You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
B24<br />
Abstrakta / Abstract book<br />
Nová protinádorová léčiva<br />
pátek / 30. listopadu 2012 / 13.45–15.30 hod.<br />
In vitro testování účinnosti<br />
na komplementu závislé cytotoxity<br />
monoklonálních protilátek<br />
určených pro léčbu B-buněčných<br />
malignit<br />
Marek Borský, Tomáš Loja, Michael Doubek<br />
Laboratoř průtokové cytometrie, Centrum<br />
molekulární biologie a genové terapie, IHOK,<br />
FN Brno<br />
Vývoj v oblasti monoklonálních protilátek<br />
jako léčiv určených pro hematologické malignity<br />
přináší další vylepšená léčiva. Příkladem je preparát<br />
Arzerra obsahující monoklonální protilátku<br />
ofatumumab (anti-CD20), která má oproti své<br />
předchůdkyni, protilátce rituximab (anti-CD20),<br />
vylepšené vlastnosti. Vyšší účinnost ofatumumabu<br />
se týká především oblasti na komplementu<br />
závislé cytotoxicity. Ofatumumab je již podáván<br />
některým pacientům s refrakteriemi při chronické<br />
lymfatické leukemii (CLL). Přesto je studium<br />
účinků a účinnosti těchto preparátů stále vysoce<br />
aktuální, protože řada procesů spojených s jejich<br />
působením není ještě zcela objasněna.<br />
Cílem naší práce je zavést do praxe pokud<br />
možno jednoduchý nástroj pro testování<br />
cytotoxicity závislé na komplementové dráze<br />
indukované monoklonálními protilátkami v podmínkách<br />
in vitro. Popsat podstatné zákonitosti<br />
tohoto procesu a pokusit se najít možnosti<br />
využití tohoto testování jako predikčního nástroje<br />
u B-buněčných malignit.<br />
V první fázi našeho projektu jsme testovali 12<br />
B-buněčných tkáňových linií na lytickou odpověď<br />
na protilátky ofatumumab a rituximab s pomocí<br />
průtokové cytometrie. Jednoduchý test<br />
byl vytvořen v podmínkách in-vitro, kdy buňky<br />
v přítomnosti 20% aktivního směsného lidského<br />
séra, léčiva a propidium iodidu (PI) byly inkubovány<br />
30 min v 37°C. Buňky, v jejichž plazmatické<br />
membráně se vytvořily póry vlivem formace<br />
MAC komplexů, nedokázaly zabránit průniku PI<br />
do jádra a staly se tak pozitivní pro fluorescenční<br />
signál v oblasti pro PI měřený průtokovým cytometrem.<br />
Kombinací údajů o absolutním a relativním<br />
množství buněk před a po proběhnutí<br />
testu bylo vypočítáno množství rezistentních<br />
buněk a jimi byla vyjádřena účinnost léčiva. Aby<br />
mohly být testy správně interpretovány a opakovány<br />
se shodnými výsledky, byla sledována<br />
řada dalších faktorů ovlivňujících účinnost léčiva<br />
v daném testovacím systému. Jsou to: exprese<br />
povrchového antigenu CD20 a buněčných regulátorů<br />
komplementové dráhy CD21, CD35, CD46,<br />
CD55, CD59, koncentrace léčiva a lidského séra<br />
i vazebné podmínky pro použité protilátky. Naše<br />
výsledky se většinou shodují s pozorováními<br />
ostatních vědeckých týmů testujících účinnost<br />
anti-CD20 protilátek v podobných podmínkách.<br />
Nad to byla učiněna některá nová pozorování,<br />
která ukazují, že například proces lýzy buněk<br />
závislý na komplementové dráze spouštěné vazbou<br />
protilátky je závislý nejen na koncentraci<br />
protilátky, ale také na koncentraci buněk v reakci.<br />
Jiné naše experimenty ukázaly schopnost<br />
modifikace vazebných podmínek pro protilátky<br />
potenciovat celý lytický proces.<br />
Úspěšná první fáze projektu umožnila zahájit<br />
druhou fázi projektu, ve které testujeme B lymfocyty<br />
pacientů s CLL na lytickou odpověď iniciovanou<br />
léčivy ofatumumab a rituximab. Cílem<br />
je shromáždit data o expresi podstatných povrchových<br />
molekul CD20, CD21, CD35, CD46, CD55,<br />
CD59 B lymfocytů od 50 neléčených CLL pacientů<br />
a dát je do vztahu k výsledkům účinnosti<br />
léčiv v aktivaci komplementové dráhy v našich<br />
in-vitro testech. První testované primární vzorky<br />
vykazují oproti tkáňovým liniím vnitřní heterogenitu<br />
v odpovědi na aktivaci lytické dráhy komplementu,<br />
která naznačuje, že B lymfocyty CLL<br />
pacientů jsou směsí rezistentních, slabě citlivých<br />
a silně citlivých buněk na lýzu komplementem.<br />
Třetí fáze projektu by měla ukázat korelaci<br />
našich in-vitro testů se skutečnou účinností<br />
léčby, aby se mohla uzavřít otázka schopnosti<br />
našich in vitro testů predikovat léčebnou<br />
odpověď in vivo. Práce koncepčně navazuje<br />
na souběžný výzkum na našem pracovišti<br />
v oblasti testování monoklonálních protilátek<br />
ve vztahu k apoptóze.<br />
In vitro proteomické profilování<br />
buněčné linie CEM platinovými<br />
protinádorovými léčivy<br />
Tomáš Oždian 1 , Dušan Holub 1 , Petr<br />
Džubák 1 , Gabriela Rylová 1 , Madhusudhan<br />
Kolbredy Reddy Kollaredy 1 , Jiří Řehulka 1 ,<br />
Lenka Radová 1 , Dana Cahová 1 , Vladimír<br />
Havlíček 2 , Marián Hajdúch 1<br />
1<br />
Laboratoř experimentální medicíny, Ústav<br />
molekulární a translační medicíny, LF UP<br />
a FN Olomouc<br />
2<br />
Mikrobiologický ústav, Akademie věd České<br />
republiky, v.v.i., Praha<br />
Platinová léčiva jsou již dlouhou dobu neodmyslitelnou<br />
součástí protinádorové terapie. Přes<br />
svou chemickou i biologickou podobnost se liší<br />
ve spektru nádorů, jež jsou jimi léčeny. Naším<br />
cílem bylo charakterizovat proteomické profily<br />
po použití těchto léčiv na modelové nádorové<br />
linii. Aby jejich porovnání získalo vyšší výpovědní<br />
hodnotu, přidali jsme do testovaného souboru<br />
vinkristin a daunorubicin jako chemicky a funkčně<br />
nepříbuzná léčiva. K profilování jsme zvolili<br />
buněčnou linii CCRF-CEM odvozenou od akutní<br />
lymfoblastické leukemie, která se vyznačuje<br />
dostatečnou citlivostí na širokou škálu běžně<br />
používaných cytostatik. Buněčná linie byla označena<br />
izotopicky značenými aminokyselinami<br />
a následně ošetřena vybranými léčivy o koncentraci<br />
5xIC50. Doba ošetření byla definovaná<br />
jako polovina času do indukce apoptózy. Takto<br />
ošetřené buňky byly smíchány s neznačenými<br />
kontrolními v poměru 1:1, lyzovány a následně<br />
separovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy,<br />
kde byly rozděleny do 45 frakcí. Jednotlivé elektroforetické<br />
frakce jsme podrobili štěpení trypsinem<br />
a analyzovali pomocí HPLC-MS. Pro získání<br />
co nejvyššího počtu identifikovaných peptidů<br />
jsme použili dva hmotnostně spektrometrické<br />
přístupy: MALDI-TOF/TOF, LC-MS/MS. Získaná<br />
hmotnostní spektra byla analyzována algoritmy<br />
Mascot a Phenyx a kompilována v databázovém<br />
systému Proteinscape. Celkově jsme identifikovali<br />
646 ± 133 proteinů metodou LS-MS/MS<br />
a 312 ± 85 proteinů metodou MALDI v jednom<br />
opakování. Identifikované a kvantifikované proteiny<br />
jsme vyhodnotili statistickými metodami.<br />
Metodou hierarchického clusterování jsme zjistili<br />
dle očekávání blízkou příbuznost cis a karboplatiny,<br />
překvapením však byla odlehlost oxaliplatiny.<br />
Analýzou hlavní komponenty byly určeny<br />
proteiny odpovědné za tento stav, a tyto jsou<br />
validovány metodou Western blot.<br />
Tento projekt byl podpořen interním grantem<br />
Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci<br />
(LF_2012_018); infrastrukturální část tohoto projektu<br />
(Ústav molekulární a translační medicíny) byla<br />
podpořena z Operačního programu Věda a výzkum<br />
pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/01.0030).<br />
Identifikace cílů protinádorových<br />
léčiv pomocí afinitní purifikace<br />
Gabriela Rylová 1 , Petr Džubák 1 , Anna<br />
Janošťáková 1 , Ivo Frydrych 1 , Petr Konečný 1 ,<br />
Dušan Holub 1 , Tomáš Oždian 1 , Dalibor
Change language