Técnicas Cromatográficas - UNAM

Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Química
Química Analítica Instrumental II
Técnicas Cromatográficas
Diciembre de 2007

Capítulo 1.
Introducción a los métodos de separación
Introducción a los métodos de separación
1.1 Introducción a la cromatografía
En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo
que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte
superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la
mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a
diferentes velocidades.
Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera
que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo
largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se
mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el
experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de
ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase
estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos
retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o
papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,
logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química.
Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos
cromatográficos según el estado físico de la fase móvil:
Cromatografía líquida. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un
sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un
líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-
líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en
columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un
tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor
uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior
de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido-
líquido.
Capítulo 1 1

Introducción a los métodos de separación
Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase
estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte
(cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única
manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna
puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase
estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo
(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede
clasificar en los siguientes tipos:
adsorción (normal, de fase reversa)
partición líquido-líquido
intercambio iónico
permeación sobre gel
de afinidad
Las áreas de aplicación son muy diversas y abarcan prácticamente todas las actividades en las que
interviene la química, por ejemplo: se emplea en:
El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva, la sangre, la orina;
Seguir la transformación de las sustancias responsables de la transmisión neurológica;
Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente;
Descifrar la composición de los combustibles fósiles;
Realizar el control de calidad de los productos químicos y farmacéuticos manufacturados; en fin, la lista
de ejemplos es interminable.
1.2 Cromatografía en papel
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La
fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en
un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente
empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en función de la
afinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se
aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las
sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos
Capítulo 1 2

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aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso
también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un
componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que
los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El
tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el
cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea
un método adecuado para fines analíticos.
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se
le puede añadir un adherente.
En la elección del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes
(reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy volátiles.
Evitar que contengan trazas de metales
(catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y
probar con eluyentes cada vez menos polares.
Capítulo 1 4

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Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con
los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo
con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el
tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.
1.4 Cromatografía de permeación en gel
La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de exclusión es
una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que las
partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin de
que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso
molecular.
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son
arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “cama
de vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque
tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienen
accesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la
cantidad de poros por los que puedan pasar.
Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos están
los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro
controlado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso
ya que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen
un tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son
compatibles con sistemas no acosos.
Capítulo 1 5

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Otro tipo de empacamiento hidrofílico poroso es preparado mediante una polimerización por
suspensión de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten
presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes
orgánicos polares.
Disolventes. La cromatografía de exclusión requiere un solo disolvente durante el análisis en el cual se
pueda disolver la muestra. El único inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la
relación de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad
de la fase móvil se pueden dar, una distorsión en los picos cromatográficos y cambios anómalos en los
tiempos de retención.
1.5 Cromatografía de exclusión de iones
Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de exclusión, es cuando
se realiza para la exclusión de iones. Mediante esta modificación, se tienen separaciones que dependen
de factores como tamaño de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros. Esto
permite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo
en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, ácidos minerales
diluidos.
Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de
muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, puede ser
hecho fácilmente mediante el uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas de
exclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separación de oligosacáridos
usando agua como eluyente a una temperatura de 90ºC, aplicando también la separación por exclusión
estérica.
1.6 Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados
permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más
común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de la
fase estacionaria.
En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catiónicas.
Los más comunes son los sulfónicos, los cuales son fuertemente ácidos y tiene las propiedades de los
Capítulo 1 6

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ácidos fuertes cuando está en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el
intercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son
fuertemente básicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos
funcionales están totalmente disociados. Así, sus propiedades de intercambio son independientes del pH
de la fase móvil.
La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de
empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,
sobre una cuenta de vidrio con diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen
recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice en el que se impregna o
enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:
0.01- 0.1 meq/g.
El intercambiador puede también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones de
sililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.
El proceso primario en la cromatografía de intercambio iónico involucra la adsorción/desorción de
materiales iónicos cargados en la fase móvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de
signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solución
que contiene iones K + , existe un equilibrio:
resina, H + K + resina, K + + H +
Las diferencias de retención están gobernadas esencialmente por las propiedades físicas de los iones
solvatados. La fase de resina presenta preferencia por:
1. El ion de carga mayor.
2. El ion con menor radio solvatado.
3. El ion que tenga mayor polarizabilidad.
Aplicaciones de intercambio catiónico:
Los cationes inorgánicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajos
en sodio, y en muestras de orina.
Aplicaciones de intercambio aniónico:
Se pueden separar los ácidos HCN, carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico y
clorhídrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.
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1.7 Cromatografía de fluidos supercríticos
La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir
en la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión de vapor de una
sustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su
temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido supercrítico.
Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre
las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido.
Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y líquidos. (Los datos sólo
indican el grado de magnitud).
GAS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO
Densidad (g/cm 3 ) (0,6-2)*10 -3 0,2- 0,5 0,6- 2
Coeficiente de difusión (cm 2 /s) (1-4) * 10 -1
Viscosidad (g cm- 1 s- 1 ) (1-3)* 10 -4
10 -3 – 10 -4
(1-3) * 10 -4
(0,2 – 2)* 10 -5
(0,2- 3)* 10 -2
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografía de gases,
líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importante
de los fluidos supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm 3 ), es su
notable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el dióxido de carbono
supercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 átomos de carbono. Una segunda
propiedad notable de los fluidos supercríticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser
fácilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la
atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercríticos es que son
baratos, inocuos y no son sustancias tóxicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la
atmósfera sin efectos ambientales dañinos.
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre la cromatografía
de gases y de líquidos que combina algunas características de cada una de ellas. Esta técnica es una de
los tres tipos importantes de cromatografía en columna, ésta permite la separación y determinación de
compuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la de líquidos: compuestos
no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable y (2) los
Capítulo 1 8

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compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas o
electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos.
Los equipos instrumentales para la cromatografía de fluidos supercríticos son bastante parecidos
en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos
diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y
además proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase móvil; (2) un restrictor o un
dispositivo de contrapresión, que se utiliza para mantener la presión en la columna en el nivel deseado y
para convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector.
Las variaciones de presión en cromatografía de fluidos supercríticos tienen un efecto muy
marcado sobre el factor retención o de capacidad, k’. Este efecto es una consecuencia del incremento de
la densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Tal incremento de la densidad origina un
aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo cual acorta los tiempos de elución. La mayoría de
los perfiles de presión utilizados en cromatografía de fluidos supercríticos son: presión constante
(isobárica) para un período de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asintótico de la presión hasta
alcanzar el valor de la presión final.
Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque
las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de sílice fundida
con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas
tienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la película varía
entre 0.05 1 micrómetro.
Fases móviles. La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de
moléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no
tóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles cromatográficas.
La temperatura crítica del CO2 ES 31° C y su presión crítica 72,9 atmósferas, lo cual permite jugar con una
banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operación de un equipo de
HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, óxido nitroso, diclorodifluorometano, éter dietílico,
amoníaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases móviles de cromatografía de fluidos
supercríticos.
Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la
cromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de respuesta universal a
compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas también se pueden
Capítulo 1 9

Introducción a los métodos de separación
adaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de
absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de
llama.
La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio conjunto de
sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos, pesticidas y herbicidas,
tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles y explosivos y propelentes.
1.8 Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de
fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque
están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una
estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes
disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida.
Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos,
esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las
proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución
que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente
por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible,
se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican
las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para
continuar con la regeneración de la columna cromatográfica.
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de
proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo
restringido para la separación.
Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínas
que se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína de
interés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta para
que eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan a
través de la columna.
Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige
unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero.
Capítulo 1 10

Introducción a los métodos de separación
1.9 Cromatografía de líquidos de alta resolución
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente
utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas,
es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias
que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la fase
estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.
1.10 Electroforesis
Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró separar
mezclas de proteínas (micelas cargadas eléctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso
al que se aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquier
especie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica.
El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de
especies cargadas. Por aplicación de un campo eléctrico entre los extremos del soporte poroso las
especies se separan en función de sus cargas y su movilidad iónica en ese medio. Cuanto más elevado
sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separación; sin embargo valores altos de
estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporación del disolvente y
acumulación de sales del tampón, lo cual es indeseable.
Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que
son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente
escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han
utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc.
Capítulo 1 11

Electroforesis capilar
Introducción a los métodos de separación
La sección transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drástica al realizar
la electroforesis en el interior de un tubo capilar de diámetro interno menor a 0.1mm y una longitud de
50cm a 1m. Es efectivo llevar de ésta forma la técnica porque la resistencia eléctrica de la disolución es
tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes más altos sin
calentamiento excesivo. La técnica tiene gran poder de resolución y se han desarrollado métodos para
llevar a cabo la electroforesis incluso en moléculas neutras no iónicas.
Además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual
modo que en una cromatografía en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de
muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y después de la separación, cada uno de los
analitos está en volúmenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños, muy pocos
métodos de detección se pueden usar eficazmente.
1.11 Bibliografía
Fig. 1. Diagrama de las partes básicas de un
instrumento de electroforesis capilar con detección
espectroscópica.
La muestra penetra por la parte de la izquierda
introduciendo el final del capilar en la disolución de
la muestra y cargándolo, bien hidrodinámicamente,
bien electrocinéticamente. Toda la unidad de la
ilustración funciona a temperatura constante. El
capilar está enrollado alrededor de un soporte.
Durante el análisis los niveles de las dos disoluciones
tampón deben ser iguales como se indica con la
línea punteada) para evitar el flujo de masa debido a
una diferencia de presión.
چ Braithwaite, A. Métodos cromatográficos, 4ª ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Páginas 216-
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Capítulo 1 12

Introducción a los métodos de separación
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Capítulo 1 13

Capítulo 2
Parámetros cromatográficos
Parámetros cromatográficos
2.1 Glosario
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un
separador de banda.
Banda: Es una situación ideal, es una distribución gausiana. La cantidad de compuesto que sale de
cromatografico o de una columna electroforética.
Coeficiente de difusión: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s.
Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribución de un soluto entre dos fases,
para definir el coeficiente de partición solo se utiliza una forma de un soluto (kD).
Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un método para un interferente dado en
comparación con su sensibilidad para el analito (KA,I).
Cola: prolongación final de un pico cromatográfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy
activos en la fase estacionaria.
Constante de disociación: constante de equilibrio de una reacción en la que un complejo metal- ligando
se disocia para formar un ión metálico libre y un ligando (kD).
Constante de equilibrio: K’ Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor
numérico de K’ depende de la fuerza iónica del medio.
Cromatografía: separación en la que los solutos se distribuyen entre fase móvil y estacionaria.
Cromatografía gaseosa: técnica cromatográfico en la que la fase móvil es un gas.
Cromatograma: registro de la señal de detección en función del tiempo de elusión o del volumen.
Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico, se suele
expresar en términos de la altura H, de los platos o del número N de platos teóricos. En la medida en que
la distribución del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos está dada por la varianza
dividida entre la longitud de la columna del empacado.
Capítulo 2 14

Parámetros cromatográficos
Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza
desde el punto de inyección al detector.
Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k’).
Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad
de la columna para uno de ellos (α).
Factor de separación: medida de la eficacia de una separación en lo que se refiere a la separación entre
el analito y el interferente.
Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posición fija.
Fase móvil: fase extractarte que se desplaza a través del sistema.
Número de platos teóricos: característica de una columna cromatográfica que se emplea para medir su
eficiencia.
Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una
columna, como si estuviera compuesta de pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto
entre las fases móvil y estacionaria
Relación de distribución: cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en relación
con una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto (D).
Resolución: separación entre dos bandas cromatográficas (R).
Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un método que se mide ante el cociente de
selectividad del mismo.
Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y la llegada a un
pico de analito al detector.
Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través de la columna.
Capítulo 2 15

Parámetros cromatográficos
Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separación, α, donde
dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2:
α = k2 / k1
El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del sistema
cromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retención para dos
compuestos específicos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significaría que no hay
separación, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retención muy largos se
traducen en tiempo desperdiciado durante la operación experimental. Los valores de α depende de los
dos solutos y de
1) La composición química de la fase estacionaria.
2) La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía de gases).
3) La temperatura.
En cromatografía de fluidos supercríticos, la presión también puede afectar a α al cambiar la densidad de
la fase móvil.
FIG. 2. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografía de líquidos.
2.5 Eficiencia de separación de una columna
Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de las
cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas
zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una
columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El
Capítulo 2 18

2.8 Cuantificación en cromatografía
Parámetros cromatográficos
Para llevar a cabo un análisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,
tanto para la construcción de la curva de calibración como para el tratamiento del analito mismo.
Primero es necesario llevar a cabo un análisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones
óptimas. Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográficos de cada ensayo que sirven como
referencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones
posibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo más exactos que ésta técnica
nos permite.
Si no se obtiene una buena resolución, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de
muestre, sino puede probarse utilizando una fase móvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra
fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,
y analizar la naturaleza química de las distintas fases así como solutos, para probar con otra fase sea
estacionaria o móvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operación mejor, y que una vez
encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse.
Para realizar la curva de calibración puede usarse el método de estándar externo o interno,
siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operación.
2.9 Resumen
La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferencia de distribución que
existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y móvil. Así, cada soluto tendrá un
tiempo de retención distinto y podrán analizarse por separado.
Los parámetros cromatográficos son claves para el diseño de un análisis, pues son herramientas
que ayudan a evaluar las condiciones en las que se está llevando a cabo.
Cada soluto tendrá asociado un tiempo de retención distinto que se puede expresar como el
factor de capacidad, y la relación de los tiempos de retención o factores de capacidad de los solutos nos
indicará si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolución se podrá evaluar si la separación
entre los tiempos de retención se los solutos es suficiente o excesiva. El cálculo de los platos teóricos nos
indicará la eficiencia del sistema.
Una vez evaluados los parámetros cromatográficos, se podrá determinar si el cromatograma
obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condición para optimizarlo.
Capítulo 2 22

2.10 Bibliografía
Parámetros cromatográficos
Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related
differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edición, EUA, 1992, pp. 2-14
Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM,
México 2002
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/skoog/26d.html
Capítulo 2 23

Capítulo 3
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
3.1 Procedimientos de empaquetamiento
En cromatografía de fase líquida, la fase móvil es un líquido y éste desciende a través de la
columna. La fase estacionaria es frecuentemente un líquido que recubre el interior de un tubo capilar o
la superficie de partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas
partículas sólidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el
reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria dan lugar a la separación.
Fig 1. Representación esquemática de una separación cromatográfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad
que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna más tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena
con partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de las
columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil.
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase
estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial,
inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían,
entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG), alúminas, resinas de
intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a un
tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico que
Capítulo 3 Página 24

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento del
empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:
1. Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y
compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados).
2. Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del
cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia.
2.2 Aplicación de la muestra
Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicación de
la disolución de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, ésta se
queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el
desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco
y, empujado por la disolución que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el
disolvente utilizado para la elusión es el mismo que la disolución problema, los platos teóricos
comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase móvil en equilibrio con ellos y las
concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona sólo es aparente en sus extremos
por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene más espesor de un plato
teórico.
2.3 Procedimientos de elución
La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es
prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el
desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.
Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes de
acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie
eluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valor
cero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
respecto a la sílice en cromatografía de adsorción.
Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la
columna.
Capítulo 3 Página 25

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal,
que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más
polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se
caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un
disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de fase inversa elimina las colas
de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningún soluto
originando colas. La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impurezas polares (como
el agua), que pueda haber en el eluyente.
2.4 Elución isocrática y gradiente
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una
elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,
produciendo un gradiente continúo.
Fig 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción con los puntos activos
de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más fácilmente se desplaza el soluto.
2.5 Cromatografía de absorción y de partición de columna
Estas son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analito
en la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria.
En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,
con la fase estacionaria, en la de absorción, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de
partición de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.
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2.6 Cromatografía de adsorción
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas sustancias son
atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie
interfacial, formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea
sólido o líquido, aunque este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas o
químicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es
solo física, y quimisorción, cuando la retención implica enlaces con el adsorbente. Así pues, en la
cromatografía de adsorción, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si
es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el
analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen.
Durante la separación, se filtra una solución a través de una columna de adsorbente, que es la
fase móvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” de
partículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a lo largo
del sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorción.
El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la separación del analito. Si vemos la
ilustración de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la
fase sólida, los huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la fase
estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque
generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de
magnesio.
Capítulo 3 Página 27

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para la
separación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos
con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada para
separar azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como oligosacáridos, y también
se ha usado para obtener proteínas biliares.
2.7 Cromatografía de partición de columna
Esta técnica se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra o
cualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente
afín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa; cuando la fase móvil pasa a través de la columna, el
equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al
final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase
móvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los círculos, alrededor de los cuales hay una
capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,
donde este se disuelve.
Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto se le llama
partición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoquímica del sistema, entre
las dos fases. La retención depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la
matriz sólida, y de que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el
analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa
Capítulo 3 Página 28

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del líquido afuera de la matriz de gel
(V0, volumen de la fase móvil que eludirá a una molécula completamente excluida ), el volumen del
líquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).
V V0
K
El volumen de elusión (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: e
d i
Kd es el coeficiente de distribución volumétrica: K d ( Ve
V
0)
/ Vi
Kd caracteriza el comportamiento de retención del soluto. Representa la fracción del volumen del gel
que es accesible a la molécula en cuestión. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una
serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:
En un rango pequeño de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una línea recta:
K d
A Blog
M
La separación por cromatografía en gel está influenciada por las propiedades de los poros de la
red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material
para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímeros
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente
suave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el
vidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel
Capítulo 3 Página 30
V

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Aplicaciones. Desalinización: Largas moléculas de origen biológico son separadas de especies
ionizables o inorgánicas. Un ejemplo en la separación de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex.
La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos,
polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesos
moleculares en mezclas de polímeros.
2.9 Cromatografía de intercambio iónico.
El intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contacto
con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies
iónicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solución y
un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución.
Las resinas cambiadoras de iones están constituidas por una red tridimensional de cadenas
polímeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase
insoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se
mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condición de
que se mantenga la electroneutralidad. Una resina típica se prepara por polimerización de estireno y
divinilbenceno.
Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen el
protón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones
positivos.
Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Los
cambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un medio
básico.
Las propiedades más importantes que determinan el funcionamiento de una resina:
o Tamaño de las partículas – velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna.
o Naturaleza de los grupos funcionales – tipo de los iones intercambiables.
o Fuerza de los grupos funcionales – coeficiente de distribución.
o Número de grupos funcionales – capacidad de la resina.
Capítulo 3 Página 31

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
A partir de la sustitución de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen
equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de acción de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la
constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribución KD:
K D
K[
HR]
[ H ]
Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir
por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relación de distribución o evitar un
intercambio total. El efecto del pH sobre la elusión:
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejos
de carga negativa. En esta forma, los cationes metálicos que se separen mal en cambiadores catiónicos,
se pueden complejar y separar en cambiadores aniónicos.
Aplicaciones. Eliminación de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasándola a
través de un cambiador de cationes, y después a través de un cambiador de aniones.
Separación de aminoácidos. La naturaleza anfótera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o
eliminar la carga neta, de modo que un ácido determinado se puede intercambiar en una resina
aniónica, en una resina catiónica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solución.
2.10 Cromatografía covalente
Es un sistema especial de cromatografía, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se
forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar, las
separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la biología molecular; por lo cual es
muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solo
se puede separar un solo analito.
Capítulo 3 Página 32

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
2.11 Conformación de la cromatografía covalente
a) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas las
responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2
maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y
los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las
lectinas y nucleótidos.
b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe
poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientemente
hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica,
en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de los
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
2.12 Fundamento de la cromatografía de afinidad
Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la
columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado
covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este
ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la
elusión de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el
acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por
alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos;
generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos de esta
manera se eluye el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la
columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil siendo una etapa
rápida.
Capítulo 3 Página 33

2.13 Cromatografía Flash
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Es un método cromatográfico, el cual nos permite separar de una manera rápida, fiable y económica;
principalmente utilizada para la separación y purificación de proteínas.
La Cromatografía Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez.
El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuración de las columnas (variables por el
usuario), una bomba peristáltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiación
ultravioleta para detectar las biomoléculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de
elusión, las válvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyección de la muestra, la selección
de la columna o corriente de inversión, y un controlador con una función de integración
computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el análisis.
Aplicaciones. En farmacia la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) se utiliza para la
depuración de grandes cantidades de diferentes biomoléculas (es decir, las proteínas y el ADN).
2.14 Resumen
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con
partículas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho
con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de
dos sencillos pasos: a) colocación de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)
Verificación de compactación (no espacios vacíos).
El desplazamiento de la muestra a través de la columna, depende de la afinidad por ésta y del disolvente
empleado para el proceso.
Capítulo 3 Página 34

Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos
de elusiones: Elusión por gradiente (cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de
aumento de fuerza eluyente) y elusión isocrática (un solo disolvente).
Cromatografía de adsorción: esta técnica aprovecha el fenómeno de la absorción de sustancias en una
superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material
adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a través de su superficie.
Cromatografía de partición de columna: sta técnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una
columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente químicamente similar al analito, en el que este
queda disuelto y retenido cuando pasa la fase móvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,
en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.
Cromatografía en gel: consiste en la filtración en gel que consiste en la separación de moléculas basado
en el tamaño relativo de las mismas. El flujo de la fase móvil del sistema provocará que moléculas
mayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas
más pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el mismo.
Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
Cromatografía de intercambio iónico: el intercambio iónico es un proceso donde una solución de un
electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son
remplazados por las especies iónicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios
iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su
alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga.
Cromatografía covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la
biología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño
inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separación de
anticuerpos y enzimas.
Cromatografía Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una técnica muy utilizada en el área de
bioquímica ya que nos permite separar biomoléculas y proteínas.
Capítulo 3 Página 35

2.15 Bibliografía
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
BERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma
edición, Madrid 1991.
HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Química Analítica - 7ª ed - McGraw Hill – México, 2001.
ROUESSAC - Métodos y técnicas instrumentales modernas. Análisis Químico - McGraw Hill – USA, 2003.
SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosíntesis and Functions - Addison-Wesley - New
York, 1975.
PECSOK, Robert – Métodos Modernos de Análisis Químico – Editorial Limusa – México, 1981.
BRAITHWAITE, SMITH – Chromatografic Methods – 4° edición - Chapman & Hall – UK, 1994.
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm
www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm
Capítulo 3 Página 36

Capítulo 4
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Esta técnica permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos; permite identificar los
componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado
notablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y líquidos)
de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser sensible, rápido y
sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información cuantitativa exacta con cantidades
muy pequeñas de muestra.
En cromatografía de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna
cromatográfica. La elución se produce por el flujo de un fase móvil de un gas inerte a diferencia de los
otros tipo de cromatografía, la fase móvil no interaccionan con la moléculas del analito; su única función
es la de transportar el analito a través de la columna.Existen dos tipos de cromatografía de gases:la
cromatografía Gas-Sólido (GCS) y la cromatografía gas liquido (GLC).La cromatografía gas liquido tiene
gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como
cromatografía de gases (GC).
En la cromatografía gas sólido se produce la retención de los analitos de una fase estacionaria
como consecuencia de la absorción física. La cromatografía gas sólido ha tenido una aplicación limitada
debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de
elusión con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de absorción),
de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas
especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas líquido se basa en la distribución del
analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquido inmovilizada sobre la superficie de un sólido
inerte.
4.1 Instrumentación
Los componentes básicos de un instrumento para la cromatografía de gases se muestran a
continuación, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposición se utiliza
cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la
presencia de las moléculas de analito.
Capítulo 4 37

Cromatografía de gases
Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran el
helio, nitrógeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de
presión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas portador contiene a menudo un
tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente
mediante un regulador de presión de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algún tipo de
regulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo.
Sistema de inyección de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestra
sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un de vapor, la inyección lenta de la
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolución .El
método mas común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una
muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o de goma de silicona en una cámara de
vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara demuestra normalmente esta
unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra.
Configuración de la columna y del horno para la columna. En cromatografía de
gases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la
mayor parte de las cromatografía de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la
actualidad esta situación está cambiando rápidamente y parece probable que en un futuro próximo,
Capítulo 4 38

Cromatografía de gases
Como lo muestra la figura, la resolución 1.5 nos da una separación prácticamente completa de
los solutos, mientras que una resolución de 0.75 no lo hace. A una resolución de 1, la zona X contiene
casi 4% de Y y viceversa, a una resolución de 1.5 la superposición es de aproximadamente 0.3%. Para el
mismo tipo de empaque, la resolución puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto
aumentando el número de platos teóricos.
Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares o
semicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separación cromatográfica
Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un
diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000
(platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10 componentes. La
columna está rellena de un material sólido (soporte), finamente dividido y homogéneo; recubierto, por
una capa de 0,05-1 μm de espesor, de fase estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, con
un diámetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado
Fase estacionaria. Elección de la fase estacionaria de una columna cromatográfica ha de reunir
una serie de requisitos como:
Baja volatilidad, su punto de ebullición debe de ser por lo menos 100 o
C superior a la
temperatura máxima de operación de la columna.
Estabilidad térmica.
Capítulo 4 40

Inercia química.
Cromatografía de gases
Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad (α) de los analitos deben estar
dentro de los intervalos aconsejados.
La separación en cromatografía gas-líquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del
analito entre la fase móvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los
compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una característica muy importante de la fase estacionaria
es la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen
más en las fases líquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las
compuestas por poliéster son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separación, los
alcoholes, ácidos y aminas son polares; los ésteres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y
son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los límites de temperatura que puede soportar la fase
estacionaria, el límite inferior será el punto de fusión o temperatura a la que la viscosidad de la fase
líquida es muy elevada, lo que haría disminuir la eficacia. El límite superior es la temperatura a la que la
presión de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 o
C inferior al punto de ebullición) por encima de esta
temperatura se produce arrastre de la fase líquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,
suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.
En una fase líquida cualquiera, una serie homóloga se eluye según orden creciente de número de
átomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen según orden creciente de punto
de ebullición. En una fase polar se retendrán más los solutos polares que los no polares a igualdad de
puntos de ebullición.
Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte sólido empleado en las
columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase
líquida en forma de película muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase
móvil y fase estacionaria.
Las características de los soportes sólidos son, una elevada superficie específica (1m 2
/g); una
superficie homogénea; estabilidad térmica; geometría adecuada; baja dispersión de tamaño de las
partículas, entre 150-250 μm; dureza mecánica; inercia química y naturaleza porosa.
Capítulo 4 41

Cromatografía de gases
Los soporte, más generalizados, son los de silíceo como las tierras de diatomeas o sintéticos; de
vidrio y de polifluorocarbonados (teflón). Los soportes de diatomeas están constituidos por residuos de
algas unicelulares diatomáceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen
una superficie específica de 1 m 2
/g. El constituyente mayoritario es de anhídrido silícico SiO 2 (90%),
tratado con un fundente alcalino a 1.600 o
C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb
W de superficie poco adsorbente por lo que es muy útil para separar compuestos polares.
Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,
tiene mayor resistencia mecánica y superficie específica que el anterior, pero es muy activo y no se
puede utilizar con compuestos polares.
Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de sílice fundida, en las
columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado
picos cromatográficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenómeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la
superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las moléculas orgánicas
polares. Este proceso puede desactivarse por sililación con dimetilclorosilano , Cl 2 Si(CH 3 ) 2 , que elimina el
H del silanol formando ClH.
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos básicos: WCOT,
de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto.
Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto
con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte
interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de
relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a
las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayores
cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en
primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas tubulares
abiertas de sílice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de sílice especialmente pura, sin
Capítulo 4 42

Cromatografía de gases
apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo
proceso de obtención del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede
enrollarse con un diámetro de unos pocos centímetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de
2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con diámetros de
10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja
reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.
Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm y 150-200 μm para
columnas de alta resolución. Estas últimas requieren menor cantidad de analito y un detector más
sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con diámetros de
hasta 530 μm, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores
prestaciones.
En estas columnas existe un problema debido a la adsorción del analito sobre la superficie de la
sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente
con moléculas polares orgánicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por
sililación con DMCS. La adsorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada en gran parte por la elevada
pureza de la sílice empleada.
4.2 Cromatografía gas-sólido
En la cromatografía gas-sólido se produce la retención de los analitos en una fase estacionaria
sólida como consecuencia de la absorción física.
La cromatografía gas-sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención
semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elusión con colas muy
significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorcion), de modo que esta
técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de
bajo peso molecular.
La cromatografía gas-sólido se basa en la adsorcion de sustancias gaseosas sobre superficies
sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en el caso de la
cromatografía gas-liquido. En consecuencia la cromatografía gas-sólido es útil para la separación de
especies que no se retienen en columnas de gas-liquido, tales como los componentes del aire, sulfuro de
hidrogeno, disulfuro de carbono, óxidos de nitrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono y gases
nobles.
Capítulo 4 43

Cromatografía de gases
La cromatografía gas-sólido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas
abiertas. En estas últimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa del adsorbente; estas
columnas a veces se denominan columnas abiertas de pared porosa, o columnas PLOT. Se encuentras
dos tipos de adsorbente: los tamices moleculares y los polímeros porosos.
4.3 Tamices moleculares.
Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamaño de
poro depende del tipo de catión presente. Los preparados comerciales de esos materiales están
disponibles en tamaños de partícula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican según el
diámetro máximo de las moléculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices moleculares
comerciales ser encuentran con tamaños de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las moléculas más
pequeñas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partículas donde tiene lugar la
adsorcion, para estas moléculas el área de la superficie disponible es enorme cuando se compara con el
área disponible para las moléculas más grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para
separar las moléculas pequeñas de las grandes.
Por ejemplo, un relleno de 5 amstrongs y 183 cm de largo, a temperatura ambiente, separar
fácilmente una mezcla de helio, oxigeno, nitrógeno, metano y monóxido de carbono en ese orden. En la
primer figura de la siguiente hoja se muestra un típico cromatograma obtenido con tamices moleculares.
En esta aplicación se utilizan dos columnas de relleno: una es una columna de gas-liquido ordinaria y la
otra es una columna de tamices moleculares. La primera retiene solamente el dióxido de carbono y deja
pasar los restantes gases a una velocidad que corresponde a la velocidad del portador. Cuando el dióxido
de carbono eluye de la primera columna, un conmutador desvía el flujo de la segunda columna para
evitar la adsorcion permanente del dióxido de carbono en los tamices moleculares. Una vez que la señal
de dióxido de carbono ha vuelto a cero el flujo se reconduce a traves de la segunda columna, y de este
modo se produce la separación y elusión del resto de los componentes de la muestra.
4.4 Polímeros porosos:
Las bolitas de los polímeros porosos de tamaño uniforme se fabrican a partir de estireno
polimerizado con divinilbenceno. El tamaño de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por el
grado de polimerización. Los polímeros porosos han encontrado una gran aplicación en la separación de
especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, óxidos de nitrógeno, agua, dióxido de
carbono, metanol y cloruro de vinilo.
Capítulo 4 44

Cromatografía de gases
En la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicación característica de una columna
abierta revestida con un polímero poroso (columna PLOT).
4.4 Aplicaciones.
Se sabe que los ácidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL
en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de ácidos grasos trans aumenta el riesgo de
enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupación por los ácidos grasos trans requiere de
métodos precisos y convenientes para el análisis de productos comerciales.
Los métodos analíticos disponibles actualmente incluyen: cromatografía de gases,
espectroscopia de infrarrojo, y cromatografía de gases de capa fina (AgNO3- TLC- GC, por sus siglas en
inglés). Dentro de estos métodos la cromatografía de gases se ha usado preferencialmente dado su
conveniencia y su sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno son
las fases estacionarias comúnmente usadas en el análisis de ácidos grasos trans en correspondencia a la
necesidad por una alta resolución entre los picos de los metil- esteres de los ácidos grasos (FAME).
Existen varios métodos analíticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los
métodos del AOAC (Asociación Oficial de Químicos Agricultores) y AOCS (Asociación Americana de
Químicos y Aceites) (por sus siglas en inglés).
A pesar de que el método de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un
tiempo de análisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificación de
los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos económicos
debidos a el uso de un estándar caro.
Por lo tanto debe buscarse un método más conveniente de GC, particularmente para el
propósito de control de calidad.
Capítulo 4 45

Cromatografía de gases
Método 1 Método 2 Método 3 1
Columna TC- 70 TM (GL- Science) SP-2560 TM (Supelco Inc.)
Fase estacionaria bis cianopropilsiloxano polisilfenileno bis cianopropil polisiloxano
Longitud 30m 60m 100m
Diámetro interno 0.25mm 0.25mm
Grosor de película 0.25μm 0.20μm
Temperatura 190ºC 180ºC 2
Inj/Det 250ºC/260ºC 250ºC/250ºC
Gas acarreador 1 ml/min Helio 1 ml/min Helio
Split 100:1 100:1
Volumen inyectado 3 1μl 1μl
Tiempo de corrida 18min 40 min 74min
Tabla 1. Ejemplo del trabajo hecho por Shirasawa y colaboradores para encontrar un mejor método de
determinación de ácidos grasos trans
1) Prueba control: AOCS celh-05
2) 180ºC (60 min)- (10ºC/min)- 220ºC (10 min)
3) 1% del aceite en hexano.
Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 -
metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupo
de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bien
identificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemático entre la población joven y a pesar
de que las intoxicaciones agudas han sido ampliamente documentadas el potencial de toxicidad por
lapsos mayores de tiempo para el sistema nervioso es el tema de muchas controversias. MDMA se
excreta en la orina generalmente sin cambio alguno junto con otros derivados de las anfetaminas como
HHMA, HHA, HMMA y HMA.
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas es la técnica instrumental más
comúnmente empleada en el análisis de anfetaminas y sus derivados. La derivatización es requerida para
mejorar la cromatografía, en cuanto a la sensibilidad y reproducibilidad de aminas primarias y
secundarias.
Capítulo 4 46

Cromatografía de gases
Tabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificación de derivados de anfetaminas en orina
por GC-MS
4.5 Resumen
La cromatografía de gases constituye un poderoso instrumento en la determinación de los
componentes de una muestra, al permitir tanto la separación de éstos como su detección individual. Una
gran ventaja de este método es la rapidez y su límite de detección, un requisito indispensable para el
análisis es que la muestra debe ser volátil.
Dependiendo de la fase estacionaria utilizada la cromatografía de gas se subdivide en: gas-
líquido y gas sólido.
En el caso de la cromatografía de líquidos, los parámetros dependen del poder del eluyente (la
polaridad de este); para la cromatografía de gases, los parámetros dependen de la temperatura a la cual
se esté trabajando y del flujo del gas de arrastre.
Las partes esenciales de un equipo de cromatografía son: fuente de gas portador, sistema de
regulación de caudales, bloque termostatado de inyección de las muestras, columna termostatada,
detector termostatado, con amplificador de señal y registro gráfico y caudalímetro de precisión.
4.6 Bibliografía
http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm
http://instrumental.uprh.edu
BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Química Analítica generla, cuantitativa e
instrumental. Vol. 2. 6ta. Edición. Ed. Paraninfo. Madrid 1991.
SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Análisis Instrumental,Madrid: McGraw-Hill.
Pirnay et al. Sensitive Gas Chromatography – Mass Spectrometry Method for Simultaneous
Measurement of MDEA, MDMA, and metabolites HMA, MDA, and HMMA in human urine. Drug
Monitoring and Toxicology. Clinical Chemistry 52:9. 1728-1734. (2006).
Shirasawa et al. A Rapid Method for Trans- Fatty Acid Determination Using a Single Capillary GC
.Journal of Oleo Science. J. Oleo Sci. 56 (2) 53- 58. (2007)
Rubinson, Kenneth. Analisis Instrumental. Editorial Pearson Education, Madrid 2001. pps 680-
700.
Capítulo 4 47

Capítulo 5
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación, basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. En cromatografía
líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase
estacionaria. La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. Después se coloca la
muestra por la parte superior y se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la
gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la cromatografía de alta resolución; el
tamaño de las partículas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando altas presiones para lograr
que la fase móvil pueda fluir.
5.1 Tipos de cromatografía en HPLC y aplicaciones
La Cromatografía de líquidos, es una técnica de análisis químico ampliamente utilizada, la cual
permite separar físicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una solución por la
absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla, consta de dos fases, una fija que suele llamarse
fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso
es un líquido. La tabla 1 nos muestra los tipos de cromatografía líquida que existen así como su
separación cromatográfica.
Nombre
Tipo de fase
móvil
Tipo de fase
estacionaria
Método de fijación de la fase estacionaria
Partición Líquido Líquido Adsorbida en un sólido poroso sostenido en una columna tubular
Adsorción Líquido Sólido Sostenida en una columna tubular
Papel Líquido Líquido Sostenida en los poros de un papel grueso
Capa delgada Líquido Líquido o sólido
Sólido finamente dividido sostenido sobre una placa de vidrio: el
líquido puede absorberse sobre las partículas
Gel Líquido Líquido Sostenido en los intersticios de un polímero sólido
Intercambio
iónico
Líquido Sólido
Tabla1.- Clasificación de las separaciones cromatográficas
Resina de intercambio iónico finamente dividida en una columna
tubular
Capítulo 5 48

5.2 Cromatografía de adsorción
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Es la técnica más usada para la separación de compuestos orgánicos neutros, es adecuada para
compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Se basa en la afinidad
de adsorción, su fase estacionaria es la superficie de un sólido finamente dividido. El soluto compite por
los sitios sobre la superficie del sólido con el disolvente utilizado como eluyente; la retención es el
resultado de la adsorción. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la
alúmina, siendo la primera la preferida. La elección de la fase móvil es fundamental para el éxito de una
cromatografía líquido-sólido; variando el disolvente, si este presenta una alta fuerza de elución eluirá las
especies absorbidas más rápidamente que uno que tenga un valor más bajo. La cromatografía de capa
fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un
plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte.
Aplicaciones: se utiliza para compuestos no polares con masas alcohol>carbonilo>éster>hidrocarburo. A continuación se muestra una
cromatografía de absorción.
Figura 1.- Cromatografía de Adsorción
Capítulo 5 49

5.3 Cromatografía de partición
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Cromatografía líquido-líquido La separación de las sustancias se logra por migración diferencial
de los solutos. La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido
inerte, el más usado es el ácido silícico o gel de sílice. La fase móvil puede ser un disolvente puro o una
mezcla de disolventes, la polaridad puede ser notablemente diferente al la del líquido estacionario. Esta
consiste en aplicar una gota de la solución con la mezcla de substancias a separar en la parte inferior de
una tira de papel o en una delgada capa de un material inerte, como silicagel o celulosa, el papel o
material inerte (los denominaremos soportes) se colocan en un recipiente con un solvente, de manera
que, este los vaya impregnando; el disolvente se elige de manera tal que uno de ellos se adsorba más al
soporte que el otro; a medida que el disolvente avance a lo largo del soporte los líquidos suben
espontáneamente por capilaridad, aquellos componentes de la muestra que sean más solubles en el
líquido que queda adsorbido serán retenidos, y los que tengan mayor afinidad por el que no se adsorbe
serán arrastrados por este.
Aplicaciones: es un poderoso instrumento para la separación de sustancias estrechamente
relacionadas. Ejemplos típicos son la resolución de los numerosos aminoácidos formados en la hidrólisis
de una proteína, la separación y análisis de alcoholes alifáticos y la separación de derivados de azucares.
Fig. 2 Separación de moléculas pequeñas por cromatografía de partición.
5.4 Cromatografía de intercambio iónico
El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones, es muy utilizada en la
química inorgánica, también se usa para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases orgánicas.
Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria.
El intercambio iónico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una
solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. La fase estacionaria es una
resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies
ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH.
Capítulo 5 50

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Dentro de los intercambiadores encontramos: arcillas y las ceolitas, así como resinas sintéticas.
Estas últimas pueden ser usadas para intercambio de cationes se usan: resinas ácidas fuertes las cuales
contienen grupos de ácidos sulfónico y resinas ácidas débiles con grupos de ácido carboxílico. En el caso
de intercambiadores aniónicos, contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula de
polímero generalmente son aminas. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que
contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la
Fase Móvil es generalmente una solución amortiguador de pH.
Aplicaciones: encuentra mucho uso en los analizadores para aminoácidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus metabolitos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas.
Figura 3.-Cromatografía Iónica (a) Separación de aniones en una columna de intercambio aniónico. (b) separación
de iones alcalinotérreos en una columna de intercambio catiónico.
5.5 Cromatografía en gel
Es una técnica de caracterización de polímeros que proporciona la distribución completa de
pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios. El fraccionamiento se basa, por lo menos
en parte, en el tamaño y la forma molecular de las especies de la muestra, también se le conoce como
cromatografía de permeación en gel, cromatografía de exclusión y cromatografía de tamizado
molecular. Se efectúa en una columna por el método de elusión. La fase fija está formada por partículas
poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las
moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas
en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las
últimas que se eluyen, los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del
poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser
estables, mecánica y químicamente, tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y
Capítulo 5 51

Cromatografía de líquidos de alta resolución
tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa
(Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula
para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.
Aplicaciones: Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de
glucosa y fructosa en zumos de fruta, así como para la separación de compuestos de alto peso
molecular- proteínas y polímeros, ácidos grasos, azucares. Cambios de buffers, después de
cromatografías de intercambio iónico, afinidad o de interacción hidrofóbica; desalado, proteínas,
polisacáridos, polipéptidos etc. pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados;
eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos; eliminación de compuestos de bajo peso
molecular marcados. I125, FITC de las soluciones de marcaje de proteínas; para reacciones entre
macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular; eliminación de productos, cofactores, inhibidores,
etc. de las enzimas; Purificación de macromoléculas; determinación del peso molecular de las proteínas.
Figura 4.- Cromatograma Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. Bovine serumalbumin; 4.
ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.
5.6 Cromatografía plana
La separación se produce sobre una capa de un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre
una superficie plana, es un método notablemente simple y de bajo costo. Técnica de separación en la
que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano, éste puede ser un papel, que esté
impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria o una capa de partículas sólidas extendida
sobre un soporte, tal como una placa de vidrio. A veces a la se la llama Cromatografía de Lecho Abierto.
La cromatografía plana tiene como fase móvil un líquido y como fase estacionaria un líquido o
un sólido dispuestos sobre una superficie plana; existen tres tipos, cromatografía en papel, donde una
hoja o tira de papel de filtro sirve como fase estacionaria y medio de separación; cromatografía en capa
fina, en la que la separación se produce sobre una capa de sólido finamente dividido que se ha fijado
Capítulo 5 52

Cromatografía de líquidos de alta resolución
sobre una superficie plana; y la electroforésis. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria
por capilaridad, a veces es ayudado por gravedad o por potencial eléctrico.
Aplicaciones: se utiliza para separar e identificar los componentes de pequeñas muestras de
substancias inorgánicas, orgánicas y bioquímicas, se usa en determinadas aplicaciones con una
finalidad didáctica, también para la separación de muestras clínicas y bioquímicas así como en otras
aplicaciones analíticas generales por su gran sencillez y bajo costo.
5.7 Cromatografía en papel
Se utilizan papeles especiales de elevada pureza, Es una técnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel
de filtro (Whatman nº 1 por ejemplo) como soporte para la separación. El mecanismo que interviene en
la separación fundamentalmente de reparto. La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida
sobre las moléculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de filtro estándar o papel,
La fase móvil se selecciona empíricamente, se emplean mezclas consistentes en compuestos orgánicos,
agua y otras especies (ácidos, bases, agentes complejantes) que modifiquen la solubilidad de los
compuestos de la muestra.
5.7 Cromatografía en capa fina
Se realiza en placas de vidrio o plástico recubiertos con una capa delgada de partículas finamente
divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo predominante es la adsorción. Los materiales
más usados han sido: gel de sílice, alúmina, celita, poliamidas. La fase móvil el disolvente a utilizar debe
reunir una serie de características: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase
estacionaria, elevada pureza, adecuada viscosidad y tensión superficial, bajo punto de ebullición para
facilitar el secado de las placas, económico y baja inflamabilidad y toxicidad.
Figura 5.- Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de sílice) de algunos aminoácidos. Disolvente A:
tolueno/2- cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/ácido acético. Aminoácidos: (1) ácido
aspártico, (2) ácido glutámico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9)
isoleucina y (10) cisteína.
Capítulo 5 53

Cromatografía de líquidos de alta resolución
El HPLC se utiliza para: detección y cuantificación de sacarina benzoatos, cafeína y aspartame en
refrescos; detección de ciclomato en jugos de fruta; separación de esteres de ácidos grasos por fase
inversa y con argentación de columnas( Silicato de Al con Ag); separación de triglicéridos por la longitud
de la cadena y el grado de instauración por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el
estudio de aceites y grasas adulteradas; determinación del contenido de Vit A y sus precursores ( α y β
caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa; determinación del contenido en Vit D en
leche en polvo y cereales por fase normal.
5.8 Instrumentación.
Un equipo para HPLC puede ser representado por la siguiente figura 6
Figura 6.-Esquema de los componentes de un HPLC
La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es
que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan
interferir en la elución de la muestra o bien que contengan algunas pequeñas partículas que puedan
tapar la columna; por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna.
Dependiendo del equipo, cuando se trata de una mezcla de disolventes; se puede o no
programar la bomba para que tome las cantidades adecuadas de cada disolvente o bien, algunas otras
bombas (las más antiguas) no tienen la capacidad de realizar esta mezcla y por lo tanto esta se tiene que
preparar por nosotros. Cuando durante toda la separación se usa el mismo disolvente, se denomina
isocrática.
La bomba envía el disolvente hacia la válvula inyectora que es una válvula de seis vías que
permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan al detector. El cual da una
señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia; esta señal es enviada al registrador que a su vez da
un cromatograma de intensidad en función del tiempo (figura 7); en el cual, lo ideal es obtener picos
gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.
Capítulo 5 54

En HPLC existen dos tipos básicos de detectores:
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Figura 7.- Cromatograma típico obtenido por un HPLC
Los basados en una propiedad de la disolución.
Los basados en una propiedad del soluto
Algunos de los detectores más usados son: detectores de absorbancia, detectores de
fluorescencia, detectores de Índice de refracción, detector de dispersión de luz, detectores
electroquímicos, detectores por espectrometría de masas.
El integrador calcula el área de cada pico, la cual se puede relacionar con la concentración del
componente si se tiene una curva patrón; si no se cuenta con ella, sólo sería cualitativa.
Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es posible
recuperar los productos que salen de él, y de esta manera realizar otro tipo de separaciones (por
ejemplo) analíticas (también depende del tamaño del loop, de la columna y del tipo de bomba).
5.9 Volumen y tiempo de retención
El volumen de fase móvil (o tiempo para Tr) necesario para transportar la banda de soluto desde
el punto de inyección a través de la columna, hasta el detector, en el punto máximo del pico del soluto
se define como volumen de retención (Vr).
El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la
columna, incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, tubería, conexión, columna y
detector.
Capítulo 5 55

5.16 Instrumentación
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los componentes básicos de un sistema para HPLC son:
A) Depósitos para la fase móvil (disolventes)
B) Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil
C) Sistema de inyección de muestras
D) Columna cromatográfica
E) Termostatos para las columnas
F) Detectores
G) Sistema para el tratamiento de datos y registrador
Componentes básicos de un sistema para HPLC. Hernández, 2002.
Como algunas de las fases móviles usadas en HPLC pueden ser químicamente activas como
ácidos, bases o líquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estén fabricados con
materiales resistentes, por lo que la mayoría de las partes en contacto con la fase móvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable (Hernández L. 2002).
Los disolventes más usados en HPLC son agua, disoluciones tampón acuosas y disolventes
orgánicos como el metanol. Deben ser espectroscópicamente puros, exentos de partículas sólidas y
degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo más común es usar partículas microporosas esféricas de sílice muy
puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001).
Capítulo 5 58

Cromatografía de líquidos de alta resolución
A) Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil tienen que ser inertes, es decir, el
disolvente no deberá extraer especie alguna del material con el que estén construidos. Suelen ser
botellas de vidrio y tubos de teflón. Están provistos de unos filtros, indispensables para eliminar los gases
disueltos y partículas que pueda contener la fase móvil (Harris, . 2001).
B) Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeño tamaño de las partículas de la fase
estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase móvil o disolvente a través
de la columna.
Los sistemas de bombeo deberán reunir las siguientes características: (Hernández, L. 2002).
Generar presiones superiores a 6000 psi.
Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10 ml/min con una precisión del 0,5 % y
que esté libre de pulsaciones.
Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.
Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos:
Bombas recíprocas o de vaivén, son las más utilizadas. Están formadas por una pequeña cámara
cilíndrica que se llena y luego se vacía por oscilación de un pistón de zafiro. El bombeo produce un flujo
pulsado que después debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones
elevadas y se suministra un caudal constante, pudiéndose adaptar a la técnica de elución con gradiente,
debido a su pequeño volumen interno (Skoog, D. A. et al. 2001).
Bombas neumáticas o de presión constante, hacen uso de la presión de un gas aplicado al
recipiente conteniendo la fase móvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero están limitadas a
presiones relativamente bajas. (Hernández, L. 2002).
Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una cámara equipada con un
mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos
250 ml. (Harris,D.C. 2001)
C) Los volúmenes que se inyectan de muestra deberán ser pequeños para evitar la sobrecarga de la
columna. Hay varios tipos:
El método más simple es la utilización de una jeringa de alta presión con un diafragma (“septum”) a la
entrada de la columna. Está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi.
Capítulo 5 59

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Las válvulas de inyección con bucles de volumen conocido, es el método más utilizado (Harris, D. C.
2001).
D) En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que
permite su separación (Harris, D. C. 2001). El material de las columnas cromatográficas suele ser de
acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm y un diámetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas
aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria. El tamaño típico de las
partículas es de 3-10 um (Harris, D. 2001).
Columna para HPLC. Fuente: P.V.G. Lab. 3-D, Facultad de Química, 2007
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna
con otra más corta, la precolumna, que retiene por adsorción las impurezas de forma irreversible (Harris,
D. 2001).
E) No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, pero las separaciones resultan
más reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante. Los instrumentos comerciales
modernos están equipados con calentadores que regulan la temperatura de la columna.
F) El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes, y proporcionar
indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la
muestra y deberá reunir una serie de características como son, tener una sensibilidad elevada, buena
estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presión y la
temperatura. Se pueden clasificar de la forma siguiente: (Hernández, L. 2002)
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentración del soluto y se registra
en función del tiempo y obteniéndose una serie de picos, generándose un grafico que se denomina
cromatograma. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra.
Capítulo 5 60

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase móvil. Suelen ser
muy selectivos y sensibles:
Detectores de absorbancia ultravioleta, son los más utilizados. Su fundamento es la
espectrofotometría de absorción de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada
longitud de onda. Los más potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el
espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia se representan en
función de la longitud de onda y del tiempo.
Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operación se basa en
la irradiación con la luz UV al componente de interés y la posterior medida de la luz fluorescente emitida
por éste.( Harris, D. C. 2001)
Detectores electroquímicos, ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad y amplia
aplicabilidad, especialmente para compuestos orgánicos. Responde a analitos que puedan oxidarse o
reducirse. Es el ejemplo de fenoles, aminas, peróxidos (pueden detectarse por oxidación) y cetonas,
aldehídos (detectados por reducción). Las técnicas electroquímicas más utilizadas con esta finalidad son
la amperometría, voltamperometría y culombimetría.
Los detectores basados en una propiedad de la disolución, responden a un conjunto amplio de solutos,
pero suelen ser poco sensibles:
Detectores de índice de refracción, está formado por una celda con dos compartimentos, en uno
se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra
en la celda soluto de distinto índice de refracción al disolvente el has se desvía y varía la señal dada por la
fotocélula (Harris, D. C. 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de
temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusión con gradiente.
Detectores de conductividad, son los más utilizados cuando los solutos eluidos son iónicos, como
ácidos y bases, así como cationes y aniones inorgánicos después de su separación por cromatografía de
cambio iónico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duración.
Características de los detectores:
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal
eléctrica medible.
Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria.
Capítulo 5 61

Cromatografía de líquidos de alta resolución
El significado práctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentración
para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la curva de linealidad:
El límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección.
El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de linealidad.
Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de conocer el
nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinación de la cantidad mínima
detectable y el límite inferior del rango lineal.
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal
que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está
operativo sin que alguna sustancia pase a través de él. Esta señal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un
cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel la evolución, en
función del tiempo, de un parámetro que depende de la concentración instantánea del soluto a la salida
de la columna. Este gráfico se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y
Rouessac, 2003).
Montaje cromatográfico y cromatograma (Skoog, A. D. Et. Al, 2001).
Capítulo 5 62

5.17 Bibliografía
Cromatografía de líquidos de alta resolución
BERMEJO, M. F. – “Química analítica general, cuantitativa e instrumental “. Vol. 2. Ed. Paraninfo, S. A.
Madrid. 1991.
HARRIS, D. C. – “Análisis químico cuantitativo”. Ed. Reverte, S. A. Barcelona. 2001.
HERNÁNDEZ, L. y GONZÁLEZ, C. – “Introducción al análisis instrumental”. Ed. Arial Ciencia. 2002.
KIRK, R. S., SAWYER, R., EGAN, H. – “Compuestos y análisis de alimentos de Pearson” Ed. Continental, S.
A. México. 1996.
LORO, J. F. – “Manual de cromatografía”. Colección Textos Universitarios. 2001
ROUESSAC, F. y ROUESSAC, A. – “Análisis químico: Métodos y técnicas instrumentales modernas”. Ed. Mc
Graw Hill. 2003.
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J. – “Química analítica”. Ed. Mc Graw Hill. 7ª edición. 2001.
SKOOG, A y LEARY – “Análisis instrumental”. Ed. Mc Graw Hill. 1998
Capítulo 5 63

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Cromatografía líquida de alta resolución II
5.18 Cromatografía en fase reversa
En esta técnica una mezcla de agua/solvente orgánico es comúnmente usada como fase móvil, y
un sólido de área de superficie altamente no polar es empleado como fase estacionaria. La última es
usualmente un empaque de alcanos adheridas a sílice, por ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18
carbonos cubriendo la superficie de sílice. RPC (reverse phase chromatography) es actualmente el
método más popular de cromatografía en líquidos; mas del 70 % de todas las separaciones por HPLC son
llevadas a cabo por este método.
La base de la retención de soluto en RPC es aun algo controversial; algunos trabajadores
prefieren un proceso de adsorción, mientras que otros creen en la partición del soluto dentro de la fase
estacionaria no polar. Probablemente ambos procesos son importantes para algunas muestras. La
retención de un soluto, X, por la adsorción competitiva en la superficie de la fase estacionaria puede ser
representado por:
Xm + zMs ↔ Xz + zMm
Donde M es una molécula de fase móvil. Los subíndices m y s refirieren a las moléculas en la fase
móvil o estacionaria respectivamente. La ecuación 1.1 asume que una competencia entre el soluto y las
moléculas de la fase móvil por un lugar en la superficie de la fase estacionaria existe. Esto es, una
molécula adsorbida, X, desplazara un numero z de moléculas M previamente adsorbidas. Las pruebas
que favorecen un proceso de particiones en RPC son de varias clases:
Primero, la retención de una serie de alcanos sustituidos del tipo Cn-substituidos en el empaque
de una columna, muestra una discontinuidad diferente cuando el soluto alquilo sustituido es igual en
tamaño con el grupo Cn de la fase estacionaria. Esto indica que los grupos n-alquilo en un soluto la
molécula puede penetrar (partición) dentro de la fase estacionaria, mientras no sean demasiado largos
[1]
5.19 Cromatografía quiral
Los compuestos ópticamente activos han atraído una gran atención porque los sistemas de la
vida son quirales. Proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos poseen características quirales las cuales
poseen una estrecha relación con sus funciones.
Capítulo 5 64

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los estereoisomeros son isómeros con una constitución idéntica pero un arreglo espacial
diferente. Los estereoisomeros se clasifican de acuerdo a si factor de de simetría en un carbono
denominado el carbono quiral.
Los enantiomeros tienen propiedades físicas idénticas excepto por el signo de la rotación óptica.
Generalmente los enantiomeros se obtienen en una mezcla racemica, mezcla en la cual la cantidad de
los enantiomeros es igual.
Modos de separación. La separación cromatografica de enantiomeros se puede conseguir
por varios métodos; sin embargo, es siempre necesario el uso de un discriminador de enantiomeros o
selector. Dos diferentes tipos de selectores pueden distinguirse: un aditivo quiral en la fase móvil o una
fase estacionaria quiral. El mecanismo de separación es dependiente del modo de separación usado.
5.20 Cromatografía de derivados diastoméricos.
Este el más antiguo y ampliamente usado método cromatográfico para distinguir enantiomeros.
La columna de derivación de un soluto ópticamente activo con otra molécula ópticamente activa
depende de la habilidad de separar a la molécula buscada. Un número importante de de grupos que
desvían la actividad de los compuesto a separar se han estudiado entre ellos están los grupos amino,
(separados con amidas, carbamatos, ureas, tioureas, y sulfoaminas) grupos hidroxilo, (separados con
esteres, carbonatos, y carbamatos) grupos carboxilo (esteres y amidas), epóxidos (isotiocianatos),
olefinas (con complejos quirales de platino), y tioles (con tioeteres).
Las ventajas de esta técnica son:
1. La metodología ha sido ampliamente estudiada, haciendo que la aplicación sea relativamente
fácil y accesible.
2. La detección de los productos puede ser llevada a cabo mediante la selección adecuada del
agente derivante (separante) con un fuerte cromoforo o fluoroforo.
Las principales limitantes:
1. La síntesis de derivados diastomericos requiere del aislamiento de los compuestos necesarios
para la separación.
2. Las muestras se contaminan con el derivado diastomérico.
3. Los productos de interés pueden tener reacciones con los aditivos de la columna.
Capítulo 5 65

Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.21 Separación usando aditivos quirales a la fase móvil.
La separación de compuestos enantiomericos se ha logrado a través de la formación de
complejos diastoisomericos con una molécula quiral añadida a la fase móvil. La separación quiral es
posible dada la diferencia de los complejos diastoisomericos formados, la solvatación en la fase móvil o
la unión a la fase solida. Una visión general del fundamento de este método ha sido publicada por
Lindner y Pettersson [2] .
Existen tres principales tipos de aditivos para la formación de los complejos:
A) Complejos de metales de transición (intercambiadores de ligandos)
B) Apareamiento de iones
C) Inclusión molecular
5.22 Separación usando aditivos quirales en la fase estacionaria.
A diferencia del método anterior en este método los complejos se forman en la fase estacionaria,
donde los aditivos se encuentran ya fijados. El enlace que se forma con uno de los enantiomeros hace
posible la separación de estos mismos. Existen 5 tipos principales de sistemas usados en esta técnica.
1) Es los complejos soluto fase estacionaria son formados por interacciones atractivas, puentes de
hidrogeno, interacciones pi, dipolos instantáneos, etc., entre el soluto y la fase estacionaria.
2) El mecanismo para la formación de complejos soluto-fase estacionaria es a través de
interacciones atractivas en donde la inclusión de complejos juega un papel importante.
3) El soluto entra dentro de cavidades quirales en la fase estacionaria para formar los complejos
incrustados.
4) El soluto es parte de un complejo metálico diastomérico.
5) La fase estacionaria es una proteína y el complejo soluto-fase estacionaria se basa en
combinaciones e interacciones hidrofóbicas y polares.
Aplicaciones. Las principales aplicaciones e encuentran en la industria farmacéutica donde
los compuestos quirales tienen diferentes actividades biológicas en un organismo, la adecuada
separación de estos compuestos es de vital importancia en esta industria [3] .
Capítulo 5 66

Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.23 Cromatografía de intercambio iónico
Se utiliza principalmente para la separación de iones o de una sustancia fácilmente ionizable, en
donde una de los principales factores que facilitan la retención, es la atracción electrostática entre los
iones de la fase móvil y aquellos situados en la fase inerte estacionaria.
En este tipo de cromatografía los iones del analito se separan basándose en las diferencias entre
sus afinidades relativas por la fase estacionaria (iones de la fase inerte), contra aquellos que se
encuentran en la fase móvil, de forma tal, que se establece un continuo intercambio de cargas en donde
los iones de la matriz son reemplazados por los de la muestra a su paso por la columna.
Los iones que se intercambian más frecuentemente son cationes como NH4 + , metales grupo I y II, NO2 - ,
NO3 - , PO4 2- , haluros, SO4 2- .
Fundamento
Es un proceso en el que una solución de un electrolito es puesta en contacto con una resina
intercambiadora, en donde los iones activos de la resina son reemplazados por aquellos iones de la
misma carga presentes en el analito.
5.24 Intercambiadores catiónicos y aniónicos
Un intercambiador catiónico es aquel en el que los iones activos sobre la matriz son cationes y el
proceso de intercambio involucra cationes, entre los más comunes se encuentran:
-SO3H, -CO2H, -OH, -PO4H3
Los grupos más comunes en una resina aniónica son grupos amino terciarios y cuaternarios y se
intercambian de manera análoga a una resina catiónica.
Resinas. Inicialmente la fase estacionaria constaba de resinas preparadas por
policondensación, de fenoles ya minas aromáticas con formaldehído. Algunos grupos inorgánicos eran
introducidos por condensación de formaldehído con sulfo o carboxil derivados. Actualmente estas se han
reemplazado por materiales basados en estireno (poliacrilatos y divinilbencen derivados) los cuales
pueden ser modificados para adaptar el tamaño de partícula, así como para mejorar la selectividad y la
capacidad de retención de la columna.
Capítulo 5 67

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Las resinas se preparan por copolimerización de estireno con divinilbenceno, de la cual se origina
una maya tridimensional que puede ser modificada con gradientes de concentración para obtener
diferencias en el tamaño de poro y así aumentar la selectividad.
Para las resinas aniónicas, se realiza una clorometilación de la matriz polimérica seguida de un
tratamiento con la correspondiente amina.
Resinas catiónicas de ácido fuerte. Intercambian iones positivos (cationes). Funcionan
a cualquier pH. Es la destinada a aplicaciones de suavizado de agua, como primera columna de
desionización en los desmineralizadores o para lechos mixtos. Elimina los cationes del agua y necesitan
una gran cantidad de regenerante, normalmente ácido clorhídrico (HCl).
Resinas catiónicas de ácido débil. Tienen menor capacidad de intercambio. No son
funcionales a pH bajos. Elevado hinchamiento y contracción lo que hace aumentar las pérdidas de carga
o provocar roturas en las botellas cuando no cuentan con suficiente espacio en su interior. Se trata de
una resina muy eficiente, requiere menos ácido para su regeneración, aunque trabajan a flujos menores
que las de ácido fuerte. Es habitual regenerarlas con el ácido de desecho procedente de las de ácido
fuerte.
Resinas aniónicas de base fuerte. Intercambian iones negativos (aniones). Es la
destinada a aplicaciones de suavizado de agua, como segunda columna de desionización en los
desmineralizadores o para lechos mixtos. Elimina los aniones del agua y necesitan una gran cantidad de
regenerante, normalmente sosa (hidróxido sódico - NaOH).
Resinas aniónicas de base débil. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos
sosa para su regeneración. No se puede utilizar a pH altos. Pueden sufrir problemas de oxidación o
ensuciamiento.
Propiedades de las resinas:
1. Poseer grupos intercambiadores monofuncionales
2. Un tamaño de partícula pequeño
3. Factor de retención elevado
Tamaño de la partícula
Estos se basan en los requerimientos estándares (50 mesh)
Capítulo 5 68

Cromatografía de líquidos de alta resolución
100-200 mesh: separaciones a macroescala; cuantitativa
50-100 mesh: preparativas
14-50 mesh: separaciones a escala industrial
Capacidad intercambiadora. Es la medida de la habilidad de la resina para intercambia
un número determinado de iones o de carga por gramo de resina. Está determinada por la accesibilidad
del grupo que se desea intercambiar, la concentración del eluyente, fuerza iónica, pH, tamaño de
partícula y la fuerza de la unión resina-analito
Para una resina catiónica, esta cantidad se define como la capacidad de intercambiar H + ,
mientras que para una resina aniónica esta capacidad esta e función de la cantidad de iones Cl - que
pueda intercambiar.
Selectividad de la Resina. La afinidad entre la resina y la partícula a intercambiar, es
función de la resina y de los iones. Esto se puede expresar como un equilibrio de la siguiente forma:
n(R - H + ) + M n+1 ( R - )n M n+ + n H +
Donde R representa la matriz y puede establecerse la constante de equilibrio como se muestra:
Kd = [M n+ ]r [H + ] n / [M m+ ] [H + ] n r
Donde el último término representa las concentraciones de los iones. Entre mayor sea el valor se
Kd mayor será la afinidad de la partícula por la resina intercambiada y en consecuencia aumentará la
capacidad de intercambio.
Naturaleza de la Resina. El coeficiente de selectividad Kd está determinado por algunos
de los factores de capacidad de la resina; la selectividad se afecta de acuerdo al grado de fuerza relativa
en el enlace ion-resina. Los pequeños tamaños de partícula excluyen en su totalidad a aquellas de mayor
tamaño, aumentando la selectividad de la resina; así como la temperatura.
La afinidad de los cationes de las resinas e solución acuosa se incrementa caudno la carga se
incrementa; para cationes de la misma carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del ion
hidratado. Algunas secuencias de afinidad se muestran a continuación:
1. Na < Ca < Al < Th
2. Li < Na < NH < K < Ag
3. Mg < Cu < Sr < Ba
Capítulo 5 69

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Para las resinas aniónicas el intercambio depende del grado de polarizabilidad del anión por el
intercambiador; en la medida en la que la polarización sea mayor, mayor será la fuerza con la cual se
desplaza el ion de la matriz por el ion de la muestra. En general los iones polivalentes tienen una mayor
afinidad que los monovalentes; y para los aniones de la misma carga el ion de mayor tamaño tendrá una
afinidad:
En general:
F - < HCO3 - < Cl - < HSO3 - < CN - < Br - < NO3 - < I -

Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.26 Cromatografía de apareamiento iónico
La cromatografía iónica, que es una versión de cromatografía de intercambio iónico de alta
eficacia, se ha convertido en el mejor método de análisis de iones. Por ejemplo se usa en la industria de
semiconductores para controlar niveles de 0.1 ppm de aniones y cationes en agua desionizada.
La cromatografía de pares iónicos utiliza una columna HPLC de fase inversa, en lugar de una
columna de intercambio iónico. Para separar una mezcla de cationes se añade a la fase móvil un
surfactante aniónico, como n-C8H17-SO3. El surfactante se aloja en la fase estacionaria convirtiéndola
eficazmente en un intercambiador iónico. Cuando los cationes del analito pasan a través de la columna
se pueden unir a la fase estacionaria por atracción electrostática con los aniones del surfactante. El
mecanismo de retención es una mezcla de interacciones con fase inversa y de intercambio iónico. Para
separar los analitos aniónicos se pueden añadir a la fase móvil sales de tetrabutilamonio, como reactivo
de par iónico. La cromatografía de pares iónicos es más compleja que la cromatografía de fase inversa,
por que el equilibrio del surfactante con la fase estacionaria es lento, la separación es más sensible a
variaciones de temperatura y pH, y la concentración del surfactante no afecta la separación. El
disolvente a elegir es el metanol debido a que los surfactantes iónicos son mas solubles en mezclas
metanol/agua que en mezclas acetonitrilo/agua. Las estrategias para el desarrollo de un método
dependen de las variaciones en el pH y la concentración de surfactante, para una concentración de
metanol y temperatura fija. Dada la lentitud del equilibrio entre el surfactante y la fase estacionaria, no
se recomienda una elución gradiente en cromatografía de pares iónicos.
Figura 1. Fundamento de la
cromatografía de pares iónicos. EL
surfactante octamonosulfato sódico
añadido a la fase móvil se une a la
fase estacionaria no polar. Los grupos
sulfonato negativos, que sobresalen
de la fase estacionaria, actúan como
puntos activos de intercambio iónico
frente analitos catiónicos, como
+ [6]
bases orgánicas protonadas, BH
Capítulo 5 71

Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.26 Cromatografía de exclusión de tamaño
La cromatografía de exclusión, también llamada cromatografía de permeación en gel es un modo de
separación no interactivo. Las partículas del empaque de la columna tienen varios tamaños y estructuras
de poro, de forma que las moléculas son retenidas o excluidas con base en su volumen molecular
hidrodinámico; estos es, su tamaño y forma. Estrictamente, la separación en cromatografía de exclusión
no se basa en el peso molecular.
Conforme la muestra pasa por la columna las moléculas del soluto se ordenan. Las moléculas muy
grandes no pueden entrar en muchos de los poros e incluso penetran menos en las regiones
comparativamente abiertas del empaque. Las moléculas muy pequeñas difunden hacia dentro de todos
o muchos de los poros accesibles a ellas. Con un mayor volumen de la columna a su disposición, las
moléculas pequeñas tardan más en salir de la columna.
Empaques de la columna. Los empaques para la columna pueden ser semirrígidos
(polímeros macromoleculares entrecruzados) o rígidos (vidrios o sílices de tamaño de poro controlado).
Los primeros están limitados para una presión máxima de 300 psi. Las perlas de poliestireno
parcialmente sulfonadas son compatibles con los sistemas acuosos y las no sulfonadas con los no
acuosos.
Los vidrios y sílices porosos cumplen una amplia gama de tamaños de poro. A continuación se
presentan unos ejemplos y los correspondientes intervalos de operación.
Diámetro del poro (nm) Intervalo de operación (daltons)
4 1 000 – 8 000
10 1 000 – 30 000
25 2 500 – 125 000
55 11 000 – 350 000
150 100 000 – 1 000 000
250 200 000 – 1 500 000
Estos empaques son químicamente resistentes a valores de pH menores de 10 y pueden usarse
con disolventes acuosos y orgánicos polares.
Capítulo 5 72

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Disolventes. Se requiere de un solo disolvente en el que se disuelve y cromatografía la
muestra. Si la diferencia en la viscosidad entra una muestra inyectada y la fase móvil es muy grande,
puede producirse la distorsión del pico y anomalía en los tiempos de elusión.
Detectores. Los detectores más utilizados son el refractómetro diferencial y los
espectrofotométricos que operan en las regiones ultravioleta e infrarroja. Un detector de dispersión de
luz laser de ángulo bajo (LALLS) hace posible la determinación directa de los pesos moleculares ya que
responde al peso molecular del analito, no únicamente a la concentración.
Un detector de infrarrojo proporciona información sobre la composición del copolímero, ramificación y
tacticidad, esta se refiere a la estereorregularidad que se encuentra en ciertos tipos de polímeros.
Comportamiento de la retención. El comportamiento esencial de un soluto y la
característica de los empaques de las columnas se puede describir en términos muy simples. Si se
supone que el tiempo que toma un soluto para difundirse dentro de un poro es pequeño con respecto al
tiempo que la molécula está en la vecindad del poro, entonces el proceso de separación es totalmente
independiente del proceso de difusión, esto se representa de la siguiente forma (coeficiente de
distribución:
VR
V
K
V
Capítulo 5 73
S
Se puede enunciar como la fracción interna del volumen de poro que es accesible al soluto.
Donde VR (volumen de retención): es el volumen de eluyente que fluye de una columna entre la
inyección de la muestra y su salida en el eluyente; VM: es el volumen ocupado por la fase móvil (esto es,
en los intersticios entre las partículas porosas llenas de disolvente), que s e estima con la elución de un
soluto totalmente excluido; VS: es el volumen interno acumulado dentro de los poros de las partículas y
disponible para un soluto totalmente incluido o para las moléculas del disolvente.
Las moléculas totalmente excluida eluyen en un volumen vacío, esto es, VR=VM y por lo tanto
K=0. Para las moléculas pequeña que pueden entrar en todos los poros del empaque, VR=VM+VS y, por lo
tanto, K=1. Las moléculas de tamaño intermedio eluyen entre estos dos límites y K se encuentra en el
intervalo de 0 a 1.
M

5.27 Aplicaciones
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras fisiológicas en las
que la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, se realiza con facilidad con columnas de
exclusión de aniones. Vino, cerveza, jugo de fruta y muchos productos lácteos se analizan rápidamente
con una preparación mínima de la muestra (generalmente sólo filtración o centrifugación). Otra
aplicación es la separación de oligosacáridos y azúcares de alcohol con una columna de exclusión de
aniones en la forma iónica de calcio con agua como eluyente y una temperatura de 90°C. La maltotriosa
y otros oligosacáridos superiores se separan del mono y los disacáridos por efectos de exclusión estérica.
En bioquímica la separación de péptidos, proteínas y demás moléculas biológicas es importante y se
puede separar efectivamente por este método [7] .
5.28 Cromatografía líquido-líquido
Los empaques de columna más utilizados más ampliamente para cromatografía de reparto
líquido-líquido, son aquellos con fases estacionarias orgánicas enlazadas. Reemplazan a los empaques
clásicos en los que el líquido estacionario recubre un material de soporte. El reparto ocurre entre la fase
enlazada y una fase móvil líquida.
Preparación de soportes con fase enlazada Los soportes con fase enlazada se
preparan uniendo covalentemente a la superficie de la sílice una especie orgánica de hidrocarburo. Los
soportes incluyen geles de sílice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartículas. El
siloxano se ha convertido en el estándar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la
porción hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase móvil. Las fases
monoméricas responden rápidamente a los cambios en la composición de la fase móvil, cuando son
mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentándose adsorción en la
interfase o entrecara adsorbente-disolvente en adición al equilibrio de reparto líquido – líquido
esperado.
Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas
longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este último puede
utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un máximo de retención.
Capítulo 5 74

Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.29 Cromatografía líquido-liquido de fase normal
Utiliza una fase estacionaria polar (frecuentemente hidrofílica) y una fase móvil menos polar.
Para seleccionar una fase óptima, es mejor empezar con una fase móvil de un hidrocarburo puro como el
heptano. Si la muestra se retiene fuertemente, la polaridad de la fase móvil debe aumentarse, quizá
añadiendo pequeñas cantidades de metanol o de dioxano.
5.30 Cromatografía de fase inversa
Utiliza un empaque enlazado hidrofóbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C-18) u
octilo(C-8) y una fase móvil polar, frecuentemente una fase móvil parcial o totalmente acuosa. Conforme
aumenta el carácter hidrofóbico de los solutos, la retención aumenta. El agua es el eluyente más débil. El
metanol y el acetonitrilo son disolventes populares porque tienen baja viscosidad y son fáciles de
conseguir con excelente pureza.
En cromatografía de fase inversa la fuerza de la retención no es la interacción favorable del
soluto con la fase estacionaria, sino el efecto del disolvente de la fase móvil para forzar al soluto hacia
dentro de la capa hidrocarbonada enlazada.
Aplicaciones de cromatografía de fase inversa La técnica de fase inversa en sus varias
formas es el modo más ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los métodos de
cromatografía líquida. Esta técnica es la que probablemente proporcionará retención y selectividad
óptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrógeno o no tienen un carácter
predominantemente alifático o aromático. El método es muy apropiado para separar solutos con base
en el tamaño y estructura de los grupos alquilo.
En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de esta técnica. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria
incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los
métodos de fase inversa son los preservativos alimentarios, herbicidas y azúcares.
En el campo farmacéutico ha venido en aumento el uso de esta técnica a costa de la
cromatografía de adsorción. Un amplio espectro de biomoléculas, lipofílicas o iónicas, pequeñas o
grandes, pueden ser cromatografiazas debido a que el contenido de agua en la fase móvil puede variar
desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto. Los compuestos lipofílicos, tal como
los triglicéridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con
Capítulo 5 75

Cromatografía de líquidos de alta resolución
frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada con
octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano [7] .
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[7] Willard. (1991) “Métodos instrumentales de análisis” Edit. Iberoamérica S.A. de C.V. México.
Capítulo 5 76

Capítulo 6
Técnicas acopladas
Cromatografía y técnicas espectroscópicas acopladas
Los métodos de acoplamiento combinan las capacidades de separación de la cromatografía con
las de detección cuantitativa y cualitativa de los métodos espectrales tales como infrarrojo, resonancia
magnética nuclear y masas, entre otros. A estas técnicas se les denomina en ocasiones técnicas
hifenadas.
En los primeros métodos de esta categoría los eluyente de la columna cromatográfica se
recogían como fracciones separadas en una trampa fría, después de lo cual se usaba un detector no
selectivo ni destructivo para la identificación de su presencia. Posteriormente, se investigaba la
composición de cada fracción por espectroscopia de resonancia magnética nuclear, infrarroja, masas o
con medidas electroanalíticas. Una importante limitación de esta aproximación era la pequeña cantidad
(usualmente de micromoles) de soluto contenida en las fracciones. Sin embargo, hoy día muchos
métodos hifenados monitorizan el efluente de la columna cromatográfica de manera continua, con
métodos espectroscópicos dando como resultado una combinación de dos técnicas, que basadas en
principios distintos, permiten lograr una enorme selectividad.
Características y requerimientos de las técnicas acopladas
6.1 Cromatografía HPLC acoplada a Espectroscopia de Masas (MS)
Aunque la espectroscopia de masas es una poderosa herramienta para la identificación de
compuestos puros, la complejidad de los espectros de masas dificulta enormemente el análisis de
mezclas, incluso simples. Por ello para el análisis de muestras complejas se emplean acoplamientos de
esta técnica con técnicas potentes de separación, como es la cromatografía líquida.
Así el acoplamiento Cromatografía Líquida-Espectroscopia de Masas (GL-MS), es una
herramienta más poderosa al alcance de los químicos para el análisis de muestras complejas. En este
caso se efectúan los espectros de masas de los compuestos que salen de la columna de cromatográfica.
Es necesaria una interfase entre ambos instrumentos que tiene como misión fundamental
eliminar el eluyente (fase móvil) antes de la introducción de los analitos en el espectrómetro.
Capítulo 6 81

Técnicas acopladas
Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una técnica poderosa de separación con una
herramienta poderosa de identificación. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de toda la
separación cromatográfica. Así pueden registrarse inequívocamente los picos y comprobar incluso su
pureza, es decir si la separación ha sido completa o se ha producido en algún momento la co-elución de
dos compuestos.
Espectroscopia de Masas acopla a Cromatografía Líquida de Alta Resolución
Tal vez una de las desventajas de esta técnica es que los espectros de masas de los compuestos
orgánicos analizados por esta técnica, dependen de las condiciones de análisis, principalmente del tipo
de fase móvil y del potencial de ionización aplicado; ya que comúnmente a partir del espectro de masas
se obtiene normalmente el ión molecular y fragmentos que proporcionan a su vez el peso molecular del
compuesto. En tanto que en la técnica del HPLC-MS, el ión molecular forma fragmentos con el
disolvente empleado en la fase móvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular
del compuesto analizado. Razón por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrón que
contengan los compuestos objetos del análisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente
potencial y ionización), para conocer el espectro de masas característico del compuesto en cada caso.
Sin embargo pese a ello esta técnica resulta extremadamente útil en el análisis de ultratrazas
(ng/kg) de compuestos orgánicos. Donde un análisis de tan bajos niveles de concentración (ultratrazas)
puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad y que se
cumula en los organismos vivos. Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los
dibenzofuranos policlorados (PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos
vivos principalmente ya que se acumulan en la materia orgánica del suelo.
Capítulo 6 82

Técnicas acopladas
Otra de las aplicaciones de esta técnica, es la identificación de analitos desconocidos, ya sea como
productos secundarios de síntesis, análisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas comerciales,
ó la identificación inequívoca de sustancias de estructura similar, para las que un simple espectro masas
es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una herramienta muy selectiva que se
emplea hoy día permite la identificación de algunos péptidos y proteínas.
Equipo de HPLC acoplado a MS
6.2 Cromatografía HPLC acoplada a Ultravioleta (UV)
El Detector de Ultravioleta Visible es el más común acoplado a HPLC, se usa cuando los componentes
absorben radiación UV- visible, como los compuestos aromáticos, alquenos, moléculas con enlaces C-O,
C-N, C-S. Pueden ser de longitud de onda fija o variable (arreglo de diodos).
La detección UV-visible no es destructiva, es estable en el tiempo y se afecta poco por la
temperatura, por lo que se puede colectar los componentes por separado. Se considera a la detección
UV como selectiva ya que se elige la longitud de onda de mayor absorbancia de acuerdo con la sustancia
que se desea conocer, pero debe tenerse en cuenta que en el rango del UV lejano (190-220nm) la
mayoría de los compuestos está en el orden de los nanogramos (ng), lo que posibilita el análisis de
cantidades trazas.
Capítulo 6 83

Técnicas acopladas
El detector de UV-visible es de longitud de onda variable o espectrofotométrico es el más usado
ya que ofrece como ventaja la libre selección de longitud de onda de trabajo sin necesidad de cambiar
filtros o lámparas. Permite trabajar desde 190 hasta 700 u 800nm debido a que utiliza una red de
difracción consistente en un prisma que posibilita, mediante su rotación, seleccionar la longitud de onda
de trabajo de forma continua y no discreta como los detectores fotométricos.
Estos detectores utilizan también como fuente de luz una lámpara de deuterio o halógeno, que
en algunos modelos puede ser intercambiada por una de tungsteno para la detección en el rango visible.
Al ser constructivamente más complejos que los detectores fotométricos son algo menos sensibles y más
costosos.
La espectroscopia de ultravioleta (UV) es de mucho valor, especialmente en HPLC. El espectro UV
es muy utilizado para corroborar la identidad, ya que la identificación basada en una sola longitud de
onda del rango UV puede presentarse a interferencias. En los detectores de arreglo de diodos (DAD) el
espectro UV puede ser registrado en computadora y comparado con el del compuesto sospechosos para
corroborar su variedad
Así mismo en la industria láctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinación de
vitamina D3 en determinación de productos derivados de la leche y en premezclas vitamínicas. Esto
debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus
derivados en cantidades muy bajas. Por esta razón, industrialmente se adiciona la misma a algunos
productos lácteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinación del contenido de
vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lácteo
terminado.
Otra de las aplicaciones de esta técnica es la determinación de sulfonamidas, nitrofuranos y
cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibióticos y otros quimioterapéuticos
inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento
industrial de la misma, además de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparición
de cepas de microorganismos patógenos resistentes a los mismos.
El control de estas sustancias se basa en la extracción selectiva de los residuos de sulfonamidas,
nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se
evapora hasta sequedad a presión reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M
desgrasándose por partición con hexano. La fase acuosa (buffer) contendrá los residuos de sulfonamida,
Capítulo 6 84

Técnicas acopladas
nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatógrafo de líquidos de
alta resolución con detección de UV-visible y columna de fase reversa (C18).
Así mismo en la industria láctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinación de
vitamina D3 en determinación de productos derivados de la leche y en premezclas vitamínicas. Esto
debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus
derivados en cantidades muy bajas. Por esta razón, industrialmente se adiciona la misma a algunos
productos lácteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinación del contenido de
vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lácteo
terminado.
Otra de las aplicaciones de esta técnica es la determinación de sulfonamidas, nitrofuranos y
cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibióticos y otros quimioterapéuticos
inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento
industrial de la misma, además de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparición
de cepas de microorganismos patógenos resistentes a los mismos.
El control de estas sustancias se basa en la extracción selectiva de los residuos de sulfonamidas,
nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se
evapora hasta sequedad a presión reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M
desgrasándose por partición con hexano. La fase acuosa (buffer) contendrá los residuos de sulfonamida,
nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatógrafo de líquidos de
alta resolución con detección de UV-visible y columna de fase reversa (C18).
6.3 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) acoplada a RMN
El acoplamiento de HPLC y RMN requiere el ajuste de los sistemas de análisis. El flujo de la fase
móvil lleva a un período de exposición limitada (m) para los núcleos de células de la corriente. El tiempo
(m) es definido como la proporción del volumen de detección de la velocidad de flujo. Por otra parte, el
estado de equilibrio se alcance en un tiempo más corto permitiendo un rápido tiempo de la tasa de
repetición de la exposición de un espectro y, por tanto, un aumento en la sensibilidad.
En la técnica de HPLC la mayoría de las separaciones se realizan con materiales de fase invertido usando
mezclas binarias de disolventes como acetonitrilo / agua, acetona / agua o metanol / agua como móvil
fases. La elección de la fase móvil debe ser adaptada a la espectroscopía de RMN. Una ventaja evidente
es la de obtener un número pequeño de señales del disolvente en el espectro de RMN, ya que el
disolvente puede ocultar las señales de la muestra espectros. En general, las condiciones en
Capítulo 6 85

Técnicas acopladas
cromatografía HPLC-RMN los experimentos son los mismos que en la cromatografía convencional, pero
el agua se sustituye por agua deuterada. El uso de disolventes deuterados orgánicos en general es
demasiado caro. Para un ajuste correcto del receptor de la ganancia RMN instrumento, la intensidad de
las señales de disolvente debe reducirse a la altura de la muestra mediante la aplicación de una técnica
de represión del disolvente.
La combinación de técnicas de separación cromatográfica con espectroscopía de RMN es uno de
los más poderosos y los métodos de ahorro de tiempo para la separación y la determinación estructural
de compuestos desconocidos y mezclas. Especialmente para la elucidación de la estructura de sustancias
sensibles a la luz y el oxígeno, por ejemplo ácidos de lúpulo amargo y estereoisómeros de carotenoídes.
6.4 Cromatografía HPLC acoplada a espectroscopía de IR
En esta técnica de acoplamiento se presenta un problema importante que la diferencia de la CG-
IR: la mayoría de los disolventes (y solutos) empleados como fase móvil en HPLC presenta una
considerable absorción en la zona infrarroja del espectro por lo que la caracterización de los analitos se
hace más problemática.
Existen dos tipos de acoplamiento:
1.- Acoplamiento directo: parecido al de CG-IR, se emplea un tubo lumínico que actúa de célula de flujo.
Los interferogramas obtenidos durante todo el proceso cromatográficos son almacenados y
posteriormente se ofrecen los espectros IR convencionales de los analitos cuando el ordenador ha
sustraído en los mismos las bandas de absorción correspondientes a la fase móvil. Para evitar un bloqueo
excesivo del espectro por parte del disolvente se reducen las dimensiones de la célula (el paso de la luz
de 0.1 a 0.2 mm y el volumen entre 3 y 12 µL) y aun así existen inconvenientes:
no se puede usar gradiente de elución
no se puede obtener información segura de la zona del espectro en el que el disolvente absorbe
fuertemente
algunos disolventes ofrecen dificultades especiales para la sustracción
la sensibilidad es veinte veces menor a la de CG-IR, comparable a la que se obtiene con un
detector de índice de refracción convencional.
2.- Acoplamiento con eliminación del disolvente (previa a la identificación IR): debe cumplirse la
condición de que los analitos sean mucho menos volátiles que los componentes de la fase móvil para
lograr una volatilización selectiva. Se usa un muestreador con varios pocillos que contienen mg de KCl
Capítulo 6 86

Técnicas acopladas
soportados sobre una placa metálica. El efluyente cromatográfico es rociado en un tubo concentrador,
usando nitrógeno que evaporara un 90 % del disolvente; al entrar un pico a dicho tubo se abre una
válvula y se vierte el contenido en los pocillos del muestreador (se vierte de pozo en pozo al cerrarse y
abrirse la válvula). La detección se realiza por reflectancia difusa.
6.5 Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-MS)
El espectrómetro GC/MS es un equipo de gran importancia en los laboratorios analíticos debido
a su gran sensibilidad (límite de detección de picomoles), el compuestos al que se realice el análisis por
GC/MS, debe ser térmicamente estable (no descomponerse) a las temperaturas de la columna, y debe
ser lo suficientemente volátil como para estar en fase gaseosa en el proceso de separación
cromatográfica (punto de ebullición < 250ºC).
En la técnica de GC/MS se utiliza la espectrometría de masas (que no se debe confundir con
espectroscopia, ya que no hay absorción o emisión de radiación) como método de detección para
identificar los analitos separados en la columna cromatográfica. El espectrómetro de masas está
acoplado de modo hermética y directamente a la salida de la columna cromatográfica a través de un
capilar.
El cromatograma, que registra los picos de elución de los analitos a su salida de la columna y sus
tiempos de retención. Esta información es de especial interés en series homólogas (compuestos de la
misma familia que se distinguen entre sí sólo por la longitud de la cadena alifática, por ejemplo, la serie
homóloga de los alcoholes ya que permite hacerse una idea sobre el peso molecular de la especie.
El espectro de masas correspondiente a cada pico de elución, que permite identificar el pico con
un compuesto determinado. La espectrometría MS consiste en la ionización de moléculas en fase
gaseosa y la separación de los iones resultantes de acuerdo a su relación masa/carga (m/z). Un haz de
electrones colisiona con las moléculas que entran en la cámara de ionización del espectrómetro de
masas y, paradójicamente, les arranca un electrón, dando lugar a diversos fragmentos cargados
positivamente. Estos fragmentos son acelerados en un campo electromagnético y llegan al detector.
Capítulo 6 87

Técnicas acopladas
Los instrumentos de CG/MS se han utilizado para la identificación y caracterización de sabores,
olores en los alimentos, identificación de contaminantes en el agua, llevar a cabo diagnostico medico
basado en componentes del aliento y estudio sobre los metabolitos de drogas.
6.6 Cromatografía de gases acoplada Infrarrojo (CG-IR)
Una ventaja sustancial de esta hibridación es que la fase móvil cromatográfica no absorbe en la
zona de IR, por lo que no es precisa su separación previa de los analitos., además del carácter no
destructivo del detector acoplado. Este acoplamiento puede llevarse a cabo mediante dos
planteamientos técnicos diferentes:
Discontinuo , cuando no se dispone de un instrumento IR-TF(IR-Transformada de Fourier)
Continuo , mediante una interfase ,lo que exige la mayor sensibilidad y alta velocidad de barrido
del instrumento (IR-TF)
a) En la figura se muestran un diagrama de bloque de combinación CG-IR. La muestra se inyecta en el
cromatógrafo de gases y los analitos se separan en la columna capilar .El efluyente cromatográfico se
dirige a una cedula de flujo especial denominada “tubo lumínico” que constituye la interfase de la
hibridación. Después el fluido regresa al cromatógrafo donde realiza la detección continua convencional
b) Tubo lumínico, está cubierto de oro en su interior para reflejar la luz, y calentado eléctricamente. Se
sitúa alineado axialmente a la radiación de IR modulada incidente. Sus extremos so de material
transparente a esta radiación, generalmente KCl. El flujo gaseoso entra y sale mediante dos orificios.
Para obtener la información del acoplamiento:
1. Se obtiene el cromatográma ordinario a través del detector de CG puede o no ser destructivo
2. El espectrómetro IR pude realizar varias misiones una vez aplicado el algoritmo y obteniendo el
espectro de IR convencional: (a) proporcionar espectros IR de cada pico (b) proporcionar un
Capítulo 6 88

Técnicas acopladas
cromatográma (c) comprobar la pureza de espectral. (d) Comparar los espectros obtenidos con
los almacenados para identificar a los analitos.
Muestra representativa de una determinación de herbicidas en los sedimentos de una plata industrial
6.7 Cromatografía de Gases acoplada a Espectroscopia Atómica (CG-EAA)
Se trata de las combinaciones más simples, ya que las correspondientes interfases son
atomizadores comerciales, con escasas variaciones. La facilidad y sencillez de los montajes aumenta en
el siguiente sentido Hornos de grafito< llamas < plasmas.
Los plasmas ICP, DCP, MIP y los atomizadores de llama pueden acoplarse directamente con el
efluyente de un cromatógrafo de gases debido a que el caudal cromatográfico es generalmente
compatible con el de introducción a estos atomizadores. En el caso de los plasmas, el argón o helio
deben ser los gases portadores usados en el cromatógrafo. Las ventajas del uso de emisión atómica en
plasma son: Mayor sensibilidad, posibilidad de multidetección atómica con instrumentos comerciales,
mayor campo de aplicación.
El acoplamiento de un cromatógrafo de gases con la espectroscopia de absorción atómica con
una llama como interfase puede ser directo, aun que la mejor alternativa es utilizar un tubo de cuarzo o
de cerámica calentando en la llama a través del cual circula el efluyente gaseoso.
En general los diferentes diseños descritos tienen por objetivo aumentar el tiempo de los átomos
en la zona de absorción lumínica.
Los analitos más frecuentemente determinados mediante estas hibridaciones instruméntales
son compuestos órgano metálicos procedentes de su introducción como contaminantes a partir de
productos comerciales (estabilizadores de plásticos aditivos de gasolina, diacidas o de alquilación en
Capítulo 6 89

Técnicas acopladas
procesos naturales). Pese a que estas técnicas presentan una gran sensibilidad (generalmente el límite
de detección es inferior al ng), siempre son necesarias técnicas de preconcentración debido a que se
encuentran en niveles sumamente bajos en la naturaleza. Lo limites de detección alcanzados para
compuestos organometálicos de plomo son 250pg Pb/m 3 para tretrametilplomo y 375pg Pb/m 3 para
tetraetilplomo.
Figura: Una de dichas técnicas presente dos etapas: En la primera tiene lugar la retención de los analitos en un tubo
de absorción de polímetro poroso. La segunda etapa la desorcion-determinación continúa con la hibridación CG-
EAA. Se utiliza una corriente adicional de hidrogeno y un tubo de cuarzo sobre la llama.
6.8 Cromatografía (HPLC) acoplada a Espectroscopia Atómica (CG-EAA)
El caudal de aspiración de las muestras en los plasmas es de 1y 2 mL/min. Lo que los hace
compatibles con los caudales de los efluyentes cromatográficos líquidos. Cuando el disolvente de la fase
móvil es fundamentalmente acuoso (en cromatografía de líquidos en fase invertida, cromatografía de
intercambio iónico) un nebulizador convencional es la interfase CG-EAE. Cuando los disolventes son
hidrocarburos o compuestos orgánicos halogenados, debe unirse un nebulizador especial de impacto.
Los plasmas de microondas (MIP) no son recomendables para ser hibridados en HPLC.
Los métodos atómicos de llama tienen un caudal entre 3 y 6 mL/min, superior el de los caudales
usuales de salida en HPLC por lo cual puede usarse un flujo adicional un que los analitos sufres una
dilución excesiva, una solución interesante es la propuesta por Slavin que se basa en la formación de
una gota a la salida del efluyente. Cuando esta alcanza un determinado tamaño (≈100l) se desprende y
cae sobre un micro embudo de teflón conectado directamente al nebulizador.
Las interfases más complejas son las que se necesitan para acoplar un HPLC con un
espectrofotómetro de absorción atómica con vaporización electrotérmica. Esto se debe a la
Capítulo 6 90

Técnicas acopladas
discontinuidad implícita de la detección por la necesidad de establecer ciclos precisos de incrementos de
temperatura para cada medición por eso todo acoplamiento de este tipo debe ser de modo discontinuo
Otra posibilidad es HPLC-EAA (cámara de grafito); en general constan de dos válvulas de
apertura/cierre, una múltiple de desvió y otra de inyección cuyo funcionamiento controlado por un
secuenciador es clave. Este secuenciador controla además el funcionamiento de la bomba a alta presión,
los ciclos de temperatura en la atomización y el funcionamiento del EAA .La válvula de inyección
introduce alícuotas a través de u capilar de tántalo.
Las dos válvulas de apertura/cierre permanecen cerradas durante el periodo de calentamiento
programado del tubo de grafito y posteriormente son abiertas cuando se realiza la inyección de la
siguiente muestra, Estas válvulas también pueden permanecer abiertas y así la mayor parte del efluyente
no es enviado al instrumento de de medida, inyectando alícuotas después de cada ciclo de
calentamiento.
Una posibilidad mas es de conectar HPLC con EAA (cámara de grafito) se utiliza un muestreador
comercial adaptado a la absorción atómica con cámara de grafito. El eluyente cromatográfico puede ser
recogido en su totalidad en los pocillos a intervalos regulares de tiempo o bien puede programarse de
tal forma que el eluyente valla alternativamente a los pocillos receptores y al desecho según lo
programado.
Estas interfases son más complejas respecto a las que origina un atomizador de llama, pero la
vaporización electrotérmica origina sensibilidades superiores, de ahí su atractivo.
6.9 Resumen
El acoplamiento instrumental se define como la combinación a través de una interfase adecuada
de dos técnicas analíticas independientes, que genera información única e integral de la composición de
la muestra, la cual se caracteriza por ser más completa que la información alcanzada
independientemente por cada técnica. La razón es que se combinan el elevado poder de separación de
la cromatografía para una amplia mezcla de analitos y el elevado poder de discriminación e identificación
que poseen estas técnicas determinativas.
En general todas las técnicas de acoplamiento constan de una interfase entre los dos
instrumentos que constituyen la conexión que produce el fluido que emerge de la columna
cromatográfica y el sistema de detección. Es imprescindible el control coordinado del funcionamiento de
ambos instrumentos (separativo y determinativo).
Capítulo 6 91

Técnicas acopladas
La gran cantidad de datos generada exige un sistema de almacenamiento, tratamiento,
interpretación y presentación de resultados.
6.10 Bibliografía
Hoy las técnicas acopladas son una gran herramienta para los
químicos y la ciencia en general y son por este orden las más
usadas: Espectrometría de masas (EM), Espectroscopia de
Absorción Infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF), Técnicas
Espectroscópicas Atómicas de Emisión (ICP) ó Absorción Atómica
(EAA) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
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Capítulo 6 92

Capítulo 7
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Una parte importante de la cromatografía de gases y líquidos son los detectores, Un detector es
un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una
señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. En
cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el eluyente puro y el mismo
eluyente llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta
acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador
gráfico ó integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
7.1 Clasificación de los detectores
Detectores según su Grado de Selectividad.
Universales. Responde a la mayoría de los solutos que pasan por él.
Específicos ó Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un
mínimo de respuesta a otras.
Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificación, obviamente, es en referencia a si la
muestra es destruida o no.
Detectores según su Modo de Respuesta:
Dependientes del Flujo Másico. Producen una señal que es proporcional a la cantidad de soluto
que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas
portador requerido para la elución.
Dependiente de la Concentración. Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por unidad
de volumen de gas portador que pasa a través de él.
Detectores según el proceso de detección Ionización, Óptico-espectroscópico, Electroquímico,
etc.
7.2 Características de los Detectores
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal
eléctrica medible.
Capítulo 7 93

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del detector es
el que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la
curva de linealidad:
Límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección y, límite Superior,
definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un
5% de desviación.
Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de
conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinación de la cantidad
mínima detectable y el límite inferior del rango lineal.
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir
una señal que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector
está operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal es muy importante, ya que
permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
7.3 Detectores en Cromatografía de Gases
Detector de Conductividad Térmica (DCT). Mide la conductividad térmica del gas portador,
ocasionada por la presencia de substancias eluídas.
El funcionamiento del DCT esta basado en el hecho que la velocidad de pérdida de calor de un
cuerpo caliente para un cuerpo más frío es proporcional, entre otros factores, a la conductividad térmica
del gás que separa estos cuerpos. Un filamento metálico muy delgado (de W, Au o aleación W-Re) es
calentado por el pasaje de una corriente eléctrica constante. Este filamento está colocado dentro de un
orificio en un bloque metálico (celda), calentado a una temperatura más baja que aquella del filamento,
por donde el gas de arrastre proveniente de la columna pasa continuamente (Fig.1). Mientras pasa gas
de arrastre puro por la celda, la proporción de pérdida de calor del filamento para el bloque es constante
y la temperatura del filamento no varía. Cuando un componente es eluido de la columna, este sale
mezclado con el gas de arrastre y pasa por el detector. Si la conductividad de esta mezcla es diferente de
aquella del gas de arrastre puro, el filamento pasa a perder calor para el bloque en una proporción
diferente de aquella del equilibrio. Por ejemplo, si la proporción de pérdida de calor disminuye, el
filamento se calienta cuando la muestra es eluida. El calentamiento del filamento causa una variación en
Capítulo 7 94

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
su resistencia eléctrica y la resistividad de un metal aumenta con la temperatura. El filamento es
montado en un circuito puente de Wheatstone, que transforma la variación en resistencia eléctrica del
filamento en una variación de voltaje, que es colectada en un registrador generando el cromatograma.
Figura 1. Celda de un detector de conductividad térmica.
El DCT es un detector universal, sensible a la concentración del soluto en el gas de arrastre.
Generalmente, cuando se usa DCT, el gas de arrastre es He o H2. Por el hecho de que estos gases tienen
conductividades térmicas altas, las mezclas gas de arrastre más soluto siempre tendrán conductividades
térmicas menores que la del gas de arrastre puro, lo que impede señales negativas, además de
obtenerse factores de respuesta más grandes. Sin embargo, es considerado un detector poco sensible.
La CMD de un modelo moderno, para propano, es de 400 pg/ml de gas de arrastre, con un rango lineal
de 10 6 . A pesar de eso, el hecho de ser universal, barato y de funcionamiento simple, lo hace
extremamente útil para análisis que no necesitan de alta sensibilidad.
Detector de Ionización a la Llama. Basado en la medida de las variaciones de la corriente de
ionización en una llama oxígeno-hidrógeno debido a la presencia de substancias eluídas.
Básicamente es un quemador de hidrógeno/oxígeno, donde se mezcla el efluente de la columna
(gas portador y analito) con hidrógeno. Inmediatamente, este gas mezclado se enciende mediante una
chispa eléctrica, produciéndose una llama de alta temperatura. La mayoría de compuestos orgánicos al
someterse a altas temperaturas pirolizan y se producen iones y electrones, que son conductores
eléctricos. Este hecho se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial de unos centenares de
voltios entre la parte inferior del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. La
corriente generada es baja (del orden de los 10 -12 A), por lo tanto debe ser amplificada mediante un
amplificador de alta impedancia (Fig. 2).
El proceso de ionización que se da en la llama es complejo, pero se puede aproximar el número
de iones producidos al número de átomos de carbono transformados en la llama. Esto produce que sea
Capítulo 7 95

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
un detector sensible a la masa (al número de átomos de carbono que salen de la columna) más que a la
concentración, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida.
Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo,
alcohol, halógeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y óxidos
de nitrógeno. Este hecho, más que limitar el ámbito de aplicación de este detector, permite el análisis de
muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados.
Ventajas:
♠ Alta sensibilidad, del orden de 10 -13 g/s.
Fig. 2. Detector de ionización de llama.
♠ Amplio intervalo lineal de respuesta, 10 7 unidades.
♠ Bajo ruido de fondo (elevada relación señal/ruido).
♠ Bajo mantenimiento, fácil de fabricar.
Desventajas:
♠ Destruye la muestra (la piroliza).
Detector de Captura Electrónica. Basado en la electronegatividad de las substancias eluídas, y su
habilidad para formar iones negativos por captura de electrones.
El detector de captura electrónica es sensible en particular a las moléculas que contienen
halógeno, carbonilos conjugados, nitrilos, nitrocompuestos y compuestos organometálicos, pero es
relativamente insensible a los hidrocarburos, alcoholes y cetonas. El gas portador o el complementario
tiene que ser o N2 o Ar con un 5% de metano. La humedad disminuye la sensibilidad. El gas que entra en
Capítulo 7 96

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
el detector se ioniza por electrones de gran energía ("rayos beta") emitidos por una lámina que contiene
63 Ni radiactivo. Los electrones así formados son atrapados por un ánodo, produciendo una pequeña
corriente continua. Cuando llegan moléculas de analito de gran electroafinidad captan algunos
electrones. El detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el ánodo y el
cátodo para mantener constante la corriente. Cuando estos compuestos se difunden a la estratosfera,
catalizan la descomposición de las moléculas de ozono
Detector de Fotometría a la Llama. Basada en la medida de la intensidad de la emisión
molecular de la fluorescencia de heteroátomos en las moléculas orgánicas.
La fotometría de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biológica,
debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de átomo
de sodio libre en fase gaseosa. Debe producirse la activación de ese átomo pasando el electrón de
valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energía,
se trata de cuantificar la intensidad de la energía emitida por los electrones al volver a su nivel
fundamental.
Necesitamos: Fuente de radiación, monocromador, detector.
La fuente de radiación que provoca la activación de los átomos es una llama. El monocromador
será en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de
resolución. Los detectores podrán ser células fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades
relativamente altas.
Detector de Ionización de Llama Alcalina. El detector de nitrógeno fósforo, también llamado detector de
llama alcalina, es un detector de ionización de llama modificado, que es especialmente sensible a
compuestos que contienen nitrógeno y fósforo (pero que, en general, responde también a
hidrocarburos.) En particular, tiene interés en análisis de medicamentos, pesticidas y herbicidas.
Cuando estos elementos se ponen en contacto con una bola de vidrio, que contienen Rb2SO4 y
que está en la punta de un mechero, producen iones que crean una corriente que se puede medir. Desde
luego, no se puede usar N2 como gas portador, si se analizan muestras que contienen nitrógeno.
Otros detectores de cromatografía de gases:
Fotómetro de llama: ciertos elementos muy concretos, como P, S, Sn, Pb.
De fotoionización: compuestos aromáticos e insaturados.
De quimiluminiscencia de azufre: S
Capítulo 7 97

De quimiluminiscencia
De nitrógeno: N
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
De emisión atómica: la mayoría de los elementos (seleccionados individualmente). Espectrómetro de
masas: la mayoría de los analitos
Espectrómetro de infrarrojos: la mayoría de los analitos
Un detector fotométrico de llama mide la emisión óptica procedente del fósforo, azufre, plomo,
estaño, y algún otro elemento concreto. Cuando el eluato pasa por una llama de H2-aire, análoga a la de
un detector de ionización de llama, los átomos excitados emiten luz característica. Las emisiones del
fósforo a 536 nm y del azufre a 394 nm se pueden aislar con un filtro interferencial de banda estrecha y
detectar con un tubo fotomultiplicador.
El detector de fotoionización utiliza una fuente ultravioleta de vacío para ionizar compuestos
aromáticos y no saturados, pero apenas responde a hidrocarburos saturados. Recoge y mide los
electrones producidos por ionización de estos compuestos.
Un detector de quimiluminiscencia de azufre recoge los productos que salen de un detector de
ionización de llama, entre los que se puede encontrar SO producido por oxidación de azufre, y lo mezcla
con ozono, formándose SO2 en estado excitado, que emite luz azul y radiación ultravioleta. La intensidad
de emisión es proporcional a la cantidad de azufre eluido, independientemente del compuesto de que
procede, con una sensibilidad 107 veces mayor que la que tiene frente al carbono.
Un detector de quimiluminiscencia de nitrógeno funciona de forma semejante. El eluato se
quema a 1800 ºC, para transformar el nitrógeno en NO, que al reaccionar con el O3, produce un
producto quimiluminiscente. Así mismo, la sensibilidad frente al nitrógeno es 10 7 veces mayor que frente
al carbono.
Un detector de emisión atómica conduce el eluato a un plasma de helio generado en una
cavidad de microondas. Todos los elementos de la Tabla Periódica producen emisión atómica
característica que se puede detectar con un policromador de fila de fotodiodos. Se puede sintonizar el
detector para observar casi cualquier elemento presente en el analito que emerge de la columna. Por
ejemplo, observando la emisión del selenio se pueden identificar trazas de compuestos de selenio, que
dan el característico olor a ajos. El contenido total de selenio de ajos naturales es sólo de 0,28 μg de
selenio por gramo de ajos.
Capítulo 7 98

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
7.4 Detectores en Cromatografía de Líquidos
Los tipos de detectores en cromatografía de líquidos se clasifican en:
Detectores basados en una propiedad de la fase móvil.
Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar.
Los detectores más utilizados en cromatografía de líquidos son:
Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija
Detector de Longitud de Onda Variable
Detector de Arreglo de Diodos
El detector más común en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la
que se muestra en la figura 3, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas más
simples utilizan la intensa raya de emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio. Los instrumentos más
versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o volframio, y un monocromador, con el que se puede
elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
El sistema de la figura 4 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier
soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa
desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala más sensible, una absorbancia de 0,0005, daría
una señal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre más de
cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que
se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta están indicados para elución gradiente, y para
disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo.
Detector de Índice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente
existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexión
Tipo Fresnel
Capítulo 7 99

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Fig. 3. Camino óptico de una microcelda de un detector espectrofotométrico. Una celda ordinaria contiene un
camino óptico de 0,5 cm y contiene sólo 8μl de líquido.
Fig. 4. Detector ultravioleta de fila de diodos para HPLC.
Un detector de índice de refracción responde a casi cualquier soluto, pero su límite de detección es
aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de
deflexión, que se muestra en la figura 5, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 μl: a través de
uno pasa disolvente puro, y a través del otro eluato. Para eliminar la radiación infrarroja (que calentaría
la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a través de la celda, con disolvente puro en los
dos compartimientos, y se dirige a la fotocélula mediante la placa de deflexión. Cuando entra en la celda
soluto de diferente índice de refracción, el haz se desvía, y varía la señal dada por la fotocélula.
Los detectores de índice de refracción no sirven en elución gradiente, porque es imposible ajustar
exactamente la muestra y la referencia mientras varía la composición del disolvente. Los detectores de í-
ndice de refracción son sensibles a las variaciones de presión y temperatura (~0,01 °C). Debido a su baja
sensibilidad, los detectores de índice de refracción no sirven en análisis de trazas. Tienen intervalos
Capítulo 7 100

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
pequeños de linealidad, que se extiende sólo en un factor de 500 de concentración de soluto. La
principal ventaja de este detector es que es casi universal, respondiendo a todos los solutos, incluso a
aquellos que no absorben en el ultravioleta.
Fig. 5. detector de índice de refracción de tipo de deflexión.
Detector de dispersión de luz. Responde a todos los solutos que son claramente menos volátiles
que la fase móvil.
Como se ve en la figura 6, el eluato entra en este detector por la parte superior. En el
nebulizador, el eluato se mezcla con nitrógeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma
una fina dispersión de gotitas. El disolvente se evapora en un tubo caliente que se le hace recorrer,
dejando una nube de finas partículas sólidas, que entran en la zona de detección por la parte inferior. Las
partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser y llega al fotodiodo por dispersión.
El detector de dispersión de luz responde a la masa del analito, no a su estructura o peso
molecular. Si se observa un pico grande y uno pequeño, se puede estar seguro de que el pico pequeño
corresponde a menos cantidad que el pico grande. Con un detector de ultravioleta, una pequeña
cantidad de un analito que absorbe mucho da una señal más intensa que una cantidad grande de un
analito que absorbe poco. La respuesta de un detector de dispersión de luz no es lineal, de modo que
frecuentemente se recurre a polinomios para construir la curva de calibrado.
El detector de dispersión de luz es compatible con una elución gradiente. Además, no hay picos
asociados con el frente del disolvente, y así no se dan interferencias con los picos que se eluyen al
principio.
Capítulo 7 101

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Si se usa un tampón en el eluyente, debe ser volátil, o de lo contrario se evaporara formando
partículas sólidas, que dispersaran la luz y no dejaran discernir la señal del analito. Se pueden usar
tampones de baja concentración a partir de ácido acético, fórmico o trifluoroacético, acetato de amonio,
fosfato de diamonio, amoníaco o trietilamina.
Fig. 6 Funcionamiento de un detector de dispersión de luz.
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan
fluorescencia nativa o inducida.
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitación. Semejantes a los detectores de absorbancia. Son altamente sensitivos
Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperométrico, Detector
Conductimétrico y Detector Potenciométrico
Se basan en métodos electroquímicos (amperometría, voltamperometría, conductimetría y
coulombimetría). Elevada sensitividad. El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos
redox. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis
reproducibles:
integrador.
Checar que estén conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador-
Usar bombas reciprocantes de doble pistón
Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Capítulo 7 102

Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la
necesidad de reacondicionar los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solución 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de
referencia en la celda 1 ó 2 veces a la semana.
Desconectar el detector electroquímico cuando este limpiando las columnas.
Utilizar agua, buffer y solventes orgánicos de alta pureza.
Comparación de detectores comerciales usados en HPLC:
Detector límite de detección aproximado a (ng) ¿útil en elución gradiente?
De ultravioleta 0,1-1 Sí
De índice de refracción 100-1000 No
De dispersión de luz 0,1-1 Sí
Electroquímico 0,01-1 No
De fluorescencia 0,001-0,01 Sí
De conductividad 0,5-1 No
De espectrometría de masas 0,1-I Sí
De infrarrojos con transformada de Fourier 1000 Sí
7.5 Bibliografía
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm#detectores
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm
http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/edpct(_4/edpct(_4.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Detector_de_ionizaci%C3%B3n_de_llama
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-
instr14/harris/c24b.html
http://www.elergonomista.com/tecnicas/fotometria.htm
http://webservmida.mida.gob.pa/CYTED/CYTED%20PDF/tallerhomonologacionpma/anexos/CROMATOG
RAFIA%20LIQUIDA%20HPLC.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/harris/c25b.html
http://www.pucpr.edu/titulov/Q420/examen%203/Cap%2028.pdf
Capítulo 7 103

Capítulo 8
Procesamiento de datos cromatográficos
Procesamiento de datos cromatográficos
Cromatogramas
Es la Representación de la respuesta o señal del sistema de detección continuo (CLAR o CG) o discontinuo
en función del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho Cromatográfico. El cromatograma puede
tomar varias diversas formas: un registro en la carta de un registrador o plotter, una mancha en cromatografía
plana, o un número determinado de datos tomados por un microcomputador después de la correspondiente
transformación. Según el tipo de detector continuo, el cromatograma puede ser diferencial, cuando la señal
solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la señal se acumula (Figura 1).
Figura 1. Tipos de Cromatogramas: (1) Diferencial, (2) Integral.
El cromatograma contiene la información analítica relativa a la muestra (complejidad: número de picos,
detección cualitativa y/o cuantitativa de uno o varios componentes) o del funcionamiento del sistema
cromatografico. Los parámetros que definen el comportamiento cromatográfico de un soluto en un sistema
cromatográfico de elución, y que sirve de base para los cálculos analíticos, que a continuación se comentaran.
Para ello se usará el esquema de la Figura 2.
Capítulo 8 104

Procesamiento de datos cromatográficos
Figura 2. Parámetros que definen un cromatograma.
Los aspectos termodinámicos y cinéticos de la separación cromatográfica quedan reflejados en el
cromatograma, es decir, en la situación y forma del pico.
Ajuste de datos
El software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el
correcto funcionamiento del algoritmo de integración. Con tal finalidad, se probaron distintos métodos
optándose finalmente por splines de segundo orden con derivada primera continua. Este método permitió una
mejor identificación del comienzo de pico y de los máximos, aún en condiciones de alto ruido.
En la Figura 4 se muestra en detalle un trozo de cromatograma, en el que puede observarse la curva continua del
ajuste y los datos con el ruido de la señal.
Integración de los picos
El algoritmo de integración del cromatograma es capaz de distinguir diferentes casos de picos
cromatográficos en los cuales la línea de base se fija de distinta manera.
Para ello se tiene en cuenta el valor de la señal, su derivada (D1) y su derivada segunda (D2).
Picos simples: Se considera detectado el comienzo del pico cuando la derivada primera de la señal supera un
valor prefijado (D1 > Ls) punto 2 de la Figura 5.
Cuando la derivada pasa por cero siendo la derivada segunda negativa, se detecta el máximo (D1=0, D2Li) Punto 4 de la Figura 5.
Los valores de Ls y Li pueden ser variables a lo largo del cromatograma, lo cual permite compensar el efecto de
ensanchamiento de los picos.
El tiempo de retención que identifica al componente es aquel en el cual ocurre el máximo, punto 3 de la Figura
5.
Capítulo 8 105

Procesamiento de datos cromatográficos
La línea de base es una recta que une los puntos 2 y 4, Figura 5.
Para calcular el área se resta el área bajo la línea de base del área bajo la curva de la señal.
Figura 5 Principio para la detección de los picos.
Picos superpuestos: En el caso de dos o más picos fusionados o superpuestos se traza una línea de base
entre el comienzo del primero y el fin del último. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles
hasta la línea de base común y en base a esta división se asignan las áreas.
Figura 6 Detección de picos superpuestos
Picos tangentes: Los picos pequeños montados sobre uno mucho mayor se denominan tangentes y su
línea de base se traza de manera especial. Para detectarlo un criterio común es comparar alturas con la misma
diferencia medida en el pico anterior, si este valor cae por debajo de un límite prefijado, el pico será
considerado tangente.
Colección y procesamiento de datos
Figura 7 Ejemplo de pico tangente
Capítulo 8 106

Procesamiento de datos cromatográficos
El procesamiento de datos en cromatografía incluye tres objetivos:
colectar y procesar la señal proveniente del detector de modo de producir un cromatograma y la
información correspondiente como área de los picos, tiempos de retención y ancho de picos
colectar y analizar los datos de modo de obtener información cualitativa y cuantitativa y generar los
reportes correspondientes
optimizar los parámetros cromatográficos.
Detección
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una
señal elaborable y ofrece información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. Es la parte del
cromatógrafo que se encarga de determinar cuándo ha salido el analito por el final de la columna.
En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre la muestra a analizar y la
sustancia portadora llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna,
esta acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador
gráfico ó integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
*Detectores según su Grado de Selectividad :
*Detectores según el proceso de detección Ionización, Óptico-espectroscópico, Electroquímico, etc.
*Detectores según su Modo de Respuesta:
Características de los Detectores
medible.
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal eléctrica
o Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del detector es el
que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable.
Rango Dinámico Lineal: Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de conocer el
nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinación de la cantidad mínima detectable
y el límite inferior del rango lineal.
Capítulo 8 107

Procesamiento de datos cromatográficos
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal
que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está
operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro de la
cromatografía en la forma de un cromatograma. La señal del detector debe ser proporcional a la cantidad de
cada soluto (analito). Con lo cual debe ser posible realizar un análisis cuantitativo.
Registro e integración
La señal proveniente del detector, se transmite a un sistema de registro e integración, el cual genera un
cromatograma que representa un registro del análisis. Los datos obtenidos son procesados mediante un
registrador e integrador sin ninguna o muy poca capacidad de procesamiento, o a través de sistemas
computarizados que incluyen un procesamiento posterior (post-run analysis) mas sofisticado y completo
mediante el empleo de un software apropiado. En la mayor parte de los casos, el sistema integra
automáticamente el área de cada pico, realiza los cálculos e imprime un reporte con los resultados
cuantitativos y los tiempos de retención.
Cálculo de área del pico (análisis cuantitativo)
La cromatografía tuvo un gran crecimiento durante las anteriores cuatro décadas, en parte a que se trata
de una técnica rápida, sencilla, de bajo costo y esencialmente a su gran aplicación como herramienta de
separación. No obstante su gran éxito se debe sin duda a que también proporciona información cualitativa
acerca de las especies separadas. La cromatografía en columna cuantitativa tiene como principio la
comparación de las alturas, o de las áreas del pico del analito con la de uno o más patrones, en la
cromatografía en plano el área ocupada por las especies separadas sirve como parámetro analítico, si las
condiciones son controladas adecuadamente esos parámetros varían linealmente con la concentración, es
decir, que el área del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentración del analito, así es
fundamental para la confiabilidad del análisis que el área de los picos sea medida lo más exacto y
reproduciblemente posible.
Los instrumentos cromatográficos modernos estas equipados con integradores electrónicos digitales, los
cuales permiten una precisa estimación de las áreas de los picos, si no se dispone de tales equipos tienen que
hacerse una estimación manual. Existen varias maneras de medir el área de los picos cromatográficos. Una de
Capítulo 8 108

Procesamiento de datos cromatográficos
esta técnicas consiste en suponer que el pico se asemeja a un triangulo isósceles, para lo cual se mide la altura
del pico (h) y el ancho de la base del pico (Wb) o ya sea la mitad de la altura (Wh) y se calcula el área del pico
empleando la formula usada para el calculo del área de un triangulo.

Procesamiento de datos cromatográficos
el costo del computador con los accesorio necesarios para hacer el análisis es por lo general inferior al de un
buen integrador, además con el computador se obtiene resultados más confiables.
Desarrollo y optimización de métodos
Cromatografía de gases (rampas de temperatura)
El control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y más efectivas de
influenciar la separación de los componentes. La columna se fija entre un inyector mantenido a una
temperatura de inyección, y un detector mantenido a una temperatura también predeterminada. Por lo tanto,
se debe definir la temperatura a la que cada uno de los componentes opera.
En general, caben dos posibilidades de modificación de las condiciones de trabajo cromatográficas. En
cromatografía gaseosa, la temperatura debe ser mantenida por encima del “punto de rocío” de la muestra,
pero no por encima de su punto de ebullición.
(a) Modalidad Isocrática, en la que las condiciones
experimentales permanecen constantes durante el proceso
cromatográfico.
(b) Modalidad no Isocrática, en la que durante el proceso
de separación cromatográfica se varia de manera gradual y
estrictamente controlada el parámetro de temperatura.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los
diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura
depende del punto de ebullición del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente
superior a él.
Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de
temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el
ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable
utilizar temperaturas bajas para la elución, pero conforme la temperatura es mayor la elución es más rápida,
pero corriendo el riesgo de descomponer el analito. Por ejemplo:
Si al meter a eluir una muestra nos salen cuatro analitos con tiempos muy diferentes de elución la
temperatura adecuada para que eluyan todos se calcula con la rampa de temperatura:
Capítulo 8 110

Procesamiento de datos cromatográficos
Se toman los primeros 5 minutos como 60 °C y a partir de
estos 5 minutos cada minuto adicional se le aumenta 10°C, por
ello observamos en el primer pico 80°C, ya que los primeros 5
minutos se toman como 60° más 2 minutos se le suman 10°C esto
es precisamente 80°C y así, se trabaja con los siguientes picos,
tomando en cuenta la escala de temperatura.
HPLC (Cambios en la fase móvil.)
Esto es muy importante ya que si en nuestra muestra solo se
vieran dos picos uno en 11 minutos y otro en 20 la temperatura e
elución correcta seria una que estuviera entre estos dos puntos, con
lo que se correría muy bien la muestra y no tendríamos que esperar
mucho entre a y otra.
El proceso de elución en cromatografía de adsorción, el disolvente compite con las moléculas de soluto
por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para
eluir un determinado soluto del adsorbente es independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la
elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
La fuerza eluyente (ε 0 ) es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor de
cero para el sistema pentano/ sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
Capítulo 8 111

Procesamiento de datos cromatográficos
respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente , tanto
más rápidamente se eluirán los solutos de la columna.
La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se
caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene
fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza por que la fase
estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene
mayor fuerza eluyente.
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una
elución en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de aumento
de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del
disolvente.
En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo así
un gradiente continuo el análisis utilizando el método de elución por gradiente permite mantener una
resolución deseada y al mismo tiempo disminuir la duración del análisis.
Por ejemplo en la figura 15 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente de la elución isocrática de
ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separación con fase inversa , la fuerza eluyente
disminuye a medida que el disolvente se hace más polar . El primer cromatograma (superior izquierda) se
obtuvo con un disolvente que tenía 90% de acetonitrilo y 10% de tampón acuoso. El acetonitrilo tiene una gran
fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rápidamente. Se observan sólo 4 picos por que los demás están
solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgánico. El primer
cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con
80% de B, se consigue una separación un poco mejor, observándose 5 picos. Con 60% de B, se empiezan a ver 6
picos. Con 40% de B se ven claramente 8 picos. Con 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la
separación tarda demasiado (cerca de 2 horas).
A partir de los datos obtenidos con las elusiones isocráticas de figura 13, se eligió el gradiente que se
presenta en la figura 25.11, con el que se consiguió resolver todos los picos en 38min. Primero se trabajo con
30% de B (B=acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1,2,3. A continuación se fue
aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se
mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente se modifico el disolvente hasta alcanzar un
80% de B en 2 minutos, manteniéndose esa composición para eluir los últimos picos.
Capítulo 8 112

Procesamiento de datos cromatográficos
Figura 15. Separación isocrática en HPLC de una mezcla de compuestos aromáticos en una columna Hypersil ODS (C18
sobre sílice de 5μm), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( ˜22°C). (1) alcohol bencílico, (2) fenol,
(3)3¨,4¨-dimetoxiacetofenona, (4) benzoína, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) ometixibifenilo.El
eluyente estaba formado por un tampón acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El
tampón contenía KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografía es utilizada para análisis del principio activo de un producto farmacéutico, por ejemplo
la determinación de cafeína y ácido acetilsalicílico en cafiaspirina , los siguientes datos fueron obtenidos para
determinar la cantidad de cafeína y ácido acetilsalicílico contenidos una tableta de cafiaspirina . En este caso
se realizo el análisis en HPLC
Para tal análisis se tomo como estándar las siguientes concentraciones de cafeína y ácido acetilsalicílico:
Ccafeína = 0.03mg/mL CAAS = 0.53mg/mL
Se realizo el análisis y se obtuvieron los siguientes resultados.
Cromatograma de la inyección número 1 del estándar Cromatograma de la inyección número 3 del estándar
Capítulo 8 113

Procesamiento de datos cromatográficos
Cromatograma de la inyección número 4 del estándar Cromatograma de la inyección número 5 del estándar
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente
ecuación A=FrC.
Fr cafeína = 177018.4 / 0.03 = 5900613.33
Fr AAS = 751481.4 / 0.53 = 1417889.43
Análisis de la tableta de CAFIASPIRINA
Posteriormente se analizo la tableta de Cafiaspirina
Cafeína Ácido Acetilsalicílico
Núm. Inyección Área Núm. Inyección Área
1 149019 1 615352
2 187639 2 784811
3 162884 3 684670
4 201409 4 874595
5 184141 5 797979
Ã=177018.4 Ã=751481.4
(lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
Capítulo 8 114

Procesamiento de datos cromatográficos
Cromatograma de la inyección #1 de la muestra problema Cromatograma de la inyección #2 de la muestra problema
Cromatograma de la inyección # 3 de la muestra problema
Cafeína Ácido Acetilsalicílico
Núm. Inyección Área Núm. Inyección Área
1 177343 1 678496
2 178856 2 717425
3 182458 3 723643
Ã= 179552.3 Ã= 706521.3
Con los datos de las áreas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de
cafeína y ácido acetilsalicílico en cada tableta.
Capítulo 8 115

C cafeína = 179552.3 / 5900613.33 = 0.0304
0.0304 * 10/ 1 * 100 = 30.4 mg
Procesamiento de datos cromatográficos
Cada tableta de cafiaspirina contiene 30.4 mg de cafeína
CAAS = 706521.3 / 1417889.43 = 0.4983
0.4983 * 10 / 1 * 100 = 498.3 mg
Cada tableta de cafiaspirina contiene 498.3 mg de ácido acetilsalicílico
Determinación del grado alcohólico de una bebida
Conocer el contenido de etanol en muestras analizadas a partir del método del estándar interno. Se
analiza el tequila comercial “Herradura”, EtOH 40%
Se trabajo a 70°C y se realizaron corridas a diferentes concentraciones de EtOH (2, 4, 6, 8, 10%v/v) y una
concentración constante de Acetona (6%v/v; estándar interno. Para la curva patrón, las diferentes disoluciones
se realizaron a partir de una solución Stock de EtOH al 20%.
En los cromatogramas aparecen 2 picos con 2 áreas diferentes. El primer pico y área corresponde a la
acetona, ya que es el compuesto menos polar. El segundo correspondo al del EtOH. Los valores de área para la
curva patrón:
Área [Acet] [Acetona](%) Área [EtOH] [EtOH](%)
752578 6 225296 2
394769 6 125961 2
175540 6 57133 2
Promedio 440962.3333 136130
270166 6 198196 4
251991 6 183560 4
168917 6 142527 4
Promedio 230358 174761
183014 6 207592 6
177426 6 219475 6
Capítulo 8 116

Procesamiento de datos cromatográficos
234651 6 282560 6
Promedio 198363.6667 236542.3333
276769 6 382117 8
145605 6 228924 8
Promedio 211187 305520.5
178488 6 341568 10
168642 6 350407 10
266046 6 486201 10
Promedio 204392 392725.3333
Ae/Aei
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Curva Patrón - Estándar Interno
y = 1.2536x - 0.075
R 2 0 0.5 1 1.5 2
Ce/Cei
= 0.9868
Frr=1.2536 Ae/Aei=Frr*(Ce/Ci)
Tequila "Herradura" (EtOH 40%)
Capítulo 8 117
E.I.
Área [Acet] [Acet] (%) Área [EtOH] R=[EtOH] (%)
250005 6 300125 5.789146394
213666 6 288804 6.518217346
Promedio 231835.5 294464.5 6.125112357

Procesamiento de datos cromatográficos
Los resultados obtenidos en la tabla se obtuvieron con cálculos de regresión lineal, de la misma manera
que se realizaron para la muestra del destilado.
Tomando en cuenta el factor de dilución utilizado se encontrará la concentración (%v/v) del etanol en la
muestra de Tequila.
Para hacer la dilución de la muestra se tomaron 1.5ml del tequila, y se aforaron a 10ml para llevarlo a
una concentración del 6% (equivalente a la de la acetona, el estándar interno).
10ml
E.I.: 6. 12511
30.
6255%
2ml
Según la información del producto, este indicaba que el porcentaje de etanol que contenía es del 40%. El
estudio cromatográfico, encontró una concentración del 30%. El estudio de la muestra a través del estándar
interno, disminuye el error caudado por la inyección es por ello que el resultado es confiable. La cromatografía
tiene una gran aplicación una de ellos es la determinación del grado alcohólico de una muestra para comparar
con el porcentaje reportado por el fabricante.
Capítulo 8 118

RESUMEN
Procesamiento de datos cromatográficos
Los cromatogramas. son la representación de la respuesta o señal del sistema de detección
continuo (CLAR o CG) o discontinuo en función del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho
cromatográfico. Contiene la información analítica relativa a la muestra (complejidad: número de picos,
detección cualitativa y/o cuantitativa de uno o varios componentes) o del funcionamiento del sistema
cromatográfico.
Los aspectos termodinámicos y cinéticos de la separación cromatográfica quedan reflejados en el
cromatograma, es decir, en la situación y forma del pico.
La colección y procesamiento de datos así como su análisis se realiza con el fin de obtener
información cualitativa y cuantitativa y generar los reportes correspondientes, obteniéndose los datos a
partir de un detector; éste es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible
directamente, en una señal elaborable que ofrece información sobre la naturaleza y magnitud de la
propiedad física. La señal proveniente del detector se transmite a un sistema de registro e integración,
el cual genera un cromatograma. Los datos obtenidos son procesados mediante un registrador e
integrador.
La cromatografía en columna cuantitativa tiene como principio la comparación de las alturas, o de
las áreas del pico del analito con la de uno o más patrones, en la cromatografía en plano el área ocupada
por las especies separadas sirve como parámetro analítico, el área del pico cromatografico es
directamente proporcional a la concentración del analito, por lo cual es fundamental para la
confiabilidad del análisis que el área de los picos sea medida lo más exacto y reproduciblemente posible.
Existiendo así varias maneras manuales de medir el área de los picos cromatográficos; sin embargo, son
los instrumentos cromatográficos modernos equipados con integradores electrónicos digitales son los
más precisos y rápidos que cualquier método manual para determinar el área del pico cromatografico.
Se ha logrado un desarrollo y optimización de métodos a través de ciertas modificaciones en las
condiciones de trabajo tales como las rampas de temperatura utilizadas en cromatografía de gases en
donde el control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y más efectivas de
influenciar la separación de los componentes.
En general, caben dos posibilidades de modificación de las condiciones de trabajo cromatográficas.
La modalidad Isocrática, en la que las condiciones experimentales permanecen constantes durante el
proceso cromatográfico y la modalidad no Isocrática, en la que durante el proceso de separación
cromatográfica se varia de manera gradual y estrictamente controlada el parámetro de temperatura.
Capítulo 8 119

Procesamiento de datos cromatográficos
Otra modificación en el caso de cromatografía de líquidos de alta eficiencia es cambios de
composición de la fase móvil. En donde sí un disolvente no permite una elución suficientemente rápida
de todos los componentes, se usa una elución en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la
composición del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente
retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del disolvente con el fin de producir análisis manteniendo
una resolución deseada y al mismo tiempo disminuir la duración de éste.
La cromatografía es utilizada para análisis del principio activo de un producto farmacéutico, Otra
de las aplicaciones de la cromatografía en este caso la de líquidos, es la determinación del grado
alcohólico de una bebida. Entre muchas otras más.
BIBLIOGRAFÍA
España, 1990, pp778
M. Valcárcel Cases, A. Gómez Hens, Técnicas analíticas de separación, Editorial Reverte,
Lucas Hernández Hernández, Claudio González Pérez, Introducción al análisis
instrumental,1ª Edición, Editorial Ariel S.A, Barcelona, 2002. pp 456
Douglas A. Skoog, F. James Holler, Principios de Análisis Instrumental, Quinta Edición,
Editorial Mc. Graw Hill, España 2001, pp 753
Reverte, España 2001.
Daniel C. Harris, Análisis Químico Cuantitativo, Segunda Edición en Español, Editorial
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
Capítulo 8 120

Procesamiento de datos cromatográficos
Determinación de Azúcares por CGL a través del método de derivados TMS
Este método se recomienda para la identificación y cuantificación de los monosacáridos y
disacáridos presentes en diversos alimentos frescos o industrializados, después de la correspondiente
derivatización de éstos para su análisis por CGL con detector FID.
Fundamento del Método. Se basa en la obtención de derivados de trimetilsililados (TMS) de los
carbohidratos presentes en el alimento para su posterior análisis en CGL. La derivatización se realiza en 2
pasos: formación de la oxima del azúcar correspondiente con hidroxilamina clorhidrato en piridina y
silanización con hexamil disilazano (HMDS) y ácido trifluoroacético (TFA). La identificación se efectúa por
los tiempos de retención y la cuantificación por el método del estándar interno.
Procedimiento. Para productos lácteos (yogur o leche) se debe liofilizar una alícuota de
aproximadamente 100mg. Para vegetales frecos se extrae en baño de agua a 50ºC durante 1 hora con
etanol 70%. El extracto se rotovapora a sequedad en evaporador rotatorio de vacío a 50ºC como
máximo. Añadir a cada frasco de muestra 1 mL de solución de estándar interno (2mg/mL de m-inositol o
1mg de xilosa) antes de liofilizar.
Preparación Estándar. Pipetear 1mL de cada solución de estándares y estándar interno en etanol en un
matraz de fondo cónico y boca esmerilada. Llevar a sequedad en el evaporador rotatorio a una
temperatura no mayor de 40ºC.
Derivatización. Se agrega a cada frasco de muestra liofilizada y a la mezcla de estándares 1mL de
solución de hidroxilamina clorhidrato lavando cuidadosamente el recipiente. Se trasvasa hacia un tubo
de tapa rosca y se coloca durante media hora en baño de agua a 75-85ºC con agitación ocasional. Se
toman 100 µL de la solución de piridina de la muestra y se pasa a un vial ambar se añaden 150 µL de
HMDS y 1 gota de TFA, se deja reposar hasta la aparición de precipitado blanco.
Análisis por CGL
Condiciones operacionales
Flujo de gas acarreador (nitrógeno): 35mL /min.
Temperatura: Detector: 300ºC, Inyector: 250ºC, Horno (programado): 180ºC (2min) a 8ºC/min, hasta
250ºC.
Se inyectará 1 µL de la mezcla de estándares hasta obtener reproducibilidad en la respuesta del
equipo. Es decir que el factor de respuesta (km) debe de ser mínima la variación. Ajustar las demás
Capítulo 8 121

Procesamiento de datos cromatográficos
condiciones de operaciones de tal forma que el estándar de glucosa brinde una señal aproximadamente
igual a la mitad de la escala del registrador o el dispositivo de salida del cromatógrafo de gases.
Los azúcares se identifican por comparación con los tiempos de retención de cada estándar
correspondiente. La concentración se determina por el método de estándar interno utilizando las
fórmulas siguientes.
Para la inyección de la mezcla de estándares puros:
Donde:
Km = Factor de respuesta para el azúcar (ej glucosa)
AM = Área del pico del estándar correspondiente (ej. Glucosa)
Mi = Masa tomada del estándar interno utilizado (2mg para inositol o 1 mg para xilosa)
Ai = Área del pico estándar interno
MM = Masa tomada del estándar correspondiente (1mg de glucosa)
Se calculan tantos valores de km como azúcares se cuantifiquen.
Para la muestra el peso de cada azúcar se calcula por la siguiente fórmula:
Donde:
MM = peso del azúcar correspondiente en la muestra
AM = área del pico del azúcar en la muestra (mm)
Mi = masa del estándar interno añadido a las muestras (mg)
Ai = área del pico estándar interno añadido a las muestras (mm)
Km = valor promedio obtenidos mediante la fórmula (1) para el azúcar correspondiente.
Un cromatograma típico de la separación de algunos TMS derivados de azúcar se muestra en la figura1.
Capítulo 8 122
(1)
(2)

Procesamiento de datos cromatográficos
2. Se desea determinar el contenido de etanol en una bebida alcohólica. Para ello se realizó un
análisis cromatográfico utilizando una curva de calibración relativa.
Preparación de soluciones
Solución de estándar interno (EI). Solución de acetona 10%
Solución patrón (SP). Solución de etanol al 10%
Empleando estas soluciones se preparó la siguiente curva de calibración
Tabla 2.
Preparación de la muestra
SP (mL) EI (mL) Volumen final (mL)
0.1 1 10
0.5 1 10
1.0 1 10
1.5 1 10
2.0 1 10
De cada concentración de la curva se inyectó 1µL en el cromatógrafo.
Se tomaron 5 mL de licor, se adicionó 1mL de acetona (EI), se aforó a 10ml con agua. La muestra se
inyectó en el cromatógrafo 5 veces (1µL).
Tr acetona = 0.79min y tr etanol = 1.38min
Capítulo 8 123

Condiciones cromatagráficas
Procesamiento de datos cromatográficos
Cromatógrafo de gases integrado con inyector split/splitless, detector de ionzación de flama y una
columna de sílice fundida SP 1000, fase polar (30m x0.32mm x 0.251µm).
Temperatura del inyector y detector 200ºC.
Programa de temperatura: temperatura inicial 80ºC / 1.3 min, incrementandose a 20ºC/min hasta
130ºC y mateniendose a esa temperatura durante 5 min.
Resultados
Curva estándar (n=3)
Tabla 3.
Área EtOH Àrea EI
Promedio 1 2 3 1 2 3 Promedio
29054.33 30556 25864 30743 290080 249370 287220 275556.6
123820 109170 123050 139240 214770 246810 266110 242563.3
243853.3 228380 247660 255520 241720 263180 261540 255480
360023.3 321700 371000 387370 220850 254990 265390 247076.6
468270 489390 481950 433470 261410 261700 247950 257020
Con respecto a estos resultados obtenidos se calculo el promedio de cada repetición.
Muestra (n=5)
Tabla 4.
Inyección Área de etanol Área acetona
1 296800 187150
2 290840 185900
3 287960 185880
4 285800 183680
5 291010 187180
Promedio 29.0482 186078
Capítulo 8 124

Procesamiento de datos cromatográficos
Tomando en cuenta los promedios de las áreas tanto de Etanol como del Estándar Interno (tabla 3.) así
como la relación entre éstas y de las concentraciones tanto de la solución patrón como la interna que se
muestran en la tabla 2. Se grafica y se obtiene la pendiente que en este caso es el Frr (factor de
respuesta relativo); en base a éste dato se puede determinar la concentración de etanol en la muestra.
Por lo tanto tenemos que:
m = Frr =0.9114
Y sabemos que:
Área de Etanol Área EI AEtOH / AEI [sp] /[EI]
29054.33 275556.6 0.1054 0.1
123820 242563.3 0.5105 0.5
243853.3 255480 0.9545 1
360023.3 247076.6 1.4571 1.5
468270 257020 1.822 2.0
Frr
A
A
EI
EI EtOH
Por lo tanto despejando y tomando en cuenta los promedios de la tabla 4. con las respectivas áreas de
la muestra tenemos que:
AEtOH / AEI
2
1.5
1
0.5
EtOH
Curva Patrón
Capítulo 8 125
EtOH
290,
4820.
1
0. 911186078
[EtOH] v/v = 0.1713 x 100
y = 0.9114x + 0.0403
R 2 = 0.9974
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[sp] /[EI]
0.
1713
= 17.13 % de Etanol por cada 100ml de bebida alcohólica en este caso licor.

Procesamiento de datos cromatográficos
Estudio sobre los ácidos grasos libres en queso blanco
Fundamento del método. Los ácidos grasos libres juegan un papel importante en el sabor de muchos
quesos y se producen por la hidrólisis de los triglicéridos de la grasa por las lipasas nativas de la leche, las
lipasas microbianas y las lipasas de las células somáticas. También se liberan durante el metabolismo de
los carbohidratos y aminoácidos por las bacterias.
Los ácidos grasos de bajo peso molecular son consecuencia de la fermentación bacteriana, mientras que
los ácidos grasos restantes son el resultado de la acción de la lipasa [1]. Se ha demostrado que los
ácidos grasos libres deben estar presentes dentro de un rango específico y a un nivel óptimo de
concentración para un sabor deseable. Cantidades excesivas de ácidos grasos libres se asocian con
rancidez hidrolítica y causan sabores desagradables.
Procedimiento. Los ácidos grasos libres (AGL) analizados fueron: butírico (C4), caproico (C6), caprílico
(C8), caprico (C10), laurico (C12), miristico (C14), palmitico (C16), estearico
(C18), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).
Extracción de los lípidos del queso. Se mezclaron 2 g de queso rayado con 6 g de sulfato de sodio
hidratado para absorber la humedad y 0,6 ml de ácido sulfúrico 2,5 mol/l. Se procedió a la extracción de
los lípidos con 6 ml de eter/heptano (1:1 v/v) en un tubo de centrífuga de 75 ml mediante centrifugación
a 2.500 rpm/min por 2 min. Esta extracción se repitió dos veces añadiendo la misma cantidad de
eter/heptano (1:1 v/v) al residuo. Los tres extractos se mezclaron.
Separación de los ácidos grasos libres. Se utilizó como estandar interno el ácido pelargónico (C9) (0,043
mg) el cual se adicionó al extracto lipídico antes de proceder al aislamiento de los ácidos grasos libres.
Para tal fin se utilizaron columnas aminopropílicas de 3 ml (Supelclean LC-NH2 de Supelco, Inc)
acondicionadas con 2 ml de heptano. El volumen total del extracto se aplicó a la columna con presión
positiva. Los lípidos neutros fueron eluídos con 3 ml de cloroformo/2-propanol 2:1 v/v. A continuación
los ácidos grasos libres adsorbidos en la columna fueron eluídos con 3 ml de dietil eter con 2% de ácido
fórmico. El primer ml se descartó por no contener ácidos grasos libres. De los siguientes 2 ml eluídos,
con la totalidad de los AGL, se inyectó 1 ml al cromatógrafo para su determinación. Se realizaron 2
extracciones de cada muestra de queso y cada extracción se inyectó por duplicado al cromatógrafo [2,3].
Las condiciones de operación en el cromatógrafo fueron:
Temperatura inicial 90ºC
Tiempo Inicial 1 min
Variación de temperatura 20ºC/min
Temperatura final 220ºC
Capítulo 8 126

Tiempo final 10 min
Temperatura del detector 250ºC
Temperatura del inyector 250ºC
Flujo de helio 20 ml/min
Cuantificación de los AGL.
Procesamiento de datos cromatográficos
Flujo de hidrógeno 30 ml/min
Flujo de aire 500 ml/min
Purga 1 min
Se utilizó un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 5890 equipado con un detector de ionización
de llama y una columna capilar de sílica de 15 m x 0,53 mm (Nukol de Supelco, Inc.) calibrado con
soluciones de referencia de los ácidos grasos a analizar (Sigma) [6]. Se adaptó inyección directa debido a
las bajas concentraciones de los ácidos grasos. La cuantificación se realizó relacionando las áreas de los
picos con el área del estándar interno (C9) mediante un integrador Hewlett Packard 3393A. Se obtuvo
la media y la desviación estandar de todos los AGL.
Resultados
molecular, entre los cuales resalta el butírico (C4).
La Tabla 1 y las Figuras 1 y 2 muestran la composición y los
cromatogramas de los ácidos grasos libres de los quesos
Palmita y Semiduro. Se ha podido comprobar la presencia
en los quesos de los AGL saturados del butírico (C4) al
palmítico (C18), así como de los mono-insaturados y poli-
insaturados, el ácido oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en
concentraciones muy diversas entre 2.3 g/g (C6) en el
queso Palmita y 185.1 g/g (C18:1) en el queso Semiduro,
con el predominio de los de mayor peso molecular,
palmítico (C16) y oleico (C18:1), sobre los de menor peso
Capítulo 8 120

Procesamiento de datos cromatográficos
Se observan amplias variaciones entre las muestras, debido posiblemente a la influencia de las
diferentes condiciones del proceso de elaboración en la composición de los quesos, así como la
manipulación y almacenamiento durante el período de comercialización.
La columna utilizada proporcionó excelentes resultados sin la necesidad de derivatizar para
obtener los ésteres metílicos previo a su cuantificación. Al disminuir una etapa del análisis se evita una
posible fuente de error y se consigue un ahorro de tiempo.
Estudio de validación de la Metodología para la determinación de Vitamina A en
Alimentos infantiles instantáneos por HPLC
Fundamento. Los alimentos infantiles instantáneos, en su gran mayoría, son fortificados normalmente
utilizando formulaciones especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria
recomendada de 400-700 g de vitamina A, para niños de 1-10 años de edad 3.
En ese sentido, y buscando una óptima metodología de análisis, en el presente estudio se realizó la
validación de la metodología por HPLC para la determinación de vitamina A contenida en alimentos
infantiles instantáneos.
Procedimiento. Se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), marca
Shimadzu, modelo LC10A, con inyector automático, bomba con sistema de degasificación, con
integrador o sistema de registro, software para el procesado de datos cromatográficos, detector de
arreglo de diodos (longitud de onda variable). La columna cromatográfica fue de acero inoxidable LC-18
para fase reversa, de 25 cm x 4,6 mm de diámetro interno, 5 m de diámetro de partícula, y guarda
columna con cartucho C18, Supelco. Las condiciones típicas de operación fueron: sistema isocrático, flujo
1,2 mL/min, volumen de inyección 20 l, detección UV 242 nm, temperatura de horno, ambiente, y
tiempo de corrida 7 min. La fase móvil fue metanol al 100% grado HPLC.
Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil en un balón de base plana, se colocó un
magneto y se adicionó 70 mL de etanol absoluto. Se colocaron los tubos de reflujo y se agitó la mezcla
hasta su ebullición con corriente de nitrógeno. Luego, se adicionó 20 mL de solución de KOH al 50% y se
saponificó la mezcla por 30 minutos con agitación moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuagó el
contenido con 50 mL de agua en 3 porciones. La solución se enfrió a temperatura ambiente y luego se
filtró al vacío. Se colocó inmediatamente el contenido en una pera de separación de 250 mL y se
adicionó 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extracción. Se agitó la mezcla por 20 segundos y al
separarse las fases se colocó la capa superior (fase orgánica) en un balón de 250 mL de base redonda
Capítulo 8 120

Procesamiento de datos cromatográficos
que contenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácido ascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y
se juntaron los extractos en el balón de 250 mL. Se evaporó a sequedad el solvente, haciendo uso de un
rotavapor con baño de agua a 40°C, se diluyó inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se
llevó a volumen en un matraz volumétrico de 10 mL. Finalmente, se pasó la solución final por un filtro de
0,2 m, llenándolos en viales ámbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatógrafo.
Cálculos:
Donde: Am (Área del pico de vitamina A en la muestra), As (Área del pico de vitamina A en el estándar),
Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml), D (Factor de dilución), Wm (Peso de la muestra.
lecturas de los resultados de las 18 muestras.
Resultados
Se analizaron muestras de papilla para cuantificar la
vitamina A expresada en g/g. El analito se adicionó a
la matriz, disuelto en el mismo solvente usado para la
extracción, y se dejó en contacto con ésta por varias
horas antes de la extracción, para permitir su
interacción. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y 1,78 mL de
una solución estándar de 100 ppm de vitamina A y se
adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel. Se dejó
en contacto la solución estándar con las muestras
durante toda la noche bajo refrigeración y, al día
siguiente, se realizó el tratamiento y se hicieron las
En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos concentraciones (mayor y menor)
de vitamina A para la curva de calibración. El tiempo de retención de la vitamina A fue 3,91 ± 0,5 min,
siendo el tiempo total de análisis para una muestra de 7 min.
La respuesta de detección fue lineal en el rango de concentraciones de 5- 15 g/g (Figura 2),
obteniéndose un coeficiente de correlación r=0,99. El límite de detección del método en base a la señal /
ruido (S/N) fue de 0,06 g/g y el límite de cuantificación de 0,58 g/g
Capítulo 8 121

La recuperación obtenida fue de 97,98%.
Procesamiento de datos cromatográficos
Determinación de óxido de etileno en aire. Método de muestreadores pasivos
por difusión / Cromatografía de gases
El oxido de etileno es una sustancia utilizada en la industria farmacéutica para la esterilización de
embases, viales, ampolletas, tapones etc. Utilizados en la fabricación de inyectables.
Toma de muestras. Para el muestreo personal colocar el muestreador pasivo 3M-3551 en la zona de
respiración. Una vez terminado el período de captación desmontar la membrana y el aro de sujeción
colocando en su lugar la tapa para la desorción, asegurando la hermeticidad de ésta y los tapones de la
misma.
Preparación de la muestra. El muestreador se desorbe con 1,5 ml de la disolución de 10% de cloruro de
metileno en metanol por 30 min. Una vez realizada la desorción se diluyen las muestras diez veces con la
disolución de 50% de acetonitrilo en tolueno.
Calibración. La disolución patrón se prepara por triplicado, añadiendo una cantidad determinada de 2-
bromoetano a un volumen de disolución desorbente de 10% de cloruro de metileno en metanol a fin de
obtener una disolución patrón de concentración similar a la muestra a analizar. Dicha concentración se
debe expresar en mg/ml de disolución desorbente.
Desarrollo de una curva de calibrado. Para el desarrollo de la misma, se preparan cinco disoluciones de
calibración de los analitos de interés que cubran el intervalo de concentraciones de aplicación del
método. Analizar los patrones en las mismas condiciones que las muestras. Se recomienda un mínimo de
seis inyecciones. Calcular para cada concentración y analito el promedio de las respuestas obtenidas y la
desviación típica correspondiente. Las curvas de calibración se construyen representando los intervalos
Capítulo 8 122

Procesamiento de datos cromatográficos
de los valores promedios ±2 desviaciones típicas, frente a las concentraciones en mg/ml de cada analito.
Comprobar diariamente la curva de calibrado mediante el análisis de uno de los patrones de calibración.
El valor obtenido para cada analito debe encontrarse dentro del intervalo asociado a ese patrón.
Las condiciones de trabajo para el cromatógrafo de gases equipado son las siguientes:
Temperatura del inyector 200 ºC
Temperatura del horno 120 ºC
Temperatura del detector 250 ºC
Cálculos
Gas portador nitrógeno 25 ml/min
Gas auxiliar nitrógeno 50 ml/min
Se calcula el factor de respuesta del analito con los datos obtenidos mediante la expresión:
donde:
Fz = m/A
m= es la cantidad de analito en las disoluciones patrón
A es el área promedio correspondiente al analito en las disoluciones patrón.
La concentración en miligramos por mililitro de analito en las disoluciones de desorción de cada muestra,
se determina según la expresión:
donde:
co = Ao x FR
co= es la concentración de analito en mg/ml de disolución.
Ao= es el área correspondiente al pico de analito en la muestra.
FR= es el factor de respuesta.
Calibración multinivel. Leer la concentración en miligramos por mililitro en la curva de calibración
realizada.
Capítulo 8 123

Procesamiento de datos cromatográficos
Análisis cuantitativos de los principales constituyentes químicos de raíces de
Echinacea purpurea y E. angustifolia producidas.
Fundamento. Se cuantificó los fenilpropanoides libres: ácido clorogénico y ácido cichórico, glicosídicos
así como las alcamidas presentes en extractos de raíces de las plantas medicinales Echinacea purpurea y
E. angustifolia.
Procedimiento. Se recolectaron 300 g de material vegetal, fue macerada con una mezcla 80:20 de etanol
al 95%: agua. Después de realizar 3 maceraciones, el extracto hidroalcohólico fue concentrado en un
evaporador rotativo a presión reducida y 45[grados]C, obteniéndose 1,5 litros de extracto concentrado.
Análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
La detección y cuantificación de los fenilpropanoides libres y del fenilpropanoide glicosilado, se
realizó por medio de un cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HP 1090 A). Los fenilpropanoides fueron
separados utilizando un gradiente lineal de fase móvil (20 min) de un 5% de acetonitrilo [agua.sup.-1]
hasta un 25% de acetonitrilo. El flujo fue de 1,0 ml [min.sup-1]. Además, la fase móvil contenía un 1%
(v/v) de ácido fosfórico 0,1 N., para lograr una mejor resolución de los picos presentes en el
cromatograma. La separación fue monitoreada a 330 nm.
Las alcamidas fueron identificadas según los tiempos de retención y los espectros de masas de
los picos obtenidos en los cromatogramas, comparados con los obtenidos con las disoluciones de
sustancias puras, previamente analizados y almacenados en una base de datos. La cuantificación se
realizó con el método de estándar externo empleando patrones en rango de concentración de 0-1,5% en
peso.
Resultados
La mayor concentración de extractos de E. purpurea fue de 5,16% de la region de Santos y
contiene 1,12% más ácido clorogénico y cichórico que la muestra reportada de EE.UU.
El análisis por HPLC se obtuvo que los contenidos de metabolitos secundarios producidos tanto
en Echinacea purpurea como en E. angustifolia, en condiciones de Costa Rica, son mayores que los
reportados en los EE.UU., de donde es originaria esta planta. Se encontró que E. angustifolia, además
produce un equinacósido que no sintetiza E. purpurea y que es de suma importancia por ser uno de los
principales compuestos para mejorar el sistema inmunológico de los seres humanos.
Capítulo 8 121

Procesamiento de datos cromatográficos
Anfotericina b: determinación en diversos fluidos biologicos por cromatografía
líquida. Aplicación a estudios farmacocinéticos y de estabilidad química.
La anfotericina B (AnB), comercializada en el año 1956, continúa siendo el fármaco de elección para el
tratamiento de las micosis sistémicas, aunque su utilización no está exenta de toxicidad.
Procedimiento. Se determinó analizando 10 veces dentro de la misma serie analítica, dos muestras, una
de concentración de AnB de 0.5 -g/mL y otra de 2.5 -glmL, preparadas a partir de un "pool'Lde sueros al
cual le fue adicionado el fármaco.
En este estudio se presenta un método de determinación de AnB en suero humano por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa y columna corta (30 mm). El desarrollo y
puesta a punto de la técnica se realizó en base a los métodos de determinación de AnB por HPLC
previamente descritos y resumidos en la siguiente tabla.
Fase móvil EI Procedimiento de extracción Tr
405 (1) Tampón Na2HPO4-KH2-PO4
382
(2)
1.6 mM, acetonitrilo
(63/37, v7v) pH=7
Flujo 1.5 mL/min
Na2EDTA 2.5 mM,
Acetonitrilo
(55/45, v/v)
Flujo 1 mL/min
405 (3) Acetonitrilo, 25mM
EDTA, metanol
(30:20:50 v/v/v)
Flujo 1.6 mL/min
405 (4) Metanolm tampón fosfato
(10 mM KH2PO4, 5mM
EDTANa2 pH=4)
(80:20, v/v)
Acetronitirilo, tampón
fosfato (10 mM KH2PO4, 5
mM EDTANa2 pH=4) (40:60,
v/v)
1-Amino-4-Nitro
naftaleno
Precipitación proteínas sétricas con
metanol (lleva incorporado el estándar
interno). Centrifugación inyección directa
sobrenadante.
NO Extracción proteínicas séricas con metanol
con acetronilo Na2EDTA 2.5 mM
(60/40/,v/v)
Inyección del eluido
NO Precipiatación proteínas séricas con
1-Amino-4
Nitronaftaleno
metanol. Centrifugación inyección directa
del sobre nadante
Precipitación proteninas séricas con
metanol (lleva incorporado el estándar
interno). Centrifugación Inyección directa
del sobresedante.
5.5 min
6-7 min
Capítulo 8 122
4 min
6.8 +-
0.5 min
8.4 +-
0.5 min

382(5) EDTA 0.01 M, acetronitrilo
Resultados
(60/40 v/v) pH=4.2 Flujo 1.5
mL/min
Procesamiento de datos cromatográficos
1-Amino-4
Nitronaftaleno
N-
acetilanfotericina
B
Si bilirrubinas < + mg/dL:
Precipitación proteínas séricas con
metanol. Centrifugación. Inyección directa
del sobrenadante.
Si bilirrubinas > 3 mg/dL:
Precipitación preteínas séricas con
metanol. Extracción en fásesólida con
columna SuperClean C18 (vacmetanol e
inyección del eluído)
4.9 +-
0.8 min
Se realizó una curva de calibración, misma que se calculó por regresión lineal a partir de las áreas
de los picos correspondientes a los estándares, procesados en cada serie analitica. La concentración de
las muestras se obtuvo por interpelación de su área en la recta de calibración. Se resenta un método de
determinación de AnB en suero humano por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase
reversa y columna corta (30 mm). Para ello. se escogib una columna de octadecilsilano (C18), más corta
(30 mm x 4.6 mm ID) que en los métodos de referencia (125 a 300 mm) (108,119,120,129,131), con el fin
de obtener tiempos de retención más pequeños y se utilizó la fase móvil del método descrito por Wang
et al (131) (acetonitrilo y tampón EDTA ).
Bibliografia:
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Perez C. Ruth. Estudio de validación de la Metodología para la determinación de Vitamina A en
Alimentos infantiles instantáneos por Cromatografía Líquida de alto rendimiento (HPLC). Rev.
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Capítulo 8 123