Aktualności bioMérieux nr 43 plik do pobrania (format pdf)

14
● zdolnoÊç do wytwarzania katalazy,
● zdolnoÊç wzrostu w zakresie temperatur
10–45°C,
● zdolnoÊç wzrostu w bulionie o pH
9,6 oraz w bulionie z dodatkiem
6,5% NaCl,
● zdolnoÊç hydrolizy eskuliny w obecnoÊci
40% ˝ó∏ci,
● zdolnoÊç do hydrolizy L-pyrrolidonylo-β-naftylamidu
(test PYR) i L-leucynoβ-naftyloamidu
(test LAP). ZdolnoÊç
hydrolizy PYR posiada ponad 96% enterokoków
i wszystkie rozk∏adajà LAP.
Wyjàtek stanowià gatunki o niewielkim
znaczeniu klinicznym: E. cecorum, E.
columbae i E. saccharolyticus, które
nie posiadajà zdolnoÊci hydrolizowania
PYR (29,30),
● okreÊlenie przynale˝noÊci do grupy
serologicznej D wg Lancefield (antygen
D wyst´puje u oko∏o 80% szczepów
enterokoków).
W celu identyfikacji enterokoków
do poziomu gatunki wykorzystuje
si´ g∏ównie ich cechy biochemiczne
zgodnie ze schematem zaproponowanym
przez Facklama (31,29):
● fermentacja cukrów i alkoholi (rafinoza,
sacharoza, mannitol, sorbitol),
● hydroliza argininy,
● wykorzystanie pirogronianu z wytworzeniem
acetoiny.
W identyfikacji gatunku pomocne
jest równie˝:
● obserwowanie ruchu umo˝liwiajàce
odró˝nienie E. casseliflavus i E. gallinarum
(gatunki ruchliwe) od E. faecalis
i E. faecium (gatunki nie wykazujàce
ruchu),
● wytwarzanie ˝ó∏tego barwnika na
pod∏o˝u agarowym przez E. casselifavus,
E. mundtii i E. sulfurens,
● redukacja tellurynu potasu podczas
wzrostu na pod∏o˝u agarowym
z dodatkiem 0,04% tellurynu.
Do ca∏kowitej redukcji tellurynu zdolny
jest jedynie gatunek E. faecalis,
po∏owicznà reakcj´ wykazujà natomiast
gatunki ruchliwe: E. casseliflavus
i E. gallinarum. Pozosta∏e istotne
kliniczne gatunki enterokoków (E. faecium,
E. durans, E. avium, E. hirae)
wykazujà wynik ujemny w tym teÊcie
(31,32). E. faecalis wzrasta na pod-
∏o˝u z dodatkiem 0,04% tellurynu
potasu w postaci czarnych koloni
w wyniku inkrustacji komórek bakteryjnych
per∏owo-czarnymi kryszta∏ami
zredukowanego do metalicznego
telluru – tellurynu potasu.
Zaproponowany przez Facklama
(31) schemat identyfikacji fenotypowej
enterokoków do poziomu gatunku
sta∏ si´ podstawà do opracowania
komercyjnych testów identyfikacyjnych
o charakterze automatycznym
i pó∏automatycznym wykorzystywanych
rutynowo w laboratoriach mikrobiologicznych
(33,34).
Oznaczanie opornoÊci
na wankomycyn´
Rutynowo stosowanà w laboratoriach
mikrobiologicznych metodà wykrywania
VRE jest metoda dyfuzyjno-krà˝kowa
z u˝yciem krà˝ków o zawartoÊci
wankomycyny 30 µg i teikoplaniny
30 µg (35,36). Nale˝y pami´taç o koniecznoÊci
24 godzinnej inkubacji.
Odczyt przeprowadzaç nale˝y w Êwietle
przechodzàcym. Izolat uznajemy za
oporny równie˝ w przypadku wzrostu
mg∏awicowego i obecnoÊci kolonii
w strefie zahamowania wzrostu. Dla
szczepów wykazujàcych stref´ Êredniej
wra˝liwoÊci nale˝y oznaczyç MIC
lub oznaczyç wra˝liwoÊç na glikopeptydy
metodà przeglàdowà rekomendowanà
przez CLSI. Na pod∏o˝e
BHIA (Brain Heart Infusion Agar)
o zawartoÊci 6 µg/ml wankomycyny
nale˝y nanieÊç 10 µl zawiesiny bakteryjnej
o g´stoÊci 0,5 McFarlanda,
a nast´pnie inkubowaç 24 godziny
w temp. 35°C w warunkach tlenowych.
Izolat uznaje si´ za oporny
w przypadku uzyskania jego wzrostu
na pod∏o˝u w postaci co najmniej jednej
kolonii. Do okreÊlenia fenotypu
opornoÊci badanego izolatu nale˝y
wówczas okreÊliç MIC oraz potwierdziç
identyfikacj´ do gatunku. Konieczne
jest wykonanie testu na ruch
oraz wytwarzanie barwnika w celu
rozró˝nienia czy nie mamy do czynienia
z gatunkami o naturalnej oporno-
Êci na wankomycyn´ (E. gallinarum
i E. casseliflavus), które cz´sto rosnà
na pod∏o˝u z 6 µg/ml wankomycynà
(35,36). Problem diagnostyczny stanowiç
mogà E. gallinarum i E. casseliflavus
nie wykazujàce ruchu, wówczas
przydatny jest test na zakwaszenie
metylo-D-glukopiranozydu (MGP). E.
gallinarum i E. casseliflavus zakwaszajà
MGP, natomiast E. faecium i E.
faecalis nie wykazujà tej reakcji (37).
Do badaƒ przesiewowych w kierunku
VRE wykorzystywane sà równie˝ pod-
∏o˝a mikrobiologiczne zawierajàce
obok wankomycyny substancje hamujàce
wzrost innych drobnoustrojów
ni˝ szczepy wankomycynooporne
(np. azydek sodu) oraz substancje
wskaênikowe dla enterokoków (eskulina,
40% ˝ó∏ç). Coraz cz´Êciej do
pod∏o˝y dodawane sà wskaêniki chromogenne.
Ró˝ne systemy automatyczne stosowane
w laboratoriach mikrobiologicznych
dysponujà panelami antybiotykowymi
umo˝liwiajàcymi wykrycie i zró˝nicowanie
fenotypów VRE na VanA, VanB
i VanC. Sà to testy szybkie, wiarygodne
i odznaczajàce si´ wysokà czu∏oÊcià
(38,33,34).
Referencyjnà metodà wykrywania
VRE jest analiza molekularna z wykorzystaniem
techniki PCR, za pomocà
której precyzyjne okreÊla si´ system
opornoÊci obecny w danym szczepie
(39). PCR z regu∏y wykorzystywany jest
w celu potwierdzenia klasycznych, fenotypowych
oznaczeƒ lekowra˝liwoÊci.
Gwa∏towny wzrost liczby zaka˝eƒ enterokokowych,
szczególnie w Êrodowisku
szpitalnym, powoduje koniecznoÊç wykonania
badaƒ epidemiologicznych,
w tym typowania fenotypowego i genotypowego,
jako elementu systemu
kontroli zaka˝eƒ. Typowanie, czyli ró˝nicowanie
wewnàtrzgatunkowe polega
na badaniu pokrewieƒstwa pomi´dzy
izolatami poddanymi analizie. Prowadzi
ono do identyfikacji ogniska epidemicznego,
ustalenia êród∏a i dróg
transmisji szczepów epidemicznych
(40). Metody fenotypowe wewnàtrzgatunkowego
ró˝nicowania izolatów
opierajà si´ na porównaniu np. cech
biochemicznych, serologicznych, czy
wzorów lekowra˝liwoÊci, natomiast
metody genotypowe (genetyczne,
molekularne) polegajàce na analizie
ró˝nic zawartoÊci DNA chromosomalnego
i pozachromosomalnego oraz
ró˝nic okreÊlonych sekwencji DNA pomi´dzy
poszczególnymi izolatami (41).
Metoda referencyjna, wysoce ró˝nicujàca,
stosowana w genotypowaniu
enterokoków to analiza fragmentów
restrykcyjnych chromosomalnego DNA
w elektroforezie w zmiennym polu
elektrycznym- RFLP-PFGE (Restriction
Fragment Length Polimorphism
– Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
(42). Szybkà i ∏atwà metodà typowania
jest analiza liczby tandemowych