Aktualności bioMérieux nr 43 plik do pobrania (format pdf)

aktualności 

bioMérieux 

numer 43 

grudzieƒ 2007 

Warszawa 

diagnostyka 

êród∏em dobrego zdrowia

z życia firmy 

www.biomerieux.pl 

Zapraszamy na internetowà stron´ bioMérieux Polska, gdzie w Dziale 

„WiadomoÊci” zamieszczamy informacje o nowoÊciach w ofercie firmy. 

Z przyjemnoÊcià informujemy, ˝e dotychczasowà ofert´ bioMérieux Polska 

w zakresie produktów do diagnostyki zaka˝eƒ wirusem HIV, która obejmuje 

testy w systemie automatycznym VIDAS HIV Duo Quick, VIDAS HIV 

DUO Ultra, testy ELISA Vironostica HIV oraz testy biologii molekularnej 

NucliSens EasyQ HIV-1 uzupe∏nia obecnie szybki, ∏atwy w wykonaniu test: 

VIKIA HIV (nr kat. 31112) 

2 

2 

3 

5 

12 

17 

19 

Spis treści 


Z ˝ycia firmy 

Techniki biologii molekularnej w badaniach 

epidemiologicznych zaka˝eƒ szpitalnych 

Enterokoki oporne na wankomycyn´ (VRE) 

– epidemiologia i metody wykrywania 

Ocena przydatnoÊci pod∏o˝a chromID VRE firmy 

bioMérieux w monitorowaniu zaka˝eƒ szpitalnych 

Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum 

substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli 

i Klebsiella spp. za pomocà testu potwierdzajàcego 

wg CLSI oraz kart AST–N041 systemu VITEK 2 

20 Identifying Resistance 

StandLab IQs pierwszy polski internetowy program 

kontroli jakoÊci 

23 

25 

Nowe produkty w ofercie bia∏ek specyficznych 

(Konelab system reagent) 

27 Z ˝ycia firmy – XVI Zjazd PTDL „POLMEDLAB” 

Wydawca: bioMérieux Polska Sp. z o.o. 

Osoba odpowiedzialna: El˝bieta Wójcik 

Osoby bioràce udzia∏ w przygotowaniu nr 43: 

Katarzyna Haltof 

Marcin Iszku∏o 

Miros∏aw Kachalik 

Ireneusz Pop∏awski 

Barbara Krawczyƒska 

Piotr Czajka 

Karolina Âwiderska 

Adres redakcji i wydawcy: 

bioMérieux Polska 

01-882 Warszawa, ul. ˚eromskiego 17 

tel. (22) 569 85 00 • fax (22) 569 85 54 


Przygotowalnia i druk: 

PASSA Zak∏ad Poligraficzny 

Wojciech Bia∏kowski 

Konstancin-Jeziorna, ul. Lipowa 26 

Jest to jakoÊciowy test wykorzystujàcy 

technik´ immunochromatograficznà, 

umo˝liwiajàcy 

wykrywanie przeciwcia∏ anty- 

HIV1 i anty-HIV2 w surowicy, 

osoczu oraz w pe∏nej krwi. 

Wychodzàc naprzeciw oczekiwaniom u˝ytkowników systemu VIDAS oraz 

Êrodowiska medycznego, firma bioMérieux Polska ma przyjemnoÊç poinformowaç 

o wprowadzeniu nowego testu: 

nr kat. 30 449 

VIDAS NT-proBNP jest testem 

iloÊciowym w automatycznym 

systemie VIDAS do oznaczania 

N-koƒcowych fragmentów peptydów 

natriuretycznych typu 

B w surowicy lub osoczu (heparyna 

litowa), przy u˝yciu techniki 

ELFA (metoda enzymoimmunofluorescencyjna). 

Oznaczenia NT-proBNP wykorzystywane sà do diagnozowania pacjentów 

z podejrzeniem niewydolnoÊci lewej komory serca. Jest to szczególnie 

przydatne do odró˝nienia pomi´dzy dusznoÊcià sercowà i p∏ucnà. 

Do zobaczenia w sieci! 

Zapraszamy równie˝ do zapoznania 

si´ z wiadomoÊciami 

o dzia∏alnoÊci firmy bioMérieux, 

które zamieszczane sà w Dziale 

„Informacje Prasowe”. 

Na stronie www.biomerieux.pl/informacje prasowe znajdujà si´ wiadomoÊci 

nt. wprowadzenia na rynek testu do diagnostyki i prognostyki niewydolnoÊci 

serca – VIDAS ® NT-proBNP. 

Na tej stronie znajdà Paƒstwo równie˝ informacje nt. podsumowania dzia- 

∏alnoÊci firmy bioMérieux za szeÊç miesićy 2007 roku.

80-lecie Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów 

Kraków, 31.08–1.09.2007 

„Âwiat cz∏owieka Êwiatem drobnoustrojów” – pod takim tytu∏em w dniach 31 sierpnia – 1 wrzeÊnia 2007 roku, w Krakowie 

odby∏o si´ jubileuszowe sympozjum zorganizowane z okazji 80-lecia Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów 

(PTM). Towarzystwo powsta∏o w 1927 roku i nale˝y do najstarszych medycznych towarzystw naukowych w Polsce. 

Za∏o˝ycielami byli Roman Nitsch, Feliks Przesmycki i Zygmunt Szymanowski. Celem Towarzystwa jest propagowanie 

rozwoju nauk mikrobiologicznych i popularyzowanie osiàgni´ç mikrobiologii wÊród cz∏onków oraz szerokich kr´gów 

spo∏eczeƒstwa. 

Z racji jubileuszu, wyk∏ad inauguracyjny zosta∏ poÊwićony wielkim mikrobiologom. Program konferencji obejmowa∏ ró˝norodnà 

problematyk´, takà jak: nowe strategie walki z chorobami zakaênymi, nowe leki przeciwbakteryjne, implikacje 

kliniczne i terapeutyczne zaka˝eƒ Helicobacter pylori, metody genetyczne ró˝nicowania drobnoustrojów, zoonozy, zaka- 

˝enia pozaszpitalne, nowe metody post´powania wobec H.influenzae, patogenez´ zaka˝eƒ C.difficile, leki przeciwwirusowe, 

szczepienia, grzyby dro˝d˝opodobne, badania mikrobiologiczne powietrza, a tak˝e wp∏yw drobnoustrojów 

na niszczenie zabytków oraz zarzàdzanie jakoÊcià i akredytacj´ w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych. 

Oprócz wyk∏adów odby∏a si´ sesja plakatowa, a tak˝e wystawa firm diagnostycznych i farmaceutycznych. Firma 

bioMérieux Polska prezentowa∏a na stoisku nast´pujàce systemy: BacTAlert 3D 60 do wykrywania drobnoustrojów 

we krwi i innych p∏ynach ustrojowych, VITEK 2 compact do identyfikacji drobnoustrojów i okreÊlania lekowra˝liwoÊci 

oraz nowy system do genotypowania DiversiLab. Oprócz systemów automatycznych na stoisku mo˝na by∏o tak˝e zebraç 

informacje na temat nowych produktów w ofercie firmy, pod∏o˝y mikrobiologicznych, testów lateksowych oraz 

testu VIKIA HIV. 

Jubileusz by∏ doskona∏à okazjà do spotkaƒ oraz wymiany doÊwiadczeƒ pomi´dzy mikrobiologami z ró˝nych oÊrodków. 

èród∏o: materia∏y zjazdowe 

3

Pomorskie Spotkania z Mikrobiologią 

Gdańsk – Sobieszewo, 5–6.10.2007 

W dniach 5–6.10.2007 roku w Sobieszewie pod patronatem J. M. Prof. dr hab. Romana Kaliszana Rektora Akademii 

Medycznej w Gdaƒsku oraz Prof. dr hab. Walerii Hryniewicz Prezesa Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów odby∏a si´ 

konferencja „Pomorskie Spotkania z Mikrobiologià”. 

Program obejmowa∏: 

nowoczesne metody w diagnostyce mikrobiologicznej, zaka˝enia wywo∏ywane przez bakterie Staphylococcus aureus, 

diagnostyk´ i ró˝nicowanie toksoplazmozy wczesnej i przewlek∏ej, laboratoryjnà diagnostyk´ chorób paso˝ytniczych 

ze szczególnym uwzgl´dnieniem badaƒ molekularnych, zastosowanie bakteriofagów w diagnostyce i terapii, epidemiologi´, 

diagnostyk´ i profilaktyk´ inwazyjnej choroby meningokokowej, posocznice bakteryjne, aktualne problemy 

antybiotykoterapii, zastosowanie markerów molekularnych w diagnostyce bakteryjnych patogenów roÊlin, wytwarzanie 

biofilmu przez szczepy Enterococcus faecalis izolowane z przewodu pokarmowego oraz z zaka˝eƒ i in. 

Prace z ró˝nych oÊrodków woj. pomorskiego, zosta∏y wystawione podczas bardzo interesujàcej sesji plakatowej. 

Firma bioMérieux prezentowa∏a na stoisku firmowym produkty stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. 

„Zakażenia szpitalne – monitorowanie, rozpoznawanie 

i zapobieganie” 

Warszawa, 11.10.2007 

11 paêdziernika 2007 roku odby∏a si´ druga z cyklu corocznych konferencji, organizowanych przez firm´ bioMérieux 

Polska. Podobnie jak poprzednio, tegoroczna konferencja zosta∏a zorganizowana w Hotelu Marriott i poÊwićona by∏a 

tematyce zaka˝eƒ szpitalnych. Przybyli na nià kierownicy zak∏adów mikrobiologii, laboratoriów mikrobiologicznych oraz 

epidemiolodzy i dyrektorzy placówek ochrony zdrowia. 

Program naukowy obejmowa∏ nast´pujàce wyk∏ady: 

monitorowanie opornoÊci bakterii na terenie szpitala, rozpoznawanie i zapobieganie opornoÊci, a tak˝e diagnostyk´ 

mikrobiologicznà w monitorowaniu zaka˝eƒ szpitalnych. 

4 

GoÊciliÊmy znakomitych wyk∏adowców w osobach Pani Profesor Walerii Hryniewicz, Pani Doktor Ma∏gorzaty Fleischer 

i Pana Doktora Tomasza Ozorowskiego. Konferencja by∏a okazjà do burzliwej dyskusji i wymiany doÊwiadczeƒ na temat 

kontroli zaka˝eƒ szpitalnych i trudnoÊci w s∏u˝bie zdrowia wynikajàcych z szerzenia si´ opornoÊci drobnoustrojów.

iologia molekularna 

Techniki biologii molekularnej 

w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych 

dr Beata Krawczyk 

Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska 

Epidemiologia jest dzia∏em medycyny 

zajmujàcym si´ badaniem przyczyn 

wyst´powania i szerzenia si´ 

chorób zakaênych i niezakaênych 

w zbiorowiskach ludzi, opracowuje 

metody zapobiegania i zwalczania 

chorób wywo∏anych przez wirusy, 

bakterie, dro˝d˝aki i dermatofity. 

W obecnej dobie rozwoju medycyny, 

wprowadzanie nowych technik i leków 

do terapii, zwi´ksza z jednej strony 

prze˝ywalnoÊç pacjentów, z drugiej 

strony pojawia si´ problem zaka˝eƒ 

szpitalnych. Du˝y problem stanowià 

infekcje szpitalne wywo∏ane przez 

szczepy wielooporne, które ∏atwo 

rozprzestrzeniajà si´ w Êrodowisku 

szpitalnym, a których leczenie jest 

problematyczne ze wzgl´du na ograniczone 

mo˝liwoÊci terapeutyczne. 

Problem zaka˝eƒ szpitalnych i epidemii 

wynika z selekcji szczepów opornych, 

powstawania nowych mechanizmów 

opornoÊci czy rozprzestrzeniania si´ 

genów a nawet ca∏ych kaset genów odpowiedzialnych 

za opornoÊç na antybiotyki 

i chemioterapeutyki. Problem 

ten jest istotny nie tylko z punktu widzenia 

medycyny, ale równie˝ ma 

pod∏o˝e ekonomiczne i prawne, dlatego 

tak istotny staje si´ program 

kontroli zaka˝eƒ szpitalnych. Od roku 

1970 Centers for Disease Control and 

Prevention (CDC) w Atlancie w Stanach 

Zjednoczonych, jako pierwsze 

stworzy∏o program ciàg∏ego nadzoru 

nad zaka˝eniami (NNIS – National 

Nosocomial Infections Surveilance 

System). CDC jest najwa˝niejszym 

na Êwiecie centrum badaƒ nad wyst´powaniem 

i profilaktykà chorób, 

w tym równie˝ zaka˝eƒ szpitalnych. 

W Europie decyzjà (nr 2119/98/EC) 

Parlamentu Europejskiego oraz Rady 

z dnia 24 wrzeÊnia 1998 roku powsta- 

∏a sieç nadzoru epidemiologicznego 

oraz kontrola chorób zakaênych we 

Wspólnocie Europejskiej (Dz. U. EW 

nr L 268, z 3.10.1998). Nadzór epidemiologiczny 

w Europie reguluje 

Unia Europejska, która wprowadzi∏a 

obowiàzek rejestracji wskazanych 

chorób zakaênych, zaka˝eƒ szczepami 

lekoopornymi oraz zaka˝eƒ szpitalnych. 

JednoczeÊnie powo∏ano 

europejskie centrum epidemiologiczne, 

European Centre for Disease 

Prevention and Control (ECDC). 

Mikrobiologiczne zaka˝enia szpitalne 

dotyczà wszystkich szpitali niezale˝nie 

od stopnia wyspecjalizowania 

czy poziomu rozwoju kraju, w którym 

si´ znajdujà. Dlatego te˝ sta∏a kontrola 

zaka˝eƒ szpitalnych oraz dà˝enie 

do ograniczenia ich liczby powinno 

nale˝eç do g∏ównych obowiàzków 

personelu medycznego szpitali. 

Badania epidemiologiczne wewnàtrz 

szpitali sà prowadzone g∏ównie w celu 

opracowania efektywnego programu 

kontroli zaka˝eƒ. W wielu przypadkach 

prosta identyfikacja gatunkowa i badanie 

antybiotykowra˝liwoÊci wystarczà 

do okreÊlenia epidemiologicznej zale˝noÊci 

szczepów oraz Êledzenia drogi 

ich rozprzestrzeniania si´ w czasie. 

W przypadku, gdy infekcja jest spowodowana 

mikroorganizmem b´dàcym 

sk∏adnikiem naturalnej flory bakteryjnej 

lub Êrodowiska (np. Escherichia 

coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus 

epidermidis), to do okre- 

Êlenia epidemiologicznej zale˝noÊci 

poszczególnych izolatów potrzebne 

jest wykonanie dodatkowych testów. 

Badania fenotypowe w dochodzeniach 

epidemiologicznych sà kosztowne 

i czasoch∏onne, a cz´sto trudne 

i niejednoznaczne w interpretacji, np. 

w przypadku szczepów o charakterze 

endemicznym. 

OkreÊlenie pokrewieƒstwa pomi´dzy 

szczepami tego samego gatunku 

i wykrycie klonów lub grup klonalnych 

wywo∏ujàcych zaka˝enia epidemiczne 

bàdê endemiczne, a tak˝e 

ustalenie êród∏a szerzenia si´ zaka- 

˝eƒ i drogi transmisji pomi´dzy oddzia∏ami, 

szpitalami, a nawet krajami 

jest mo˝liwe dzi´ki dobrze rozwini´tej 

technologii kwasów nukleinowych. 

Specyfika badaƒ metodami 

molekularnymi opartymi na analizie 

DNA polega na dok∏adnym okreÊleniu, 

czy szczepy izolowane od wielu 

pacjentów nale˝à do jednego klonu, 

który rozprzestrzenia si´ horyzontalnie 

na oddziale, czy te˝ problem zaka˝eƒ 

dotyczy szczepów reprezentujàcych 

kilka grup klonalnych. Badania epidemiologiczne 

prowadzone przez d∏u˝szy 

okres czasu wymagajà monitoringu 

rozprzestrzeniania si´ i okreÊlenia dominacji 

poszczególnych szczepów, 

co mo˝e byç przydatne w opracowaniu 

d∏ugoterminowych programów 

kontroli zaka˝eƒ. W badaniach epidemiologicznych 

typowanie szczepów 

przeprowadzane jest nie tylko 

w szpitalach, ale równie˝ w ramach 

kontroli kontaminacji wody i ˝ywnoÊci 

drobnoustrojami oraz w mikrobiologii 

weterynaryjnej. Typowanie szczepów 

ma wiele aplikacji w badaniach naukowych 

i przemyÊle spo˝ywczym np. do 

kontroli jakoÊci ˝ywnoÊci. 

Szybkie metody typowania szczepów 

mogà znaczàco zredukowaç koszty 

zwiàzane z leczeniem, powstrzymaniem 

rozprzestrzeniania si´ epidemii 

i dekontaminacjà. Metody genotypowania 

coraz cz´Êciej stajà si´ integralnà 

cz´Êcià zarówno w klinicznych, jak 

i naukowych laboratoriach mikrobiologicznych. 

Szeroka wiedza na temat 

mechanizmów molekularnych oraz 

w∏aÊciwoÊci fizyko-chemicznych makroczàsteczek 

komórkowych pozwala 

tworzyç nowe, coraz bardziej dok∏adne 

techniki genotypowania. Techniki 

te w g∏ównej mierze opierajà si´ na 

analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji oraz 

amplifikacji DNA in vitro przy zastosowaniu 

∏aƒcuchowej reakcji polimerazy 

(ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) 

oraz sekwencjonowaniu. Rozdzia∏ powsta∏ych 

fragmentów DNA o ró˝nej 

5

6 

d∏ugoÊci, uzyskuje si´ przy pomocy 

technik elektroforetycznych. Otrzymany 

w ten sposób profil prà˝ków jest 

charakterystyczny zarówno dla wybranej 

metody jak i dla badanej próby. 

Ró˝nice we wzorach Êwiadczà o odmiennoÊci 

genetycznej badanych 

organizmów. Generalnie metody genotypowe 

uwa˝a si´ za bardziej kompleksowe. 

Nie sà to jednak metody 

uniwersalne i w zale˝noÊci od rodzaju 

metody charakteryzuje je ró˝ny 

potencja∏ ró˝nicujàcy, czu∏oÊç i powtarzalnoÊç, 

koszt i stopieƒ trudnoÊci 

wykonania. 

Zostanà omówione trzy grupy metod 

opartych na analizie zmiennoÊci genomowej: 

1. analiza restrykcyjna chromosomalnego 

DNA po∏àczona z elektroforezà 

pulsowà (REA-PFGE); 

2. techniki oparte o ligacj´ adaptorów 

oligonukleotydowych; 

3. wykorzystanie sekwencji repetytywnych 

w genotypowaniu bakterii. 

Analiza restrykcyjna 

chromosomalnego DNA 

po∏àczona z elektroforezà 

pulsowà (REA-PFGE) 

Konwencjonalna elektroforeza agarozowa 

mo˝e byç stosowana tylko do 

rozdzia∏u DNA o wielkoÊci do 20 kpz. 

Na migracj´ ma wp∏yw ró˝ny ∏adunek 

pomi´dzy fragmentami DNA, a rozdzia∏ 

odbywa si´ na zasadzie „sita 

molekularnego”, utworzonego przez 

pory noÊnika. Fragmenty DNA migrujà 

jako sferyczne spirale, im mniejsza 

czàstka DNA, tym szybciej migruje 

przez pory w ˝elu. Niestety dla czàstek 

DNA powy˝ej 20 kpz ruchliwoÊç staje 

si´ coraz mniej zale˝na od rozmiarów 

czàsteczki i rozdzia∏ ich klasycznymi 

metodami elektroforetycznymi staje 

si´ niemo˝liwy. W 1983 r. Schwatrz 

i Cantor wprowadzili elektroforez´ 

pulsowà (PFGE – ang. Pulsed Field 

Gel Electrophoresis), która z biegiem 

czasu umo˝liwi∏a rozdzia∏ w ˝elu agarozowym 

DNA o d∏ugoÊci od 20–50kpz 

do 2–10Mpz. Fragmenty wi´ksze ni˝ 

20 kpz podczas migracji tworzà mocno 

rozciàgni´tà spiral´, która nie migruje 

na zasadzie sita molekularnego, 

tylko pe∏za jak wà˝ (ang. „snake like”). 

Fragmenty te nie b´dà migrowa∏y ju˝ 

zgodnie z efektem ∏adunku. 

Technika PFGE polega na wymuszonej 

zmianie kierunku migracji czàsteczek 

DNA pod wp∏ywem okresowej 

zmiany orientacji pola elektrycznego. 

Zmiana kierunku pola elektrycznego 

wymusza zmian´ konformacji czàsteczki 

DNA i jej reorientacj´ w kierunku 

elektrody dodatniej. Czas potrzebny 

na reorientacj´ zale˝y od wielkoÊci 

czàsteczki DNA i jest tym d∏u˝szy im 

czàsteczka jest wi´ksza. Zatem wi´ksze 

czàsteczki migrujà wolniej ni˝ mniejsze, 

wićej czasu zajmuje im przystosowanie 

si´ do „nowego” kierunku 

przep∏ywu pola elektrycznego. Ró˝nica 

w czasie reorientacji jest czynnikiem 

krytycznym, który decyduje o rozdziale 

fragmentów DNA o ró˝nej d∏ugo- 

Êci. Powsta∏o wiele odmian technik 

PFGE, które ró˝nià si´ sposobem 

rozmieszczenia elektrod tzn. kàtem, 

pod jakim zmienia si´ kierunek pola 

elektrycznego. Dzielimy je na dwie 

kategorie: techniki, w których kàt reorientacji 

wynosi 180° i techniki, dla 

których kàt reorientacji zawiera si´ 

w przedziale 90–180°. Pierwszà grup´ 

stanowi elektroforeza w odwracalnym 

polu elektrycznym – FIGE 

(ang. Field Inversed Gel Electrophoresis) 

i polega na cyklicznej, okresowej 

zmianie polarnoÊci jednorodnego 

pola elektrycznego pod kàtem 180°. 

Czàsteczki DNA w zale˝noÊci od polarnoÊci 

ustawionych po obu stronach 

˝elu elektrod, poruszajà si´ raz 

w przód (F – forward), raz w ty∏ (R 

– reverse). Ten typ elektroforezy PFGE 

jest stosowany g∏ównie do rozdzia∏u 

czàsteczek o wielkoÊci 0.1–700 kpz. 

Elektroforeza w polu elektrycznym 

o kàcie reorientacji zawierajàcym si´ 

w przedziale 90–180° mo˝e ró˝niç 

si´ iloÊcià i u∏o˝eniem stosowanych 

elektrod oraz kszta∏tem toru migracji 

czàstek. Elektroforeza w pulsowym 

polu – PFG (ang. Pulsed Field Gel) 

i elektroforeza w zmiennym polu 

o kszta∏cie prostokàta – OFAGE (ang. 

Orthogonal Field Alternation Gel 

Electrophoresis) umo˝liwiajà dobry 

rozdzia∏ fragmentów DNA, jednak˝e 

zakrzywienie toru ruchu czàsteczek 

DNA utrudnia interpretacj´, szczególnie 

przy fragmentach o bardzo podobnej 

d∏ugoÊci. Proste tory migracji 

czàstek dajà: elektroforeza w rotacyjnym 

polu – RGE (ang. Rotating Gel 

Electrophoresis), elektroforeza pionowa 

w zmiennym polu – TAFE (ang. 

Transverse Field Electrophoresis), 

elektroforeza w jednorodnym polu 

o kszta∏cie prostokàta – PHOGE (ang. 

Pulsed Homogenous Orthogonal 

Gel Electrophoresis) i elektroforeza 

w zmiennym, homogennym polu 

o kszta∏cie szeÊciokàta foremnego – 

CHEF (ang. Contour – Clamped Homogenous 

Electric Field Electrophoresis). 

Dla CHEF uk∏ad 24 elektrod 

tworzy dwa jednorodne pola skierowane 

do siebie pod kàtem 120°, co 

daje najwi´ksze mo˝liwoÊci do rozdzia∏u 

czàstek, nawet o wielkoÊci oko- 

∏o 10 Mpz. Technika ta zosta∏a wykorzystana 

mi´dzy innymi do stworzenia 

mapy fizycznej ludzkiego genomu. 

Analiza polimorfizmu d∏ugoÊci fragmentów 

restrykcyjnych po∏àczona 

z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE 

ang. Restriction Enzyme Analysis – 

Pulsed Field Gel Electrophoresis) 

uznawana jest za „z∏oty standard” 

w typowaniu molekularnym bakterii. 

Metoda ta polega na trawieniu ca∏ego 

genomowego DNA enzymem (-ami) 

restrykcyjnym rzadko tnàcym. Liczba 

i wielkoÊç otrzymanych fragmentów 

jest charakterystyczna dla danego organizmu 

i zale˝y od rozmieszczenia 

w genomie sekwencji rozpoznawanej 

przez stosowany enzym restrykcyjny. 

W wyniku trawienia otrzymuje 

si´ od 10 do 30 du˝ych fragmentów, 

o wielkoÊci od ok. 0,5 kpz do 1000 kpz. 

Fragmenty restrykcyjne rozdziela si´ 

w pulsowej elektroforezie agarozowej. 

Metoda REA-PFGE mo˝e byç zastosowana 

dla dowolnego mikroorganizmu, 

z którego mo˝na wyizolowaç DNA 

(znajomoÊç sekwencji nie jest wymagana). 

PFGE ze wzgl´du na wysokà powtarzalnoÊç 

wzoru i dobrà rozdzielczoÊç 

dla wi´kszoÊci wspólnych enteropatogenów, 

w USA jest rutynowo 

stosowana w du˝ych laboratoriach, 

gdzie korzysta si´ z wystandaryzowanych 

protoko∏ów do typowania 

szczepów, a rezultaty zestawia si´ 

w centralnych bazach danych. 

Techniki oparte o ligacj´ 

adaptorów 

oligonukleotydowych (LM-PCR 

ang. Ligation Mediated PCR) 

Wiele obecnie stosowanych technik 

typowania molekularnego opiera si´ 

na analizie polimorfizmu genomowego 

DNA. Majà one na celu przypisanie 

konkretnemu szczepowi specyficznego 

profilu fragmentów DNA stanowiàcego 

jego tzw. „odcisk palca” (ang. 

fingerprint). Techniki fingerprinting, czyli 

techniki tzw. „genomowego odcisku

palca”, wykorzystujà w g∏ównej mierze 

amplifikacj´ fragmentów DNA in vitro 

przy zastosowaniu ∏aƒcuchowej reakcji 

polimerazy (ang. Polymerase Chain 

Reaction, PCR), bàdê analiz´ restrykcyjnà 

po∏àczonà z amplifikacjà PCR. 

Rozdzia∏ powsta∏ych fragmentów 

DNA o ró˝nej d∏ugoÊci uzyskuje si´ 

przy pomocy technik elektroforetycznych. 

Otrzymany w ten sposób profil 

prà˝ków jest charakterystyczny zarówno 

dla wybranej metody jak i dla 

badanej próby. Ró˝nice we wzorach 

Êwiadczà o odmiennoÊci genetycznej 

badanych organizmów. Bardzo 

przyjaznà technikà do analizy DNA 

o nieznanej sekwencji jest grupa 

technik opartych o ligacj´ adaptorów 

oligonukleotydowych (LM-PCR ang. 

Ligation Mediated PCR). 

Do metod wykorzystujàcych adaptory 

w reakcji PCR nale˝à: AFLP (ang. 

Amplified Fragment Length Polymorphism), 

ADSRRS (ang. Amplification 

of DNA Fragments Surrounding Rare 

Restriction Sites) oraz PCR MP (ang. 

PCR Melting Profiles). Ka˝da z tych 

metod oparta jest na selektywnej 

amplifikacji fragmentów restrykcyjnych 

uzyskanych w wyniku trawienia 

ca∏ego genomowego DNA endonukleazami 

(jednà lub dwoma), dajàcymi 

wiszàce koƒce 5’ a nast´pnie 

ligacji odpowiednio zaprojektowanych 

adaptorów oligonukleotydowych: oligonukleotydu 

pomocniczego, który 

zawiera sekwencj´ komplementarnà 

do sekwencji rozpoznawanej przez 

stosowany enzym restrykcyjny i umo˝liwia 

przez to hybrydyzacj´ adaptora 

do fragmentu restrykcyjnego oraz oligonukleotydu, 

który ulega w∏aÊciwej 

ligacji i odpowiedzialny jest za wykreowanie 

miejsca wiàzania startera 

w reakcji PCR. Oba oligonukleotydy 

nie sà ufosforylowane na koƒcach 

5’, dzi´ki czemu nie zachodzi pomi´dzy 

nimi reakcja polimeryzacji 

podczas reakcji ligacji. Po ligacji adaptora 

do DNA otrzymuje si´ dwuniciowe 

fragmenty o znanej nam na 

koƒcach sekwencji, które mogà byç 

wykorzystane w amplifikacji. Reakcj´ 

PCR prowadzi si´ dwustopniowo. 

W pierwszym etapie (pre-PCR) przeprowadza 

si´ wst´pnà denaturacj´ 

w wyniku, której oddysocjowuje niezligowany 

oligonukleotyd pomocniczy. 

Nast´pnie zachodzi wype∏nianie 

koƒców 3’ na matrycy oligonukleotydu 

ligowanego. W drugim etapie reakcji 

PCR przeprowadza si´ w∏aÊciwà 

amplifikacj´ przy zastosowaniu startera 

o identycznej sekwencji jak oligonukleotyd 

ligowany, cz´sto wyd∏u˝ony 

o sekwencj´ wiszàcego koƒca 5’ miejsca 

restrykcyjnego. 

Metody LM PCR ró˝nià si´ mi´dzy 

sobà g∏ównie sposobem selekcji amplifikowanych 

w reakcji PCR fragmentów 

DNA. W przypadku techniki 

AFLP w reakcji PCR stosuje si´ startery 

o sekwencji identycznej z sekwencjà 

oligonukleotydu ligowanego 

adaptora, wyd∏u˝onej na koƒcu 3’ 

o sekwencj´ miejsca restrykcyjnego 

oraz o 2–4 dowolnych nukleotydów. 

Amplifikacja fragmentu DNA zachodzi 

jedynie w przypadku pe∏nej komplementarnoÊci 

startera na koƒcu 3’. 

Cz´stoÊç rozpoznawania specyficznego 

miejsca przez starter selekcyjny 

wynosi 1/4 n (n – liczba zasad selekcyjnych). 

Dla techniki ADSRRS do 

ograniczenia iloÊci amplifikowanych 

fragmentów wykorzystuje si´ zjawisko 

supresji (SSH, ang. Suppression 

Subtractive Hybridisation) reakcji 

PCR. Supresja, zwana inaczej wewnàtrzczàsteczkowà 

hybrydyzacjà 

fragmentów homologicznych mo˝e 

zajÊç w przypadku, gdy jednoniciowe 

fragmenty DNA posiadajà na obu 

koƒcach komplementarne wzgl´dem 

siebie sekwencje (w tym przypadku 

adaptory). Krawczyk i wsp. 

(2002, 2003, 2004) zastosowali 

ADSRRS-fingerprinting do typowania 

szczepów Enterococcus faecium, 

Staphylococcus aureus, Klebsiella 

pneumoniae, Serratia marcescens 

i Acinetobacter baumannii w badaniach 

epidemiologicznych zaka˝eƒ 

szpitalnych. W metodzie PCR MP 

(ang. PCR Melting Profiles) ograniczenie 

iloÊci amplifikowanych fragmentów 

uzyskuje si´ poprzez zastosowanie 

ni˝szej ni˝ w standardowej 

metodzie LM PCR temperatury denaturacji 

DNA. W reakcji PCR selektywnoÊç 

i potencja∏ ró˝nicujàcy 

metody mo˝na regulowaç poprzez 

dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego 

oraz temperatury denaturacji 

w reakcji PCR. Niewàtpliwà 

zaletà techniki PCR MP jest mo˝liwoÊç 

ró˝nicowania fragmentów DNA 

o identycznej d∏ugoÊci, ale ró˝nym 

sk∏adzie zasad, co znaczàco odró˝nia 

jà od pozosta∏ych technik LM PCR. 

Technika PCR MP zosta∏a wykorzystana 

przez Krawczyk i wsp. (2006, 

2007) do ró˝nicowania klinicznych 

szczepów bakteryjnych E. coli, Enterococcus 

faecium, Staphylococcus 

aureus oraz dro˝d˝aków z rodzaju 

Candida. 

Szczególne zainteresowanie i dynamiczny 

rozwój techniki LM PCR 

zawdzićzajà: 

● uniwersalnoÊci – nie wymagajà znajomoÊci 

analizowanej sekwencji DNA; 

● opierajà si´ na analizie ca∏ego genomu 

bakteryjnego czy grzybowego 

– jest to korzystne ze wzgl´du na 

fakt, i˝ interpretacja i u˝ytecznoÊç danych 

opartych na analizie genów lub 

operonów wyst´pujàcych pojedynczo 

w genomie w wielu przypadkach 

jest niewystarczajàca; 

● prostocie wykonania (w porównaniu 

np. z PFGE) przy zachowaniu wysokiego 

potencja∏u ró˝nicujàcego; 

● wymagajà do przeprowadzenia 

pe∏nej analizy niewielkich iloÊci DNA 

(warunkiem jest pozyskanie DNA 

z czystych kultur bakteryjnych); 

● sà powtarzalne, charakteryzujà si´ 

wysokim stopniem dyskryminacji badanych 

organizmów; 

● pozwalajà na wzgl´dnie szybkà 

analiz´ bez potrzeby inwestowania 

w wysoko wyspecjalizowany sprz´t, 

nie wymagajà du˝ych nak∏adów finansowych, 

dzi´ki czemu metody LM 

PCR mogà byç stosowane w rutynowych 

laboratoriach diagnostycznych. 

Wykorzystanie sekwencji 

repetytywnych 

Sekwencjonowanie genomów ujawni∏o, 

˝e du˝y procent genomowego 

DNA mikroorganizmów wyst´puje 

w postaci powtórzonych (repetytywnych) 

sekwencji (ang. DNA repeats). 

Powtórzenia ró˝nià si´ wielkoÊcià, lokalizacjà, 

stopniem z∏o˝onoÊci oraz 

rodzajem (ang. repeat mode). Powtórzenia 

mogà byç rozproszone na 

genomie, bàdê zlokalizowane w jednym 

miejscu. Sekwencje repetytywne 

oprócz du˝ego zakonserwowania 

ewolucyjnego, wykazujà równie˝ wystarczajàcà 

zmiennoÊç, która mo˝e 

byç wykorzystana do ró˝nicowania 

szczepów bakteryjnych. 

Powtórzone jednostki mogà byç identyczne 

(homogenne powtórzenia), 

bàdê mogà ró˝niç si´ nieznacznie 

wskutek mutacji punktowych (heterogenne 

powtórzenia). Zosta∏y wprowadzone 

ró˝ne podzia∏y sekwencji 

repetytywnych np. powtórzenia proste 

7

8 

(ang. direct repeats), powtórzenia 

podwójne (ang. dyad repeats), powtórzenia 

odwrócone (ang. inverted 

repeats). W Êwiecie bakterii zosta∏ 

zaproponowany podzia∏ na dwie klasy 

powtórzeƒ na genomie: 

1. powtórzenia proste, z∏o˝one z krótkich 

oligonukleotydów (zwykle 1–5 

nukleotydów), powtórzone wielokrotnie 

obok siebie w konfiguracji 

„g∏owa-do-ogona” (ang. head-to-tail), 

2. d∏ugie powtórzenia (np. elementy 

insercyjne IS, transpozony Tn i powtórzenia 

rozdzielone (ang. spaced 

repeats). Istniej równie˝ podzia∏ na 

sekwencje rozproszone na genomie 

oraz skupione tzw. sàsiadujàce. Poni- 

˝ej przedstawiono krótki opis niektórych 

sekwencji repetytywnych i ich 

wykorzystanie w typowaniu mikroorganizmów. 

Rozproszone powtórzenia 

w genomie prokariotycznym 

Rozproszone repetytywne motywy 

znaleziono u du˝ej liczby gatunków 

bakterii. Opisano je w pracy przeglàdowej 

Lupski i Winstock (1992). Wi´kszoÊç 

tych elementów rozrzucona na 

genomie jest krótsza ni˝ 200 par zasad 

(pz), sk∏ada si´ z sekwencji niekodujàcej, 

po∏o˝onej mi´dzycistronowo. 

Do powtórzeƒ rozproszonych nale˝à 

sekwencje charakterystyczne dla bakterii 

Gram-ujemnych nale˝àcych do 

Enterobacteriaceae: ERIC (ang. Enterobacterial 

Repetitive Intergenic Consensus) 

o d∏ugoÊci 124–127 pz, i REP 

(ang. Repetitive Extragenic Palindrome) 

o d∏ugoÊci 38 pz. 

ERIC-PCR jest metodà fingerprinting 

opartà na amplifikacji genomowego 

DNA po∏o˝onego pomi´dzy elementami 

ERIC lub pomi´dzy elementami 

ERIC i innymi repetytywnymi sekwencjami 

DNA. Pomimo, ˝e sekwencje te 

zosta∏y opisane dla bakterii z rodzaju 

Enterobacteriaceae z powodzeniem 

technika ta mo˝e byç wykorzystana 

do typowania równie˝ innych bakterii. 

Elementy repetytywne w systemie 

PCR zosta∏y wykorzystane do badania 

zwiàzków pomi´dzy patogenami szpitalnymi 

np. dla E. coli, S. aureus ienterokoków. 

Analogiczne sekwencje 

by∏y wykryte u innych gatunków mikroorganizmów, 

takich jak: cyjanobakterie 

czy bakterie glebowe Rhizobium 

meliloti. 

We wczesnych latach dziewi´çdziesiàtych 

zidentyfikowano inny motyw 

rozproszonego powtórzenia u Streptococcus 

pneumoniae, zwany powtórzeniem 

BOX, odmienny od 

powtórzeƒ ERIC czy REP. Te powtórzenia 

tworzà stabilne drugorz´dowe 

struktury i sà w niektórych przypadkach 

transkrybowane. Ich funkcja jest 

prawdopodobnie zwiàzana z regulacjà 

ekspresji genów, poniewa˝ spotyka 

si´ je w bliskim sàsiedztwie genów 

np. odpowiedzialnych za wirulencj´. 

Od czasu wykrycia elementów BOX 

sà one wykorzystywane w typowaniu 

molekularnym. Wszystkie te prokariotyczne 

motywy reprezentujàce repetytywne 

DNA nie sà zorganizowane 

w tandemowe powtórzenia, ale sà 

rozrzucone wewnàtrz genomu mikroorganizmów. 

Powtórzenia sàsiadujàce 

(stykajàce si´) 

W okreÊlonych fragmentach genomu 

spotykane sà krótkie powtórzone sekwencje 

(powtórzone jednostki liczà 

od 1 do 25 nukleotydów) nazywane: 

SSRs (ang. Short Sequences Repeats), 

bàdê krótkie tandemowe powtórzenia 

STRs (ang. Short Tandem 

Repeats). Bogate w tego typu repetytywne 

regiony sà m.in. geny kodujàce 

tRNA na genomie bakteryjnym. 

Stanowià je ró˝nej d∏ugoÊci krótkie 

powtórzone jednostki. Jest kilka takich 

„eubakteryjnych loci” bogatych 

w SSR, np. dla Hemophilus influenzae 

geny lic1–lic3 zawierajà motyw 

powtórzony CAAT, w genomie Neisseria 

meningitidis wykryto domeny 

(CTA)9, podczas gdy domeny (CTA)11 

i (CTT)21 by∏y odkryte odpowiednio 

w sekwencjach u Mycoplasma genitalium 

i Mycobacterium leprae. Takie 

SSR loci mogà byç wykorzystane jako 

markery w identyfikacji i rozprzestrzenianiu 

si´ szczepów bakteryjnych. 

Typowanie bakterii oparte na 

tandemowych powtórzeniach 

(ang. tandem repeats) 

Powtórzenia tandemowe majà istotne 

znaczenie w typowaniu bakterii, 

sà definiowane jako sekwencje monomeryczne, 

o zmiennej d∏ugoÊci, 

nawet do kilkuset nukleotydów, powtórzone 

periotycznie o konfiguracji 

„g∏owa-do-ogona”. Sekwencje powtórzone 

tandemowo o okreÊlonej 

konfiguracji monomerów mogà byç 

po∏o˝one w pojedynczym locus (geny 

jednokopijne), bàdê w kilku miejscach 

genomu. Równie˝ do wykrywania polimorfizmu 

krótkich tandemowych powtórzeƒ 

mo˝na wykorzystaç technik´ 

PCR. 

Tandemowe powtórzenia DNA pos∏u- 

˝y∏y jako cel molekularny do opracowania 

metod genotypowych ró˝nicowania 

m.in. takich bakterii patogennych jak: 

Yersinia pestis, Bacillus anthracis, 

Francisella tularensis, Mycobacterium 

tuberculosis, M. avium, M. bovis, M. 

leprae, Leptospira interrogans sensu 

stricto, Haemophilus influenzae, Salmonella 

typhimurium, S. typhi, Pseudomonas 

aeruginosa, Escherichia coli 

O157, Borrelia spp., Bordetella pertusis, 

Enterococcus faecium, Staphylococcus 

aureus, Neisseria meningitidis. 

Regiony, w których wyst´pujà ró˝nice 

w liczbie powtórzonych jednostek 

zwane sà domenami o zró˝nicowanej 

liczbie tandemowych powtórzeƒ 

(ang. Variable Number Tandem Repeat). 

Klasa VNTR u organizmów 

prokariotycznych dotyczy pojedynczego 

locus. Kombinacja polimorficznej 

natury VNTRs i zastosowanie 

techniki PCR sta∏o si´ podstawà opracowania 

nowej metody ró˝nicowania 

drobnoustrojów opartej na analizie 

zró˝nicowanej liczby tandemowych 

powtórzeƒ wielu loci – MLVA (ang. 

multiple-locus variable number tandem 

repeats analysis). Funkcjonuje 

ona jako genetyczny „fingerprint”. 

Zró˝nicowana liczba tandemowych 

powtórzeƒ wielu loci (MLVA) mo˝e 

byç odpowiednim podejÊciem do 

ró˝nicowania genetycznego wysoko 

monomorficznych gatunków takich 

jak Bacillus anthracis i Yersinia pestis. 

MLVA wykorzystano równie˝ do ró˝nicowania 

szczepów Staphylococcus 

aureus w uk∏adzie MP-PCR (ang. Multiplex 

PCR). Amplifikacji poddawano 

wiele polimorficznych loci charakteryzujàcych 

si´ powtórzeniami tandemowymi: 

clfA, clfB, sdr, spa, sspA. 

W roku 1991 opublikowano wykorzystanie 

tandemowych powtórzeƒ typu 

DR (ang. Direct Repeats) do identyfikacji 

Mycobacterium tuberculosis. 

Powtórzenia DR po∏o˝one sà w obr´bie 

flankujàcych sekwencji elementów 

insercyjnych IS i charakteryzujà 

si´ polimorfizmem pod wzgl´dem 

rozmiaru i kompozycji wÊród szczepów 

M. tuberculosis complex. Motyw 

DR sk∏ada si´ z krótkich powtórzonych 

sekwencji o d∏ugoÊci 36 par zasad, 

rozdzielonych unikalnymi obszarami

sekwencji rozdzielajàcej (ang. „spacer 

element”) o d∏ugoÊci od 35 do 41 

nukleotydów. Metoda okreÊlona jako 

„spoligotyping” oparta jest na amplifikacji 

PCR obszarów rozdzielajàcych 

sekwencje DR, ich znakowaniu i hybrydyzacji 

do oligonukleotydów (zakonserwowane 

powtórzenia) zwiàzanych 

z membranà nylonowà. Metod´ „spoligotyping” 

stosuje si´ do wst´pnej 

analizy epidemiologicznej gruêlicy. 

Obecnie bardzo przydatna jest metoda 

oparta o analiz´ MIRU-VNTR. 

MIRU (ang. Mycobacterial Interspersed 

Repetitive Units) sà to homologiczne 

46–100 nukleotydowe rozproszone 

sekwencje wykazujàce strukturalne 

podobieƒstwo do MSY1 ludzkich minisatelitów 

(zwane sà one równie˝ 

przez to sekwencjami mikrosatelitarnymi). 

SpoÊród 41 sekwencji MIRU 

wykorzystuje si´ 12, o d∏ugoÊci od 

52 do 77 nukleotydów. Ka˝da z 12 

sekwencji mo˝e wyst´powaç na genomie 

w kilku lub kilkunastu powtórzeniach 

w zale˝noÊci od szczepów. 

Metoda MIRU-VNTR oparta jest na 

niezale˝nej amplifikacji 12 loci przy 

wykorzystaniu sekwencji starterowych 

komplementarnych do regionów 

sàsiadujàcych z sekwencjami MIRU. 

Liczb´ powtórzeƒ sekwencji MIRU 

u poszczególnych loci obrazuje si´ jako 

uk∏ad liczb. System typowania MIRU- 

VNTR zosta∏ równie˝ zautomatyzowany 

i wykorzystuje uk∏ad multiplex-PCR, 

wyznakowane fluorescencyjnie startery 

i rozdzia∏ na automatycznym sekwenatorze. 

Dzi´ki technice PCR uleg∏a zwi´kszeniu 

czu∏oÊç i specyficznoÊç badaƒ 

diagnostycznych. Wprowadzenie do 

diagnostyki medycznej techniki PCR 

uproÊci∏o równie˝ procedury badawcze 

umo˝liwiajàc ich automatyzacj´ 

i powstanie szeregu handlowo dost´pnych 

testów. 

Komercyjny, zautomatyzowany 

system DiversiLab 

do typowania drobnoustrojów 

w oparciu o technik´ rep-PCR 

Tylko jeden system molekularnego typowania 

szczepów jest komercyjnie 

dost´pny w postaci wystandaryzowanego 

kitu – automatyczny system 

DiversiLab, który wykorzystuje rep-PCR 

do ró˝nicowania izolatów bakteryjnych 

i grzybowych oraz identyfikuje 

niektóre grzyby do poziomu gatunku. 

Po ekstrakcji DNA z wyizolowanych 

kultur, przeprowadzana jest 

reakcja amplifikacji w oparciu uk∏ad 

rep-PCR z wykorzystaniem starterów, 

dobranych odpowiednio do repetytywnych 

sekwencji, które sà rozdzielone 

sekwencjami genomu (stosujemy 

odpowiedni zestaw zwierajàcy w swoim 

sk∏adzie wszystkie komponenty potrzebne 

do przeprowadzenia reakcji 

PCR – DiversiLab DNA Fingerprinting 

Kit). Amplifikacji ulegajà fragmenty pomi´dzy 

sekwencjami repetytywnymi 

(startery dobrane do zewn´trznych 

sekwencji powtórzenia i skierowane 

naprzeciw siebie amplifikujà region 

pomi´dzy elementami repetytywnymi 

w przeciwieƒstwie do starterów 

skierowanych do wn´trza sekwencji 

repetytywnej, które amplifikujà elementy 

repetytywne jak w przypadku 

zró˝nicowanej liczby tandemowych 

powtórzeƒ – VNTR). Wiele amplikonów 

DNA o ró˝nej wielkoÊci i iloÊci 

(oraz intensywnoÊci) jest wytwarzana 

podczas PCR. Manualna metoda 

nastawiona jest na klasyfikacj´ drobnoustroju 

do podgatunku oraz na 

ró˝nicowanie szczepów bakteryjnych. 

Automatyczna metoda rep-PCR zawiera 

trzy komponenty: 1. odczynniki do 

rep-PCR w formie kitu; 2. bioanalizator, 

który s∏u˝y do rozdzia∏u amplifikowanych 

fragmentów na zintegrowanym, 

p∏ytkowym mikrosystemie cieczowym 

(ang. microfluidic chip) i detekcji 

opartej na pomiarze intensywno- 

Êci fluorescencji i czasie migracji 3. 

oprogramowanie do analizy wyników 

(jest to analiza w czasie rzeczywistym), 

które okreÊla podobieƒstwo 

pomi´dzy wszystkimi analizowanymi 

próbkami i raport wygenerowny 

przez DiversiLab System. Wyniki 

przedstawione sà w postaci dendrogramów 

(ilustrujà hierarchiczne relacje 

pomi´dzy izolatami) i wykresów 

graficznych, mo˝na uzyskaç równie˝ 

obraz naÊladujàcy elektroforegram. 

Komercyjnie dost´pne kity, automatyzacja, 

prostota wykonania, szybkoÊç 

(do ok. 4 godzin), przyjazny raport 

czyni DiversiLab System atrakcyjnym 

i dost´pnym dla wszystkich laboratoriów 

mikrobiologicznych. 

DiversiLab System zosta∏ wystandaryzowany 

dla wielu bakterii, dro˝d˝aków 

i dermatofitów. Ca∏y szereg prac naukowych 

donosi o du˝ej powtarzalno- 

Êci wewnàtrz- i mi´dzylaboratoryjnej. 

Brano pod uwag´ ró˝ne warunki hodowli 

drobnoustrojów, st´˝enie i jakoÊç 

matrycy do reakcji rep-PCR, badano 

powtarzalnoÊç w wielu laboratoriach 

z udzia∏em ró˝nego personelu 

i sprz´tu laboratoryjnego. Manualny 

rep-PCR jest u˝yteczny w typowaniu 

szczepów, ale podwa˝any jest przez 

niskà powtarzalnoÊç mi´dzylaboratoryjnà, 

jest bardziej czasoch∏onny oraz 

wymaga rozdzia∏u i detekcji amplikonów 

na ˝elu agarozowym. ReprodukcyjnoÊç 

metod genotypowania jest 

punktem krytycznym w d∏ugoterminowych 

badaniach epidemiologicznych 

i dla porównania archiwizowanych 

wzorów „fingerprint”. Wykazano, ˝e 

rep-PCR – fingerprinting jest stabilny 

po wielu pasa˝ach bakterii, powtarzalny 

w obr´bie szczepu i odleg∏y 

pomi´dzy szczepami. Zadowalajàcy 

potencja∏ ró˝nicujàcy i powtarzalnoÊç 

wzorów „fingerprint” dla rep-PCR 

Êwiadczy o przydatnoÊci tej metody 

do porównania d∏ugoterminowych 

badaƒ i studiów epidemiologicznych. 

Podsumowanie 

Wybór metody molekularnej nale˝y dostosowaç 

do problemu, który chcemy 

rozwiàzaç: wykrywanie, identyfikacja, 

ró˝nicowanie, badania taksonomiczne. 

Nie bez znaczenia istotne sà tu równie˝ 

aspekty techniczne tj. stopieƒ trudno- 

Êci wykonania (doÊwiadczenie personelu), 

zaplecze badawcze (sprz´t, 

którym dysponujemy), ∏atwoÊç interpretacji 

wyników, czas wymagany do 

analizy, ca∏kowite koszty stosowanej 

metody, oraz koszty pojedynczej próbki. 

W diagnostyce mikrobiologicznej 

system genotypowania drobnoustrojów 

powinien byç równie˝ tak dobrany, 

aby metoda by∏a wystarczajàco czu∏a, 

powtarzalna, odtwarzalna i powinna 

mieç du˝y potencja∏ ró˝nicujàcy. 

9

mikrobiologia 

Enterokoki oporne na wankomycynę (VRE) 

– epidemiologia i metody wykrywania 

dr Alicja Kuch 

Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Instytutu Leków w Warszawie 

12 

Enterokoki sà wzgl´dnie beztlenowymi 

Gram-dodatnimi ziarenkowcami. 

Wyodr´bnienie Enterococcus jako jednostki 

taksonomicznej – nowego rodzaju 

wÊród bakterii Gram-dodatnich, 

nastàpi∏o po roku 1980, co wiàza∏o si´ 

z wynikami badaƒ przeprowadzonych 

z wykorzystaniem nowych technik 

molekularnych – uprzednio bakterie 

te zaliczano do paciorkowców grupy 

D. Do dziÊ opisano ponad 30 gatunków 

Enterococccus spp. (1). W praktyce 

klinicznej najcz´Êciej wykrywa 

si´ i izoluje: Enterococcus faecalis 

(80–95%) i Enterococcus faecium 

(5–15%). W ostatnich latach E. faecium 

staje si´ jednak patogenem 

coraz powszechniejszym, co t∏umaczy 

si´ jego wi´kszà opornoÊcià na antybiotyki. 

Infekcje wywo∏ane przez pozosta∏e 

gatunki rodzaju Enterococcus 

sà sporadyczne. Enterokoki sà szeroko 

rozpowszechnione w Êrodowisku: wyst´pujà 

zarówno w wodzie, jak i w glebie, 

spotkaç je mo˝na powszechnie 

w Êwiecie roÊlin i zwierzàt. U ludzi 

wchodzà w sk∏ad mikroflory jelitowej, 

choç mogà równie˝ kolonizowaç skór´, 

cewk´ moczowà i ˝eƒskie drogi rodne 

(2). Enterokoki nale˝y traktowaç 

jako drobnoustroje oportunistyczne 

powodujàce infekcje u osób z obni- 

˝onà odpornoÊcià, hospitalizowanych, 

cierpiàcych na choroby przewlek∏e 

oraz poddawanych d∏ugotrwa∏ej antybiotykoterapii, 

zw∏aszcza cefalosporynami 

i glikopeptydami. Enterokoki 

powodujà zaka˝enia uk∏adu moczowego, 

zapalenie wsierdzia, posocznic´, 

zaka˝enia w obr´bie jamy brzusznej 

oraz infekcje mieszane ran oparzeniowych 

i chirurgicznych. Sporadycznie 

izolowane sà z zapaleƒ opon mózgowo-rdzeniowych 

i uogólnionych zaka- 

˝eƒ noworodkowych. Enterokoki nie 

posiadajà wielu spoÊród czynników 

zjadliwoÊci charakterystycznych dla 

innych Gram-dodatnich bakterii chorobotwórczych. 

Wytwarzajà jednak 

czynniki u∏atwiajàce ich adhezj´ do 

komórek gospodarza (adhezyna – 

bia∏ko wià˝àce kolagen), czynniki modulujàce 

odpornoÊç organizmu (bia∏ka 

wià˝àce domen´ Fc przeciwcia∏, 

peroksydaz´, dysmutaz´ nadtlenkowà, 

feromony p∏ciowe) oraz czynniki 

wywo∏ujàce zmiany patologiczne takie 

jak: cytolizynya (hemolizyna), proteinazy, 

hialuronidaza (3,4). 

Po pa∏eczkach z rodziny Enterobacteriacae 

i Staphylococcus aureus enterokoki 

zajmujà trzecie miejsce wÊród 

patogenów szpitalnych w USA i Europie 

(6,23). Do zaka˝eƒ szpitalnych 

mo˝e dochodziç zarówno na drodze 

endogennej jak i egzogennej, w tym 

ostatnim przypadku zw∏aszcza przez 

rće personelu medycznego. Przyczynà 

utrzymywania si´ enterokoków 

w Êrodowisku szpitalnym jest ich opornoÊç 

na czynniki fizyko-chemiczne, 

niskie wymagania od˝ywcze oraz naturalna 

i nabyta opornoÊç na wiele 

antybiotyków i chemioterapeutyków. 

Dla rozpowszechniania wyst´powania 

tej bakterii nie bez znaczenia jest 

równie˝ wzrost liczby osób z niedoborami 

uk∏adu immunologicznego. 

Enterokoki nale˝à do najbardziej 

opornych na wysokie temperatury 

spoÊród wszystkich bakterii nieprzetrwalnikujàcych. 

Wzrastajà w temperaturze 

10–45°C, w Êrodowisku 9,6% 

NaCl, przy pH 9,6 i prze˝ywajà ogrzewanie 

w 60°C przez 30 minut (2,7). 

Naturalna opornoÊç, b´dàca w∏aÊciwo- 

Êcià rodzaju, dotyczy penicylin izoksazolilowych, 

niskich st´˝eƒ antybiotyków 

aminoglikozydowych, kotrimoksazolu, 

cefalosporyn, linkozamidów oraz niskich 

st´˝eƒ glikopeptydów u gatunków E. 

casseliflavus i E. gallinarum (fenotyp 

VanC). 

OpornoÊç nabyta jest nowà cechà 

szczepów, wynikajàcà ze zmian w materiale 

genetycznym. Z klinicznego 

punktu widzenia najistotniejsze znaczenie 

ma opornoÊç na wysokie st´- 

˝enie aminoglikozydów (HLAR) oraz 

opornoÊç na wankomycyn´ (VRE). 

OpornoÊç ta stanowi powa˝ne niebezpieczeƒstwo, 

poniewa˝ glikopeptydy 

sà antybiotykami z wyboru w terapii 

powa˝nych zaka˝eƒ wieloopornymi 

szczepami enterokoków oraz opornych 

na metycylin´ gronkowców (MRSA). 

Ponadto enterokoki mogà przekazywaç 

geny kodujàce opornoÊç na glikopeptydy 

innym drobnoustrojom, np. 

Staphylococcus aureus (8). Szczepy 

E. faecium i E. faecalis HLAR i VRE 

w∏àczono na list´ szpitalnych patogenów 

alarmowych (5). 

Wankomycyna jest glikopeptydem 

o z∏o˝onej budowie chemicznej wywierajàcym 

dzia∏anie bakteriobójcze 

na bakterie Gram-dodatnie poprzez 

hamowanie syntezy g∏ównego sk∏adnika 

Êciany komórkowej bakterii, 

peptydoglikanu. Tworzy kompleks 

z D-alanylo-D-alaninà w czàsteczce 

prekursora mureiny hamujàc polimeryzacj´ 

i transpeptydacj´ peptydoglikanu. 

Mechanizm opornoÊci na 

wankomycyn´ polega na wytwarzaniu 

przez bakterie zmienionych 

czàsteczek dipeptydów: D-alanino- 

D-mleczanu oraz D-alanino-D-seryny 

o niskim powinowactwie do wankomycyny, 

które w∏àczane sà zamiast 

D-alanylo-D-alaniny w ∏aƒcuch prekursora. 

Wówczas wankomycyna nie 

jest ju˝ w stanie zablokowaç syntez´ 

peptydoglikanu (9). Opisano dotychczas 

6 fenotypów opornoÊci na wankomycyn´: 

VanA (10), VanB (11), 

VanC (12), VanD (13,14), VanE (15) 

i VanG (16) (Tabela 1). Fenotypy te 

ró˝nià si´ mi´dzy sobà lokalizacjà 

genów warunkujàcych opornoÊç 

(w tym zdolnoÊcià do ich horyzontalnego 

rozprzestrzeniania), poziomem 

ekspresji, zakresem opornoÊci i znaczeniem 

klinicznym. SpoÊród nabytych 

i rozprzestrzeniajàcych si´ horyzontalnie 

fenotypów najlepiej scharakteryzowane 

i najbardziej powszechne sà 

VanA i VanB. Fenotyp VanA zdefiniowany 

jest poprzez indukowalnà opornoÊç 

na wysoki poziom wankomycyny 

i teikoplaniny. Fenotyp VanB cechuje 

indukowalna opornoÊç wobec wankomycyny 

na ró˝nym poziomie i wra˝liwoÊç 

na teikoplanin´. OpornoÊç 

VanA i VanB jest przekazywana mi´dzy 

drobnoustrojami za pomocà ru-

chomych elementów genetycznych 

takich jak plazmidy i transpozony. 

Fenotyp VanC jest zwiàzany z konstytutywnym, 

niskim stopniem oporno- 

Êci na wankomycyn´ i wra˝liwoÊcià 

na teikoplanin´. Fenotyp VanD przypomina 

VanB i charakteryzuje si´ 

konstytutywnà opornoÊcià na wankomycyn´ 

i niskà opornoÊcià na teikoplanin´. 

Szczepy o fenotypie VanE 

wykazujà niski stopieƒ opornoÊci na 

wankomycyn´ i wra˝liwoÊç na teikoplanin´. 

Szczep E. faecalis, zaklasyfikowany 

jako VanG, wykazuje wra˝liwoÊç 

na glikopeptydy podobnà do 

enterokoków o fenotypie VanE, ale 

zespó∏ genów warunkujàcych t´ 

opornoÊç (vanG) posiada odmiennà 

organizacj´ ni˝ pozosta∏e znane loci 

dla van (16). 

Enterokoki oporne na wankomycyn´ 

VRE (ang. vancomycin-resistant enterococcus) 

wykryto po raz pierwszy w Europie 

w 1986 r. (17,18), a w 1988 r. 

opisano je w Stanach Zjednoczonych 

(19). W Polsce szczepy oporne na 

wankomycyn´ zarejestrowano po 

raz pierwszy w grudniu 1996 roku 

na oddziale hematologicznym Szpitala 

Klinicznego w Gdaƒsku (20). Od 

momentu pojawienia si´ szczepów 

VRE na Êwiecie obserwujemy systematyczny 

wzrost liczby infekcji wywo∏anych 

tymi szczepami. W USA 

liczba szpitalnych zaka˝eƒ VRE wzros∏a 

drastycznie w okresie 1989–1999 

z 0,3% do 25,2%, co zwiàzane jest 

z masowym wykorzystaniem wankomycyny 

w terapii zaka˝eƒ szczepami 

MRSA i biegunki poantybiotykowej 

wywo∏anej przez Clostridium difficile 

(6). W USA szczepy VRE izoluje si´ 

g∏ównie wÊród pacjentów oddzia∏ów 

intensywnej opieki medycznej, nie 

stwierdzono natomiast pozaszpitalnych 

rezerwuarów VRE (21,22). Wg 

danych European Antimicrobial Resistance 

Surveillance System (EARSS) 

w Europie liczba zaka˝eƒ szpitalnych 

VRE jest znacznie ni˝sza, pomimo 

obserwowanej tendencji wzrostowej 

z 3,3% w roku 2001 do 7,8% w roku 

2004 (23). Najbardziej istotny statystycznie 

wzrost liczby szpitalnych zaka˝eƒ 

VRE w ciàgu ostatnich pićiu 

lat odnotowano w pićiu krajach: 

Grecja, W∏ochy, Anglia, Irlandia oraz 

Portugalia. Wi´kszoÊç epidemii szpitalnych 

VRE dotyczy oddzia∏ów hematologicznych 

i nefrologicznych 

i zwiàzana jest z rozprzestrzenianiem 

si´ wieloopornego, epidemicznego, 

szpitalnego kompleksu klonalnego 

17 (CC 17) szczepów E. faecium (23, 

24). W Europie, w przeciwieƒstwie do 

Stanów, opisano pozaszpitalne rezerwuary 

szczepów VRE wÊród zdrowych 

ludzi (bezobjawowych nosicieli) 

i zwierzàt hodowlanych. Prawdopodobnym 

êród∏em pozaszpitalnych 

szczepów VRE by∏y zwierz´ta, karmione 

paszà wzbogaconà innym antybiotykiem 

glikopeptydowym – awoparcynà 

(25). Szczepy zwierzće via ∏aƒcuch 

pokarmowy uleg∏y przeniesieniu na ludzi 

a ich geny opornoÊci przeniesieniu 

na szczepy pochodzenia ludzkiego za 

pomocà ruchomych elementów genetycznych 

(transpozony) (22). Kolonizacja 

dotyczy g∏ównie przewodu 

pokarmowego, rzadziej ujÊcia cewki 

moczowej. Kolonizacja VRE zdrowych 

ludzi mo˝e trwaç od kilku tygodni 

do kilku lat (22) i stanowiç êród∏o 

infekcji VRE dla osób z grupy ryzyka 

(d∏ugotrwa∏a hospitalizacja, d∏ugotrwa∏a 

antybiotykoterapia, pobyt na 

oddziale intensywnej terapii, hematologicznym 

lub onkologicznym) (21). 

Dlatego wyhodowanie VRE od osoby 

z personelu medycznego wià˝e si´ 

z koniecznoÊcià odsunićia jej, do czasu 

ustania nosicielstwa, od opieki nad 

pacjentami VRE ujemnymi (21,26). 

Pacjenci skolonizowani lub zaka˝eni 

VRE powinni podlegaç procedurom 

opracowanym przez Zespó∏ ds. Kontroli 

Zaka˝eƒ w celu zapobiegania 

i kontroli rozprzestrzeniania si´ zaka- 

˝eƒ VRE. W ostatnich latach prowadzi 

si´ badania z u˝yciem doustnych antybiotyków 

nad eradykacjà kolonizacji, 

co umo˝liwi kontrol´ rozprzestrzeniania 

si´ i zmniejszenie cz´stoÊci infekcji 

VRE (27). 

Identyfikacja Enterokoków 

Ziarniaki Gram-dodatnie katalazoujemne 

rodzaju Enterococcus w preparatach 

barwionych uk∏adajà si´ 

pojedynczo, parami lub w krótkie 

∏aƒcuszki. Schemat diagnostyczny 

enterokoków obejmuje ich izolacj´ 

na pod∏o˝u agarowym (Columbia, 

TSA, Schaedler) wzbogaconym krwià, 

identyfikacj´ fenotypowà do rodzaju 

i gatunku, oraz oznaczenie wra˝liwo- 

Êci na antybiotyki i chemioterapeutyki 

(antybiogram) zgodnie z rekomendacjami 

CLSI i KORDL obejmujàce: 

badanie w kierunku opornoÊci na 

wysokie st´˝enia aminoglikozydów 

(tzw. fenotyp HLAR) i opornoÊci na 

wankomycyn´ (w przypadku VRE 

z oznaczeniem minimalnego st´˝enia 

hamujàcego, MIC, wankomycyny 

i teikoplaniny). Szybka i precyzyjna 

identyfikacja do poziomu gatunku, 

szczególnie w przypadku ci´˝kich zaka˝eƒ 

enterokokowych (zapalenie 

wsierdzia, posocznica), stanowi wa˝nà 

wskazówk´ terapeutycznà do 

momentu oznaczenia lekowra˝liwo- 

Êci badanego szczepu. Identyfikacja 

E. casseliflavus i E. gallinarum, które 

sà naturalnie oporne na wankomycyn´ 

(obecnoÊç genu vanC), pozwala 

z góry uniknàç stosowania wankomycyny 

w terapii zaka˝eƒ wywo∏anych 

przez te gatunki. KoniecznoÊcià wydaje 

si´ obecnie rozró˝nienie gatunków 

E. faecalis i E. faecium ze wzgl´du na 

ich znaczenie kliniczno-epidemiologiczne 

i gatunkowo-specyficzne mechanizmy 

opornoÊci na leki (naturalna 

opornoÊç E. faecalis na chinupristin´/ 

dalfopristin´) (28). 

Na pod∏o˝ach wzbogaconych krwià 

enterokoki rosnà w postaci kolonii szaro-bia∏ych, 

g∏adkich i okràg∏ych z hemolizà 

lub bez. Szczepy E. faecalis 

wytwarzajàce cytolizyn´ (hemolizyn´) 

na pod∏o˝ach agarowych z krwià 

króliczà, ludzkà lub koƒskà wykazujà 

hemoliz´ typu beta. Natomiast na 

pod∏o˝u agarowym z dodatkiem krwi 

baraniej szczepy te mogà dawaç 

hemoliz´ alfa lub gamma (brak hemolizy). 

Inne gatunki sà zazwyczaj 

alfa-hemolizujàce. Powszechnie stosowane 

pod∏o˝a wybiórczo-ró˝nicujàce 

dla enterokoków zawierajà ˝ó∏ç, 

eskulin´ i cytrynian ˝elaza oraz azydek 

sodu. Na tych pod∏o˝ach wokó∏ 

kolonii enterokokowych pojawia si´ 

bràzowo-czarne zabarwienie wskutek 

hydrolizy eskuliny do eskuletiny, 

która reaguje z cytrynianem ˝elaza 

dajàc barwny kompleks. Dodatek 

cytrynianu i azydku sodu warunkuje 

wybiórczoÊç pod∏o˝a w stosunku do 

bakterii Gram-ujemnych i innych ni˝ 

enterokoki Gram-dodatnich. 

Identyfikacja i zró˝nicowanie enterokoków 

do rodzaju obejmuje: 

● wyglàd kolonii i typ hemolizy na pod- 

∏o˝u agarowym wzbogaconym krwià 

baranià, 

● wyglàd drobnoustrojów w preparacie 

barwionym metodà Grama, 

13

14 

● zdolnoÊç do wytwarzania katalazy, 

● zdolnoÊç wzrostu w zakresie temperatur 

10–45°C, 

● zdolnoÊç wzrostu w bulionie o pH 

9,6 oraz w bulionie z dodatkiem 

6,5% NaCl, 

● zdolnoÊç hydrolizy eskuliny w obecnoÊci 

40% ˝ó∏ci, 

● zdolnoÊç do hydrolizy L-pyrrolidonylo-β-naftylamidu 

(test PYR) i L-leucynoβ-naftyloamidu 

(test LAP). ZdolnoÊç 

hydrolizy PYR posiada ponad 96% enterokoków 

i wszystkie rozk∏adajà LAP. 

Wyjàtek stanowià gatunki o niewielkim 

znaczeniu klinicznym: E. cecorum, E. 

columbae i E. saccharolyticus, które 

nie posiadajà zdolnoÊci hydrolizowania 

PYR (29,30), 

● okreÊlenie przynale˝noÊci do grupy 

serologicznej D wg Lancefield (antygen 

D wyst´puje u oko∏o 80% szczepów 

enterokoków). 

W celu identyfikacji enterokoków 

do poziomu gatunki wykorzystuje 

si´ g∏ównie ich cechy biochemiczne 

zgodnie ze schematem zaproponowanym 

przez Facklama (31,29): 

● fermentacja cukrów i alkoholi (rafinoza, 

sacharoza, mannitol, sorbitol), 

● hydroliza argininy, 

● wykorzystanie pirogronianu z wytworzeniem 

acetoiny. 

W identyfikacji gatunku pomocne 

jest równie˝: 

● obserwowanie ruchu umo˝liwiajàce 

odró˝nienie E. casseliflavus i E. gallinarum 

(gatunki ruchliwe) od E. faecalis 

i E. faecium (gatunki nie wykazujàce 

ruchu), 

● wytwarzanie ˝ó∏tego barwnika na 

pod∏o˝u agarowym przez E. casselifavus, 

E. mundtii i E. sulfurens, 

● redukacja tellurynu potasu podczas 

wzrostu na pod∏o˝u agarowym 

z dodatkiem 0,04% tellurynu. 

Do ca∏kowitej redukcji tellurynu zdolny 

jest jedynie gatunek E. faecalis, 

po∏owicznà reakcj´ wykazujà natomiast 

gatunki ruchliwe: E. casseliflavus 

i E. gallinarum. Pozosta∏e istotne 

kliniczne gatunki enterokoków (E. faecium, 

E. durans, E. avium, E. hirae) 

wykazujà wynik ujemny w tym teÊcie 

(31,32). E. faecalis wzrasta na pod- 

∏o˝u z dodatkiem 0,04% tellurynu 

potasu w postaci czarnych koloni 

w wyniku inkrustacji komórek bakteryjnych 

per∏owo-czarnymi kryszta∏ami 

zredukowanego do metalicznego 

telluru – tellurynu potasu. 

Zaproponowany przez Facklama 

(31) schemat identyfikacji fenotypowej 

enterokoków do poziomu gatunku 

sta∏ si´ podstawà do opracowania 

komercyjnych testów identyfikacyjnych 

o charakterze automatycznym 

i pó∏automatycznym wykorzystywanych 

rutynowo w laboratoriach mikrobiologicznych 

(33,34). 

Oznaczanie opornoÊci 

na wankomycyn´ 

Rutynowo stosowanà w laboratoriach 

mikrobiologicznych metodà wykrywania 

VRE jest metoda dyfuzyjno-krà˝kowa 

z u˝yciem krà˝ków o zawartoÊci 

wankomycyny 30 µg i teikoplaniny 

30 µg (35,36). Nale˝y pami´taç o koniecznoÊci 

24 godzinnej inkubacji. 

Odczyt przeprowadzaç nale˝y w Êwietle 

przechodzàcym. Izolat uznajemy za 

oporny równie˝ w przypadku wzrostu 

mg∏awicowego i obecnoÊci kolonii 

w strefie zahamowania wzrostu. Dla 

szczepów wykazujàcych stref´ Êredniej 

wra˝liwoÊci nale˝y oznaczyç MIC 

lub oznaczyç wra˝liwoÊç na glikopeptydy 

metodà przeglàdowà rekomendowanà 

przez CLSI. Na pod∏o˝e 

BHIA (Brain Heart Infusion Agar) 

o zawartoÊci 6 µg/ml wankomycyny 

nale˝y nanieÊç 10 µl zawiesiny bakteryjnej 

o g´stoÊci 0,5 McFarlanda, 

a nast´pnie inkubowaç 24 godziny 

w temp. 35°C w warunkach tlenowych. 

Izolat uznaje si´ za oporny 

w przypadku uzyskania jego wzrostu 

na pod∏o˝u w postaci co najmniej jednej 

kolonii. Do okreÊlenia fenotypu 

opornoÊci badanego izolatu nale˝y 

wówczas okreÊliç MIC oraz potwierdziç 

identyfikacj´ do gatunku. Konieczne 

jest wykonanie testu na ruch 

oraz wytwarzanie barwnika w celu 

rozró˝nienia czy nie mamy do czynienia 

z gatunkami o naturalnej oporno- 

Êci na wankomycyn´ (E. gallinarum 

i E. casseliflavus), które cz´sto rosnà 

na pod∏o˝u z 6 µg/ml wankomycynà 

(35,36). Problem diagnostyczny stanowiç 

mogà E. gallinarum i E. casseliflavus 

nie wykazujàce ruchu, wówczas 

przydatny jest test na zakwaszenie 

metylo-D-glukopiranozydu (MGP). E. 

gallinarum i E. casseliflavus zakwaszajà 

MGP, natomiast E. faecium i E. 

faecalis nie wykazujà tej reakcji (37). 

Do badaƒ przesiewowych w kierunku 

VRE wykorzystywane sà równie˝ pod- 

∏o˝a mikrobiologiczne zawierajàce 

obok wankomycyny substancje hamujàce 

wzrost innych drobnoustrojów 

ni˝ szczepy wankomycynooporne 

(np. azydek sodu) oraz substancje 

wskaênikowe dla enterokoków (eskulina, 

40% ˝ó∏ç). Coraz cz´Êciej do 

pod∏o˝y dodawane sà wskaêniki chromogenne. 

Ró˝ne systemy automatyczne stosowane 

w laboratoriach mikrobiologicznych 

dysponujà panelami antybiotykowymi 

umo˝liwiajàcymi wykrycie i zró˝nicowanie 

fenotypów VRE na VanA, VanB 

i VanC. Sà to testy szybkie, wiarygodne 

i odznaczajàce si´ wysokà czu∏oÊcià 

(38,33,34). 

Referencyjnà metodà wykrywania 

VRE jest analiza molekularna z wykorzystaniem 

techniki PCR, za pomocà 

której precyzyjne okreÊla si´ system 

opornoÊci obecny w danym szczepie 

(39). PCR z regu∏y wykorzystywany jest 

w celu potwierdzenia klasycznych, fenotypowych 

oznaczeƒ lekowra˝liwoÊci. 

Gwa∏towny wzrost liczby zaka˝eƒ enterokokowych, 

szczególnie w Êrodowisku 

szpitalnym, powoduje koniecznoÊç wykonania 

badaƒ epidemiologicznych, 

w tym typowania fenotypowego i genotypowego, 

jako elementu systemu 

kontroli zaka˝eƒ. Typowanie, czyli ró˝nicowanie 

wewnàtrzgatunkowe polega 

na badaniu pokrewieƒstwa pomi´dzy 

izolatami poddanymi analizie. Prowadzi 

ono do identyfikacji ogniska epidemicznego, 

ustalenia êród∏a i dróg 

transmisji szczepów epidemicznych 

(40). Metody fenotypowe wewnàtrzgatunkowego 

ró˝nicowania izolatów 

opierajà si´ na porównaniu np. cech 

biochemicznych, serologicznych, czy 

wzorów lekowra˝liwoÊci, natomiast 

metody genotypowe (genetyczne, 

molekularne) polegajàce na analizie 

ró˝nic zawartoÊci DNA chromosomalnego 

i pozachromosomalnego oraz 

ró˝nic okreÊlonych sekwencji DNA pomi´dzy 

poszczególnymi izolatami (41). 

Metoda referencyjna, wysoce ró˝nicujàca, 

stosowana w genotypowaniu 

enterokoków to analiza fragmentów 

restrykcyjnych chromosomalnego DNA 

w elektroforezie w zmiennym polu 

elektrycznym- RFLP-PFGE (Restriction 

Fragment Length Polimorphism 

– Pulsed-Field Gel Electrophoresis) 

(42). Szybkà i ∏atwà metodà typowania 

jest analiza liczby tandemowych

powtórzeƒ – MLVA (Multilocus variable-number 

tandem repeat analysis) 

(43). Technika ta opiera si´ na analizie 

tandemowo powtarzajàcych si´ 

sekwencji par zasad (minisatelitarny 

DNA) równoczeÊnie dla kilku wybranych 

loci. Liczba powtórzeƒ jest zró˝nicowana 

wÊród ró˝nych szczepów 

tego samego gatunku, co jest spowodowane 

licznymi zdarzeniami rekombinacyjnymi. 

Ostatnio coraz cz´Êciej 

wykorzystywanà metodà w ocenie 

pokrewieƒstwa szczepów bakteryjnych 

w badaniach populacyjnych i analizie 

epidemiologicznej jest technika MLST 

(Multilocus Sequence Typing). Polega 

ona na sekwencjonowaniu okre- 

Êlonych fragmentów kilku genów 

kodujàcych enzymy metabolizmu 

podstawowego (w przypadku enterokoków 

7 genów) odznaczajàcych 

si´ pewnym stopniem polimorfizmu. 

Metoda ta odznacza si´ wysokà czu- 

∏oÊcià i powtarzalnoÊcià. Umo˝liwia 

identyfikacj´ drobnoustrojów i analiz´ 

porównawczà profili allelicznych 

z wykorzystaniem internetowej bazy 

danych (www.mlst.net) (44). 

Podsumowanie 

Wankomycycnooporne szczepy enetrokoków 

nale˝à do szpitalnych patogenów 

alarmowych i stanowià coraz 

cz´stsze êród∏o epidemii szpitalnych 

dlatego znajomoÊç mechanizmów 

opornoÊci, szybka i precyzyjna diagnostyka, 

równie˝ do poziomu gatunku, 

pozwala uniknàç powa˝nych 

b∏´dów terapeutycznych i selekcji 

szczepów opornych. Coraz wi´ksza 

dost´pnoÊç ró˝norodnych pod∏o˝y 

diagnostycznych, testów automatycznych 

i biochemicznych pozwala 

na skrócenie czasu identyfikacji patogenu. 

Rozwój i dost´pnoÊç nowych 

technik molekularnych umo˝liwi∏, nie 

tylko precyzyjna identyfikacj´ patogenu, 

czy mechanizmu opornoÊci 

ale równie˝ Êledzenie rozprzestrzeniania 

si´ fenotypów opornoÊci, 

opracowywanie ognisk epidemicznych 

oraz porównywanie izolatów 

wyst´pujàcych na ca∏ym Êwiecie. 

PiÊmiennictwo u Autora 

Tabela 1. Charakterystyka fenotypów VRE (5,21) 

Fenotyp opornoÊci VanA VanB Vanc VanD VanE VanG 

Gatunki 

E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecium E. faecalis E. faecalis 

E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. faecalis 

E. gallinarum 

E. casseliflavus 

E. avium 

E. durans 

E. mundtii 

E. raffinosus 

OpornoÊç na 

Wankomycyna 

Wankomycyna 

Wankomycyna 

antybiotyk Teikoplanina Teikoplanina 

Wankomycyna Wankomycyna Wankomycyna 

MIC (mg/L) 

Wankomycyny 

MIC (mg/L) 

Teikoplaniny 

64–1000 4–1024 2–32 64–128 8–32 16 

16–512 0,5–1 0,5–1 4–64 0,5 0,5 

15 

Poziom opornoÊci wysoki zró˝nicowany niski Êredni niski niski 

Znaczenie kliniczne du˝e du˝e Êrednie nieznane nieznane nieznane 

Typ opornoÊci nabyta nabyta naturalna nabyta nabyta nabyta 

Przenoszenie 

Tn1546 na 

plazmidzie 

Tn1547 na 

plazmidzie 

chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie 

Syntetyzowany 

dipeptyd 

D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser 

Regulacja indukowalna indukowalna 

indukowalna 

konstytutywna 

konstytutywna indukowalna indukowalna

BADANIA PRZESIEWOWE BAKTERII WIELOOPORNYCH 

chromID VRE 

Podłoże chromogenne do badań przesiewowych E. faecium i E. faecalis 

wykazujących nabytą oporność na wankomycynę (VRE) 

Izolacja enterokoków opornych 

na wankomycynę VRE 

i Decyzja o Izolacji Pacjenta

ocena produktu 

Ocena przydatności podłoża chromID VRE 

firmy bioMérieux w monitorowaniu zakażeń szpitalnych 

dr Elżbieta Stefaniuk, dr Alicja Kuch 

Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 

Zaka˝enia wywo∏ywane wankomycynoopornymi 

enterokokami (VRE, ang. 

vancomycin resistant enterococci) 

stanowià problem na ca∏ym Êwiecie, 

w tym tak˝e i w naszym kraju. 

Pierwsze udowodnione epidemiologicznie 

zaka˝enie VRE w Polsce, mia- 

∏o miejsce ju˝ w roku 1997 i od tego 

czasu obserwowaç mo˝na nasilenie 

tego zjawiska w skali ca∏ego kraju. Zaka˝enia 

Enterococcus spp. dotyczà 

w du˝ej mierze osób z dysfunkcjà 

uk∏adu immunologicznego, zw∏aszcza 

chorych onkologicznych, hematologicznych, 

zarówno pacjentów w wieku 

dziecićym, jak i w wieku dojrza∏ym. 

Zaka˝enia enterokokowe mogà mieç 

charakter endogenny, jak równie˝, egzogenny 

stwarzajàcy istotne problemy 

epidemiologiczne, przenoszony z pacjenta 

na pacjenta. Do najcz´stszych 

zaka˝eƒ enterokokowych nale˝à wywo∏ywane 

przez szczepy Enterococcus 

faecalis oraz E. faecium Wysi∏ki 

mikrobiologów zmierzajà w kierunku 

szybkiego i wiarygodnego stwierdzenia 

zaka˝enia, kolonizacji czy te˝ nosicielstwa 

Enterococcus spp. oraz okreÊlenia 

ich lekowra˝liwoÊci z jednoczesnà 

identyfikacjà mechanizmów oporno- 

Êci, takich jak opornoÊç wysokiego 

stopnia na aminoglikozydy tzw. HLAR 

(ang. high level aminoglicoside resistance), 

czy opornoÊç na leki glikopeptydowe 

(wankomycyn´, teikoplanin´). 

Zgodnie z zasadami monitorowania 

zaka˝eƒ szpitalnych, coraz wićej szpitali 

wykonuje badania przesiewowe 

w kierunku patogenów charakteryzujàcych 

si´ groênymi mechanizmami 

opornoÊci. 

Cel pracy 

W Zak∏adzie Epidemiologii i Mikrobiologii 

Klinicznej Narodowego Instytutu 

Leków w Warszawie przeprowadzono 

badanie walidacyjne pod∏o˝y 

chromogennych chromID VRE 

firmy bioMérieux przeznaczonych do 

badaƒ przesiewowych, pozwalajàcych 

wykryç w badanym materiale 

szczepy enterokoków opornych na 

wankomycyn´, z jednoczesnym rozró˝nieniem 

na podstawie ró˝nego 

zabarwienia kolonii szczepów E. faecalis 

(kolor niebiesko-zielony) i E. 

faecium (kolor fioletowy). Celem badania 

by∏a ocena przydatnoÊci pod- 

∏o˝a chromID VRE firmy bioMérieux 

do pracy rutynowej w monitorowaniu 

zaka˝eƒ VRE. 

Materia∏ i metody 

Badanie przeprowadzono dwutorowo: 

a. z wykorzystaniem 70 izolatów klinicznych 

E. faecium (n=30), E. faecalis 

(n=30) i E. gallinarum (n=10) 

pochodzàcych z materia∏ów klinicznych 

od pacjentów hospitalizowanych 

w polskich szpitalach i znajdujàcych 

si´ w kolekcji NIL. Szczepy te 

charakteryzowa∏y si´ ró˝nà wra˝liwo- 

Êcià na leki glikopeptydowe: szczepy 

wankomycynowra˝liwe (n=20) oraz 

z obecnoÊcià mechanizmów VanA 

(n=20), VanB (n=20) i VanC (n=10), 

b. z wykorzystaniem materia∏ów klinicznych 

(wymazy z odbytu) od siedmiu 

chorych hematologicznych. Materia∏ 

kliniczny opracowywano równolegle 

wg rutynowej procedury z wykorzystaniem 

pod∏o˝y wzrostowych i ró˝nicujàcych 

w kierunku enterokoków. 

Wszystkie u˝yte do badania izolaty 

zosta∏y dobrze scharakteryzowane 

w Zak∏adzie Epidemiologii i Mikrobiologii 

Klinicznej NIL, dzi´ki zastosowaniu 

ró˝nych technik identyfikacyjnych 

(metody konwencjonalne i automatyczne), 

metod oznaczania lekowra˝liwosci 

(metoda mikrorozcienczeƒ 

w bulionie wg zaleceƒ CLSI, metoda 

E-test wg zaleceƒ AB Biodisk), technik 

biologii molekularnej – metody 

PCR do wykrywania genów oporno- 

Êci vanA, vanB i vanC. Wyniki uzyskane 

tymi metodami stanowi∏y wyniki 

odniesienia w prowadzonej ocenie. 

Kontrol´ jakoÊci przeprowadzono 

z u˝yciem szczepów wzorcowych z kolekcji 

ATCC oraz kolekcji MIKROBANK. 

Badane izolaty w postaci hodowli na 

pod∏o˝u Columbia Agar z 5% krwi 

baraniej oraz materia∏y posiewano 

metodà redukcyjnà na pod∏o˝e 

chromID VRE firmy bioMérieux 

w dwojaki sposób: bezpoÊrednio na 

pod∏o˝e chromogenne oraz po wcze- 

Êniejszej 18–24 godzinnej inkubacji 

w temp. 37°C w bulionie mózgowosercowym 

(Brain-Heart broth) z krà˝kiem 

antybiogramowym zawierajàcym 

30 µg wankomycyny. Posiane w ten 

sposób pod∏o˝a inkubowano 24 godz. 

w 37°C w warunkach tlenowych. 

Nast´pnie obserwowano charakter 

wzrostu oraz zabarwienie kolonii poszczególnych 

izolatów. W przypadku 

bezpoÊredniego posiewu na pod∏o- 

˝e chromogenne, w sytuacji skàpego 

wzrostu lub braku wzrostu, inkubacj´ 

przed∏u˝ano o kolejne 24 godziny, 

zgodnie z zaleceniami producenta 

pod∏o˝a. 

Ocenie poddawano wzrost lub jego 

brak oraz zabarwienie kolonii poszczególnych 

izolatów bakteryjnych u˝ytych 

do badania, wyniki porównywano do 

wyników metod odniesienia. W przypadku 

posiewów materia∏ów klinicznych 

obserwowano charakter wzrostu 

drobnoustrojów, oceniano stopieƒ 

trudnoÊci interpretacji uzyskanego 

obrazu tak˝e w odniesieniu do wyników 

uzyskanych metodami konwencjonalnymi. 

Wyniki 

I. Izolaty bakteryjne E. faecalis, 

E. faecium i E. gallinarum 

B. wyniki posiewu bezpoÊredniego 

na pod∏o˝e chromID VRE 

● Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C 

w warunkach tlenowych uzyskano 

wyraêny wzrost, w postaci drobnych 

17

18 

kolonii szczepów E. faecalis i E. faecium, 

u których wykryto metodami 

odniesienia mechanizmy VanA i VanB. 

Kolonie E. faecalis wykazywa∏y zabarwienie 

od zielonego, poprzez turkusowy, 

a˝ do niebieskiego. Kolonie 

szczepów E. faecium zabarwione 

by∏y na kolor fioletowy o ró˝nej intensywnoÊci. 

Po przed∏u˝eniu czasu 

inkubacji o kolejne 24 godziny w warunkach 

j.w. uzyskano wzrost badanych 

szczepów w postaci du˝ych, 

intensywnie zabarwionych kolonii. 

Uzyskany obraz nie stwarza∏ problemów 

identyfikacyjnych. 

● Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C 

w warunkach tlenowych, w przypadku 

wankomycynowra˝liwych szczepów 

E. faecalis i E. faecium oraz szczepów 

nale˝àcych do gatunku E. gallinarum 

uzyskano delikatny, smu˝àcy 

wzrost na linii pierwszego posiewu 

wyraênie ró˝niàcy si´ od wzrostu 

szczepów wankomycynoopornych. 

Nie obserwowano wzrostu na ca∏ej powierzchni 

posiewu. Obraz nie ulega∏ 

zmianie po kolejnej dobie inkubacji. 

B. wyniki posiewu badanych 

szczepów z zastosowaniem etapu 

namna˝ania 

● W posiewie na pod∏o˝e chromID 

VRE, poprzedzonym etapem namna- 

˝ania badanych szczepów E. faecalis, 

E. faecium oraz E. gallinarum w bulionie 

mózgowo-sercowym (Brain- 

Heart broth) w obecnoÊci krà˝ka 

antybiogramowego z 30 µg wankomycyny, 

uzyskano wzrost wy∏àcznie 

wankomycynoopornych szczepów 

E. faecalis i E. faecium w postaci du- 

˝ych intensywnie zabarwionych kolonii 

pozwalajàcych odró˝niç mi´dzy 

sobà te dwa gatunki drobnoustroju. 

● W miejscu posiewu szczepów E. 

faecalis i E. faecium wankomycynowra˝liwych 

i szczepów E. gallinarum 

nie uzyskano ˝adnego wzrostu. 

kolonie zabarwione na fioletowo 

bàdê turkusowo, których izolacja i identyfikacja 

potwierdzi∏y przynale˝noÊç do 

rodzaju Enterococcus. Drobnoustroje 

towarzyszàce rosnà na pod∏o˝u w postaci 

kolonii bezbarwnych. 

B. wyniki posiewu wymazów 

z odbytu z zastosowaniem etapu 

namna˝ania 

Po zastosowaniu wczeÊniejszego etapu 

namna˝ania, na pod∏o˝u chromID 

VRE uzyskano wzrost mniej liczny ni˝ 

w przypadku tych samych materia∏ów 

z posiewu bezpoÊredniego. ObecnoÊç 

pojedynczych kolonii oraz intensywniejsze 

zabarwienie u∏atwia∏o 

interpretacj´ otrzymanego obrazu, 

kolonie o zabarwieniu fioletowym 

by∏y du˝e, w odró˝nieniu od kolonii 

turkusowych, których wzrost okreÊlono 

jako s∏aby, a intensywnoÊç zabarwienia 

jako Êrednià. Kolonie o zabarwieniu 

fioletowym i turkusowym poddawano 

dalszej identyfikacji: w preparacie 

mikroskopowym barwionym metodà 

Grama widoczne by∏y komórki ziarniaków 

Gram-dodatnich, po uzyskaniu 

wzrostu na pod∏o˝u agarowym 

z krwià wykonano identyfikacj´ biochemicznà 

testem rapid ID 32 Strep. 

Wyniki identyfikacji wskaza∏y w jednym 

przypadku Enterococcus faecalis, 

w pozosta∏ych E. faecium. Otrzymane 

wyniki by∏y zgodne z uzyskanymi metodami 

odniesienia. 

III. Sposób wykonania posiewu 

na pod∏o˝u chromID VRE 

Posiew redukcyjny zarówno materia∏ów 

klinicznych jak i szczepów bakteryjnych 

pozwoli∏ uzyskaç wzrost pojedynczych 

kolonii badanych drobnoustrojów, co 

w po∏àczeniu z zabarwieniem kolonii 

umo˝liwi∏o wst´pnà interpretacj´ oraz 

przeprowadzenie dalszych badaƒ diagnostycznych. 

dzi´ki wytwarzaniu β-galaktozydazy, 

E. faecalis – kolor niebiesko-zielony 

dzi´ki wytwarzaniu α-glukozydazy. 

Przeprowadzona analiza z u˝yciem 

70 ró˝nych pod wzgl´dem wra˝liwo- 

Êci na leki glikopeptydowe i mechanizmów 

opornoÊci izolatów klinicznych 

E. faecalis, E. faecium oraz E. gallinarum 

w pe∏ni potwierdza to stwierdzenie. 

Pod∏o˝e chromID VRE firmy 

bioMérieux hamuje wzrost szczepów 

enterokoków, które nie wykazujà 

ekspresji nabytej opornoÊci na wankomycyn´, 

gatunków enterokoków 

o fenotypie VanC, wi´kszoÊci bakterii 

Gram-ujemnych i Gram-dodatnich 

oraz grzybów. 

Przeprowadzone badania wskazujà na 

koniecznoÊç wykonywania posiewu 

badanego materia∏u metodà redukcyjnà 

oraz stosowanie etapu namna˝ania 

w bulionie mózgowo-sercowym. 

Stosowanie tych zaleceƒ umo˝liwia 

i u∏atwia interpretacj´ wyniku posiewu. 

Interpretacja wyników posiewu zarówno 

wyizolowanych izolatów bakteryjnych, 

jak i materia∏ów klinicznych 

powinna byç wykonywana przez do- 

Êwiadczonego mikrobiologa. Wiedza 

i doÊwiadczenie stanowià gwarancj´ 

uzyskania wiarygodnego wyniku. 

Wybiórcze pod∏o˝e chromogenne 

chromID VRE firmy bioMérieux 

jest pod∏o˝em przydatnym do wykrywania 

wankomycynoopornych szczepów 

E. faecium i E. faecalis u pacjentów 

z grup ryzyka. Nale˝y pami´taç, ˝e jest 

to pod∏o˝e do badaƒ przesiewowych 

i nie zast´puje rutynowych metod 

oznaczania lekowra˝liwoÊci. 

II. Wymazy z odbytu od pacjentów 

oddzia∏u hematologicznego 

A. wyniki posiewu bezpoÊredniego 

na pod∏o˝e chromID VRE 

Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C 

w warunkach tlenowych p∏ytek z bezpoÊrednim 

posiewem wymazów 

z odbytu na pod∏o˝e chromID VRE 

uzyskano wzrost zwartej masy drobnoustrojów 

charakteryzujàcych si´ 

ró˝nym wyglàdem kolonii pod 

wzgl´dem wielkoÊci i zabarwienia. 

WÊród wyros∏ych kolonii widoczne sà 

Wnioski 

Pod∏o˝e chromogenne chromID 

VRE firmy bioMérieux, dzi´ki zawartoÊci 

dwóch chromogennych substratów 

oraz 8 µg/L wankomycyny, 

pozwala w sposób szybki i wiarygodny 

wykryç szczepy E. faecalis i E. faecium 

oporne na wankomycyn´. 

BezpoÊrednie wykrycie E. faecium 

i E. faecalis mo˝liwe jest dzi´ki charakterystycznemu 

zabarwieniu kolonii: 

E. faecium przyjmuje fioletowy kolor

mikrobiologia 

Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum 

substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli 

i Klebsiella spp. za pomocą testu potwierdzającego 

wg CLSI oraz kart AST–N041 systemu VITEK 2 

Łukasz Golec, dr Krzysztof Golec 

Zakład Mikrobiologii Szpital Wojewódzki nr 2 w Rzeszowie 

Wprowadzenie 

Beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum 

substratowym (ESBL) sà grupà 

enzymów majàcych zdolnoÊç hydrolizy 

nawet trzeciej generacji cefalosporyn. 

Zaka˝enia wywo∏ane bakteriami 

posiadajàcymi ten mechanizm opornoÊci 

w znacznym stopniu ograniczajà 

opcje terapeutyczne zaka˝eƒ wywo- 

∏anych przez te szczepy. Z tego powodu 

szybkie i dok∏adne wykrywanie 

bakterii wytwarzajàcych ESBL jest bardzo 

wa˝ne w rutynowej pracy ka˝dego 

laboratorium mikrobiologii klinicznej, 

umo˝liwiajàc nie tylko prawid∏owà 

terapi´, ale wa˝ne jest równie˝ w zapobieganiu 

szerzenia si´ tego mechanizmu 

opornoÊci w Êrodowisku. 

Cel pracy 

Celem niniejszej pracy by∏o porównanie 

wykrywania β-laktamaz o rozszerzonym 

spektrum substratowym 

u Escherichia coli i Klebsiella spp. 

przez system Vitek 2 z zastosowaniem 

kart AST – N041 w porównaniu z testem 

potwierdzajàcym wg CLSI (5). 

Materia∏y i metody 

Materia∏ badany niniejszej pracy stanowi∏y 

izolaty bakterii E. coli i Klebsiella 

spp., uzyskane z materia∏ów klinicznych 

dostarczanych do Zak∏adu Mikrobiologii 

Szpitala Wojewódzkiego Nr 2 

w Rzeszowie w okresie od 01. marca 

do 31. lipca 2007 r. Analizie poddano 

187 szczepów bakteryjnych, z których 

139 pochodzi∏o z materia∏ów od chorych 

hospitalizowanych i 48 z materia- 

∏ów pozaszpitalnych (specjalistyczne 

przychodnie przyszpitalne, poradnie 

POZ, laboratoria prywatne) (Ryc. 1.). 

Identyfikacj´ do gatunku wykonano 

przy pomocy kart GN systemu VITEK 2, 

Tab. 1. Rodzaje materia∏ów, z których 

uzyskano izolaty 

Rodzaj materia∏u 

IloÊç 

izolatów 

Wymaz z górnych dróg 

oddechowych (gard∏o, nos) 50 

Wymaz z dróg rodnych 44 

Wymaz z rany, ropy 42 

Mocz 25 

Krew, PMR 12 

Materia∏y z dolnych dróg 

oddechowych (plwocina, BAL) 9 

˚ó∏ç 5 

natomiast oznaczenie obecnoÊci 

ESBL z u˝yciem kart AST-N041 tego 

systemu oraz testem potwierdzajàcym 

wg CLSI (5). 

1. Test potwierdzajàcy wg CLSI 

Na pod∏o˝e Mueller-Hinton (bioMérieux) 

nanoszono zawiesin´ badanego szczepu 

(o g´stoÊci 0,5 McFarlanda). 

Do oznaczeƒ u˝yto krà˝ków firmy 

BectonDickinson wysycanych nast´pujàcymi 

antybiotykami: 

● ceftazydym (CAZ – 30 µg), 

● ceftazydym + kwas klawulanowy 

(CAZ/CLA – 30/10 µg), 

● cefotaksym (CIX – 30 µg), 

● cefotaksym+kwas klawulanowy 

(CTX/CLA – 30/10 µg). 

Krà˝ki umieszczano na p∏ytce o Êrednicy 

90 mm w maksymalnych odleg∏oÊciach 

od siebie, pozwalajàcej na 

dok∏adne zmierzenie stref zahamowania 

wzrostu. P∏ytki inkubowano 

przez 18 h w 37°C i mierzono strefy 

zahamowania wzrostu. Za dodatni 

wynik testu uznawano taki w którym, 

strefa zahamowania wzrostu wokó∏ 

krà˝ka zawierajàcego antybiotyk + 

inhibitor by∏a wi´ksza lub równa 5mm, 

w porównaniu za strefà wzrostu wokó∏ 

krà˝ka z samym antybiotykiem. 

2. System VITEK 2 

Metoda ta wykorzystuje karty ze studzienkami 

wype∏nionymi odpowiednimi 

antybiotykami. Do badaƒ u˝yto 

kart AST-N041 umo˝liwiajàcych wykrywanie 

β-laktamaz o rozszerzonym 

spektrum substratowym. 

W sk∏ad testu ESBL wchodzi szeÊç 

studzienek: 

● zawierajàce sam cefotaksym 

(CTX) i ceftazydym (CAZ) 

w st´˝eniach 0,5 µg /ml oraz 

cefepim (FEP) w st´˝eniu 1µg/ml, 

● oraz studzienki zawierajàce 

antybiotyk w po∏àczeniu z kwasem 

klawulanowym (CTX/CAZ+CLA) 

w st´˝eniu 0,5/4 µg /ml oraz 

(FEP + CLA) w st´˝eniu 1/10. 

Badania wykonywano zgodnie z procedurà 

zalecanà przez producenta. 

Wynik testu przedstawiany jest jako: 

● ESBL „POS” – ESBL dodatni: 

wysokie prawdopodobieƒstwo, ˝e 

drobnoustrój wytwarza ESBL. 

● ESBL „NEG”- ESBL ujemny: 

bardzo niskie prawdopodobieƒstwo, 

˝e drobnoustrój wytwarza ESBL. 

Jako szczepów kontrolnych dla wymienionych 

metod u˝yto szczepów: 

● E. coli ATCC 25922, 

● E. coli ATCC 35218, 

● K. pneumoniae ATCC 700603. 

Wyniki i ich omówienie 

WÊród zbadanych 187 szczepów 144 

(77%) nale˝a∏o do gatunku E. coli, 

36 (19%) Klebsiella pneumoniae, 

a 7 do gatunku Klebsiella oxytoca, 

co stanowi∏o niespe∏na 4% wszystkich 

badanych szczepów (Ryc. 2.). 

W 48 izolatach wyhodowanych z materia∏ów 

pozaszpitalnych nie stwierdzono 

w ˝adnej z metod, szczepów 

produkujàcych β-laktamazy o rozszerzonym 

spektrum substratowym. 

19

200 

150 

100 

50 

0 

Ryc. 1. Rozk∏ad procentowy badanych szczepów 

pod wzgl´dem pochodzenia 

25,70% 

szczepy szpitalne 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

30,00% 

25,00% 

20,00% 

15,00% 

10,00% 

5,00% 

0,00% 

8,40% 

187 

144 

1 

∏àcznie E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 

111 

Ryc. 2. Badane szczepy 

25 

36 

E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 

5,40% 

74,30% 

szczepy pozaszpitalne 

Ryc. 3. Liczba izolatów szpitalnych 

Ryc. 4. Odsetek szczepów ESBL+ w obr´bie gatunku 

E. coli i K. pneumoniae 

E. coli K. pneumoniae 

3 

28% 

Ryc. 5. Produkcja ró˝nych typów ESBL 

7 

Nie stwierdzono równie˝, szczepów 

ESBL dodatnich w gatunku Klebsiella 

oxytoca. 

Wszystkie szczepy produkujàce ESBL 

obejmowa∏y gatunki K. pneumoniae 

i E. coli oraz pochodzi∏y wy∏àcznie 

z materia∏ów nades∏anych od chorych 

hospitalizowanych. Testem potwierdzajàcym 

wg CLSI stwierdzono12 

szczepów ESBL dodatnich, natomiast 

przy pomocy systemu VITEK 2 z u˝yciem 

kart AST-N041 stwierdzono 13 

takich szczepów. 

Ogó∏em uzyskano blisko 100% 

(99,5%) zgodnoÊç pomi´dzy testami, 

w tym 100% zgodnoÊci uzyskano 

dla rodzaju Klebsiella sp. i 99,3% 

dla gatunku E. coli. Wyniki nasze okaza∏y 

si´ zgodne z innymi badaniami, 

w których stwierdzano równie wysokà 

zgodnoÊç (80–100%), wykrywania 

enzymów ESBL u tych gatunków 

bakterii, przy pomocy kart AST-N041 

systemu VITEK 2 z innymi metodami 

rutynowo stosowanymi w klinicznych 

laboratoriach mikrobiologicznych (3,4). 

W naszych badaniach, niezgodnoÊç 

dotyczy∏a jednego szczepu E. coli 

w którym VITEK 2 wskaza∏ na obecnoÊç 

enzymu, przy bardzo niskich 

wartoÊciach MIC dla Ceftazydymu i Cefotaxymu 

wynoszàcym

Ocena kart identyfikacyjnych VITEK 2 GN 

i oprogramowania v. 4.02 systemu VITEK 2 

w identyfikowaniu i oznaczaniu lekowrażliwości 

niefermentujących pałeczek Gram ujemnych, 

izolowanych od pacjentów chorych na mukowiscydozę 

I. Otto-Karg 1 , S. Jandl 1 , T. Müller 1 , B. Stirzel 1 , U. Vogel 1 , M. Frosch 1 , H. Hebestreit 2 , 

M. Abele-Horn 1 

1 Institute of Hygiene and Microbiology 

2 Department of Pediatrics, University of Würzburg, Niemcy 

Poster P1719, ECCMID 2007, Monachium 

Cel: Dok∏adna identyfikacja (ID) i oznaczanie lekowra˝liwoÊci (AST) szczepów bakteryjnych izolowanych od pacjentów 

z mukowiscydozà (CF) jest cz´sto spotykanym problemem. Na rynku dost´pne sà komercyjne testy do systemów 

automatycznych, ale jak dotàd nie sà one zalecane. Celem tego badania by∏a ocena testów VITEK 2 GN do identyfikacji 

drobnoustrojów i nowej wersji oprogramowania VITEK 2 4.02 (bioMérieux) do oznaczania lekowra˝liwoÊci niefermentujàcych 

pa∏eczek Gram ujemnych, izolowanych od pacjentów z CF w porównaniu z metodami referencyjnymi. 

Metody: W badaniu u˝yto 168 szczepów do ID i 117 szczepów do AST. Jako metod´ referencyjnà dla AST zastosowano 

metod´ mikrorozcieƒczeƒ w bulionie, zawierajàcym dziewi´ç czynników przeciwdrobnoustrojowych: cefepim, 

ceftazidim, piperacylin´, imipenem, meropenem, gentamicyn´, tobramycyn´, ciprofloksacyn´ i kotrimoksazol. Interpretacja 

wyników AST zosta∏a wykonana zgodnie ze standardem DIN 58940. 

Wyniki: SpoÊród 168 badanych szczepów, dla 143 uzyskano prawid∏owe wyniki. 25 szczepów dla których otrzymano 

nieprawid∏owe wyniki poddano sekwencjonowaniu 16S rRNA. Na kartach VITEK 2 GN zidentyfikowano prawid∏owo 

12 spoÊród 25 szczepów do poziomu gatunku (155/168; 92%) i dziewi´ç szczepów do rodzaju (164/168; 98%); 

4 (2%) szczepy zosta∏y zidentyfikowane nieprawid∏owo. Dla porównania, spoÊród tych szczepów, za pomocà testów 

API NE prawid∏owo zidentyfikowano 4 szczepy do gatunku (147/168; 88%), 9 szczepów do rodzaju (154/168; 93%) 

i nieprawid∏owo 12 (7%) szczepów. OdnoÊnie testów AST zgodnoÊç kategorii w porównaniu z metodà referencyjnà 

wynosi∏a 97% dla wszystkich antybiotyków. Ma∏e b∏´dy znaleziono w 8%. 

21 

Wnioski: Nowe karty VITEK 2 GN sà wiarygodnà metodà identyfikacji niefermentujàcych pa∏eczek Gram ujemnych 

izolowanych od pacjentów z CF. Ponadto, nowe oprogramowanie 4.02 daje dobre wyniki w porównaniu z metodà 

referencyjnà dla testów AST i wydaje si´ byç w∏aÊciwe do stosowania rutynowego w oznaczaniu testów lekowra˝liwoÊci 

niefermentujàcych pa∏eczek Gram ujemnych u pacjentów z CF.

kontrola jakości 

StandLab IQs pierwszy polski internetowy program 

kontroli jakości 

mgr Mirosław Firlej 

StandLab w Bystrej woj. Małopolskie 

Metody analizy statystycznej sà wykorzystywane 

w ocenie b∏´du laboratoryjnego 

ju˝ od lat trzydziestych 

ubieg∏ego stulecia. Obecnie pomimo 

ogromnego post´pu pryncypia metod 

praktycznie nie zmieni∏y si´. Za∏o˝enia 

mówià, ˝e na podstawie obliczeƒ 

statystycznych wnioskujemy o ca∏o- 

Êci procesu. Wykryte niestabilnoÊci 

w analizie kontrolek Êwiadczà o mo˝liwoÊci 

pojawiania si´ takich samych 

b∏´dów we wszystkich próbkach pacjentów. 

Przez wiele lat diagnoÊci 

dysponowali jedynie papierem milimetrowym, 

kartkà papieru i o∏ówkiem. 

Dzisiaj komputery sà ju˝ niemal 

standardem. Zauwa˝a si´ coraz wi´kszà 

potrzeb´ przeprowadzania kontroli. 

Liczne, cieszàce si´ uznaniem 

szkolenia ÊwiadomoÊç takà pog∏´biajà. 

JednoczeÊnie proces kontroli jakoÊci 

doczeka∏ si´ uregulowaƒ prawnych. 

Rozporzàdzenie Ministra Zdrowia 

z 23 marca 2006 roku wyraênie zak∏ada 

obowiàzek kontroli jakoÊci 

badaƒ laboratoryjnych. Ustalono minimalne 

wymagania, które taka kontrola 

powinna spe∏niaç. Niestety jak 

dotàd nie uda∏o si´ doprowadziç do 

wi´kszej spójnoÊci wyników pomiarów 

kontrolnych pomi´dzy laboratoriami. 

Potwierdzajà to opracowania 

ogólnopolskiego sprawdzianu organizowanego 

przez Centralny OÊrodek 

Badaƒ JakoÊci w Diagnostyce Laboratoryjnej 

w ¸odzi. Istniejàce programy 

i systemy kontrolne ró˝nià si´ mi´dzy 

sobà sposobem analizy danych 

czy mo˝liwoÊciami archiwizacyjnymi. 

Niektóre analizujà statystyk´ dynamicznie 

w oparciu o dane skumulowane 

inne statycznie z definiowanymi 

rćznie zakresami pomiarowymi. 

OdmiennoÊç utrudnia jednolità interpretacj´ 

i sprowadza si´ do indywidualnego 

traktowania ró˝nych systemów 

kontrolnych obecnych w obr´bie laboratoriów. 

Stanowi to dodatkowe 

obcià˝enie czasu diagnostów, którego 

obecnie brakuje. 

W diagnostyce proces pomiaru powinien 

byç kontrolowany na podstawie 

w∏asnych procedur kontrolnych tworzàc 

tzw. system kontroli wewn´trznej. 

Dodatkowo laboratoria sà obligowane 

do oznaczania wartoÊci wyznaczonych 

parametrów w nieznanych próbkach 

przysy∏anych z organizacji zewn´trznych, 

stanowiàc kontrol´ zewn´trznà. 

Parafrazujàc mo˝na powiedzieç, ˝e 

kontrola wewn´trzna jest ocenà z klasówki, 

lub pytania w szkole b´dàcà 

miarà post´pów w nauce. Mo˝liwoÊç 

porównywania osiàganych wyników 

w grupach obejmujàcych takie same 

materia∏y kontrolne jest czymÊ w rodzaju 

przedmiotowych konkursów mi´dzyszkolnych. 

Sprawdzian zewn´trzny 

jest egzaminem paƒstwowym, w którym 

ocen´ wystawia niezale˝na komisja. 

Wa˝ne aby ocena z egzaminu 

by∏a wypadkowà rzeczywistych umiej´tnoÊci 

ucznia. Dlatego do egzaminu 

z otwartà przy∏bicà mogà zawsze przyst´powaç 

uczniowie dobrze przygotowani, 

którzy dzi´ki wczeÊniejszym 

sprawdzianom ocenili co robià dobrze, 

a gdzie pope∏nili b∏´dy i nad czym 

nale˝y pracowaç. 

Zauwa˝alna potrzeba pomocy w przygotowaniu 

laboratoriów do pozytywnych 

ocen ze sprawdzianów 

zewn´trznych oraz odcià˝enie ich 

w wykonywaniu ˝mudnych obliczeƒ 

statystycznych przy braku personelu 

by∏y podstawà do stworzenia przedsi´wzićia 

u∏atwiajàcego rozwiàzywanie 

tych problemów. Nie bez znaczenia 

sta∏y si´ równie˝ odczucia pacjentów, 

którzy w zale˝noÊci od miejsca 

wykonywanych badaƒ byli czasem 

jeszcze zdrowi albo ju˝ chorzy. 

Pojawi∏ si´ ostatnio internetowy zintegrowany 

program kontroli jakoÊci 

StandLab IQs, który w swym za∏o- 

˝eniu ma realizowaç cel uproszczenia, 

upowszechnienia i ujednolicenia 

kontroli jakoÊci badaƒ laboratoryjnych. 

Obecnie materia∏y kontrolne 

podlegajà analizie statystycznej przy 

u˝yciu kalkulatorów, rćznie tworzonych 

krzywych a liczne, zw∏aszcza 

wi´ksze laboratoria analizujà za pomocà 

sieciowych systemów informatycznych, 

analizatorów lub dedykowanych 

programów. Metodologia, sposób raportowania 

pomimo wytycznych sà 

w dalszym ciàgu mocno zró˝nicowane. 

W jednolitym systemie StandLab 

IQs ca∏a obróbka statystyczna materia∏u 

kontrolnego odbywa si´ w programie 

umieszczonym na serwerze 

osiàgalnym z ka˝dego miejsca na 

Ziemi. Dzi´ki temu dost´p do wpisów, 

danych archiwalnych, raportów 

nie wymaga ˝adnego dodatkowego 

oprogramowania na komputerze 

a wpisy wykonane w jednej z pracowni 

mogà zostaç odczytane w gabinecie 

kierownika lub nawet w domu czy 

kawiarence internetowej. Identyczne 

procedury, raporty u∏atwiajà zarzàdzanie 

procesem kontrolnym oraz 

upraszczajà interpretacj´. 

System analizuje okres wst´pny 

a nast´pnie korzysta z wyników skumulowanych 

do weryfikacji obliczeƒ 

statystycznych. Dane wprowadzane 

podczas okresu wst´pnego umo˝liwiajà 

wyliczenie takich parametrów 

jak: 

● Êrednia arytmetyczna, 

● odchylenie standardowe i wspó∏czynnik 

zmiennoÊci, 

● b∏àd poprawnoÊci, 

● b∏àd ca∏kowity, 

● analizy w oparciu o przyj´tà wartoÊç 

ca∏kowitego b∏´du dopuszczalnego 

TEA, 

● b∏´dy krytyczne poprawnoÊci i precyzji, 

● b∏´dy znormalizowane poprawnoÊci 

i precyzji, 

● wybór jednej z trzech regu∏ interpretacyjnych 

na podstawie algorytmu 

wynikajàcego z oceny metody 

przedstawionej na znormalizowanej 

karcie OPS (Rys. nr 1). 

Po okresie wst´pnym dodatkowo 

analizowane sà dane miesićzne ze- 

Rys. 1. Raport walidacyjny 

23

Rys. 2. Raport precyzji 

i poprawnosci 

24 

stawione z danymi skumulowanymi, 

oraz wykreÊlane sà krzywa Levey- 

Jenningsa i krzywa b∏´du poprawno- 

Êci (Rys. nr 2). System sam równie˝ 

poddaje ocenie wpisy analizujàc je 

pod kàtem przyj´tej regu∏y interpretacyjnej. 

Omawiajàc sposób funkcjonowania 

StandLab IQs warto wspomnieç o jego 

mo˝liwoÊciach w zakresie porównaƒ 

wyników pomi´dzy laboratoriami. 

Za∏o˝ono, ˝e w danym okresie czasu 

dostawcy materia∏ów kontrolnych 

sprzedajà kontrolki z takim samym 

numerem serii Rys. 3. Przyk∏adowo 

w hematologii nowa seria pojawia 

si´ co trzy miesiàce, ale w biochemii, 

immunodiagnostyce czy RKZ producenci 

cz´sto oferuj´ tà samà seri´ 

materia∏ów kontrolnych przez rok lub 

d∏u˝ej. Statystyka wewnàtrz-laboratoryjna 

wykonana na materia∏ach kontrolnych 

powszechnie dost´pnych 

na rynku dzi´ki technice internetowej 

pozwala porównywaç ze sobà 

wyniki otrzymane na kontrolkach 

z tej samej serii i tà samà metodà. 

Dzi´ki temu otrzymuje si´ dodatkowo 

b∏àd poprawnoÊci w stosunku do 

Êredniej u˝ytkowników, oraz po okresie 

wst´pnym dodatkowo wykreÊlana 

jest krzywa b∏´dów poprawnoÊci 

w stosunku do Êredniej dla metody. 

Raporty kontroli wewn´trznej i danych 

porównawczych sà dost´pne natychmiast 

po dokonaniu wpisu do programu. 

Pozwalajà one na podjćie 

procedury naprawczej. Zbli˝enie si´ do 

Êredniej innych nie wymaga d∏ugiego 

oczekiwania na wynik egzaminu. 

Rys. 3. Zasada dzia∏ania StandLab IQs 

DziÊ na Êwiecie istnieje ju˝ wiele systemów 

analiz internetowych kontroli 

badaƒ. Cz´sto dostarczane sà wraz 

z materia∏ami kontrolnymi zw∏aszcza 

przez renomowane firmy oferujàce 

materia∏y kontrolne lub komercyjne 

systemy klasycznej kontroli zewnàtrz 

laboratoryjnej. 

Program StandLab IQs skoncentrowa∏ 

si´ jednak przede wszystkim na 

∏atwoÊci wpisów, definiowania parametrów 

kontrolnych i przejrzystej formie 

raportów umo˝liwiajàcej szybkà 

diagnoz´. Wdro˝enie programu nie 

wymusza rewolucji zwiàzanej ze 

zmianà dotychczasowych materia- 

∏ów kontrolnych. WartoÊci metrykalne 

sà wprowadzane centralnie do 

serwera i nie trzeba traciç czasu na 

˝mudnie wpisywanie ich do analizatorów 

albo programów komputerowych. 

Zakresy pomiarowe wyliczajà 

si´ same w czasie okresu wst´pnego 

i aktualizowane póêniej danymi skumulowanymi. 

Nie ma koniecznoÊci 

przeliczania jednostek. System automatycznie 

przelicza wyniki na jednostk´ 

SI, porównuje je i ponownie 

przelicza dajàc odpowiedê w jednostkach 

deklarowanych przez u˝ytkowników. 

Praca w laboratorium pozostaje 

tak samo zorganizowana, a wprowadzenie 

danych zajmuje nie wićej 

ni˝ kilkanaÊcie minut dziennie. Tradycyjne 

przeliczanie tych samych wartoÊci 

zaj´∏yby przynajmniej dzieƒ 

jednej lub dwóm osobom. OtwartoÊç 

systemu na ró˝ne rodzaje materia∏ów 

kontrolnych, parametrów, 

dzia∏ów diagnostyki stwarza ponadto 

mo˝liwoÊci porównywania wyników 

osiàganych w ró˝nych laboratoriach 

w takich parametrach, które do tej 

pory rzadko podlega∏y kontroli zewnàtrz-laboratoryjnej. 

Dotyczy to 

przyk∏adowo oznaczeƒ w koagulologii, 

bia∏ek surowicy, hemoglobiny glikowanej 

czy monitorowania leków. 

Jest jak dotàd jedynym tego typu 

programem obs∏ugiwanym w j´zyku 

polskim, równie˝ z mo˝liwoÊcià uzyskania 

konsultacji. 

Tworzàc program zdawaliÊmy sobie 

spraw´ z niedostatecznego w wielu 

przypadkach stanu infrastruktury informatycznej 

i telekomunikacyjnej 

laboratoriów. Nie ma zatem szczególnych 

wymagaƒ dotyczàcych komputerów, 

systemu operacyjnego czy 

rodzaju ∏àcza internetowego. Pracujàc 

z StandLab IQs mo˝na korzystaç 

z ∏àczy sta∏ych (np. Neostrada TP), 

modemowych a nawet GPRS przez 

telefon komórkowy. W komputerze 

powinna byç zainstalowana przeglàdarka 

internetowa. TestowaliÊmy 

program na przeglàdarkach: Internet 

Explorer, Mozilla Firefox i Opera. 

Wszystkie dzia∏ajà prawid∏owo, jednak˝e 

z uwagi na mniejszà odpornoÊç 

Internet Explorer na ataki 

wirusów i innego szkodliwego oprogramowania 

sugerujemy korzystania 

z Mozilli lub Opery. Programy sà bezp∏atne 

i mo˝na je pobraç z odpowiednich 

stron internetowych (np. 

http://dobreprogramy.com/). Cz´sto 

sà one równie˝ do∏àczane do czasopism 

informatycznych. Podczas korzystania 

z Internetu nasze komputery 

nara˝one sà na szkodliwe oprogramowanie 

z sieci, dlatego mocno 

zachćamy do instalowania oprogramowania 

antywirusowego. 

Przedsi´wzićie tego typu nie rozwià˝e 

oczywiÊcie wszystkich problemów 

administracyjnych laboratoriów 

ani nie spowoduje eliminacji b∏´dów 

powstajàcych przed procesem analitycznym 

lub przy wypisywaniu wyników 

pacjentów. Jest pierwszà polskà 

próbà stworzenia internetowego programu 

umo˝liwiajàcego zharmonizowanie 

wyników badaƒ laboratoryjnych. 

System ten mo˝e z powodzeniem 

stanowiç jeden z elementów polityki 

jakoÊci w laboratorium okreÊlonej 

wewn´trznymi procedurami lub ustaleniami 

wynikajàcymi z przyj´tych 

norm jakoÊciowych np. ISO. Daje 

mo˝liwoÊç standaryzacji procedur 

kontrolnych. Niewàtpliwie dobrze 

prowadzona polityka jakoÊci laboratorium 

w konsekwencji przyniesie 

wysokie oceny w programach kontrolnych 

wymaganych ustawowo 

oraz rzetelnoÊç wydawanych pacjentom 

wyników. 

Przes∏aniem StandLab jest zwracanie 

diagnostom czasu, który poÊwićali 

na wykonywanie skomplikowanych 

obliczeƒ. Najwi´kszà satysfakcj´ uzyskamy 

gdy kontrola jakoÊci b´dzie kojarzy∏a 

si´ ze wskazówkami jak dobrze 

pracowaç, a nie chwilami sp´dzonym 

nad kartkà papieru z kalkulatorem.

chemia kliniczna 

Nowe produkty w ofercie białek specyficznych 

(Konelab system reagent) 

mgr Mirosław Kachalik 


Konfekcjonowanie 

Nazwa zestawu (liczba testów Metoda oznaczania Postaç odczynników Kalibrator Kontrola jakoÊci 

w opakowaniu) 

PL032 2 x 3 ml Immunoturbidymetryczna Odczynniki p∏ynne, PL035 PL033 

Cystatin C (190 testów) wzmocniona lateksem gotowe do u˝ycia Cystatin C Cystatin C Control, 

Calibrator PL034 Cystatin C 

Control High 

PL040 2 x 3 ml Immunoturbidymetryczna Odczynniki p∏ynne, 28063 28163 SpeciTrol 

Ceruloplasmin (190 testów) gotowe do u˝ycia SpeciCal PL017 SpeciTrol High 

PL038 1 x 1 ml Immunoturbidymetryczna Odczynniki p∏ynne, PL052 PL039 Lp(a) Control 

Lipoprotein (a) (180 testów) gotowe do u˝ycia Lp(a) Calibrator PL051 Lp(a) Control High 

PL012 Soluble 2 x 2 ml Immunoturbidymetryczna Przeciwcia∏a w formie ciek∏y w zestawie PL007 sTfR Control 

Transferrin Receptor (400 testów) wzmocniona lateksem liofilizatu PL008 sTfR Control High 

Cystatyna C 

Bia∏ko cytoplazmatyczne z grupy cystatyn – inhibitorów 

proteazy cysteinowej, obecne we wszystkich 

p∏ynach ustrojowych. Tempo wytwarzania cystatyny C 

jest sta∏e i nie zale˝y od p∏ci, wieku, masy mi´Êniowej, procesu zapalnego. 

W zdrowych nerkach cystatyna C jest swobodnie filtrowana przez 

b∏on´ k∏´buszkowà, a nast´pnie podlega niemal ca∏kowitemu 

wch∏onićiu i rozk∏adowi w komórkach cewek proksymalnych. 

St´˝enie cystatyny C w osoczu jest zale˝ne niemal wy∏àcznie od 

wspó∏czynnika przesàczania k∏´buszkowego (GFR), dzi´ki czemu 

jest znacznie lepszym wskaênikiem oceny GFR ni˝ st´˝enie kreatyniny 

w surowicy. 

Rozpuszczalny receptor transferyny 

Receptor transferyny (TfR) jest bia∏kiem poÊredniczàcym 

w procesie przep∏ywu transferyny wià˝àcej 

˝elazo z przestrzeni zewnàtrzkomórkowej do wn´trza 

komórek. Receptory transferyny wyst´pujà we wszystkich komórkach 

za wyjàtkiem dojrza∏ych erytrocytów. Rozpuszczalny receptor 

transferyny (sTfR) stanowi skróconà form´ niezmienionego receptora 

TfR, pozbawionego struktur cytoplazmatycznych. Receptor sTfR 

tworzy kompleks z transferynà w surowicy, a iloÊç receptorów transferyny 

zale˝y od zapotrzebowania na ˝elazo poszczególnych komórek. 

Niedobór ˝elaza powoduje zwi´kszenie syntezy receptora sTfR, 

a co za tym idzie zwi´kszenie poziomu sTfR w surowicy nawet 

dwudziestokrotnie. St´˝enie receptora sTfR w surowicy mo˝e byç 

równie˝ podwy˝szone bez wyst´powania niedoboru ˝elaza w przypadku 

niedokrwistoÊci hemolitycznej, policytemii i talasemii. Obni˝one 

poziomy receptora sTfR wyst´pujà w przypadkach niedokrwistoÊci 

aplastycznej oraz przewlek∏ej niewydolnoÊci nerek. STfR to wskaênik 

zapotrzebowania tkanek na ˝elazo. Posiada du˝à wartoÊç diagnostycznà 

w ocenie zasobów ustrojowych ˝elaza i jest pomocny 

w ró˝nicowaniu niedokrwistoÊci w przebiegu chorób przewlek∏ych 

z niedokrwistoÊcià z niedoboru ˝elaza. 

Ceruloplazmina 

Bia∏ko z grupy oksydaz, którego g∏ównà w∏aÊciwoÊcià 

jest zdolnoÊç wiàzania miedzi ustrojowej. 

Ponad 95% miedzi w surowicy jest zwiàzana z ceruloplazminà. 

Podstawowa funkcja fizjologiczna ceruloplazminy obejmuje 

reakcje oksydoredukcyjne, szczególnie wa˝ne w procesie 

utleniania ˝elaza i regulacji uwalniania ˝elaza ustrojowego. Ceruloplazmina 

jest dodatnim bia∏kiem ostrej fazy, jej st´˝enie wzrasta 

w czasie ostrych lub chronicznych stanów zapalnych. 

Pomiar st´˝enia ceruloplazminy jest pomocny w rozpoznawaniu 

zaburzeƒ metabolizmu miedzi. 

Jej st´˝enie wzrasta w infekcjach, nowotworach, ch∏oniakach, zawale 

mi´Ênia sercowego. 

Spadek st´˝enia wyst´puje w zmianach degeneracyjnych wàtroby 

w chorobie Wilsona, zespole nerczycowym, przewlek∏ym zapaleniu 

wàtroby. 

Lipoproteina (a) 

Lipoproteina (a) jest jednà z apolipoprotein czyli bia- 

∏ek wià˝àcych lipidy i tworzàcych czàstki rozpuszczalne 

w wodnym Êrodowisku osocza. Apolipoproteiny poza funkcjà transportowà 

odgrywajà wa˝nà rol´ w procesach metabolicznych lipoprotein 

na drodze aktywacji enzymów przemiany lipidowej. W sk∏ad 

lipoproteiny (a) wchodzà apolipoproteiny A i B. W badaniach epidemiologicznych 

stwierdzono udzia∏ Lp(a) w procesach zwiàzanych ze 

zmianami mia˝d˝ycowymi, mi´dzy innymi wykryto obecnoÊç Lp(a) 

w blaszkach mia˝d˝ycowych. Podwy˝szone st´˝enia Lp(a) sà uznawane 

za niezale˝ny czynnik ryzyka rozwoju choroby niedokrwiennej 

serca, zw∏aszcza przy równoczeÊnie podwy˝szonym st´˝eniu LDL. 

Pomiar st´˝enia Lp(a) 

w surowicy mo˝e wspomagaç 

rozpoznanie zaburzeƒ 

metabolizmu lipidów 

szczególnie u osób m∏odych, 

u których wyst´puje 

ryzyko rozwoju chorób 

sercowo-naczyniowych. 

25

z życia firmy 

XVI Zjazd Polskiego Towarzystwa Diagnostyki 

Laboratoryjnej „POLMEDLAB 2007” 

Wrocław, 26–29 września 2007 

Barbara Krawczyńska, Karolina Świderska 


W dniach 26–29 wrzeÊnia 2007 r. we Wroc∏awiu w Hali Ludowej odby∏ si´ XVI Zjazd Polskiego Towarzystwa Diagnostyki 

Laboratoryjnej POLMEDLAB 2007. 

W Zjeêdzie uczestniczy∏o ponad 1300 delegatów. 

Zjazd poprzedzi∏y obrady Walnego Zgromadzenia Delegatów PTDL, podczas którego zosta∏ wybrany Zarzàd G∏ówny 

Towarzystwa na kadencj´ 2007–2010. Prezesem zosta∏ Prof. dr hab. Dariusz Sitkiewicz. 

Tematyka XVI Zjazdu w g∏ównej mierze obejmowa∏a doniesienia naukowe, podnoszenie naukowych kwalifikacji oraz 

wspó∏dzia∏anie w szkoleniu pracowników diagnostyki laboratoryjnej. 

Komitet Naukowy XVI Zjazdu przygotowa∏ program sk∏adajàcy si´ z szeÊciu sesji plenarnych poÊwićonych istotnym 

zagadnieniom wspó∏czesnej diagnostyki laboratoryjnej, których uzupe∏nieniem by∏y sesje satelitarne przygotowane 

przez firmy uczestniczàce w zjeêdzie. 

Firma bioMérieux Polska by∏a organizatorem dwóch sesji naukowych. 

Pierwsza z nich – „Diagnostyka biochemiczna i mikrobiologiczna sepsy – aktualne problemy i mo˝liwoÊci ich rozwiàzania” 

– zorganizowana zosta∏a w formie dwóch wyk∏adów: 

„Mo˝liwoÊci wspó∏czesnej diagnostyki biochemicznej w rozpoznaniu i monitorowaniu przebiegu sepsy” prowadzony 

przez Prof. dr hab. n. med. Marka Paradowskiego oraz „Etiologia i diagnostyka mikrobiologiczna w sepsie” prowadzony 

przez Prof. dr hab. n. med. Ann´ Przondo-Mordarskà. 

Drugà interaktywnà sesj´ „101 praktycznych pytaƒ w kontroli jakoÊci badaƒ laboratoryjnych” prowadzi∏ dr Wojciech 

Gernand. 

Przygotowane przez nas sesje cieszy∏y si´ ogromnym zainteresowaniem. 

Tematyka wyk∏adów obejmowa∏a rozpowszechnianie zdobyczy naukowych i informacje o nowych trendach w diagnostyce 

laboratoryjnej. 

Nasze stoisko cieszy∏o si´ bardzo du˝à popularnoÊcià. Przedstawiciele naszej firmy byli do Paƒstwa dyspozycji i odpowiadali 

wiele pytaƒ. 

Wielu z uczestników Zjazdu skorzysta∏o z mo˝liwoÊci prezentacji aparatów wystawianych na naszym stoisku: Vidia, 

miniVIDAS, Konelab Prime 60 i NucliSens easyMAG, a tak˝e z prezentacji nowych produktów w ofercie bioMérieux. 

Dzi´kujemy Paƒstwu za odwiedzenie naszego stoiska i uczestnictwo w przygotowanych przez nas sesjach naukowych. 

27

43/2007 / Ten dokument nie jest prawnie obowiàzujàcy. bioMérieux Polska zastrzega prawa do modyfikacji bez powiadomienia. bioMérieux i jego niebieskie logo, Identifying Resistance, Vidas, chromID VRE sà zarejestrowanymi 

i chronionymi znakami towarowymi nale˝àcymi do bioMérieux S.A. lub jednego z jej przedstawicielstw / Wyprodukowano w Polsce / PASSA Zak∏ad Poligraficzny Wojciech Bia∏kowski / Konstancin-Jeziorna, ul. Lipowa 26

Aktualności bioMérieux nr 43 plik do pobrania (format pdf)

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?