HaloTag® ガイド

HaloTag ® ガイドHaloTag ® VectorsHaloTag ® ベクター幅 広 いベクターラインナップは 緻 密 な 発 現 実 験 の 設 計 を 可 能 にしますHaloTag ® を 発 現 する Flexi ® HaloTag ® ベクターは 最 新 型 の HaloTag ® 遺 伝 子 が 含 まれており、 発 現 効 率 やリガンドとの 結 合 効 率 、タンパク 質 の 安 定 性 、 可 溶 性 に 優 れ、タグの 切 断 機 能 (TEV プロテアーゼ 切 断 サイト)も 付 加 されています。また、HaloTag ®タンパク 質 を 目 的 タンパク 質 の N 末 端 または C 末 端 に 融 合 できるように 2 つのタイプのベクターを 揃 えています。oriFlexi ® CMV VectorspFC15, pFC16, pFC17pFC14 CMV Intron T7 ORF HaloTag ® 7pFN21pFN22, pFN23, pFN24CMV Promoter–116Flexi ® T7(SP6) VectorspFN18pFN19pFN20Amp rpFN21A (HaloTag ® 7) CMVFlexi ® Vector(5064bp)CMVNFκBCMVdCMVdcerSV40 latepoly(A) signalSP1T7Intron–67T7CREB–59T7T7SP1BarnaseSP6T7SP6T7SP6SP6PmeICMV Enhancer/PromoterRBSRBSTATARBSRBSRBSintronORFHaloTag ® 7HaloTag ® 7HaloTag ® 7ORFORFSV40pASV40pASV40pASV40pAT7 SP6 Cloned geneCMVd1CMVd2CMVd3HaloTag ® 7 ORFA30 T7 terHaloTag ® 7 ORFA30 T7 terORFTEV siteSgfIT7HaloTag ® 7 OpenReading FrameHaloTag ® 7 A30 T7 terpFN21A のベクターマップと 哺 乳 動 物 発 現 用 および 大 腸 菌 発 現 ・ 無 細 胞発 現 用 ベクターの 発 現 エレメント 領 域7549MA7678MAHaloTag ® 7 Vector の 機 能 別 選 択 リストベクター 名カタログ番 号マーカーpFN18A G2751 AmppFN18K G2681 KanpFN19A G1891 AmppFN19K G1841 KanpFC20A G1681 AmppFC20K G1691 KanpFC14A G9651 AmppFC14K G9661 KanpFC15A G1611 AmppFC15K G1602 KanpFC16A G1591 AmppFC16K G1571 KanpFC17A G1551 AmppFC17K G1321 KanpFN21A G2821 AmppFN21K G2831 KanpFN22A G2841 AmppFN22K G2851 KanpFN23A G2861 AmppFN23K G2871 KanpFN24A G2881 AmppFN24K G2981 KanE.coli発 現 系 融 合 タグ *哺 乳 動 物細 胞無 細 胞発 現T7 - T7 ( 注 1)N末 端C末 端○ -T7 - T7, SP6 ○ -T7 - T7, SP6 - ○-T7T7T7-T7T7T7CMV( 最 強 ) T7 ( 注 2)- ○CMV d1( 強 ) T7,SP6 - ○CMV d2( 中 ) T7,SP6 - ○CMV d3( 弱 ) T7,SP6 - ○CMV( 最 強 ) T7 ( 注 2)○ -CMV d1( 強 ) T7,SP6 ○ -CMV d2( 中 ) T7,SP6 ○ -CMV d3( 弱 ) T7,SP6 ○ -*TEV プロテアーゼ 認 識 サイトを 含 むためタグの 切 除 が 可 能※ Flexi ® ベクターは Barnase ( 致 死 遺 伝 子 を 含 むため 大 腸 菌 でそのまま 増幅 することはできません。)注 1) 真 核 生 物 系 の 無 細 胞 発 現 には 不 適注 2)E.coli S30 抽 出 液 による 無 細 胞 発 現 には 不 適A.Firefly Luciferase Expression (RLU)10,000,0001,000,000100,00010,0001,0001,000,000100,00010,000CHOHEK293U2OSNIH3T3HeLaCMV プロモーターの B.段 階 的 削 除 による 発 現 レベルへの 影 響ホタルルシフェラーゼ 100,000,000遺 伝 子 を 各 ベクターに 組 み 込 み、その 発 現 量 を 比較 した。CHO 細 胞 以 外 では CMV プロモーター 領 域 を 段 階 的 に 削 除 することで 発 現 量 が 抑 制 されることが 示 された。 発 現 レベルは CMV>10,000,000CMV d1> CMV d2 > CMV d3。Renilla Luciferase Expression (RLU)CMV CMVd1 CMVd2 CMVd3CMVCMVd1 CMVd2 CMVd37679MA製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内クローニングベクター各 Flexi ® HaloTag ® 7 Vector 各 20µg 上 表 参 照 48,000ベクターセットHaloTag ®7 Flexi ® Vectors - CMV Deletion Series 9 × 2μg G3780 38,000Sampke PackHaloTag ® Cloning Starter System 1 システム G6050 57,000CMV Deletion Series Sampke Pack(カタログ 番 号 G3780)には、pFC14K,pFC15K, pFC16K, pFC17K, pFN21A, pFN21K, pFN22K, pFN23K, pFN24Kの 各 ベクターが 2µg ずつ 含 まれます。ま た、G6050 に は 上 記 の G3780 お よ び ク ロ ー ニ ン グ 用 の 試 薬 Flexi ®System, Entry/Transfer (C8640), Carboxy Flexi ® Enzyme Blend(Sgf I andEcoICR I)(R1901)が 含 まれます。ライセンスについて:HaloTag ® Technology で 使 用 するリガンドをプロメガ 以 外 で 作 製 ・ 入 手 する 場 合 、または 研 究 用 途 以 外 ( 営 利 目 的 等 )でご 使 用 される 場 合 、ライセンス 契 約 の 必 要 があります。5

Imagingタンパク 質 の 細 胞 内 イメージングタンパク 質 の 局 在 、 動 態 、プロテインプールの 分 染HaloTag ® タンパク 質 の 蛍 光 リガンドによる 標 識 の 特 長 の 1 つは、 同 じコンストラクトより 発 現 したタンパク 質 を 任 意 の 蛍 光 色素 で 染 めることができる 点 です(GFP などの 蛍 光 タンパク 質 では、 異 なる 蛍 光 色 で 検 出 する 場 合 には、コンストラクト 自 体 を変 える 必 要 があります)。そのため、 時 間 差 で 異 なる 色 素 により 標 識 することで、パルス - チェイス 様 の 実 験 を 行 うことができます。 細 胞 表 面 に 提 示 されたタンパク 質 のみを 染 色 できる 細 胞 膜 非 透 過 性 リガンドや 任 意 の 色 素 をご 自 身 で 合 成 して 頂 くために 未 標 識 のリガンドも 用 意 しています。■ 生 細 胞 における 蛍 光 タンパク 質 とのマルチプレックス 解 析HaloTag ® テクノロジーは 複 数 の 蛍 光 染 色 を 簡 便 にします。 蛍 光 タンパク 質 とは 異 なり、HaloTag ® コンストラクトを 構 築 すれば、第 2 あるいは 第 3 の 蛍 光 染 色 として 自 由 に 蛍 光 色 を 選 択 することができ、 柔 軟 な 多 重 染 色 が 行 えます。A.C.E.B.D.F.生 細 胞 の 核 または 細 胞 質 を 標 的 としたHaloTag ® およびhMGFPレポーターHaloTag ® -(NLS)3 お よ び hMGFP-a-tubulin( パ ネ ル A-D) ま た はHaloTag ® -a-tubulin および hMGFP-(NLS)3(パネル E、F)の 各 セットを HeLa 細 胞 にトランジェントにトランスフェクションした。24 時 間 後 、HaloTag ® -(NLS)3 を 発 現 する 細 胞 は 25µM Coumarin Ligand(パネル A、B)または 5µM HaloTag ® TMR Ligand(パネル C、D)で、HaloTag ® -atubulinを 発 現 する 細 胞 は 5µM HaloTag ® TMR Ligand(パネル E、F)でそれぞれ 15 分 間 インキュベーションした(37℃ /5% CO2)。 細 胞 は 洗 浄後 、30 分 間 インキュベーションした。パネル A および B では、 細 胞 をフィルターセット(Coumarin Ligand には #31000 DAPI、hMGFP には#41001 FITC Chroma Technology Corp)、Orca CCD カメラ( 浜 松 ホトニクス 社 )および environmental controls を 装 備 したオリンパス IX81 落射 蛍 光 顕 微 鏡 でイメージングした。パネル C-F では、2 レーザーシーケンシャルスキャニングおよび TMR と FITC の 蛍 光 に 適 したフィルターで撮 影 した。4883TA4990TA■ HaloTag ® リガンドは 固 定 後 も 蛍 光 特 性 を 失 わないので、 免 疫 細 胞 染 色 (ICC)とのマルチプレックス 解 析 が 可 能HaloTag ® とリガンドは 安 定 な 共 有 結 合 を 形 成 するため 固 定 細 胞 でもイメージング 解 析 が 行 えます。タンパク 質 自 体 が 蛍 光 を有 する GFP とは 異 なり、 安 定 な 蛍 光 分 子 を 使 用 するので、 変 性 条 件 下 でも 退 色 はおこりません。ABp65-HaloTag ®タンパク 質 を 発 現 し、HaloTag ® TMR Ligand で 標 識 した細 胞 の 固 定 後 のイメージングHeLa 細 胞 に p65-HaloTag ® 融 合 タンパク 質 をコードするプラスミドをトランジェントにトランスフェクションし、 発 現 した p65-HaloTag ® 融合 タンパク 質 を 5µM HaloTag ® TMR Ligand で 37℃、15 分 間 標 識 した。細 胞 は 3.7% パラホルムアルデヒドで 固 定 した 後 、1µg/ml mouse AntibIIITubulin Antibody(カタログ 番 号 G7121)および Alexa Fluor ® -488-conjugated goat-antimouse IgG(Molecular Probes)を 用 いて 染 色 した。イメージはオリンパス FV500 共 焦 点 顕 微 鏡 (TMR または Alexa Fluor ®に 適 したフィルターセットまたは 透 過 光 を 用 いたシーケンシャルモード)により 撮 影 。パネル A. TMR 蛍 光 。パネル B. Alexa Fluor ® -488 蛍 光 。パネル C. Alexa Fluor ® -488 および TMR 蛍 光 および 透 過 光 のオーバーレイ。パネル D. Alexa Fluor ® -488 および TMR 蛍 光 のオーバーレイ。CD8

HaloTag ® ガイド■ パルスチェイス 実 験 & 時 間 的 / 空 間 的 なタンパク 質 プールの 分 離 および SDS-PAGE でのタンパク 質 修 飾 解 析HaloTag ® テクノロジーは、1 つのベクターコンストラクトを 作 製 するだけで 異 なる 波 長 の 蛍 光 を HaloTag ® レポータータンパク 質に 付 帯 させることができます。そのため、 発 現 した 時 間 の 異 なるタンパク 質 プールを 異 なる 蛍 光 色 で 染 色 でき、 異 なる 細 胞 透 過 性を 持 つ 蛍 光 HaloTag ® リガンドを 使 用 することにより 異 なる 領 域 ( 細 胞 膜 / 細 胞 内 )の 標 的 タンパク 質 を 染 め 分 けることもできます。また、ゲル 分 析 によるタンパク 質 の 翻 訳 後 修 飾 の 解 析 にも 利 用 することができます( 下 図 , パネル B: 細 胞 表 面 の HaloTag ® - インテグリン 融 合 タンパク 質 はグリコシル 化 により 修 飾 されるため 高 分 子 側 にシフトされて 観 察 されます [ グルカナ-ゼ 処 理 により 確認 済 み ])。A. B.cell-impermeantcell-permeantkDa423628C. D.1 2 3 4HaloTag ® テクノロジーを 用 いた 空 間 的 または 時 間 的 なタンパク 質 の 分 離パネル A. β1 Integrin-HaloTag ®タンパク 質 のパルス / チェイス 標 識 法の 概 略 図 (パルスでは 細 胞 表 面 の HaloTag ®タンパク 質 を 標 識 するために 細 胞 非 透 過 性 の HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligand を 使 用 し、チェイスでは 細 胞 内 の HaloTag ®タンパク 質 を 標 識 するために 細 胞 透 過 性 のHaloTag ® TMR Ligand を 使 用 )。パネル B. β1 Integrin-HaloTag ®タンパク 質 を 安 定 に 発 現 する HEK293 細 胞 を HaloTag ® TMR Ligand のみで 標識 (レーン 2)、HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligand のみで 標 識 (レーン 3)または、 膜 タンパク 質 標 識 のための HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligandによるパルスと 細 胞 内 タンパク 質 標 識 のための HaloTag ® TMR Ligand によるチェイス(レーン 4)。 生 細 胞 イメージングの 後 、 細 胞 を 溶 解 して分 子 量 マーカー(レーン 1)とともに SDS-PAGE に 供 し 分 析 した。パネル C. β1 Integrin-HaloTag ®タンパク 質 を 一 過 性 に 発 現 する HeLa 細 胞を HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligand で パ ル ス(1µM、37 ℃、15 分 )、HaloTag ® TMR Ligand でチェイスし(5µM、37℃、15 分 )、 洗 浄 した 後に Olympus FV500 共 焦 点 顕 微 鏡 ( 適 切 なフィルターセットを 用 いたシーケンシャルモード)を 用 いてイメージングを 行 った。パネル D. 細 胞 標識 12 時 間 後 のイメージング 結 果 では、 異 なる 標 識 を 行 ったタンパク 質において 細 胞 質 から 細 胞 膜 へ 移 動 したタンパク 質 や 細 胞 膜 から 細 胞 内 移行 したタンパク 質 が 観 察 された。6347TA+ NON製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内蛍 光 リガンド( 標 準 プロトコル 用 )HaloTag ® TMR Ligand 15µl G8252 45,00030µl G8251 75,000HaloTag ® Oregon Green ® Ligand 15µl G2802 45,00030µl G2801 75,000HaloTag ® diAcFAM Ligand 15µl G8273 45,00030µl G8272 75,000HaloTag ® Coumarin Ligand 15µl G8582 45,00030µl G8581 75,000HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligand( 細 胞 膜 非 透 過 性 )15µl G1002 45,00030µl G1001 75,000蛍 光 リガンド("No-wash" プロトコル 用 [11 ページ 参 照 ])HaloTag ® TMRDirect TM Ligand 30µl G2991 45,000HaloTag ® R110Direct TM Ligand 30µl G3221 45,000ビオチンリガンドHaloTag ® Biotin Ligand 30µl G8281 75,000HaloTag ® PEG-Biotin Ligand( 細 胞 膜 非 透 過 性 ) 30µl G8591 75,000未 標 識 リガンドHaloTag ® Amine(04)Ligand 5mg P6741 95,000HaloTag ® Succinimidyl Ester(04)Ligand 5mg P6751 95,000HaloTag ® Thiol(04)Ligand 5mg P6761 95,000HaloTag ® Iodoacetamide(04)Ligand 5mg P6771 95,000HaloTag ® Succinimidyl Ester(02)Ligand 5mg P1691 95,000HaloTag ® Amine(02)Ligand 5mg P6711 95,000HaloTag ® Iodoacetamide(02)Ligand 5mg P1681 95,000※ G2991, G3221 は 高 純 度 リガンドです。※ 蛍 光 リガンドは 通 常 1000 倍 に 希 釈 して 使 用 します( 原 液 30µl は 300 ウェル 分 に 相 当 :1X リガンド 希 釈 液 100µl/ ウェル 使 用 時 [8 ウェルチャンバーなど ])。※ 未 修 飾 リガンドは 研 究 目 的 に 応 じて、 新 たな 蛍 光 リガンドを 作 成 する 場 合 などに利 用 できます。また 固 相 にカップリングさせている 例 などもあります。 反 応 法 は、各 製 品 シートをご 覧 ください。O2 と O4 の 違 いは、 反 応 基 と HaloTag ® 結 合 基 の 間のエーテル 結 合 数 の 違 いです。HaloTag ® TMR Ligand555 Ex /585 EmC 35 H 42 CIN 3 O 6MW = 636HaloTag ® Oregon Green ® Ligand496 Ex/516 Em(after hydrolysis)C 35 H 34 CIF 2 NO 10MW = 702HaloTag ® diAcFAM Ligand494 Ex /526 Em (after hydrolysis)C 35 H 36 CINO 10MW = 666HaloTag ® Coumarin Ligand353 Ex /434 EmC 22 H 31 CIN 2 O 5MW = 439HaloTag ® Alexa Fluor ® 488 Ligand494 Ex/517 EmC 47 H 72 CIN 5 O 12 S 2MW = 999HaloTag ® TMRDirect Ligand555 Ex /585 EmC 35 H 42 CIN 3 O 6MW = 636HaloTag ® R110Direct Ligand502 Ex /527 EmC 31 H 34 CIN 3 O 6MW = 580H 2 NOO F–O 2 COO OO O OOOONH 2+ NOO–O 2 CNHNHOOONHNHNHOONOOOO – O –O S O O S OH 2 N O+ NH 2OOO+ NH 2OOF ONHO–CO 2NHOCO 2–OOOOOOOOOO2ClClClClNH +ClClCl6274MA蛍 光 リガンドの 特 性 と 構 造9

Imaging細 胞 免 疫 染 色抗 体 による HaloTag ® の 局 在 性 確 認細 胞 免 疫 染 色 やウェスタン 分 析 に 使 用 できる HaloTag ®に 対 する抗 体 , Anti-HaloTag ® pAb(カタログ 番 号 G9281)もございます。本 抗 体 は HaloTag ®タンパク 質 に 対 する 精 製 ウサギポリクローナル 抗 体 で、プロテイン G アフィニティレジンで 精 製 されています。この kDa 抗 体 は、HaloTag ®リガンドとの 共 標 識 に 利 用 でき、それぞれの 標 識 に 対 して 互 いに 干 渉 しません。HaloTag ®タンパク質 に 捕 捉 ・ 固 定 用 リガンドが 結 合 している 際 のイメージングや、パルスチェイス 実 験 にも 使 用 されています。p65-HaloTag ®Ligand 200Gel Imaging Western Blotting– + – +– + – + – + – +97kDa66423628ウェスタンブロッティングにおける Anti-HaloTag ® pAb の 免 疫 反 応 性p65-HaloTag ® をトランスフェクションした HEK293 細 胞 および 非 トランスフェクションコントロール HEK293 細 胞 を 5µM HaloTag ® TMRLigand で 標 識 (または 未 標 識 )した 後 、ライセートを SDS-PAGE に 供した。ゲルの 蛍 光 イメージング 像 ( 左 図 )。メンブレンに 転 写 後 、Anti-20HaloTag ® pAb(1000 倍 希 釈 )、HRP 標 識 2 次 抗 体 を 用 いてウエスタン分 析 を 行 った( 化 学 発 光 検 出 )( 右 図 )。1466363TAHaloTag ® リガンドと Anti-HaloTag ® pAb による HaloTag ® 融 合 タンパク 質 の 標 識p65-HaloTag ®コ ン ス ト ラ ク ト を 安 定 に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し たHEK293 細 胞 を HaloTag ® TMR Ligand で 標 識 後 に 固 定 した。さらに Anti-HaloTag ® pAb および Alexa Fluor ® 488-conjugated anti-rabbit-IgG で 標識 した。パネル A. HaloTag ® TMR Ligand 標 識 。パネル B. Anti-HaloTag ®pAb 標 識 。パネル C. 重 ね 合 わせ 像製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内Anti-HaloTag ® pAb 200µg G9281 52,000FACS ® 分 析セルソーティングHaloTag ® リガンドで 標 識 した 細 胞 は FACS ® 分 析 を 行 うことができます。 浮 遊 細 胞 あるいは 付 着 細 胞 で 実 施 でき、ソートした細 胞 は 顕 微 鏡 によるイメージングや SDS-PAGE、さらに 異 なる 蛍 光 色 での 標 識 ( 細 胞 内 で 新 規 に 発 現 した HaloTag ® タンパク 質 )なども 行 えます。 標 識 操 作 はステップを 簡 略 化 した "Non-Wash Protocol" あるいは 標 準 プロトコルでも 実 施 できます( 次 ページ参 照 )。HaloTag ® を 発 現 し、 標 識 された 細 胞 の FACS ® 解 析核 移 行 シグナルを 融 合 させた HaloTag ® タンパク 質 を 安 定 に 発 現 するU2OS 細 胞 を HaloTag ® R110Direct Ligand で 標 識 (Non-Wash Protocol)し、 未 標 識 細 胞 と 混 和 した 後 、 既 知 数 の 標 識 細 胞 (1%, 10% または100%)をソートした。R1 は R110 標 識 細 胞 、R2 は 死 細 胞 (プロピジウムイオダイド)、R3 は 非 標 識 細 胞 。 各 グラフは 約 20,000 個 の 細 胞 に 相 当 。7527TAFL1=R110, FL2=PI10

HaloTag ® ガイドImagingゲル 内 分 析抗 体 を 使 用 せずに 標 的 タンパク 質 だけを 検 出生 細 胞 内 で 発 現 した HaloTag ®タンパク 質 を 蛍 光 リガンドで 標 識 後 、 調 製 したライセートをそのまま SDS-PAGE に 供 し、 融 合タンパク 質 を 蛍 光 検 出 することができます。HaloTag ® タンパク 質 とリガンドの 結 合 は 強 固 ( 共 有 結 合 )であるため、SDS 共 存下 、95℃、5 分 間 の 処 理 を 行 っても 解 離 することが 無 く、 定 量 的 に 解 析 することができます。■ タンパク 質 の 定 量 的 な 検 出62 kDa33 kDa2600 pg1300 pg660 pg330pg170 pg85 pg40 pg20 pg10 pg5 pgGST-HaloTag ®HaloTag ®HaloTag ® タンパク 質 のゲル 分 析GST-HaloTag ® タンパク 質 は FAM ligand で、HaloTag ® タンパク 質 は TMRligand で 標 識 した。RFUkDa8,000,0006,000,0004,000,0002,000,000GST-HaloTag ® 7r 2 = 0.98HaloTag ® 7r 2 = 1.000 0.5 1 1.5 2pmol標 識 タンパク 質 の 直 線 的 な 標 準 曲 線■ 発 現 タンパク 質 の 迅 速 な 確 認生 細 胞 を 蛍 光 標 識 した 後 のライセートを SDS-PAGE に 供 し、 発現 タンパク 質 の 分 子 量 を 迅 速 に 確 認 することができます。この方 法 は、かずさ DNA 研 究 所 で Flexi ® HaloTag ® ORF Clone 作 製時 に 行 われるタンパク 質 発 現 の 確 認 作 業 で 実 際 に 使 用 されています( 詳 細 については 6 ページ 参 照 )。198 →126 →85 →37 →細 胞 内 で 発 現 した HaloTag ® タンパク 質 の 蛍 光 検 出 による 分 子 量 確 認ハイコンテント 分 析洗 浄 ステップを 伴 わない 簡 便 なシンプルプロトコル新 しく 開 発 された HaloTag ® TMRDirect および R110Direct Ligand を 用 いたシンプル - プロトコル '"Non-Wash Protocol" は、リガンドを 低 濃 度 に 抑 え、 長 時 間 インキュベーションすることで 標 的 HaloTag ® タンパク 質 を 標 識 する 方 法 で、 洗 浄 操 作 を 省 くことができるため、ハイコンテントスクリーニングの 自 動 化 などに 最 適 です。 低 濃 度 の HaloTag ® リガンドを 長 時 間 にわたり 暴 露しますが、 毒 性 も 無 く、 多 くのアプリケーションに 適 合 します。 (Rapid Labeling Protocol)(24-48 hrs)15minLabeling30min (”Non-Wash” Protocol)18-24 hrsLabelingCells Ligands Wash Media replacement標 準 プロトコルとシンプルプロトコルの 操 作 比 較"No-wash" 生 細 胞 標 識 プロトコルでも 示 された 高 いシグナル / ノイズ 比と 特 異 性核 移 行 シグナルを 融 合 させた HaloTag ® を 安 定 に 発 現 する U2OS 細 胞 をHaloTag ® R110Direct Ligand で 洗 浄 ステップを 省 略 した 方 法 で 標 識 した。パネル A. 蛍 光 イメージ。パネル B: 蛍 光 イメージと DIC イメージの 重 ね合 わせ。11

Imaging植 物 での 応 用HaloTag ® は 植 物 でも 発 現 し、 本 来 の 機 能 を 有 しています。植 物 細 胞 でも HaloTag ® タンパク 質 は 発 現 することが 確 認 され、 細 胞 壁 を 透 過 することも 報 告 されています。 植 物 細 胞 に 対する 毒 性 もなく、またご 利 用 目 的 に 応 じた 蛍 光 色 素 を 使 ってイメージングすることや、 植 物 細 胞 で 発 現 したタンパク 質 をHaloLink TM 等 を 用 いて、 共 沈 させることも 可 能 です。また 小 麦 胚 芽 由 来 の in vitro 転 写 、 翻 訳 系 の TNT ® Coupled Wheat GermExtract System を 利 用 して、HaloTag ® 融 合 タンパク 質 を 大 量 に 合 成 することも 可 能 です。 植 物 を 使 った 例 として、 以 下 の 論 文が 報 告 されています。Lang C. et al.(2006)HaloTag ® : A new versatile reporter gene system inplant cells. Journal of Experimental Botany. 57(12):2985-2992.(PMID:16873446)この 論 文 は、 植 物 細 胞 において 初 めて HaloTag ® Interchangeable ProteinLabeling Technology を 使 った 報 告 である。pHT2 Vector をテンプレートとして、HaloTag ® タンパク 質 の cDNA を PCR で 増 幅 し、pGEM ® -TEasy Vector へ 導 入 した。さらに 導 入 した 遺 伝 子 は、カリフラワーモザイクウイルスウイルス(CaMV)-35S プロモータにより 目 的 タンパク質 を 発 現 させるベクターに 導 入 した。 構 築 したベクターは、tobaccoprotoplast やタバコの 葉 細 胞 に 導 入 した。その 後 細 胞 内 での 局 在 を、HaloTag ® TMR や diAcFAM Ligand を 用 いて 検 出 している。Ogawa M. et al.(2008)Arabidopsis CLV3 peptide directly binds CLV1ectodomain. Science 319 , 294.(PMID: 18202283)著 者 らは、CLV1 のキナーゼ 領 域 を HaloTag ® タンパク 質 と 置 換 したCLV1-HaloTag ® 融 合 タンパク 質 をタバコ BY-2 細 胞 に 発 現 させ、その細 胞 膜 画 分 を 調 製 し、トリチウムラベルした CLV3 との 結 合 を 調 べた。CLV1-HaloTag ® 融 合 タンパク 質 を 発 現 させた 細 胞 では、 野 生 型 の 細 胞 と比 較 して 有 意 に CLV3 との 結 合 が 見 られた。さらに Photoaffinity labelingの 手 法 を 用 いて , HaloTag ® -CLV1 融 合 タンパク 質 に [ 125 I]ASA-CLV3 が 結合 する 事 を 確 認 し、CLV3 が CLV1 の 細 胞 外 領 域 に 結 合 することを 明 らかにした。その 他 の 生 物 種 での 応 用HaloTag ® は 粘 菌 やゼブラフィッシュなど 幅 広 い 生 物 種 にも 応 用 できます。HaloTag ® を 利 用 した 研 究 は、 哺 乳 動 物 細 胞 、 植 物 だけでなく、 粘 菌 、ゼブラフィッシュでも 報 告 されています。 特 に 全 反 射 顕微 鏡 を 用 いた 分 子 イメージングでは、 従 来 の 蛍 光 タンパク 質 比 べての 優 位 性 が 報 告 されています。また 大 腸 菌 での 発 現 例 もあり、多 くの 生 物 種 で HaloTag ® を 使 った 研 究 が 進 んでいます。Miyanaga Y. et al.(2009)Single-Molecule Imaging Techniques toVisualize Chemotactic Signaling Events on the Membrane of LivingDictyostelium Cells. Methods in Molecular Biology 571, 417-435.(PMID:19763983)全 反 射 蛍 光 顕 微 鏡 (TIRFM)を 用 いた、キイロタマホコリカビ( 細 胞 性 粘 菌 )での 1 分 子 ライブセルイメージングの 論 文 である。cAMP receptor 1(cAR1)-HaloTag ® プラスミドをエレクトロポレーションでキイロタマホコリカビ 細 胞 に 導 入 している。HaloTag ® + TMR Ligand と、GFP のような 蛍 光 タンパク 質 を 比 較 した 場 合 、HaloTag ® + TMR Ligand の 方 が 蛍 光のブリンキングが 少 ない、 退 色 までの 時 間 が 長 い、また TMR Lignad の濃 度 が 調 節 可 能 といった 特 長 を 持 つことから、 少 なくとも 1 分 子 イメージングにおいては HaloTag ® + TMR Ligand の 方 が 優 れていると 結 論 している。Arai Y. et al.(2010)Self-organization of the phosphatidylinositol lipidssignaling system for random cell migration. Proc. Natl. Acad.Sci.USA.107(27): 12399-12404.(PMID: 20562345)細 胞 の 自 発 運 動 では 細 胞 の 前 後 極 性 が 形 成 されるが、 外 部 シグナルがない 場 合 には 細 胞 が 自 己 組 織 化 反 応 により 自 発 的 に 極 性 を 形 成 する。この細 胞 極 性 の 時 空 間 パターンを、PTEN-HaloTag ® を TMR Ligand で 可 視 化することにより 観 察 している。Li W. M. et al.(2008)Multiple roles of the furrow deepening Ca2+transient during cytokinesis in zebrafish embryos. Dev. Biol. 316(2):228-248.(PMID: 18313658)細 胞 質 分 裂 の 際 には VAMP-2 小 胞 が 分 裂 溝 に 集 積 し、 分 裂 を 促 進 する 役割 を 持 つ。VAMP-2-HaloTag ®をコードする mRNA をゼブラフィッシュの 胚 にマイクロインジェクションし、TMR Ligand で 染 色 することにより、VAMP-2 の 分 裂 溝 への 集 積 を 観 察 している。50nM HaloTag ® TMR および 0.25% rhamnose を 含 む LB Agar プレートに HaloTag-hRL( 改 変ウミシイタケルシフェラーゼ)または、hRL のみを 含 む 大 腸 菌 KRX 株 を 播 種 (1:100)した。LB プレートを 蛍 光 観 察 (Ex532nm/Em580nm)することにより、HaloTag-hRL を 発 現 するコロニーを 検 出 した。 大 腸 菌 内 で 目 的 タンパク 質 が 発 現 していることを 電 気 泳 動 前 に 確 認 できた。12

HaloTag ® ガイドImagingタンパク 質 の 分 解タンパク 質 の 分 解 過 程 を 可 視 化 、 定 量 化 することができます。タンパク 質 の 寿 命 や 分 解 に 関 する 研 究 は 近 年 注 目 されています。これまでは、タンパク 質 の 寿 命 を 解 析 するには、[ 35 S]Met を 使 ってタンパク 質 をラベルしたりタンパク 質 合 成 阻 害 剤 を 添 加 したりする 必 要 がありました。しかし、HaloTag ® を 使 えば、 細 胞 内で 発 現 させたタンパク 質 を 瞬 間 的 に 蛍 光 ラベルし、その 後 は 蛍 光 を 測 定 するだけで、そのタンパク 質 の 寿 命 が 解 析 できます( 下図 参 照 )。また、 蛍 光 ラベルした HaloTag ® タンパク 質 は 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 できるので、 分 解 過 程 を 可 視 化 することができます。もちろん 分 解 過 程 だけでなく、 瞬 間 的 にラベルすることが 出 来 るので、タンパク 質 の 局 在 の 変 化 の 観 察 にも 適 しています(9 ページ 参 照 )。HaloTag ® Biotin Ligand [ カタログ 番 号 G8281] で 標 識 し、その 量 の 変 化 を 解 析 している 報 告 もあり、 実 験 方 法 は 多 彩です。AControlTNF-Lactacystin+ TNF-ABPercent of initial fluorescence signal1008060402000 min 30 min 60 min 120 minControlLactacystin TNF- αTNF- α0 30 60 90 120Time (min)BPercent of initial fluorescence signalB100806040200ControlLactacystin TNF- αTNF- α0 30 60 90 120Time (min)TNF- α 依 存 的 な IκB-HaloTag ® 融 合 タンパク質 の 分 解パネル A)IκB-HaloTag ® 融 合 タンパク 質 をHEK293 細 胞 に 一 過 的 に 発 現 させ、TMR リガンド(5µM)で 標 識 した。TNF-α(10ng/ml) で 刺 激 後 、10 分 間 隔 で 3 時 間 まで 観 察 を行 った( 図 では 0、30、60、120 分 後 の 画 像を 示 した)。TNF-α の 刺 激 の 30 分 前 より 10µΜの Lactacystin で 処 理 することにより、 分解 が 抑 制 された。パネル B) 細 胞 の 平 均 的 な蛍 光 強 度 をオリンパス FV500 ソフトウェアにより 求 め、 時 間 0 での 蛍 光 強 度 を 100 として 示 している。 TimeTNF-Lactacystin TNF-パルス・チェイス 多 重 染 色 の 概 念 図(min) 0 30 60 120 180 240 0 30 60 120 180 240刺 激 A(もしくは 刺 激 なし)によって 発 現 した HaloTag ®タンパク 質 ”1”を 緑 色 蛍 光 リガンドで 染 色 をすると、その 時 点 で 発 現 していた HaloTag ® タンパク 質 は 緑 色 で 検 出 できます”2”。その 後 、 一 定 時 間 経 過 した 後 、 同 じ 細 胞 に 刺 激 B を 加 えて”3”、 赤 色 蛍 光 リガンドで 染 色 すると、 刺 激 A で 発 現 し72 kDaた HaloTag ® タンパク 質 にはすでに 緑 色 リガンドが 結 合 しているため、 刺 激 B で 新 たに 発 現 したものだけが 赤 色 に 染 め 分 けられます”4”。1 種 類 の 蛍 光 リガンドとビオチンリガンドを 組 み 合 わせて 単 色 でのパルス・チェイス 染 色 を 行 うことでタンパク 質 の 寿 命 を 解 析 することも 可 能 です。また細 胞 膜 非 透 過 性 リガンドと 細 胞 膜 透 過 性 リガンドを 使 って 細 胞 膜 内 ・ 外 を 分 けて 染 色 することで 細 胞 膜 から 細 胞 質 へのタンパク 質 局 在 変 化 をパルスラベリング 法 と 組 み 合 わせて 解 析 することも 可 能 です。Wang L, et al.(2008)The Chaperone Activity of Heat Shock Protein 90Is Critical for Maintaining the Stability of Leucine-Rich Repeat Kinase 2.J .Neurosci. 28(13): 3384-3391.(PMID: 18367605)著 者 らは、LRRK2 と Hsp90 が in vivo でも 結 合 し、 安 定 性 に 大 きな 影響 を 与 えていることを HaloTag ® に 融 合 した 野 生 型 と 変 異 型 の LRRK2の 細 胞 内 分 解 をパルスチェイス 法 により 比 較 することで 示 した。 細 胞内 で 発 現 した HaloTag ® タンパク 質 を 15 分 間 、Biotin リガンドで 標 識後 、Streptoavidin-coated beads で 沈 降 させ、 沈 降 したタンパク 質 をHaloTag ® に 対 する 抗 体 を 使 って 定 量 している。Tatematsu K. et al.(2008)Identification of ubiquitin ligase activity ofRBCK1 and its inhibition by splice variant RBCK2 and protein kinase Cβ.J. Biol. Chem. 283 , 11575-11585.(PMID: 18303026)RBCK1 とユビキチン 化 タンパク 質 との 相 互 作 用 を、HaloTag ® ユビキチンと FLAG-RBCK1 を HEK293 細 胞 に 共 発 現 させて 検 討 している。パルスチェイスの 実 験 では、HEK293 細 胞 に HaloTag ® -RBCK1 タンパク 質 とRBCK2 タンパク 質 と 共 発 現 させ、HaloTag ® -TMR リガンドを 使 うことで、RBCK2 を 過 剰 発 現 させた 場 合 、RBCK1 の 半 減 期 が 延 びることを 示 している。13

Protein / Protein interactionプルダウンアッセイ効 率 的 なタンパク 質 :タンパク 質 相 互 作 用 解 析標 準 的 なプルダウンアッセイでは、 担 体 に 結 合 するベイト(bait)タンパク 質 濃 度 を 高 くするために 大 腸 菌 発 現 系 が 汎 用 され、アフィニティータグである GST との 組 合 わせが 多 く 見 られます。しかし、タンパク 質 間 の 相 互 作 用 には 修 飾 やフォールディングなどが 必 要 な 場 合 があり、 大 腸 菌 の 発 現 系 では 相 互 作 用 を 見 逃 してしまう 場 合 があります。この 点 で 哺 乳 動 物 の 細 胞 や 無 細胞 発 現 系 を 用 いた 相 互 作 用 は 有 用 ですが、 大 腸 菌 より 発 現 量 が 比 較 的 少 ないため 検 出 が 困 難 な 場 合 があります。これを 解 消 するのが HaloTag ® の 持 つ 高 い 親 和 性 ( 共 有 結 合 : 右 上 図 参 照 )と 迅 速 な 結 合 速 度 です。 発 現 量 が 少 なくても、 強 力 な 洗 浄 が 可 能であるためバックグラウンドを 極 めて 低 く 抑 えられ、 検 出 感 度 が 上 がります。 標 準 的 なプルダウンアッセイでは、 非 特 異 的 なタンパク 質 の 結 合 による 擬 陽 性 が 問 題 となりますが、HaloTag ® と HaloLink TM ( 担 体 )は 強 力 な 結 合 力 を 有 し、HaloLink TM への非 特 異 的 結 合 が 最 低 限 に 抑 えられているため 擬 陽 性 を 著 しく 低 減 させることができます。これらの 特 性 により 無 細 胞 発 現 タンパク 質 を bait/prey の 両 方 に 用 いたり、 哺 乳 動 物 細 胞 内 での 相 互 作 用 を 検 出 することも 可 能 になります。プルダウンアッセイで検 出 された 特 異 的 結 合 パートナーは、SDS-PAGE や 質 量 分 析 により 解 析 ・ 同 定 することができます。■ HaloTag ® vs GST(bait/prey = 無 細 胞 発 現 タンパク 質 )同 等 の 条 件 下 で 比 較 した HaloTag ® および GST とそれぞれの 親 和 性 レジンとの 結 合 能 力 ( 右 図 )および 実 際 のプルダウンアッセイにおける 検 出 感 度 ( 下 図 )とも HaloTag ®が優 れていました。supernatants10% inputHaloLink TM GST ResinfusionProtein 10min 24hr 10min 24hrGSTHTGST-BindingResinGST-Fos –(prey)HaloLinkpull-downJun-HT (bait)ControlGSTpull-downGST-Fos (bait)Control– Jun-HaloTag ®Fusion (prey)HT 5619TAGSTHaloTag ® 融 合 タンパク 質 の 強 固 な 結 合等 量 (25µl [ 沈 殿 状 態 ])の HaloLink TM Resin および GST 結 合 レジンを、それぞれ HaloTag ® -GST 融 合 タンパク 質 160µg と 混 合 し、インキュベーションした。レジンを 洗 浄 し、PBS に 再 懸 濁 した。4℃で 表 示 時 間 インキュベーション 後 、SDS-PAGE により 上 清 を 分 析 した。 最 左 のレーンでは、 添 加 した HaloTag ® -GST 融 合 タンパク 質 の 10% 量 を 泳 動 した。HaloLink TM では 24 時 間 後 に 回 収 した 上 清 でも HaloTag ® -GST 融 合 タンパク 質 は 検 出 されない。 一 方 、GST Resin では、すでに 10 分 後 の 上 清 でHaloTag ® -GST 融 合 タンパク 質 が 検 出 された。5612TAPreyGST*HT*PreyFos*Jun*JunbaitHT FosbaitGST HaloLink TM Resin:HaloTag ® リガンドでコートしたセファロースレジン。粒 子 サイズ : 45 ~165µm結 合 容 量 :> 7mg/ml( 沈 殿 レジン)HaloLink TM Magnetic Beads:HaloTag ® リガンドでコートした 磁性 体 粒 子 。粒 子 サイズ : 10 ~125µm結 合 容 量 :> 10mg/ml( 沈 殿 ビーズ)HaloTag ®および HaloLink TM Resin を 用 いたプルダウン 法 と GST を 用いたプルダウン 法 の 比 較GST-c-Fos および c-Jun-HaloTag ® 融 合 タンパク 質 を 無 細 胞 発 現 系 で 合成 し、 互 いに bait( 未 標 識 )あるいは prey( 35 [S]- メチオニン 標 識 )として 用 いた。 合 成 完 了 後 、 未 標 識 タンパク 質 および 標 識 タンパク 質パートナーからなる 2 組 の 反 応 液 を 混 合 し、タンパク 質 を 結 合 させた。HaloLink TM Resin( 左 パネル)または GST- 結 合 レジン( 右 パネル)を 用 いて、タンパク 質 複 合 体 をプルダウンした。 左 レーン : HaloLink TMまたはGST レジンを 用 いた GST-c-Fos または c-Jun-HaloTag ® タンパク 質 のプルダウン。 右 レーン : HaloLink TM または GST レジンのみ。製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内捕 捉 ・ 固 定 用 リガンドHaloLink TM Resin 2ml G1911 27,0005ml G1912 58,00010ml G1914 72,000HaloLink TM Magnetic Beads 1ml G9311 16,000HaloTag ® Biotin Ligand 15µ G8282 45,00030µl G8281 75,000HaloTag ® PEG-Biotin Ligand( 細 胞 膜 非 透 過 性 ) 15µl G8592 45,00030µl G8591 75,00014

HaloTag ® ガイド■ 哺 乳 細 胞 内 (in vivo)で 形 成 されたタンパク 質 相 互 作 用 の 検 出 (bait/prey = 哺 乳 動 物 細 胞 発 現 タンパク 質 )in vivo におけるタンパク 質 相 互 作 用 の 分 析 は、より 生 体 内 に 近 い 状 態 で 厳 密 な 相 互 作 用 を 再 現 できるため 非 常 に 重 要 です。HaloTag ® Mammalian Pull-Down and Labeling System は、HaloTag ® 融 合 タンパク 質 を 哺 乳 動 物 細 胞 内 で 発 現 させ、 細 胞 内 に 含 まれる 相 互 作 用 パートナーやタンパク 質 複 合 体 をプルダウンするためのシステムです。HaloTag ® とレジンとが 共 有 結 合 するため、一 過 性 あるいは 弱 い 相 互 作 用 を 形 成 するパートナーやより 高 次 の 細 胞 内 タンパク 質 複 合 体 を 捕 捉 あるいは 精 製 することができます。 本 システムには HaloTag ® TMRDirect TM Ligand も 含 まれており、 同 じ 遺 伝 子 コンストラクトを 用 いて 複 合 体 形 成 との 相 関 的な 細 胞 内 局 在 やリアルタイムイメージングも 観 察 でき、タンパク 質 機 能 全 体 像 の 理 解 に 役 立 ちます。 付 属 する HaloTag ® ControlVector には CMV プロモーター、T7 や SP6 RNA ポリメラーゼプロモーターが 含 まれており、 哺 乳 動 物 細 胞 、 大 腸 菌 あるいは 無 細胞 発 現 系 で HaloTag ® タンパク 質 を 発 現 させることができます。このベクターは 全 ての HaloTag ® 実 験 システムでコントロールとして 使 用 することができます。免 疫 共 沈 降p65 Ab No Abp65-HTHaloTag ®HT Cont POIHT POIHT HTPOI予 想 されるパートナー 免 疫 共 沈 降 HaloTag ®p105 ○ ○p100○Rel A ○ ○Rel B○C-Rel○IκBα ○ ○IκBb ○ ○IκBe ○ ○POIPOIHTHaloLinkResinbait タンパク 質 として HaloTag ®融 合 タンパク 質 を 用 いた HaloTag ®Mammalian Pull-Down Assay の 概 要HaloTag ® Mammalian Pull-Down Assay と 免 疫 共 沈 降 法 によるプルダウンの 比 較上 図 :HeLa 細 胞 で p65 の 相 互 作 用 パートナーのプルダウンを 行 った後 に 電 気 泳 動 - 銀 染 色 により 検 出 し、HaloTag ® Mammalian Pull-DownAssay と 免 疫 共 沈 降 法 を 比 較 し た。HaloTag ® Mammalian Pull-DownAssay では 免 疫 共 沈 降 法 の 約 4 ~ 5 倍 の 感 度 が 得 られた。 上 表 :2 つの方 法 により 確 認 された p65 パートナー。 予 想 される 相 互 作 用 パートナーは 質 量 分 析 により 確 認 した。製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内システムHaloTag ® Mammalian Pull-Down and Labeling System 24 回 分 G6500 88,000HaloTag ® Mammalian Pull-Down System 24 回 分 G6504 56,000関 連 製 品HaloTag ® Control Vector 20µg G6591 39,000Protease Inhibitor Cocktail, 50X 1ml G6521 14,000Mammalian Lysis Buffer 40ml G9381 9,000HaloLink TM Resin 10ml G1914 72,0009033MA内 容 :G6500、G6504• HaloLink TM Resin(5ml)• Protease Inhibitor Cocktail, 50X(1ml)• Mammalian Lysis Buffer(10ml)• 10X TBS Buffer(25ml)• SDS Elution Buffer(1.3ml)• HaloTag ® TMRDirect TM Ligand(30µl)(G6500のみ)15

Protein Arrayタンパク 質 アレイ配 向 性 に 優 れたタンパク 質 提 示 が 可 能HaloLink TM Array System は HaloTag ®リガンドを 利 用 したタンパク 質 アレイシステムです。 無 細 胞 系 で 発 現 させた 標 的HaloTag ® タンパク 質 を 固 定 化 するセルフプリント 方 式 で、 自 由 にタンパク 質 アレイを 作 製 することができます。 無 細 胞 発 現 は短 時 間 (2 時 間 以 内 )でタンパク 質 を 調 製 でき、スライド 上 の HaloTag ® リガンドへ 迅 速 に 共 有 結 合 するので 標 的 タンパク 質 を精 製 する 必 要 がありません( 固 定 化 / 洗 浄 のみ)。A.PreyB.cJucFosp501 2 3 4 5HT-cJunHT-cFosHT-PKAHT-R1HT-p53HT-p65HT-Galcell-free lysatePBSBBaitFluorescence (RFU)35,00030,00025,00020,00015,00010,0005,0000Enzyme AssaycJuncFosPKAR1αp53p65β-galHaloTag ®proteinHaloTag ® -Fusion Proteins(1:20 dilution)03510204081161323645HaloTag ® StandardProtein (pmol/ml)に 固 定 した 融 合 タンパク 質 およびタンパク 質 の 検 出 例 パネル HaloLink TMArray に 固 定 した HaloTag ® Standard Protein(1 列 目 )および 各 HaloTag ® -bait 融 合 タンパク 質 (2 列 目 )は Anti-HaloTag ® pAb および Alexa Fluor ® 633標 識 2 次 抗 体 、TNT ® T7 Quick Coupled Transcription/Translation Systemで 合 成 し た ビ オ チ ン 化 Prey タ ン パ ク 質 (cJun: 3 列 目 、cFos: 4 列 目 、p53: 5 列 目 )と 固 定 化 した bait タンパク 質 との 相 互 作 用 は Alexa Fluor ®647 labeled streptavidin を 利 用 して 蛍 光 イメージングを 行 った。パネルHaloTag ® Standard Protein(1 列 目 )および 各 HaloTag ® -bait 融 合 タンパク 質 (2列 目 )の 蛍 光 強 度 をプロットした。 平 均 蛍 光 強 度 は 直 径 2.0mm の 領 域 から算 出 した。8156TA50 ウェルのタンパク 質 アレイスライド製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)製 品 案 内システムHaloLink TM Array(TNT ® T7 Quick)2×50 回 分 G6140 80,000Two Slide SystemHaloLink TM Array(TNT ® SP6 Wheat Germ)Two Slide 2×50 回 分 G6180 80,000System関 連 製 品HaloLink TM Array Six Slide System 6×50 回 分 G6190 140,000HaloTag ® Standard Protein 30µg G4491 10,000・ G6190にはHaloLink Array GasketsおよびAnti-HaloTag ® pAbも 含 まれます。内 容 :G6140、G6180• HaloLink TM Slides• HaloLink TM Array Gaskets• Anti-HaloTag ® pAb• Methionine(G6140のみ)• TNT ® T7 Quick Master Mix(G6140)またはTNT ® SP6 High-Yield Wheat Germ Master Mix(G6180)• HaloTag ® Standard Protein• Nuclease-Free Water16GST-BindingResin酵 素 活 性 の 検 出低 濃 度 タンパク 質 でも 効 率 よく 回 収 できるので 感 度 良 く 検 出 できますHaloTag ® テクノロジーは、 酵 素 の 固 定 および 活 性 に 関 する 研 究にも 利 用 できます。 融 合 タンパク 質 を HaloLink TM (Resin またはMagnetic Beads) 上 に 共 有 結 合 させることで、 様 々なバッファー条 件 でタンパク 質 が 外 れること 無 く 長 時 間 にわたり 酵 素 活 性 を 測定 することができます。 他 のアフィニティー 担 体 でも 表 面 に 酵 素を 付 着 させることはできますが、インキュベーション 後 に 融 合 タンパク 質 は 担 体 より 解 離 してしまいます。HaloTag ® 融 合 タンパク質 は HaloLink TM 上 に 共 有 結 合 しているので、 解 離 することは 皆 無です。また、HaloLink TM 上 のリガンドに 対 して 一 定 方 向 に 結 合 するため、ビーズ 上 での 配 向 性 に 優 れており、 最 大 の 活 性 を 保 持 することができます。Rapamycin HTEnzSubstrate% Enzymatic Activity1009080706050403020100InputBoundLuciferaseControlInputBoundLuciferase-HaloTag ®HaloLink TM Resin 上 に 固 定 化 したタンパク 質 の 酵 素 活 性 検 出HaloTag ®融 合 ル シ フ ェ ラ ー ゼ を in vitro で 合 成 し、 反 応 液 20µl をHaloLink TM Resin 50µl に 添 加 した。 結 合 の 特 異 性 を 評 価 するため、タグを 付 加 していないルシフェラーゼを 発 現 させ、 陰 性 対 照 としてレジンに 添 加 した。 添 加 した 材 料 (in vitro 転 写 / 翻 訳 反 応 液 )の 酵 素 活 性 を100% とした 場 合 、レジン 表 面 の 酵 素 活 性 として 60% 回 収 することに 成功 した。5614MA

TFHTHaloTag ® ガイドProtein / DNA Interactionクロマチン 免 疫 沈 降" 抗 体 を 使 わない " 高 感 度 な ChIP 様 解 析 (タンパク 質 :DNA 相 互 作 用 解 析 )HaloTag ® テクノロジーをベースにした HaloCHIP TM System は、 細 胞 内 のタンパク 質 /DNA 複 合 体 を 共 有 結 合 により 捕 捉 する 新しい 方 法 を 採 用 したクロマチン 免 疫 沈 降 法 (ChIP)に 替 わるシステムです。 抗 体 を 使 用 しないため、 従 来 法 よりも 効 率 的 で 安 定したデータが 得 られます。 細 胞 内 で HaloTag ® 融 合 体 として 発 現 し、DNA に 結 合 した 目 的 のタンパク 質 は、ホルムアルデヒドにより DNA と 架 橋 され、 融 合 タンパク 質 の HaloTag ® 部 位 と 高 い 特 異 性 で 共 有 結 合 する HaloLink TM Resin 上 に 捕 捉 されます。レジンとタンパク 質 /DNA 複 合 体 との 間 に 共 有 結 合 が 形 成 されるため、 強 力 な 洗 浄 により 非 特 異 的 に 結 合 したタンパク 質 やDNA を 従 来 の ChIP 法 よりも 効 率 的 に 除 去 することができます。その 後 、 架 橋 を 外 して HaloLink TM Resin より 精 製 DNA 断 片 を回 収 します。HaloCHIP TMChIP)・ベクターを 使 用( 融 合 タンパク 質 の 発 現 )TFHTHaloTag ®fusion constructTF・ 抗 体 を 使 用・タグを 付 加 した 組 換 えタンパク 質TFHTHaloTag ® ProteinTFTranscription factor・ 内 在 タンパク 質・ 所 用 時 間 :1.5 ~ 2 日・ 共 有 結 合 でタンパク 質 :DNA 複 合 体 を 補 足・ 少 ないステップ 数 、エラーが 低 減HaloLink HTTFHaloLink HTHaloCHIP SystemTFHaloCHIP SystemTFTFA/GAntibodyChIP ChIPS S B B S S B BProtein A/G・ 所 用 時 間 :4 ~ 5 日・ 抗 体 / プロテイン A/G でタンパク 質 :DNA 複 合 体を 補 足・ 多 くのステップ 数 、データのバラツキS B S B・ 低 いバックグラウンド、高 い S/B 比← IκB IκB IkB →プロモーターpromoter・ 高 いバックグラウンド、低 い S/B 比HaloCHIP TM と 従 来 法 の 比 較PCR 増 幅 結 果 :HaloCHIP TM および 標 準 的 な ChIP 法 で 回 収 した DNA を 用 いて、p65 特 異 的 IkB プロモーター(300bp) 領 域 を PCR 増 幅 した 後 、2% アガロースゲルで 電 気 泳 動 し、エチジウムブロマイド 染 色 した。HEK 293T 細 胞 は p65-HaloTag ® を 安 定 に 発 現 する 細 胞 とトランスフェクションしていない 細 胞 を用 い、それぞれ TNF-a で 30 分 間 刺 激 し、HaloCHIP TM または 標 準 的 な ChIP 法 を 用 いて 処 理 した。 各 方 法 ごとにシグナル(S)とバックグラウンド(B)を 示した。バックグラウンドシグナルは、HaloCHIP TM 法 では HaloTag ® に 対 するブロッキングリガンドを 加 えたコントロールサンプル、 標 準 的 な ChIP 法 ではp65 に 対 する 抗 体 を 除 いたサンプルから 得 た。S = S specific = signal signalB B = background = 製 品 signal 案 内 signalHartzell, D. D.; Trinklein, N. D. et al.(2009)A functional analysis of theCREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughputreporter assays, BMC Genomics, 10: 497本 論 文 では、HaloCHIP TM System を 用 いた 実 験 操 作 の 基 本 的 な 手 順 、 特長 を 紹 介 している。HaloCHIP TM System と 従 来 の ChIP 法 と 比 べており、同 様 のプロモーター 領 域 が 検 出 されることを 示 している。さらにこれらのデータに 基 づき、プロモーターのオリゴ DNA マイクロアレイを 組 み合 わせることでハイスルプットなプロモーター 解 析 を 行 っている。6681TA6681TA製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)システムHaloCHIP TM System 20 回 分 G9410 85,000内 容 :• HaloCHIP TM Blocking Ligand(30µl)• HaloLink TM Resin(2ml)• High Salt Wash Buffer(25ml)• Mammalian Lysis Buffer(40ml)• Nuclease-Free Water(150ml)• Reversal Buffer(8ml)• TE Buffer, 1X, Molecular Grade(100ml)17

Purification標 的 タンパク 質 の 精 製 とタグの 切 断 / 除 去高 効 率 のタンパク 質 精 製 ストラテジーHaloTag ® Protein Purification System は、 大 腸 菌 などで 発 現 させた 組 換 えタンパク 質 の 発 現 量 および 可 溶 性 を 増 加 させる 新 規 なタグである HaloTag ® の 融 合 タンパク 質 の 精 製 用 にデザインされています。HaloTag ® テクノロジーでは、 目 的 のタンパク 質 を効 率 的 、 特 異 的 に 捕 らえ、 共 有 結 合 により 捕 捉 することができます。TEV プロテアーゼを 用 いることで HaloLink TM Resin より標 的 タンパク 質 を 切 り 離 すことができ、TEV プロテアーゼの N 末 端 には HQ タグが 付 加 されているので HisLink TM Resin を 用いて 容 易 にプロテアーゼを 除 去 することもできます。HaloTag ® タンパク 質 をコードし、 大 腸 菌 での 発 現 に 適 したベクターは、pFN18A HaloTag ® T7 Flexi ® Vector(カタログ 番 号 G2751)および pFN18K HaloTag ® T7 Flexi ® Vector(カタログ 番 号 G2681)です(キットには 付 属 しません)。8064MAStep 1 Step 2 Step 3 Step 4POIPOIPOITEVPOIHaloTag ® -IdHaloLinkResinHaloLink ResinHaloTag ® -(POI: protein of interest)HaloLinkResinHQ- TEV ProteasePOI HisLinkResinHisLink ResinTEV ProteasePOI HaloTag ®HaloTag ® coding regionTEV ProteasePOIProtein of interestHaloTag ® Purification System の 簡 便 な 操 作 ステップ全 て の HaloTag ®ベ ク タ ー に は リ ン カ ー 配 列 と し て TEV プ ロ テ ア ー ゼ 認 識 サ イ ト[ENLYFQ ↓ G] をコードする 配 列 が 含 まれるため、タグを 含 まない 標 的 タンパク 質 のみの 精 製が 容 易 に 行 えます。His タグと 同 様 の 金 属 結 合 タグである HQ タグ(HQHQHQ)が 付 加 されたTEV プロテアーゼは、HisLink TM レジンにより 除 くことができます。優 れた 切 断 効 率新 しい HaloTag ®タンパク 質 は、プロテアーゼの 切 断 効 率 を 向 上 させるためのリンカーが 付 加 されています。Cleared lysates (Coomassie stain): Without concentration : 2 x concentrated on matrix : 5 x concentrated on matrixPurified proteins (Coomassie stain)Soluble protein (µg/ml)6004002000TCTP SMPX MAR1 MAPK14 MAPK8HaloTag ® GST MBP HisPRKCG汎 用 されるアフィ 二 ティータグと HaloTag ® による 融 合 タンパク 質 の 回 収 比 較精 製 の 困 難 なタンパク 質 6 種 類 について、 各 アフィ 二 ティータグを 用 いて 精 製 を 行 った 後 、CBB 染 色 し、 可 溶 性 タンパク 質 の 回 収 量 を 比 較 した。18

HaloTag ® ガイドB.Luminescence (RLU)特 長 HaloTag ® GST MBP His GFPサイズ 33kDa 26kDa 40kDa 0.85kDa 27kDa可 溶 性 高 高 高 中 -リガンド親 和 性400,000,000300,000,000200,000,000100,000,000各 種 機 能 性 タグの 比 較0高 :リガンド特 異 的 な 共 有結 合A. kDa2001501007550S S-TEV FT E1 E2ffLucTEV35251510Super Super + TEV FT E1 E2Samplesホタルルシフェラーゼの 定 量 的 な 回 収HaloTag ® -ffLuc を 発 現 する 大 腸 菌 LB 培 養 液 50ml よりライセート 上 澄 み5ml を 調 製 し(S)、HaloLink TM Resin 1ml を 添 加 した。ルシフェラーゼの活 性 は TEV を 添 加 しても 失 活 しないこと(S-TEV)、また 効 率 よくレジンに 捕 捉 できたことが 示 された(FT)。 室 温 で 1 時 間 かけて 標 的 タンパク 質を 捕 捉 後 HaloLink TM Resin をカラムに 添 加 し、HT バッファー 20ml で 洗浄 した。cleavage solution 1ml をカラムに 添 加 し、 室 温 で 1 時 間 TEV プロテアーゼで 消 化 した。 標 的 タンパク 質 を HT バッファーで 溶 出 し、 溶出 液 2ml を 回 収 した(E1)。 最 後 に TEV プロテアーゼを 除 去 するためにHisLink TM Resin 50µl を 加 え 室 温 で 20 分 間 インキュベーションした(E2)。Lanes S; S-TEV および FT は 菌 体 培 養 液 10µl に 相 当 し、E1 および E2は 25µl に 相 当 。 活 性 測 定 では 全 てのサンプル(S, S-TEV, FT, E1 およびE2)を 1x Glo Lysis Buffer で 100 倍 に 希 釈 し、50µl を 等 量 の LuciferaseAssay Reagent(カタログ 番 号 E1501)と 混 和 した。 室 温 で 5 分 間 静 置し 発 光 を 測 定 した。E1 および E2 のデータは S および S-TEV サンプルからの 濃 縮 係 数 2.5 で 補 正 した。中 :アフィニティー(グルタチオン)中 :アフィニティー(アミロース)低 :メタルアフィニティー(IMAC)9073TA-Frequency of soluble proteins (%)80604020high solubilitymedium solubility0HaloTag ® GST MBP His発 現 融 合 タンパク 質 の 可 溶 性 比 較難 溶 性 タンパク 質 を 含 む 100 種 類 のタンパク 質 の 中 で 可 溶 性 タンパク質 として 回 収 された 割 合 を 示 す。high solubility: >100µg/ml, mediumsolubility: 10 8 cfu/ug 20 × 50μl L3002 35,000ProTEV Protease 1,000unit V6051 21,000内 容 :G6270• HaloLink TM Resin(10ml [ 25% slurry ])• HisLink TM Protein Purification Resin(10ml [ 50% slurry ])• TEV Protease for use with HisLink TM Resin(200µl)検 出Coomassie、ウエスタン、蛍 光 リガンドCoomassie、 Coomassie、ウエスタン、 ウエスタン発 色 アッセイCoomassie、ウエスタン、ゲル 内 染 色Coomassie、ウエスタン、蛍 光その 他 の用 途タンパク 質 相互 作 用 、 細 胞イメージングタンパク 質相 互 作 用タンパク 質相 互 作 用タンパク 質相 互 作 用細 胞イメージング19

Related Products製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)無 細 胞 発 現 関 連 製 品in vitro 転 写 / 翻 訳 (ウサギ 網 状 赤 血 球 ライセート)TNT ® T7 Quick Coupled Transcription/TranslationSystemTNT ® SP6 Quick Coupled Transcription/TranslationSystem5 回 分 L1171 18,00040 回 分 L1170 68,0005 回 分 L2081 20,00040 回 分 L2080 78,000in vitro 転 写 / 翻 訳 ( 小 麦 胚 芽 エクストラクト)TNT ® SP6 High-Yield Protein Expression System 10 回 分 L3261 22,00040 回 分 L3260 75,000in vitro 転 写 / 翻 訳 ( 昆 虫 細 胞 Sf21 エクストラクト )TNT ® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System 10 回 分 L1101 23,00040 回 分 L1102 82,000in vitro 転 写 / 翻 訳 (E.coli S30 ライセート)S30 T7 High-Yield Protein Expression System 8 回 分 L1115 25,00024 回 分 L1110 65,000蛍 光 標 識 システムFluoroTect TMGreen Lys in vitro Translation Labeling 40 回 分 L5001 50,000Systemイメージング 関 連 製 品GFP ベクターMonster Green ® Fluorescent Protein phMGFP Vector 20µg E6421 86,000神 経 細 胞 マーカー 抗 体Anti-βIII Tubulin mAb 100µg G7121 51,500Anti-GFAP pAb 100µg G5601 27,500製 品 名 サイズ カタログ 番 号 価 格 (¥)タンパク 質 精 製 関 連 製 品HisTag 精 製 レジンHisLink TM Protein Purification Resin 5ml V8823 5,000Streptavidin MagneSphere ® Paramagnetic Particles 9ml Z5481 20,00025ml Z5482 54,000プロテアーゼProTEV Protease (10u/µl) 1,000unit V6051 21,00010,000unit V6052 180,000タンパク 質 分 析 関 連 製 品プロテアーゼSequencing Grade Modified Trypsin 100µg V5111 13,000Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade 100µg V5280 16,500Chymotrypsin, Sequencing Grade 25µg V1061 10,000Endoproteinase Lys-C, Sequencing Grade 5µg V1071 29,000Asp-N, Sequencing Grade 2µg V1621 20,000化 学 発 光 検 出ECL Western Blotting Substrate 250ml W1001 18,000500ml W1015 29,000ライセンスについて:Monster Green ® (GFP)を 研 究 用 途 以 外 ( 営 利 目 的等 )でご 使 用 される 場 合 、ライセンス 契 約 の 必 要 があります。 詳 細 については 弊 社 までご 連 絡 ください(www.promega.co.jp/license/)On-Line Support技 術 サポートQ&A, ベクター 選 択 ガイド , Citation, etc...弊 社 ホームページより HaloTag ® の 原 理 、Q&A、Citation など、最 新 の 情 報 をご 覧 いただけます。・Q&A・ベクター 選 択 ガイド・アニメーション・Citation( 文 献 )・ 製 品 情 報・Flexi ® HaloTag ® ORF クローン 注 文 サイト詳 細 については 以 下 のサイトをご 覧 下 さい。www.promega.co.jp/halotag/HaloTag ® の 解 説 アニメーションテクニカルサービスプロメガ 株 式 会 社本 社 〒103-0011東 京 都 中 央 区 日 本 橋 大 伝 馬 町 14-15 マツモトビルTel. 03-3669-7981/Fax. 03-3669-7982大 阪 事 務 所 〒532-0011大 阪 市 淀 川 区 西 中 島 6-8-8 花 原 第 8ビル704 号 室Tel. 06-6390-7051/Fax. 06-6390-7052日 本 語 Web site:www.promega.co.jp● Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com※ 製 品 の 仕 様 、 価 格 については2010 年 9 月 現 在 のものであり 予 告 なしに 変 更 することができます。販 売 店 :PK1009-03