Técnicas Cromatográficas - UNAM

Introducción a los métodos de separación
adaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de
absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de
llama.
La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio conjunto de
sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos, pesticidas y herbicidas,
tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles y explosivos y propelentes.
1.8 Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de
fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque
están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una
estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes
disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida.
Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos,
esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las
proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución
que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente
por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible,
se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican
las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para
continuar con la regeneración de la columna cromatográfica.
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de
proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo
restringido para la separación.
Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínas
que se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína de
interés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta para
que eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan a
través de la columna.
Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige
unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero.
Capítulo 1 10