o wartość opóźnienia transportowego (to = Vo/w) - to na wlocie dokolumny chromatograficznej (w przekroju „5”) powinna zostać otrzymana dokładniefunkcja programu elucji w postaci równania (1).Rysunek 2 ilustruje wyniki studiów teoretycznych dla oczekiwania liniowegoprzebiegu funkcji programu elucji w kolumnie (przy czym, wartośćΔXp na rys. 2 jest tożsama z aTA w równaniach (1) do (3)). Podobne wnioskiotrzymano także dla wybranych, nieliniowych postaci programu elucji.W konsekwencji, w myśl streszczonych tu wyników rozważań teoretycznych,142

program elucji, otrzymywany na wlocie do kolumny chromatograficznej, możebyć dokładnym odwzorowaniem postaci funkcji, która jest oczekiwana.Rysunek 2. Schematyczne wykresy, związane ze zniekształceniem i korektą liniowego programuelucji, gdy aparat chromatograficzny można modelować obiektem inercyjnym I rzędu (idealnymmieszalnikiem) o objętości Vz = V+Va. Opóźnienie transportowe pominięto. Program pożądany:X = at+b; Program skorygowany: X = at+b + (a⋅TA) ; TA = Vz/w.a – pożądany przebieg programu elucji na wlocie do kolumny chromatograficznej,a’ – rzeczywisty przebieg programu elucji (linia ciągła), otrzymany na wlocie do kolumny chromatograficznej,gdy programator wykonuje program naszkicowany linią kreskową;b – programator wykonuje program skorygowany, zgodny z linią ciągłą;b’ – przebieg programu elucji, zrealizowany na wlocie do kolumny w wyniku wprowadzenia doprogramatora programu skorygowanego „b”.CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNAZastosowano dwa różne komercyjne analityczne gradientowe chromatografycieczowe z zaworami proporcjonującymi po stronie ssącej pompy,charakteryzujące się zróżnicowanymi wartościami parametrów dynamikimieszania cieczy w przestrzeni przed wlotem do kolumny chromatograficznej.W tabeli 1 podano dla obu aparatów wartości parametrów dynamikimieszania cieczy oraz przebiegi funkcji programu elucji, wprowadzone doprogramatora. Zastępczą objętość mieszania Vz w elementach aparatu na143

drodze od zaworów proporcjonujących do wlotu do kolumny chromatograficznejoraz wynikającą z niej zastępczą stałą czasową TA (TA = Vz/w) wyznaczonometodą „0.632”.Wpływ korekty programu elucji na wartość parametrów retencji substancjirozdzielanych w warunkach elucji gradientowej badano dla wartościnatężenia przepływu w = 1,5 cm 3 /min, z zastosowaniem typowej kolumnyLichrospher RP 18 5 μm o wymiarach 125x4 mm i 250x4 mm, rozdzielającacetanilid i węglowodory aromatyczne. Zastosowano, często wykorzystywanąw praktyce, wartość gradientu stężenia ok. 4,5%/min w zakresie od 4%do 90% metanolu w wodzie. Analizowano też wpływ opóźnienia transportowego.Dzięki obecności acetonu w cieczy A (0,025% v/v) i cieczy B (0,1%v/v) otrzymywano jednocześnie chromatogramy oraz orientacyjne przebiegizmian udziału składnika B w eluencie na wylocie z kolumny.WYNIKI I WNIOSKIW badaniach zastosowane dwa różne gradientowe aparaty chromatograficzne,scharakteryzowane w tab. 1 pod względem wartości parametrówdynamiki mieszania cieczy i odpowiednich skorygowanych postaci programuelucji. Rozpatrywano trzy warianty korekty programu elucji i momentuwprowadzenia próbki do kolumny, zilustrowane na rysunku 3:a) Próbkę dozowano ignorując istnienie zarówno opóźnienia transportowego,jak i mieszania cieczy przed wlotem do dozownika (tak jak, ma tomiejsce dotychczas – rysunek 3a),b) Próbkę dozowano z opóźnieniem w stosunku momentu uruchomieniaprogramatora gradientu elucji; wielkość opóźnienia, tak dobrana, bypróbka „trafiła” w kolumnie na początek realizacji programu elucji, jednaknie korygowano programu elucji ze względu na mieszanie cieczy przedwlotem do kolumny (rysunek 3b),c) Uwzględniono obydwa efekty powodujące odchylenie programu elucji odżądanego przebiegu, tj. dozowano z uwzględnieniem opóźnienia transportowegooraz skorygowano program elucji (rysunek 3c).Tabela 1. Parametry dynamiki mieszania cieczy w aparatach wykorzystanychw doświadczeniach, których wyniki przedstawiono na rysunku 4-6i w tabeli 2 oraz 3Lp.Nazwa aparatuOpóźnienietransportoweZastępczaobjętośćmieszania cieczyPostać skorygowanegoprogramu elucji[cm 3 ] / [min] [cm 3 ] / [min] (a * t + aTA)1 LaChrom (Ap.1) 0.6 / 0.4 0.35 / 0.23 4.3 %/min * t + 1%2 Lichrograph (Ap.2) 2.4 / 1.6 1.05 / 0.7 4.3 %/min * t + 3%Vz wyznaczano metodą „0,632” [15-17].144

Rysunek 3. Szkicowe przedstawienie przebiegów programu elucji (X 2 ) na wlocie do kolumnychromatograficznej w relacji do momentu dozowania próbki:a) przy braku korekty programu elucji i nieuwzględnieniu opóźnienia transportowegob) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego, ale bez korekty programu elucji,c) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji.Linia kreskowa - pożądany przebieg programu elucji, linia ciągła - zrealizowany przebieg programuelucji, strzałką zaznaczono moment dozowania próbki. t 0 – opóźnienie transportowe.Na rysunku 3 linią kreskową zaznaczono pożądany przebieg programuelucji, linią ciągłą zrealizowany przebieg programu elucji, zaś strzałkąmoment dozowania próbki. Jak widać, przy uwzględnieniu tylko korektyopóźnienia transportowego (rysunek 3b), następuje przesunięcie programuelucji w kolumnie wzdłuż osi czasu względem momentu dozowania próbki.W przypadku całkowitej korekty (rysunek 3c) następuje także zmiana charakterufunkcji opisującej przebieg funkcji programu elucji zrealizowany nawlocie do kolumny i dostosowanie jej do pożądanego (w tym przypadku– liniowego) przebiegu. Ma miejsce usunięcie początkowego zagięcia krzywejprogramu elucji oraz eliminacja dodatkowego przesunięcia tej linii spowodowanegomieszaniem cieczy przed wlotem do kolumny.Różnice przebiegu programu elucji w kolumnie przekładają się naróżnice czasu i objętości retencji rozdzielanych substancji. Różnice objętościretencji są względnie tym większe, im większe jest opóźnienie transportowe,im większa jest wartość zastępczej stałej czasowej TA oraz im mniejsza jest145

objętość wypełnienia kolumny. Dodatkowo, przesunięcie czasu retencji jesttym większe, im mniejsze jest natężenie przepływu eluentu (w).Potwierdzają to przedstawione na rysunku 4 przykłady chromatogramówuzyskanych dla dwóch aparatów w warunkach elucji gradientowej orazzawarte w tabeli 1 wartości czasu retencji i zawarte w tabeli 3 wartości powierzchnipików, otrzymane:A. przy braku korekty programu elucji i nieuwzględnieniu opóźnienia transportowego,rysunek 3a, tabele 2 i 3 kolumna A;B. po uwzględnieniu opóźnienia transportowego, ale bez korekty programuelucji, rysunek 3b, tabele 2 i 3 kolumna B;C. po uwzględnieniu opóźnienia transportowego oraz zastosowaniu korektyprogramu elucji, rysunek 3c, tabele 2 i 3 kolumna C.Rysunek 4. Zestawienie 3-6 nałożonych chromatogramów otrzymanych w warunkach elucjigradientowej z zastosowaniem obu aparatów chromatograficznych (Ap. 1 i Ap. 2):A. przy braku korekty programu elucji i nieuwzględnieniu opóźnienia transportowego,B. po uwzględnieniu opóźnienia transportowego, ale bez korekty programu elucji,C. po uwzględnieniu opóźnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji.Pożądany program elucji X = 4,3[%/min.] * t + 4% (w zakresie 4% do 90%), ciecz A – woda,ciecz B – metanol + 0,1% acetonu, w=1,5 cm 3 /min, kolumna – Lichrospher RP 18 5 μm,125x4 mm, t = 30°C. Ap. 1 – LaChrom (Merck-Hitachi), Ap. 2 – Lichrograph (Merck-Hitachi).Rozdzielane substancje: 1 - acetanilid, 2 – benzen, 3 – toluen, 4 – o-ksylen, 5 – n-butylobenzen.146

Tabela 2. Zestawienie średnich wartości czasu retencji bez i po zastosowaniukorekty programu elucjiA) przy braku korekty programu elucji i nie uwzględnieniu opóźnienia transportowego,B) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego, ale bez korekty programuelucji,C) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego oraz zastosowaniu korektyprogramu elucji.A B CAparat: Ap. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Ap.1 Ap.2Substancja: [min] [min] [min] [min] [min] [min]Acetanilid 6,82 8,21 6,88 6,85 6,09 6,08Benzen 12,5 14,06 12,46 12,38 11,65 11,66Toluen 16,62 16,81 15,20 15,11 14,64 14,65o-ksylen 16,91 18,47 16,90 16,84 16,34 16,35n-butylo-benzen 19,51 21,37 19,45 19,41 18,99 19,01Na rys. 5 porównano chromatogramy otrzymane bez zastosowaniakorekty programu elucji i gdy w korekcie uwzględniono tylko jeden z efektów,powodujących odchylenie programu na wlocie do kolumny od zaprogramowanejpostaci.Na podstawie chromatogramów na rys. 4 i 5 oraz wartości czasu retencji,zamieszczonych w tabeli 2, widać, że czas retencji substancji rozdzielanychw warunkach elucji gradientowej różni się znacznie bez i z zastosowaniemkorekty programu elucji. Widać też, że największe znaczenie przyprzenoszeniu parametrów retencji między aparatami o różnych wartościachdynamiki mieszania, ma uwzględnienie opóźnienia transportowego, a w następnejkolejności korekta programu elucji uwzględniająca mieszanie cieczy.W przypadku gradientowego aparatu chromatograficznego z kolumnami mikropakowanymisytuacja może być odwrotna.Powyższe wyniki dobitnie też dokumentują, że bez zastosowania odpowiedniejkorekty programu elucji nie można oczekiwać zadowalającej odtwarzalnościparametrów retencji między aparatami o różnych wartościachparametrów dynamiki mieszania cieczy przed wlotem do kolumny chromatograficznej,szczególnie gdy znaczne są różnice opóźnienia transportowego.Widać też, że stosowanie w praktyce narzędzi programowych przewidującychparametry retencji na podstawie przebiegu funkcji programu elucji,wymiarów kolumny i natężenia przepływu eluentu musi być obarczone określonymbłędem, gdy nie uwzględnia się wpływu mieszania cieczy w przestrzeniprzed wlotem do kolumny chromatograficznej, a zwłaszcza wpływuopóźnienia transportowego.Można dodać, że wtedy gdy eluent A (tzn. eluent, od którego rozpoczynasię program elucji) posiada znikomą siłę elucyjną, wówczas korygowaniemomentu dozowania próbki o wartość opóźnienia transportowego niejest konieczne. Dopóki eluent ma zerową siłę elucyjną, to znaczy do czasu,gdy nie zacznie wpływać do kolumny również składnik B eluentu, rozdziela-147

ne substancje nie podlegają elucji. Wtedy wystarczy zastosować tylko korektęuwzględniającą mieszanie cieczy.Na podstawie danych w tabeli 3 widać, natomiast, że stosowanie korektyprogramu elucji ma przede wszystkim znaczenie dla otrzymywaniaoczekiwanych wartości czasu (objętości) retencji i nie ma dużego wpływu naodtwarzalność oraz powtarzalność powierzchni pików i, w konsekwencji, namożliwość przenoszenia parametrów kalibracyjnych między różnymi aparatami,gdy czułości detektora i warunki dozowania i chromatografowania sątakie same. Jedynie, gdy zastosowanie korekty programu elucji znaczniezmieni czas retencji, to można spodziewać się różnic wartości powierzchnipików i w konsekwencji wartości współczynników kalibracyjnych, szczególniedla substancji o niskich i wysokich wartościach czasu retencji.Tabela 3. Zestawienie średnich wartości powierzchni pików bez i po zastosowaniukorekty programu elucji uwzględniającej wpływ zastępczej objętościmieszania cieczy przed wlotem do kolumny oraz bez i po uwzględnieniuwpływu opóźnienia transportowego na przebieg programu elucji (prowadzącychdo otrzymywania odpowiednich chromatogramów przedstawionych narysunku 4)A) brak korekty programu elucji i nieuwzględnienie opóźnienia transportowego;B) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego, ale bez korekty programuelucji ze względu na dynamikę mieszania cieczy przed wlotem do kolumny;C) po uwzględnieniu opóźnienia transportowego oraz zastosowaniu korektyprogramu elucji eliminującej mieszanie cieczy.A B CSubstancja /AparatAp. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Ap.1 Ap.2[mVs] [mVs] [mVs] [mVs] [mVs] [mVs]Acetanilid 1067910836(157) *) 10634 107101070010640(76)(60)Benzen 266 271 (5) 264 267 (3) 263 265 (2)Toluen 631 639 (8) 651 658 (7) 662 668 (6)o-ksylen 911924(13)916 925 (9) 922 926 (4)n-butylobenzen 776 796 (20) 779 791 (12) 783 788 (5)*)– w nawiasach podano różnice otrzymanych wartości średnich powierzchni pików.Zbadano też wpływ niedokładnego wyznaczenia zastępczej objętościmieszania Vz zastosowanej do określenia skorygowanego programu elucjina uzyskiwane wartości czasu retencji. Na rysunku 5 przedstawiono chromatogramyotrzymane dla trzech programów elucji, różniących się wartościązastępczej objętości mieszania przyjętą do obliczenia korekty programu elucji,a co za tym idzie, różniących się parametrem „b” (b+aTA) w równaniuprostej opisującej program elucji wprowadzany do programatora.148

Tabela 4. Zestawienie wartości czasu retencji, zastępczych objętościmieszania, stałych czasowych oraz odpowiadające im równania skorygowanegoprogramu elucji, wykorzystane do otrzymania chromatogramów na rysunku5 (Vo = 3 ml, Vz = 1.4 ml)Chromatogramna rysunku 5A B CV 0 [cm3] / t 0 [min] 3,0 / 2,0 3,0 / 2,0 3,0 / 2,0Vz [cm3] / TA [min] 1,05 / 0,7 1,40 / 0,93 1,74 / 1,16Równanie skorygowanejfunkcji programu elucji 4,3[%/min]*t+6[%] 4,3[%/min]*t+7[%] 4,3[%/min]*t+8[%]4,3[%/min]*t + 4% [v/v]SubstancjaCzas retencji [min]1. Acetanilid 6,14 5,99 5,812. Benzen 11,71 11,56 11,333. Toluen 14,6 14,4 14,24. o-ksylen 16,3 16,1 15,85. n-butylobenzen 18,9 18,7 18,4W tabeli 4 zestawiono wartości zastępczej objętości mieszania przyjętedo korekty, odpowiadające im wartości zastępczej stałej czasowej, postaciskorygowanych równań programu elucji dla odpowiednich chromatogramówoznaczonych na rysunku 6 jako a, b, c oraz podano uzyskane czasy retencjiposzczególnych rozdzielanych substancji.Jak można zauważyć, nawet przy dość dużej zmianie zastępczej objętościmieszania, o 0,4 cm 3 , wykorzystywanej dla korygowania programuelucji, zmiany uzyskiwanych wartości czasu retencji są względnie nieduże(na poziomie ok. 0,2 min). Oznacza to, że niewielkie błędy w wyznaczaniuzastępczej objętości mieszania nie powinny poważnie pogorszyć odtwarzalnościczasu retencji.Badania wykazały niewielki, praktycznie pomijalny, wpływ sposobui stopnia korekty programu elucji na powtarzalność: czasu retencji oraz powierzchnipików, - dla tego samego aparatu, kolumny i tych samych warunkówrozdzielania. Wydaje się to oczywiste, także intuicyjnie, ponieważ charakterfunkcji programu elucji powinien mieć drugorzędny wpływ napowtarzalność otrzymywanych wartości czasu retencji oraz powierzchni pikówchromatograficznych. O powtarzalności uzyskiwania ww. parametróww warunkach kolumnowej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem programowaniaskładu cieczy decyduje przede wszystkim powtarzalność wytwarzaniaprzez aparat określonej wartości składu eluentu czy powtarzalnośćrealizacji określonej postaci programu elucji, w tym dokładnośći stabilność pracy pompy.149

Rysunek 5. Ilustracja wpływu rodzaju korekty programu elucji na czas retencji dla aparatuLichrograph. Symbolem „I” oznaczono chromatogramy otrzymane przy braku korekty programuelucji, a symbolem „II”, odpowiednio, chromatogramy:a) gdy skorygowano tylko wpływ mieszania cieczy przed wlotem do kolumny,b) gdy skorygowano tylko wpływ opóźnienia transportowego,c) gdy skorygowano oba efekty jednocześnie.Pożądany program elucji X = 5[%/min.] * t, ciecz A - woda, ciecz B – metanol + 0,1% acetonu,w = 1,5 cm 3 /min, kolumna – Lichrospher RP 18 5 μm, 125x4 mm, t = 30°C.Substancje: 1 – acetanilid, 2 – benzen, 3 – toluen, 4 – o-ksylen, 5 – n-butylobenzenRysunek 6. Ilustracja wartości wpływu zastępczej objętości mieszania przyjętej do obliczeniakorekty programu elucji na czas retencji dla aparatu Lichrograph.Pożądany program elucji X = 4,3[%/min.] *t +4% (w zakresie 4% do 90%), opóźnienie transportoweV 0 = 3 cm 3 , t 0 = 2 min, ciecz A - woda, ciecz B – metanol + 0,1% acetonu, w = 1,5 cm 3 /min, kolumna– Lichrospher RP 18 5 μm, 125x4 mm, t = 30°C.Przyjęte wartości zastępczych objętości mieszania, stałych czasowych oraz odpowiadające imrównania skorygowanego programu elucji:a – Vz = 1,05 cm 3 , TA z = 0,7 min, X = 4,3[%/min]*t+6[%],b – Vz = 1,40 cm 3 , TA z = 0,93 min, X = 4,3[%/min]*t+7[%],c – Vz = 1,74 cm 3 , TA z = 1,16 min, X = 4,3[%/min]*t+8[%],Rozdzielane substancje: 1 – acetanilid, 2 – benzen, 3 – toluen, 4 – o-ksylen, 5 – n-butylobenzen.150

Zupełnie inaczej ma się sprawa z odtwarzalnością czasu retencjiz wykorzystaniem różnych aparatów HPLC. Wykazano, że z zastosowaniemtej samej kolumny i programu elucji, parametry retencji mogą znacznie różnićsię wartości czasu (objętości) retencji, gdy nie zostanie zastosowana korektaprogramu elucji, a wartości opóźnienia transportowego i zastępcze objętościmieszania dwóch aparatów są różne.WNIOSKI KOŃCOWEStudia i badania wykonane w ramach tej pracy wykazały, że istniejeprosty sposób postępowania, zapewniający otrzymanie na wlocie do kolumnychromatograficznej, z dobrą dokładnością, takiej postaci programu elucji,jakiego żądamy. W tej pracy wykazano to dla liniowych programów elucji.Teoretyczne zasady postępowania zostały przedstawione dla liniowychi nieliniowych programów elucji w pracy [15]. Dla liniowego programu elucjizasady teoretyczne i sposób postępowania opisują i ilustrują zależności (1)do (3) oraz rys. 1 do 3.- Należy wprowadzić skorygowany program elucji do sterownika programatoraeluentu oraz uruchomić dozownik po upływie czasu określonego napodstawie doświadczalnie wyznaczonej wartości opóźnienia transportowegooraz aktualnie stosowanego natężenia przepływu eluentu.- Postępowanie takie zapewnia otrzymywanie, zarówno powtarzalnych rezultatówrozdzielania, jak i odtwarzalność wyników, w przypadku stosowaniagradientowych aparatów chromatograficznych o różnych wartościachparametrów dynamiki mieszania cieczy [15-17] (różne wartościopóźnienia transportowego (Vo) i różne wartości zastępczej objętościmieszania cieczy w przestrzeni między wylotem z programatora i wlotemdo kolumny chromatograficznej (Vz) dla różnych gradientowych aparatówchromatograficznych).- Stosowanie w praktyce opisanej tu metody korekty programu elucji maznaczenie dla uzyskiwania zgodności parametrów retencji z wartościamiprzewidywanymi teoretycznie oraz dla weryfikacji poprawności narzędzipredykcji optymalnego przebiegu programu elucji.- Korekta programu elucji powinna być przede wszystkim stosowanaw przypadku gradientowych chromatografów cieczowych wyposażonychw tzw. niskociśnieniowe systemy programowania składu eluentu (układyz zaworami proporcjonującymi po stronie ssącej pompy) oraz przy wykorzystywaniuz zastosowaniem elucji gradientowej mikrokolumn pakowanychi kapilarnych (gdy zastępcze objętości mieszania i wartości opóźnieniatransportowego są względnie wysokie).- Użytkownik aparatu chromatograficznego może dość łatwo wyznaczyćdoświadczalnie wartości parametrów opisujących dynamikę mieszaniacieczy w gradientowym aparacie chromatograficznym między wylotemz programatora a wlotem do kolumny chromatograficznej [16, 17], jednak,wartości tych parametrów powinny zostać wyznaczone i podawane przezproducenta aparatu chromatograficznego.151

ZNACZENIE SYMBOLIa, b - współczynniki w liniowym programie elucji gradientowej (X = AT + b),t - czas, wyrażony w [s] albo [min],t 0 , To - opóźnienie transportowe, wyrażone w [s], albo [min],TA - zastępcza stała czasowa mieszalnika i aparatu, modelowana pojedynczymelementem inercyjnym I rzędu, [s] albo [min],Vo - opóźnienie transportowe wyrażone w [cm 3 ],Vz - zastępcza objętość mieszania w mieszalniku i aparacie chromatograficznymmodelowanym elementem inercyjnym I rzędu, wyrażonaw [cm 3 ],w - objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej przez kolumnęchromatograficzną, wyrażone w [cm 3 /min],X, X 1 - stężenie objętościowe składnia B, C, … w eluencie, wyrażone jakoudział objętościowy [v/v] (ułamek objętościowy), albo [% v/v](procent objętościowy).LITERATURA1. Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L., “Practical HPLC Method Development”, Willey, New York, NY, 1998.2. Dolan J.W., LC-GC 5 (1987) 950.3. Dolan J.W., LC-GC- 6 (1988) 388.4. Snyder L.R., Dolan J.W., LC-GC 8 (7) (1990) 524.5. Quarry M.A., Grob R.L., Snyder L.R., J. Chromatogr. 285 (1984) 1.6. Jandera P., Churacek J., “Gradient Elution in Column Liquid Chromatography”,Elsevier, Amsterdam, 1985.7. Dolan J.W., LC-GC INT. 8(1) (1995) 1.8. Dolan J.W., LC-GC INT, 8(7) (1995) 1.9. Dolan J.W., LC-GC INT, 9(1) (1996) 1.10. Dolan J.W., LC-GC INT, 9(5) (1996) 1.11. Engelhardt H., Arangio M., Lobert T., LC-GC-INT. 10(12) (1997) 803.12. Engelhardt H., Ah G. r, Chromatographia, 14 (1981) 227.13. Sjödahl J., Lundin H., Eriksson R., Ericson J., Chromatographia 16(1982) 325.14. Dolan J.W., Snyder L.R., “Troubleshooting LC Systems”, HumanaPress, Clifton, New York, 1989.15. Kamiński M., Kandybowicz B. and Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 292(1984) 85.16. Kamiński M., Kandybowicz B., Szukalski J., Chem. Anal. (Warsaw) 38(1993) 237.17. Kamiński M., Kandybowicz B., Proceedings of 11 th International Symposiumon Column Liquid Chromatography, Amsterdam, 1987.152

Mariusz S. KUBIAK 1 , Magdalena POLAK 2 , Paweł PISZCZ 31Katedra Procesów i Urządzeń Przemysłu Spożywczego, Wydział Mechaniczny,23Politechnika Koszalińska, KoszalinKatedra Towaroznawstwa i Badań Żywności, Wydział Nauki o Żywności,Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, OlsztynInstytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej, Wydział Nauk Ścisłych, Akademia Podlaska, SiedlceOZNACZANIE POZIOMU ZAWARTOŚCI B(a)PW RYNKOWYCH PRZETWORACH MIĘSNYCHZ WYKORZYSTANIEM HPLCZagadnienia związane ze skażeniem środowiska naturalnego oraz zanieczyszczeniamiartykułów rolno-spożywczych wzbudzają zainteresowanie społeczeństwajuż od kilku lat. W związku ze wzrostem uprzemysłowienia w ciągu ostatnich kilkudekad, ilość związków chemicznych, wprowadzonych do środowiska naturalnegoprzez człowieka, osiągnęła ogromne rozmiary.WSTĘPSzacuje się, że w środowisku występuje obecnie ponad 100 000 ksenobiotyków,które nie występowały w nim wcześniej [2, 22]. Zatem w codziennymżyciu organizm ludzki jest narażony na działanie tysięcy substancjichemicznych, które są wytworem naturalnych procesów, jak również działalnościczłowieka. Niektóre z nich są korzystne dla zdrowia (na przykład główneskładniki żywności), ale wiele innych może wpływać negatywnie, pogarszającjakość i bezpieczeństwo życia [7, 33].Prowadzona edukacja w środkach masowego przekazu i dotycząca szczególniezagrożenia zdrowia związanego ze spożyciem żywności skażonej mikrobiologicznieczy chemicznie sprawiła, że w konsumenckiej ocenie artykułówrolno-spożywczych brane są pod uwagę nie tylko walory użytkowe,sensoryczne, higieniczne czy estetyczne, ale i zawartość substancji obcychw produkcie, mogąca zagrażać bezpieczeństwu zdrowia [6]. Podawaneinformacje sprawiają, że w konsumenckiej ocenie artykułów rolno--spożywczych została zdefiniowana kolejna cecha, na którą przeciętny konsumentzaczął zwracać uwagę.Wykrywanie dużego poziomu w różnych elementach środowiskazwiązków pogarszających jakość życia pogłębia zakres prowadzonych badańnad ich dopuszczalnym stężeniem. Z uwagi na to, że zdrowie społeczeństwajest największym dobrem, coraz większego znaczenia nabierajączasowo-przestrzenne badania monitoringowe poziomu kontaminantów zarównow artykułach rolno-spożywczych, jak i w paszach dla zwierząt. Pozwalająone na ustalenie zarówno pochodzenia skażeń chemicznych, jaki ich przyczyn, co umożliwia skuteczne zapobieganie zagrożeniom bezpieczeństwazdrowia konsumentów oraz zwierząt hodowlanych [33, 38].153

Do związków tej grupy należą metale ciężkie, trwałe zanieczyszczeniaorganiczne, w tym węglowodory chloroorganiczne, dioksyny, polichlorowanebifenyle, a także wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA).Najczęściej stosowane są dwie techniki chromatograficzne: chromatografiagazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS) oraz wysokosprawnachromatografia cieczowa z detekcją fluorescencyjną (HPLC/FLD).Celem pracy było oznaczenie benzo(a)pirenu w wybranych rynkowych przetworachmięsnych poddanych różnym metodom wędzenia i określeniepoziomu zanieczyszczenia. Przygotowanie próbki do oznaczenia benzo(a)pirenuw rynkowych przetworach mięsnych wędzonych obejmowałoekstrakcję frakcji lipidowej, zastosowanie techniki SEC do wydzielenia węglowodorówz tłuszczu i techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowejz detekcją fluorescencyjną (HPLC/FLD).Jednym z głównych źródeł WWA są paliwa kopalniane – węgiel i ropanaftowa, z których są uwalniane. Powstają także w czasie wytwarzaniaenergii w elektrowniach i elektrociepłowniach. Drugim istotnym źródłem emisjido atmosfery są gazy spalinowe transportu samochodowego, jak równieżdymy z kotłowni, urządzeń grzewczych i zakładów przemysłowych, w szczególnościprzemysłu ciężkiego, hut, koksowni i tym podobnych.Policykliczne węglowodory występują w powietrzu w formie par lub skondensowanesą na cząsteczkach pyłów. W zależności od warunków atmosferycznychmogą się przemieszczać na znaczne odległości od źródeł emisjii sprzyjać imisji WWA nawet na terenach słabo zindustrializowanych lubtypowo rolniczych. Zazwyczaj cięższe wielopierścieniowe węglowodory(o masie cząsteczkowej powyżej 228 u) są przenoszone wraz z pyłami.Opadające z atmosfery pyły i kondensujące na powierzchni związki mogązanieczyszczać surowce rolno-spożywcze, wodę i glebę [2, 33].Wśród węglowodorów zanieczyszczających atmosferę przeważają alifatyczne(nasycone i nienasycone) oraz aromatyczne, o małej masie cząsteczkowej[24]. Alkeny i dieny w zakresie temperatur 500-800 o C typowychdla rozkładu termicznego (w szczególności w warunkach ograniczonego dostęputlenu) mają tendencję do rodnikowej polimeryzacji, tworząc wielopierścieniowewęglowodory aromatyczne. Uwolnione do atmosfery policyklicznewęglowodory występują w postaci par lub ulegają adsorpcji na powierzchnipyłów: sadza i lotne popioły [16, 32].Żywność i surowce rolne mogą być nie tylko zanieczyszczone policyklicznymiwęglowodorami pochodzącymi ze środowiska produkcji rolnej, ale równieżw wyniku procesów termicznych utrwalania i przygotowywania do spożycia,m.in.: heterocykliczne aminy aromatyczne, wielopierścieniowewęglowodory aromatyczne czy akrylamidu.Znane od tysięcy lat procesy utrwalania żywności poprzez suszenie,wędzenie, pieczenie na ogniu czy też suszenie bezprzeponowe gazami spalinowymi,mogą zanieczyszczać produkty spożywcze znacznymi ilościamiWWA [10, 11, 26]. Piśmiennictwo dotyczące obecności WWA w żywnościjest bardzo bogate i obejmuje różnorodne aspekty występowania tychzwiązków w żywności. Na podstawie piśmiennictwa w tabeli 1 przedstawione154

zostały źródła i przyczyny zanieczyszczenia przez WWA produktów rolnospożywczych[16].Tabela 1. Źródła i przyczyny zanieczyszczenia żywności przez WWA[16, 21, 22, 38]rodzaj skażeniaźródłoprzenoszoneprzezrodzaj żywnościśrodowiskoegzogenneprzemysłogrzewaniewytwarzanie energiitransportspalanie odpadówpożary lasów, wybuchy wulkanówzanieczyszczenia pozostałościamipaliw i/lub olejów mineralnychpowietrzewodaglebawarzywaowocezbożarośliny oleisteryby i inne owocemorzaśrodowiskoendogennezabiegi technologiczneegzogenneobróbka żywnościendogennabiosynteza w roślinachbiosynteza mikroorganizmówwędzeniepieczenie na ruszcie, grillowaniesuszenie bezprzeponowepalenie kawyekstrakcja rozpuszczalnikamiwoski, parafiny stosowanedo opakowań, oleje mineralnepreparaty uszczelniające do rurwodociągowychwysokotemperaturowa obróbkażywności−dym, powietrzerozpuszczalniki,woski parafinowesmoły paki−warzywawędzona żywnośćpieczona żywnośćsuszona żywnośćpalona kawaoleje i tłuszcze roślinneserywoda pitnażywność wstępnieprzetworzonaBudowa przestrzenna wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznychma charakter planarny. Badacze przypisują aktywność biologicznąniektórym regionom i pozycjom atomów węgla w cząsteczce WWA. Odnosisię to w szczególności do regionu K (zewnętrzny narożnik pierścienia fenantrenowego)oraz regionu M (para przeciwstawnych atomów pierścieni antracenowych)oraz usytuowania regionu „zatoki”, co zostało przedstawione narys. 1.Rysunek 1. Budowa benzo[a]pirenu oraz miejsca regionów o biologicznej aktywności [10, 11]155

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne stanowią grupę ksenobiotyków,pośród których wiele przejawia właściwości toksyczne, genotoksyczne,mutagenne i rakotwórcze [3, 21].WWA zbudowane są z dwóch lub więcej skondensowanych pierścieni aromatycznych.Nie należą do związków o tak wysokiej trwałości w środowisku,jak chlorowane węglowodory (dioksyny, furany i polichlorowane bifenyle).W obecności światła i tlenu ulegają reakcjom fotochemicznym z utworzeniemdioli, chinonów i aldehydów.Najlepiej poznanym węglowodorem z grupy WWA w środowiskui żywności jest benzo[a]pirenu (B[a]P), co przyczyniło się do traktowania gojako wskaźnika występowania innych kancerogennych węglowodorów [12,13, 14]. Tendencja traktowania tego węglowodoru jako wskaźnikowego zostałautrzymana w pracach poświęconych opracowaniu współczynnikówrównoważnej toksyczności i stanowi swoisty pomost między badaniamiw dobie współczesnej. W badaniach WWA w środowisku, istotnym ograniczeniembyły dostępne techniki analityczne, a w szczególności techniki separacjii rozdziału WWA.Międzynarodowa Agencja do Badań nad Rakiem (IARC) gromadzi informacjeo właściwościach biologicznych WWA [1, 2, 12, 25]. AmerykańskaAgencja Ochrony Środowiska (EPA) na podstawie zebranych informacji utworzyłalistę 16 WWA najczęściej oznaczanych w próbkach pobranych ze środowiskaoraz w próbkach żywności [28]. Osiem z nich ma udowodnione właściwościbiologiczne wpływające na zdrowie człowieka [8, 6, 13, 19, 23, 25].Od szeregu lat stosuje się w badaniach policyklicznych węglowodorówkoncepcję analizy zaproponowanych przez amerykańską AgencjęOchrony Środowiska 16 WWA [6, 12, 13]. Jednak ze względu na ograniczeniazwiązane między innymi z kosztami zakupu i wykorzystywania wzorcówpodczas analiz, powoduje oznaczanie tylko jednego (B[a]P) lub wybranychWWA.Wyznaczono najwyższe dopuszczalne poziomy zawartości benzo(a)pirenuw niektórych środkach spożywczych zawierających tłuszczei oleje oraz w żywności wędzonej [37]. Według Rozporządzenia Komisji(WE) nr 1881/2006 z dnia 19 grudnia 2006 roku, które określa najwyższedopuszczalne poziomy zanieczyszczeń w środkach spożywczych, zawartośćB[a]P w produktach mięsnych wędzonych, tkance mięśniowej ryb wędzonych,skorupiakach nie może przekraczać 5,0 µg·kg -1 , a w olejach jadalnychnie powinna być wyższa niż 2,0 µg·kg -1 , natomiast w produktach dla dzieci1 µg·kg -1 . Regulacje UE limitują również zawartości benzo(a)pirenu – B[a]Pi benz(a)antracenu – B[a]A w preparatach dymów wędzarniczych, którychzawartość nie może przekraczać odpowiednio 10 µg·kg -1 dla B[a]Pi 20 µg·kg -1 dla B[a]A [18, 19, 23, 25, 27, 31].Ważnym aspektem jest stwierdzenie, że rozwój metodyki badań nadzawartością WWA miał charakter prekursorski w rozwoju analizy śladowejw żywności. Metody oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów w różnorodnychmatrycach żywności zostały omówione w szeregu pracach przeglądowych,a matryce żywnościowe z punktu widzenia analitycznego cha-156

akteryzują się bardzo wysokim stopniem trudności w porównaniu ze środowiskowymi(woda, osady, gleba).Metody analityczne oznaczania tej grupy związków wymagają szczególnejprecyzji. Są czasochłonne zwłaszcza na etapie izolacji i oczyszczeniapróbek z substancji utrudniających ich oznaczanie [20]. Ze względu na poziomśladowy występowania WWA w żywności wędzonej oraz ich skomplikowanetechniki, wiarygodnego oznaczania jakościowego i ilościowego,analiza WWA obejmuje identyfikację i oznaczanie ilościowe poszczególnychzwiązków wyłącznie metodami chromatograficznymi [9, 17]. W analizieWWA stosowane są najczęściej dwie techniki chromatograficzne: chromatografiagazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS) oraz wysokosprawnachromatografia cieczowa z detekcją fluorescencyjną (HPLC/FLD).W rozporządzeniu WE nr 333/2007 z 28 marca 2007 uzupełnionymDyrektywą Komisji nr 2005/10/WE z dnia 4 lutego 2005 roku znalazły sięwymagania i kryteria sprawności, jakie muszą spełniać metody analitycznedla oznaczanych związków WWA. Należą do nich, między innymi:• specyficzność metody;• granica wykrywalności nie mniejszej niż 0,3 µgٕ·kg -1 ;• granica oznaczalności nie mniejszej niż 0,9 µgٕ·kg -1 ;• odzysk w zakresie 50-120%.Metody oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznychw matrycach żywnościowych stanowią problem z powodu tego, że mającharakter lipofilny. W celu wyodrębnienia frakcji WWA z matryc zawierającychtłuszcz stosuje się hydrolizę w środowisku zasadowym za pomocąmetalonolowego roztworu KOH, wielokrotne ekstrakcje ciecz-ciecz lub ciecz--ciało stałe [20]. Inną metodą wyodrębniania wielopierścieniowych węglowodorówaromatycznych z matryc żywnościowych jest ekstrakcja za pomocąditlenku węgla w stanie nadkrytycznym. Metodą przygotowania próbek doanalizy jest preparatywna chromatografia wykluczania sterycznego (SEC).Jest to metoda względnie szybka i prosta [4, 17, 20, 35, 36, 37].Technika oznaczania WWA z wykorzystaniem HPLC z detektoremfluorescencyjnym charakteryzuje się niższą granicą wykrywalności tej grupyzwiązków. Analizę wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych zapomocą HPLC prowadzi się w układzie faz odwróconych. Fazę ruchomąstanowią zwykle acetonitryl i woda lub metanol i woda z wykorzystaniemgradientu stężeń lub warunków izokratycznych [17, 20, 35, 36, 37].METODYKAMateriał do badań stanowiły rynkowe wędzone przetwory mięsnepoddane przemysłowym i tradycyjnym technikom wędzenia. Badane próbkipodzielono na dwie grupy asortymentu: wędzonki, kiełbasy wędzone.Dla oznaczania B[a]P stosowano następujące odczynniki i wzorce:Acetonitryl (ACN), dichlorometan (DCM), chloroform i metanol - (HPLC) firmyLabscan (Dublin, Ireland), Benzo(b)chryzen – B[b]Ch Dr firmy EhrenstorforGMBH (10 ng·µL -1 ACN), Benzo(a)piren - B[a]P Standard Reference Ma-157

terial 1647d-NIST (4,91 µg·mL -1 ). Pozostałe odczynniki były klasy „czysty doanaliz”. Woda z systemu Milli-Q (Millipore, Bedford, USA). Dla ilościowejanalizy B[a]P stosowano mieszaninę wzorców i standardu wewnętrznegow acetonitrylu o stężeniu: B[a]P (49,1 ng·mL -1 ) i B[b]Ch (50 ng·mL -1 ) orazroztwór wzorca wewnętrznego B(b)Ch w acetonitrylu o stężeniu 50 ng·mL -1 .Aparatura wykorzystana podczas przeprowadzania analizDo izolacji frakcji węglowodorowej z wyekstrahowanego tłuszczu zastosowanochromatograf preparatywny z automatycznym dozownikiem próbekASI-100, gradientową pompę chromatograficzną wraz z odgazowywaczemP-580, detektor fotometryczny z matrycą diodową UVD-340S,uniwersalny łącznik chromatograficzny UCI-100 (DIONEX-SOFTRON, Germering,Niemcy), kolektor frakcji Foxy Jr. Fraction Collector (Isco, Lincon,USA), kolumna wykluczania sterycznego – Plgel na złożu PS/DVB, 5 µm,50 Å, 600x7.8 mm i.d., wraz z przedkolumną (Polymer Laboratories,Amherst, USA). Przebieg analiz kontrolowany był przez program Chromleonv. 6.20 (DIONEX-SOFTRON, Germering, Niemcy).Do oznaczania ilościowego B[a]P wykorzystano chromatograf analitycznyAgilent seria 1100 wyposażony w próżniowy odgazowywacz próbekG-1322A, automatyczny dozownik próbek G-1313A, pompę czterokanałowąG-1311A, termostat kolumny G-1316A, detektor fluorymetryczny z możliwościąprzemiatania widm G-1321A (Agilent Technologies, Palo Alto, USA),kolumnę z przedkolumną Hypersil Green PAH, 5 µm, 250x3 mm i.d. (ThermoElectron Corporation, Runcorn, USA). Przebieg analiz kontrolowany byłprzez program Chem Station LC 3D (Agilent Technologies, Palo Alto, USA).Procedura analityczna według której wykonywane były oznaczeniaDo szklanych probówek odważano 1 g uprzednio zhomogenizowanejpróbki, dodawano wzorca wewnętrznego 100 µL B[b]Ch (50 ng·mL -1 ), a następnie1,5 mL metanolu. Próbki wytrząsano za pomocą mieszadła typu Vortexprzez 1 minutę, następnie dodawano 3 mL chloroformu i 1,5 mL wody.Całość wytrząsano ponownie przez 3 minuty, a następnie wirowano przez10 minut przy 10 000 obrotów/minutę. Roztwór chloroformowy zawierającyfrakcję lipidową WWA sączono do probówki (10 mL) przez bibułę Whatmannr 4. Próbkę ponownie ekstrahowano 3 mL chloroformu, wytrząsano za pomocąmieszadła typu Vortex przez 3 minuty, następnie wirowano przez10 minut przy 10 000 obrotów/minutę. Frakcję chloroformową ponownie filtrowanoprzez sączek. Połączone frakcje chloroformowe odparowywano dosucha w strumieniu azotu w łaźni wodnej (40 o C). Pozostałość rozpuszczanow 4 mL dichlorometanu. Tak przygotowane ekstrakty próbek poddawanooczyszczaniu z wykorzystaniem chromatografii preparatywnej wykluczeniasterycznego (SEC), [34, 35, 36].Etap oczyszczania z wykorzystaniem chromatografii preparatywnej wykluczeniasterycznego (SEC) wykonano w warunkach izokratycznych z zastosowaniemfazy ruchomej - dichlorometanu (DCM) o prędkości przepływu1 mL·min -1 . System detekcji stanowił detektor UV dokonujący pomiaru przy158

długości fali λ = 254 nm. Przygotowany ekstrakt próbki w dichlorometanie400 µL poddano oczyszczaniu. Eluent zbierano w kolektorze frakcji, a następnieodparowywano do sucha w strumieniu azotu w łaźni wodnej (40 o C).Suchą pozostałość rozpuszczano w 200 µL ACN [34, 35, 36]. Tak przygotowanepróbki nanoszono na kolumnę chromatograficzną aparatu HPLC/FLD.Oznaczanie B[a]P wykonywano stosując program gradientowy fazyruchomej woda/acetonitryl. Próbkę nanoszono przy składzie fazy ruchomej(50:50 v:v), (tab. 2). Stężenie acetonitrylu w ciągu 20 min wzrastało do100%, które utrzymywano przez 15 minut, a następnie powracano do warunkówpoczątkowych (50:50 v:v), [34, 35, 36]. Prędkość przepływu fazy ruchomejwynosiła 0,8 mL·min -1 , temperatura: 25 o C. Objętość nanoszonejpróbki stanowiło 20 µL. Kolumnę termostatowano w temperaturze 25 o C. Napodstawie czasów retencji dla B[a]P i B[b]Ch ustalono optymalne warunkipracy detektora fluorescencyjnego:B[a]P – λ ex 256 nm, λ em 446 nm;B[b]Ch – λ ex 295 nm, λ em 410 nm.Tabela 2. Program gradientowy fazy ruchomej (H 2 O/ACN)Czas [min] ACN [%] Woda [%]0 50 5020 100 035 100 045 50 50Zawartości B[a]P - benzo(a)pirenu obliczono wg poniższego wzoru:CB[a]P=AB[a]PAis⋅ M ⋅ kgdzie:C B[a]P - zawartość benzo(a)pirenu w próbce [µg·kg -1 ];A B[a]P - powierzchnia piku benzo(a)piranu [jednostki detektora];A is - powierzchnia piku standardu wewnętrznego [jednostki detektora];M - stężenie dodanego wzorca [µg·kg -1 ];k - współczynnik korekcyjny.WYNIKI I DYSKUSJAW tabeli 3 zestawione zostały wyniki oznaczeń poziomu zawartościB[a]P oznaczanego w badanych przetworach mięsnych w zależności od metodywędzenia (przemysłowe i tradycyjne).159

Tabela 3. Średnia zawartość B[a]P [µg·kg -1 ] w badanych wędzonych przetworachmięsnychwędzenie przemysłowewędzenie tradycyjneB[a]P [µg·kg -1 ] Liczba próbek Udział próbek [%] Liczba próbek Udział próbek [%]poniżej 0,30 52 37,14 33 21,15od 0,3 do 0,99 31 22,14 40 25,64od 1,0 do 2,99 19 13,57 25 16,02od 3,0 do 4,99 24 17,14 30 19,23powyżej 5,00 14 10,00 28 17,94∑ 140 100,00 156 100,00Spośród 140 próbek przetworów mięsnych wędzonych w warunkachprzemysłowych obecność benzo(a)pirenu powyżej określonego limitustwierdzono w 10% próbek (tj. w 14 próbkach). Próbki, w których stwierdzonoprzekroczenie dopuszczalnej maksymalnej zawartości B[a]P to wyrobyokreślane mianem boczek wiejski (przemysłowa metoda wędzenia) i szynkaz beczki (tradycyjna metoda wędzenia). Zawartość B[a]P większości próbekbyła w przedziale 0,30 ÷ 3,00 µg·kg -1 . Średnie zawartości B[a]P w wędzonychproduktach wynosiły kolejno 37,14% (0,30 ÷ 1,00 µg·kg -1 ), 13,57%(1,00 ÷ 3,00 µg·kg -1 ) i 17,14% (3,00 ÷ 5,00 µg·kg -1 ) i mieściły się w granicachmaksymalnej dopuszczalnej zawartości tego związku (5,00 µg·kg -1 ) określonejw Rozporządzeniu Wspólnoty Europejskiej.Przetwory mięsne z wędzenia tradycyjnego odznaczały się o wielewyższym udziałem zawartości B(a)P w poszczególnych przedziałach określonychprzez autorów. Około 18% przebadanych wyrobów z wykorzystaniemtradycyjnej metody wędzenia stanowiły próbki z zawartością B(a)P powyżej5,00 µg·kg -1 , granicy maksymalnej dopuszczalnej zawartościokreślonej w normach i Rozporządzeniu Wspólnoty Europejskiej.Na rysunku 2 przedstawiony został procentowy rozkład średniego poziomuzanieczyszczenia B[a]P badanych grup wędzonych przetworów mięsnych.160

Liczba próbekRysunek 2. Rozkład poziomu skażenia B[a]P w badanych grupachwędzonych przetworów mięsnychCiecierska i Obiedziński (2007) w badaniach nad wpływem wędzeniana zawartość 15 WWA w produktach mięsnych stwierdzili, że produkty poddanewędzeniu tradycyjnemu odznaczały się wyższym poziomem zanieczyszczeniaWWA [5]. Niższym poziomem zanieczyszczenia związkamiWWA odznaczały się produkty, które zostały poddane wędzeniu w sposóbprzemysłowy. Autorzy wykazali, że wyroby poddane zarówno wędzeniu tradycyjnemu,jak i przemysłowemu, odznaczają się zawartością benzo(a)pirenuistotnie niższą od dopuszczalnego limitu: 5,00 µg·kg -1 , ustalonegow Rozporządzeniu Komisji UE nr 208/2005 dla grupy produktówmięsnych wędzonych. Średnia zawartość B[a]P w części środkowej w poszczególnychproduktach: szynki, polędwice parzone, kiełbasy średnio rozdrobnione,była poniżej 0,30 µg·kg -1 . Część zewnętrzna również nie zawierałaB[a]P powyżej dopuszczalnego limitu i wynosiła średnio 0,43 µg·kg -1 .Natomiast w badaniach własnych otrzymaliśmy wyższe poziomy, co możebyć spowodowane odmiennym sposobem wędzenia, gdzie wykorzystanosystem wędzenia dymem gęstym.W badaniach przeprowadzonych przez Jira (2004) i Jankowskiego(2004) koncentracja B[a]P w szynkach wędzonych została wykazana na poziomie0,61÷0,96 µg·kg -1 , co wskazuje, iż limity dopuszczalnej zawartościB[a]P nie są w żaden sposób przekraczane i świadczy to o bezpieczeństwieżywności wędzonej [15, 17]. Co również wskazuje na możliwość wykorzystaniałagodniejszego dymu wędzarniczego i zadanych parametrów wędzenia.Rysunek 3 przedstawia przykładowe najwyższe średnie poziomyB[a]P w próbkach z każdej grupy asortymentu. Na chromatogramie (a)przedstawiony został rozdział węglowodorów aromatycznych z roztworuwzorcowego. Kolejne chromatogramy (b) i (c) obrazują najwyższe średnie161

zawartości B[a]P w grupie produktów: wędzonki i kiełbasy wędzone w warunkachprzemysłowych. Dla przetworów wędzonych z wykorzystaniem metodtradycyjnych podczas procesu wędzenia najwyższą średnią zawartość,jaką uzyskano dla oznaczanego związku (9,76 µg·kg -1 ) przedstawiono nachromatogramie (d) szynka z beczki. Pozostałe wyroby wędzone z wykorzystaniemmetody utrwalania (wędzenia) odznaczały się zawartością poniżejdopuszczalnego limitu 5,00 µg·kg -1 .7,46 µg·kg -1162

4,50 µg·kg -19,76 µg·kg -1Rysunek 2. Przykładowe chromatogramy oznaczania zawartości B[a]P (a)-wzorzec; (b) - boczekwiejski - grupa wędzonki (przemysłowa metoda wędzenia); (c) chłopska - grupa kiełbasy(przemysłowa metoda wędzenia); (d) - szynka z beczki (tradycyjna met. wędzenia).W ogólnym ujęciu oznaczeń wykonanych dla zawartości B(a)P dla wyrobówz produkcji przemysłowej, aż 90% stanowią produkty (wędzonki i kiełbasywędzone) poniżej dopuszczalnego limitu ustalonego w Rozporządzeniu163

Komisji UE nr 208/2005 [29, 30] dla grupy produktów mięsnych wędzonych.Jedynie 10% stanowiły produkty przekraczające ten limit. Metody tradycyjnegowędzenia wprowadzają w większym stopniu zanieczyszczenia z grupyzwiązków WWA, aż 18% wszystkich wyrobów przekraczały dopuszczalnylimit.PODSUMOWANIEZmienność zawartości benzo(a)pirenu w wędzonych przetworachmięsnych poddanych analizom może wynikać przede wszystkim z zastosowanejtechnologii oraz zadanych parametrów procesu wędzenia oraz kontrolowaniaich podczas przebiegu procesu. Kolejnym powodem różnic związanychz zawartością związków WWA opisanych w wielu publikacjach jestm.in. rodzaj zastosowanego drewna do wytworzenia dymu, użyte zioła dlapodniesienia walorów smakowych gotowego produktu.Otrzymane wyniki analiz wskazują, że właściwie realizowany proceswędzenia oraz możliwości rozwiązań technicznych przyczyniają się do zminimalizowaniapotencjalnych zagrożeń względem poziomu zawartości B[a]Pw wędzonych przetworach mięsnych.Stosowane w metody analityczne pozwalają na oznaczenie bardzo niskiegopoziomu zanieczyszczenia B[a]P tego typu produktów. Wśród przebadanychwędzonych przetworów mięsnych, wymogi określone w RozporządzeniuWE nr 333/2007 z 28 marca 2007 roku spełniało aż 90,0%z produkcji przemysłowej i 82,0% z produkcji tradycyjnej, co świadczy o prawidłowoprzeprowadzonych procesach podczas wędzenia, jak równieżo bezpieczeństwie żywności wędzonej na polskim rynku. Jednak pozostałyodsetek wyrobów zarówno z produkcji przemysłowej, jak i tradycyjnej możestanowić powód do monitorowania wyrobów wędzonych i poprawy warunkówoperacji wędzenia. Zminimalizuje to zagrożenie związkami powstającymiw procesie utrwalania żywności, jakim jest wędzenie.LITERATURA1. ACGIH, (1998): Threshold limit values for chemical substances andphysical agents and biological exposure indices. American Conferenceof Govermental Industrial Hygienists. Cinccinnati, OH.2. Adonis M., Gil L., (2000): Polycyclic aromatic hydrocarbons level andmutagenicity of inhalable particulate matter In Santiago, Chile. InhalationToxicology. Vol. 12, no. 12. 1173-1183.3. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). PublicHealth Statement. Polycyclic aromatic hydrocarbons. Atlanta 1990.4. Christie W.W., Christie W.W. (Ed.), (1993): Preparation of lipid extractsfrom tissues. Advances in Lipid Methodology – Two. (edited by, OilyPress, Dundee). 195-213.164

5. Ciecierska M., Obiedziński M., (2007): Influence of smoking process onpolycyclic aromatic hydrocarbons’ content in meat products. Acta ScientiarumPolonorum, Technologia Alimentaria. 6 (4), 17-28.6. Codex Committee on Food Additives and Contaminants (CCFAC),(2005): Discussion paper on polycyclic aromatic hydrocarbons contamination.37 th Session, The Hague, the Netherlands.7. Dutkiewicz T.: Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne w środowiskuprzyrodniczym. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa1988.8. Environmental Protection Agency (EPA) of the United States of America,Compedium Method TO-13, EPA, Cincinnati, OH, USA,(http://www.epa.gov/epahome/index), 1981.9. Garcia Falcon M.S., Gonzales Amigo S., Lage Yusty M.A., Lopez deAlda Villaizan M.J., Simal Lozano J., (1996): Enrichment of benzo(a)pyrenein smoked food products and determination by highperformanceliquid chromatography-fluorescecs detection, Journal ofChromatography A. 753, 207-215.10. Guillen M.D., Sopelana P.: Polycyclic aromatic hydrocarbons in diversefoods. Reviews on Environmental Health. 1997, vol. 12, 133-146.11. Guillen M.D., Sopelana P.: Polycyclic aromatic hydrocarbons in diversefoods. Food Safety: contamination and Toxins. Ed. D’Mello J. P. F.1999, 175-198.12. IARC, (1983): Monographs on the Carcinogenic Risk of Chemicals toHumans vol. 32. Polynuclear Aromatic Compounds. Part 1. Chemical,Environmental and Experimental Data. Lyon.13. IARC, Monographs, vol. 83/2009, www.monographs.iarc.fr/2009.14. IARC, International Agency for Research on Cancer; Monographs onthe evaluation of carcinogenic risk of the chemical to man. Certain polycyclicaromatic hydrocarbons and heterocyclic compounds. Lyon France.1973, 2.15. Jankowski P.S., (2004): Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbonscontamination in chooses group foodstuff. PhD’s dissertation. GdyniaMaritime University, Poland.16. Jenkins B.M., Jonem A.D., Turn S.Q., Williams R.B., (1996): Emissionfactors for polycyclic aromatic hydrocarbons from biomass burning. EnvironmentalScience and Technology. vol. 30, no. 8, 2462-2469.17. Jira W., (2004). A GC/MS method for the determination of carcinogenicpolycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat products and liquidsmokes. European Food Research and Technology, 218, 208-212.18. Jira W., Dijnovic J., (2008). PAK in kaltgeraucherten serbische Fleischerzeugnissen.Fleischwirtschaft. 5, 114-120.19. Jira W., Ziegenhals K., Speer K., (2006): PAK in geräucherten Fleischerzeugnissen.Untersuchungen nach den neuen EU-Anforderungen.Fleischwirtschaft 86(10), 103-106.20. Lage Yusty M.A., Cortizo Daviňa J.L., (2005): Supercritical fluid extractionand high-performance liquid chromatography-fluorescence detec-165

tion method for polycyclic aromatic hydrocarbons investigation in vegetableoil. Food Contamination. 16, 59-64.21. Larsen J.C., Meyland I., Olsen M., Tritscher A.: Polycyclic aromatic hydrocarbons.Summary and conclusions of the sixty-fourth meeting of theJoin FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA).JECFA/64/SC. 2005, 32-38.22. Larsson B.: Polycyclic aromatic hydrocarbons in Swedish foods. Aspectson analysis, occurrence and intake. Praca doktorska. Uppsala1986.23. Meador J.P., Sommers F.C., Ylitalo G.M., Sloan C.A. (2006): Alteredgrowth and related physiological responses in juvenile chinook salmon(Oncorhynchus tshawytscha) from dietary exposure to polycyclic aromatichydrocarbons (PAHs). Canadian Journal of Fisheries and AquaticSciences, 63:2364-2376.

34. Węgrzyn E., Grześkiewicz S., Popławska W., Głód B.K., (2005): Modifiedanalytical method for polycyclic aromatic hydrocarbons, using secfor sample preparation and RP-HPLC with fluorescence detection. Applicationto different food samples, Acta Chromatography, 17. 233-249.35. Węgrzyn E., Grześkiewicz S., Popławska W., Głód B.K., (2006): ImprovedRP-HPLC Assay and Preparative SEC for the Analysis of EightCarcinogenic PAH in edible oils, Tłuszcze Jadalne. T. XLI. nr 1/2. 53-64.36. Węgrzyn E., Grześkiewicz S., Popławska W., Głód B.K., (2007): Validationand estimation of uncertainty for the determination of PAHs usingRP-HPLC with fluorescencje detection and SEC for sample preparation.Tłuszcze Jadalne. T. XLII. nr 1/2. 61-71.37. Yurchenko S., Mölder U., (2005): The determination of polycyclic aromatichydrocarbons in smoked fish by gas chromatography mass spectrometrywith positive-ion chemical ionization. Journal of Food Compositionand Analysis. 18, 857-869.38. Zakrzewski S.F.: Podstawy toksykologii środowiska. Wydawnictwo NaukowePWN, Warszawa. 1997, 114.167

168