Z-DNA

Nukleotidy a nukleové kyseliny,nukleoproteínyny(Zubné lekárstvo)J. Muchová, , Z. ĎuračkováÚstav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémieLF UK Bratislava2009/20101

NUKLEOPROTEÍNYBIELKOVINA(protamíny, históny)(polynukleotid)NUKLEOVÁ KYSELINAribo/deoxyribonukleázanukleozidynukleozidázamononukleotidymononukleotidáza(fosfatáza)Kys. fosforečnáPurínovéPyrimidínové zásadySacharid2

Dusíkovkové zásadyOdvodené od purínuOdvodené od pyrimidínu3

Dusíkovkovézásadyodvodené odpurínu4

Dusíkovkovézásadyodvodenéodpyrimidínu5

Tautomérnrne formyOHOHONNNHNOHNHONHOlaktímlaktám6

Kyselina močováOHONNHNN HHONNHOHONHNHOProoxidant: Antioxidant: Primárne soli – málorozpustné Sekundárne soli – viacrozpustné Ukladanie kryštálikov dokĺbov Zápalové reakcie Priama reakcia s voľnýmiradikálmi Chelatačná činnosť7

Monosacharidové zložkyNK8

NukleozidNukleotid9

β-N-glykozidová väzbaNUKLEOZIDY10

Deoxynukleozid11

Nukleotidy• zdroj a zásoba pre syntézu NK• biologicky aktívnenukleotidy15

ADPAMPATP16

ATP – makroergická zlúčenina17

Dusíkové zásadyA, G, C, U18

Pôsobenie polyfosfátovv organizmeATP - univerzálny energetický metabolizmusGTP - metabolizmus proteínov, proteosyntézaCTP - metabolizmus lipidovUTP - metabolizmus sacharidov19

eguláciacia:• syntézypeptidovýchhormónov• imunológickýchprocesov• laktácie• sekréciežaludočnejšťavy20

+P21

NAD ++ 2H NADH + H +22

SpoluprácaNAD +a FAD, FMN23

Pantoténovnová kyselinaTioetanolamínbeta-alanalanínKoenzým A (KoA(KoA)24

NUKLEOVÉ KYSELINYDNA (deoxyribonukleové kyseliny)RNA (ribonukleové kyseliny)25

Primárna štruktúra DNANH 25´-koniecO_OP_OOONNN N5´CH 2O3´O OHP O CH 2_ OOON3´, , 5´ 5 fosfodiesterová väzba5´ koniec→ 3´ koniecNH 2NLineárnrny reťazecpolynukleotidovovOOH3´-koniec27

Pbázapentózabáza5´- koniecPpentózabázaPPpentózabázapentóza3´- koniecPoradie dusíkových zásadP28

Párovanie dusíkových zásadz>C=O….H2 N->N…………HN

POvhodné(pyr + pur)PPrečo o súskomplementárnymizásadami vždy vpurína pyrimidín ???...POprekryv2 purínovOOPPOP"trhlina" medzi2 pyrimidínmiO30

C=O….H 2 N->N……HN

Poznatky o štruktúrere DNA1868– Fridrich Miescher – chemické zloženiejadier buniek1943 - O. Avery, , C. MacLeod, , M. McCarty – DNA je nositeľdedičnosti1952 – A. Hershey, , M. Chase – nie bielkovina, , ale DNA je nositeľdedičnosti1950 – R. Franklin, , M., Wilkins – röntgenografické merania– vzdialenosť medzi závitmi z= 3,4 nm1952 – E. Chargaff – Chargaffove pravidlá1953 – J. Watson, , F. Crick – trojrozmerný model dvojzávitnicevitniceDNA – Nobelova cena (1962)32

Chargaffove pravidlá• DNA izolované z rôznych živočíšnych druhov majú rovnakékvalitatívne vne zastúpenie dusíkových zásad z(A, G, C, T)• Kvantitatívne vne zastúpenie dusíkových zásad zje druhovozávislé• Zloženie zásad zv DNA u jedného druhu sa nemení vekom,stravou, pohlavím, podmienkami• A/T = G/C = 1 A + G = T + CA + T / G + C = 1,3 – 1,51,5 u vyššíššíchživočíchov33

5’-koniecPPPPPKomplementárnrne reťazcedeoxyribóza adenín tymín deoxyribózadeoxyribóza thymín adenín deoxyribózadeoxyribóza guanín cytozín deoxyribózadeoxyribózacytozín guanín deoxyribózadeoxyribóza tymín adenín deoxyribózaPPPPP3’-koniec3’-koniec5’-koniec34

DNAGATA35

Štruktúrara DNA2 April 1953MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDSA Structure for Deoxyribose Nucleic AcidJ. D. WATSON, F. H. C. CRICKNATURE,VOL 171, page 737, 1953Nobelova cena 196236

DvojzávitnicavitnicaDNAVeľkýžliabokDNAMalý žliabokDNA37

TYPY DNAP o sta v e n ieb á zP o č e t d v o jícb á z v z á v iteB -D N A A -D N A Z -D N AC ik -c a kK o lm é Z o šik m e n é z o šik m e n é1 01 11 2Z á v itn ic aP ra v o to č iv áP ra v o to č iv ἠa v o to č iv á38

Kruhovhová DNA• vírusy, plazmidymidy,chromozómymy prokaryontov,chromozómymy mitochondrií• dvojzjzávitnicaa opačná polaritareťazcovsú zachovanané, , niensú volné3´- a 5´-5OH skupiny• môže e byťbaj jednovláknovknová39

(H2A, H2B, H3, H4) 2NukleozómyH140

SuperhelixDNA42

UsporiadanieDNA v jadreDNADNA+HisSuperhelixKondenzovaný chromatínChromozom43

Denaturácia a renaturácia DNAHyperchrómny efektabsorbancie pri 260 nmzvýšenie44

Denaturácia a renaturáciaDNA• dvojvláknová DNA je natívna forma DNA• premena na jednovláknovú formu - denaturácia• spätná premena jednovláknovej DNA nadvojzávitnicu - renaturácia45

Vplyvy vyvolávajúce denaturáciu(topenie DNA) :vysoká teplota („topenie“ vodíkových väzieb)nízka koncentrácia solí (väčšie odpudzovanie fosfátovýchzvyškov)zmena pH („topenie“ vodíkových väzieb).dvojvláknová DNA s vyšším obsahom G≡C párov mávyššiu odolnosť voči denaturácii46

Sledovanie denaturácie DNA• konjugované páry v bázachbDNA po rozvinutí vyvolávajvajúzvýšenenú absorbanciu roztoku pri p i 260 nm (Tyr,, Trp)• absorbanciajednovláknovknovejDNA je vyššššiaako dvojvláknovej• denaturácie e DNA sa sleduje meraním absorbancie pri 260 nm• teplota, pri p ktorejsa dosiahnemaximálnlna absorbanciasa voláteplota topeniat(T m )47

Renaturácia- pri i pomalom odstránení príčindenaturáciesa obnovia vodíkovkové väzbymedzidusíkovými zásadamizsadami, , obnoví sa štruktúraradvojzjzávitnice(anelácia)Hybridizácia– čiastočné alebo úplné spojeniekomplementárnrnychreťazcovz rôznrznychmolekúlDNA nebo RNA48

NUKLEOVÉ KYSELINYDNA (deoxyribonukleové kyseliny)RNA (ribonukleové kyseliny)49

Minoritnédusíkové zásadya nukleotidyv RNA51

Typy RNA informačná (mediátorová) – 5-10% ribozómovmová – 90% transferová nukleova vírusová52

RNAFosforibozylový reťazec53

m-RNADNAExónyhnRNAIntrónypolyAAAAmRNA55

-RNA56

Syntéza r – RNA v jadre 80% of all RNAGén pre r-RNAPre r-RNA28 S 5,8 S 18 S45 SŠtiepenie 45S-pre-r-RNA RNázami28 S 5,8 S 18 Sr-RNAPrestup z jadra do cytoplazmyVäzba s proteínmiribozómy57

Ribozóm eukaryotickejbunky58

t - RNA3 ’- koniec5 ’- koniecCCA – väzba AKAntikodón59

t-RNAVäzba AK na 3´-koniec transferovej RNAOOPO -OCH2OCytNH2NNOOHNNOAMPEsterová väzba medzi:- COOH aminokyselinyPO -OCH2O- OH ribózyRC CNH2OOOH3´- koniec t-RNAaminokyselina60

Kodón - antikodónkomplementarita61

Ukončenietranslácie62

Od DNAk proteínu63

64CGTGGATACACTTTTGCCGTTTCTGCACCTATGTGAAAACGGCAAAGACGUGGAUACACUUUUGCCGUUUCUCGI5´CCA-A lanínA rginínGlycínTyrozínTreonínFenylalanínV alínSerín5´5´5´ 3´3´3´KoniecD NAKoniecm RN AtRNAPeptidovýreťazecSchSchéma prepisuma prepisugenetickejgenetickejinforminformácieciem-RNA

Nukleové RNA• n-RNA - heterogénna skupina RNA – prekurzorové formym-RNA, r-RNA a t-RNA• sn-RNA – 100-300 nukleotidov, komplexy s proteínmi,hybridizujú sa s DNA – ovplyvňujú špecifickosťgénov• c-RNA – v chromatíne, viažu sa s nehistónovýmiproteínmi – aktivátory alebo supresory génov65

1977 – primárna štruktúra bakteriofágaZápis nukleotidov v DNA1 stánkaZápis nukleotidov v DNA E. coli1 kniha (800 strán)Zápis nukleotidov v DNA človeka800 kníh66

Dľžka všetkých DNA u človeka• 1,2.10 10 dvojíc bázových párov – 4 m dlhý reťazec v 46chromozómoch jednej bunky• Počet buniek v organizme = 10 13• Dľžka DNA v organizme vo všetkých bunkách = 4.10 10 km• Vzdialenosť Zeme od Slnka = 1,5 . 10 8 km• Dĺžka všetkých DNA u človeka je 100 x väčšia ako jevzdialenosť Zeme od Slnka67

Modifikácia DNA68

● Mutáciesú dedičné zmeny genotypu, ktorých podstatou súsnukleotidovésubstitúcie,deléciealebo inzercie● Nukleotidová substittitúcia:výmena nukleotidov v jednom vlákne nukleovej kyseliny, alebonukleotidovéhopáru v dvojvláknovej nukleovej kyselineTranzícia:výmena purínuza purín a pyrimidínuza pyrimidínTransverzia:výmena purínuza pyrimidín a opačne● Deléciacia:strata jedného alebo viac nukleotidov v nukleotidovej sekvencii69

MUTÁCIEMutagényAnalógyzásadAlkylačné činidláHydroxylačné činidláDeaminačné činidláInterkalátorytoryIonizujúcežiarenieUV žiarenieRetrovírusyrusy70

Tvorba tymínovýchdimérov71

Interkaláciamolekúl l do DNA73

CHEMOMUTAGÉNY1. Analógydusíkových zásadz2. HNO 2 => oxidačná deamináciaC → UA → HXG → X3. Hydrogénsirinsiričitanyitany4. HydroxylamínC → UGC → AT(-NH2 → -NHOH)GC → AT5. Metoxyamín (H 2 N-O-CH3 )GC → AT74

6. Alkylačné látky1. Alkylsulfátycez N zásadz2. N-nitrózozlúčeniny- (promutagény)7. Psoralény→ interkalátorytory + fotoaktivácia== adukty medzi pyrimidínmi8. Polycyklické uhľovodovodíky→ aktivácia cyt.P 450Prechod B-DNA B→ Z-DNA(príkladfluorén) → promutagény9. Bezpyrén → cigaret.dymAflatoxínyDusičnany→ prokancerogényny75

Oxidačnýúčinok kyseliny dusitejA - TI - C76

ÚčinokhydroxylamínuC - GHydroxy-C = A - T77

OXIDAČNÝ ZÁSAH ZDNAĽudská bunka metabolizuje denne10 12 molekúl l O 2Tvorí 3x10 9 molekúl l H 2 O 2Oxidačne sa atakuje 2x10 5nukleotidov/bunku/de/bunku/deň

OXIDAČNÉPOŠKODENIE DNA• Oxidačné poškodeniepurínovýcha pyrimidínovýchdusíkových zásadz• Oxidačné poškodeniedeoxyribózovejjednotky• Jednovláknovknové alebodvojvláknovknové zlomy DNA

Oxidačné poškodenie DNA● Vytrhnutím m atómu vodíka z dusíkovej zásadyz8-oxoGtymínglykol● Vytrhnutím m atómu vodíkadeoxyribózyMDA● Transportom elektrónov cez molekulu DNAštiepenie vlákna DNA80

Oxidačnépoškodenie DNA8-oxodG81

Hlavnéprodukty oxidačného poškodenia DNANNH 2NHNNH 2OHHNNH 2ONNHNOHFapyGua8-OH-Gua = 8-oxo-GOHNONH4,5-OH-Tym5,6-OH-TymCH3OHOHHFapy – 4-amíno-5-formamido-6-aminopyrimidaminopyrimidínONNH 2NH5-OH-CytOHH82

Apurínovémiesto (AP)OH83

ROSMutagenesis of 8-oxo-dGdATPreplicationoxo-dGhOgg1C-C--G C- -oxo-dG A- -oxo-dGC-oxo-dG rotates into synendonucleaseA-Pool of mutantDNAA- -TDNA-ligasedTTP85