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UNIVERSIDAD DE CONCEPCION 

FACULTAD DE FARMACIA 

EVALUACION DE LA INFLUENCIA DE DERIVADOS DE 

QUITOSANO SOBRE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL DE 

CAPREOMICINA SULFATO EN MODELOS in vivo E in vitro 

Pablo Miguel Torres Vergara 

Químico Farmacéutico 

Tesis para optar al grado de Magíster en Ciencias Farmacéuticas 

2009

EVALUACION DE LA INFLUENCIA DE DERIVADOS DE 

QUITOSANO SOBRE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL DE 

CAPREOMICINA EN MODELOS in vivo E in vitro 

Comisión evaluadora de tesis 

Trabajo presentado para optar al grado de 

Magíster en Ciencias Farmacéuticas 

por 

PABLO MIGUEL TORRES VERGARA 

Químico Farmacéutico 

Prof. Dr. Carlos von Plessing Rossel 

Profesor Guía 

Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia 

Universidad de Concepción 

Prof. Dra. Coralia Rivas Rocco Prof. Dr. Galo Cárdenas Triviño 

Departamento de Fisiopatología Departamento de Polímeros 

Facultad de Ciencias Biológicas Facultad de Ciencias Químicas 

Universidad de Concepción Universidad de Concepción

PARTICIPACION A CONGRESOS Y PUBLICACIONES 

Participación a congresos 

Póster presentado en las XVIII Jornadas Chilenas de Química, 3 – 6 de Noviembre 

de 2009, Termas de Chillán, Chile. 

“Preparación y caracterización de cloruro de N-trimetilquitosano libre de O- 

metilación”. 

Torres Pablo, von Plessing Carlos, Cárdenas Galo, Núñez Christian. 

Póster presentado en las XVIII Jornadas Chilenas de Química, 3 – 6 de Noviembre 

de 2009, Termas de Chillán, Chile. 

“Determinación de Capreomicina sulfato en suero de rata por HPLC-DAD”. 

Torres Pablo, von Plessing Carlos. 

Publicaciones 

Torres Pablo, Sepúlveda M.J., Rivas Coralia I., Guzmán Paula, Cárdenas Galo, 

Núñez Christian, von Plessing Carlos. 

“Effect of a non-methoxylated N-trimethyl chloride derivative on Capreomycin 

sulfate permeability in CaCo-2 monolayers”. 

International Journal of Pharmaceutics (Submitted).



INDICE 

ABREVIATURAS.................................................................................................... 8 

RESUMEN ............................................................................................................ 10 

SUMMARY............................................................................................................ 11 

1.- INTRODUCCION ............................................................................................. 12 

1.1.- Mecanismos de absorción de fármacos a través del tracto gastrointestinal . 13 

1.1.1.- Vía Transcelular ......................................................................................... 13 

1.1.1.1.- Difusión pasiva........................................................................................ 14 

1.1.1.2.- Endocitosis.............................................................................................. 15 

1.1.1.3.- Transporte mediado ................................................................................ 15 

1.1.2.- Vía paracelular ........................................................................................... 16 

1.1.2.1.- Estructura de las uniones ocluyentes...................................................... 16 

1.2.- Barreras epiteliales del tracto gastrointestinal............................................... 18 

1.3.- Métodos empleados para determinar mecanismos de absorción ................. 19 

1.3.1.- Perfusión intestinal..................................................................................... 19 

1.3.2.- Cultivos celulares CaCo-2.......................................................................... 19 

1.3.2.1.- Factores que influyen en el diseño de un experimento con monocapas 

celulares CaCo-2................................................................................................ 20 

1.3.2.1.1.- Propiedades fisicoquímicas del fármaco y uso de solubilizantes ......... 22 

1.3.2.1.2.- Medio de transporte y relevancia fisiológica......................................... 22 

1.4.- Estrategias para mejorar la absorción de fármacos macromoleculares e 

hidrofílicos desde el tracto gastrointestinal......................................................... 23 

1.5.- Quitosano...................................................................................................... 27 

1.5.1.- Propiedades ............................................................................................... 27 

1.5.2.- Preparación de Quitosano.......................................................................... 28 

1.5.3.- Propiedades biológicas de Quitosano........................................................ 28 

1.5.3.1.- Biodegradabilidad.................................................................................... 28 

1.5.3.2.- Biocompatibilidad en administración oral ................................................ 29 

1.5.3.3.- Citocompatibilidad, adhesión celular y proliferación celular en Films de 

Quitosano........................................................................................................... 29 

1



1.5.3.4.- Propiedades bacteriostáticas y fungistáticas........................................... 29 

1.5.4.- Propiedades mucoadhesivas de Quitosano y utilidad como promotor de la 

permeación......................................................................................................... 30 

1.5.5.- Derivados de Quitosano............................................................................. 32 

1.5.5.1.- Cloruro de N-trimetilquitosano (TMQ) ..................................................... 33 

1.5.5.1.1.- Uso de TMQ como promotor de la permeación ................................... 34 

1.5.5.1.2.- Síntesis de TMQ................................................................................... 34 

1.5.5.1.3.- Caracterización del cloruro de N-trimetilquitosano............................... 38 

1.6.- Capreomicina ................................................................................................ 39 

1.6.1.- Propiedades fisicoquímicas........................................................................ 39 

1.6.2.- Farmacología ............................................................................................. 40 

1.6.3.- Farmacodinamia ........................................................................................ 40 

1.6.4.- Farmacocinética......................................................................................... 40 

1.6.5.- Toxicidad y reacciones adversas ............................................................... 41 

1.6.6- Interacciones............................................................................................... 41 

1.6.7.- Posología ................................................................................................... 42 

2.- HIPOTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................. 43 

2.1.- Hipótesis de trabajo....................................................................................... 43 

2.2.- Objetivo general ............................................................................................ 43 

2.3.- Objetivos específicos .................................................................................... 43 

3.- MATERIALES Y REACTIVOS......................................................................... 45 

3.1.- Material biológico .......................................................................................... 45 

3.2.- Equipos y fungibles ....................................................................................... 45 

3.3.- Principios activos .......................................................................................... 46 

3.4.- Reactivos ...................................................................................................... 47 

4.- METODOS ....................................................................................................... 48 

4.1.- Preparación y caracterización del Cloruro de N-trimetilquitosano (TMQ) ..... 48 

4.1.1.- Síntesis ...................................................................................................... 48 

4.1.2.- Caracterización .......................................................................................... 50 

4.1.2.1.- Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear................................ 50 

4.1.2.2.- Espectroscopía de Infrarrojo con Transformada de Fourier .................... 50 

2



4.1.2.3.- Viscosidad............................................................................................... 51 

4.2.- Determinación de Capreomicina sulfato en muestras de cultivos celulares y 

suero de rata ...................................................................................................... 51 

4.2.1.- Condiciones cromatográficas ..................................................................... 51 

4.2.2.- Metodología de extracción desde suero de rata ........................................ 52 

4.2.3.- Cuantificación............................................................................................. 52 

4.2.4.- Validación del Método................................................................................ 53 

4.2.4.1.- Linealidad................................................................................................ 53 

4.2.4.2.- Precisión y Exactitud ............................................................................... 53 

4.2.4.3.- Límite de detección y cuantificación........................................................ 54 

4.3.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad intestinal de Capreomicina 

sulfato en modelos in vitro.................................................................................. 54 

4.3.1.- Cultivo celular............................................................................................ 54 

4.3.2.- Viabilidad celular ante Capreomicina sulfato y cloruro de TMQ ................. 55 

4.3.3.- Efecto del cloruro del TMQ sobre resistencia eléctrica transepitelial de 

monocapas celulares CaCo-2 ............................................................................ 55 

4.3.4.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad celular de Capreomicina 

sulfato................................................................................................................. 57 

4.3.5.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la absorción intestinal de Capreomicina 

sulfato en modelos in vivo .................................................................................. 58 

5.- RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................................ 60 

5.1.- Preparación y caracterización de cloruro de TMQ ........................................ 60 

5.1.1.- Síntesis y análisis de 1 H-RMN y FT-IR....................................................... 60 

5.1.2.- Viscosidad.................................................................................................. 67 

5.2.- Metodología analítica para la determinación de Capreomicina sulfato en 

muestras de cultivo celular y suero de rata ........................................................ 68 

5.2.1.- Cromatografía ............................................................................................ 68 

5.2.2.- Linealidad................................................................................................... 71 

5.2.3.- Recuperación desde suero de rata ............................................................ 72 

5.2.4.- Exactitud y Precisión.................................................................................. 73 

5.2.5.- Límite de detección y cuantificación........................................................... 73 

3



5.3.- Efecto de cloruro de TMQ sobre la permeabilidad intestinal de Capreomicina 

sulfato en modelos in vitro.................................................................................. 74 

5.3.1.- Viabilidad celular ante Capreomicina sulfato y cloruro de TMQ ................. 74 

5.3.1.1.- Capreomicina sulfato............................................................................... 74 

5.3.1.2.- Cloruro de TMQ ...................................................................................... 75 

5.3.3.- Efecto del cloruro de TMQ sobre resistencia eléctrica transepitelial de 

monocapas celulares CaCo-2 ............................................................................ 78 

5.3.4.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad celular de Capreomicina 

sulfato en monocapas celulares CaCo-2............................................................ 81 

5.3.5.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la absorción intestinal de Capreomicina 

sulfato en modelos in vivo .................................................................................. 86 

6.- CONCLUSIONES ............................................................................................ 90 

7.- BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 92 

4



INDICE DE FIGURAS 

Figura 1. Relaciones entre propiedades fisicoquímicas que pueden influir en la 

absorción de un fármaco....................................................................................... 12 

Figura 2. Estructura propuesta de las Uniones Ocluyentes.................................. 16 

Figura 3. Esquema de un sistema bicameral Transwell. ...................................... 20 

Figura 4. Factores que influyen en el diseño experimental con monocapas 

CaCo-2.................................................................................................................. 21 

Figura 5. Estructura química de Quitosano. ......................................................... 27 

Figura 6. Estructura química del cloruro de N-trimetilquitosano. .......................... 33 

Figura 7. Síntesis de TMQ propuesta por Muzzarelli et al .................................. 35 

Figura 8. Síntesis de TMQ propuesta por Sieval et al .......................................... 36 

Figura 9. Síntesis de TMQ propuesta por Verheul et al ....................................... 37 

Figura 10. Estructura química de Capreomicina................................................... 39 

Figura 11. Esquema de metilación de Quitosano basado en método de 

Rünnarsson et al, 2008. ........................................................................................ 49 

Figura 12. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 103,2 kDa sintetizado en dos et apas según 

método de Rünnarsson et al, 2007. .................................................................... 60 

Figura 13. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 103,2 kDa sintetizado en tres e tapas según 

método de Rünnarsson et al, 2008. ..................................................................... 61 

Figura 14. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 400 kDa sintetizado en tres eta pas según 

método de Rünnarsson et al, 2008. ..................................................................... 62 

Figura 15. Espectro IR de Quitosano 103,2 kDa .................................................. 63 

Figura 16. Espectro IR de TMQ 103,2 kDa sintetizado según método de 


Figura 17. Espectro IR de Quitosano 400 kDa ..................................................... 64 

Figura 18. Espectro IR de TMQ 400 kDa sintetizado según método de 


Figura 19. 1 H-RMN de TMQ 400 kDa sintetizado según de Britto et al, 2007. ..... 65 

Figura 20. Espectro IR de TMQ sintetizado según de Britto et al, 2007. .............. 66 

Figura 21. Cromatograma de Capreomicina sulfato 10 ug/mL en suero de rata. . 69 

5



Figura 22. Cromatograma de Capreomicina sulfato 5 ug/mL en HBSS. .............. 70 

Figura 23. Curvas de calibración en suero de rata (A) y HBSS (B). ..................... 71 

Figura 24. Viabilidad celular ante concentraciones crecientes de Capreomicina 

sulfato.................................................................................................................... 74 

Figura 25. Viabilidad celular ante concentraciones crecientes de cloruro de TMQ 

103,2 kDa.............................................................................................................. 75 

Figura 26. Reducción de TEER en monocapas celulares CaCo-2 ante 

concentraciones crecientes de cloruro de TMQ. ................................................... 78 

Figura 27. Cantidad permeada de Capreomicina sulfato en monocapas celulares 

CaCo-2 ante concentraciones crecientes de cloruro de TMQ............................... 81 

Figura 28. Permeabilidad aparente de Capreomicina en presencia de 

concentraciones crecientes de cloruro de TMQ. ................................................... 84 

6



INDICE DE TABLAS 

Tabla 1. Características del transporte activo y la difusión facilitada. ................... 15 

Tabla 2. Promotores de la permeación gastrointestinal. ....................................... 24 

Tabla 3. Mecanismos de acción de promotores de la permeación. ...................... 25 

Tabla 4. Condiciones cromatográficas propuestas para matrices en estudio. ...... 52 

Tabla 5. Valores de viscosidad en cP obtenidos para soluciones en estudio. ...... 67 

Tabla 6. Resultados de regresión lineal en matrices estudiadas. ......................... 72 

Tabla 7. Recuperación desde suero de rata. ........................................................ 72 

Tabla 8. Resultados de exactitud y precisión en suero de rata............................. 73 

Tabla 9. Límite de detección y cuantificación en para suero de rata y HBSS....... 73 

Tabla 10. Valores de Papp de Capreomicina sulfato en presencia de TMQ........... 83 

7



ABREVIATURAS 

ANOVA Análisis de la varianza 

% DA Grado de desacetilación 

% p/v Porcentaje peso volumen 

[C] Concentración 

[Ca ++ ] Ión calcio 

Cmax 

CaCl2 

CO2 

Concentración plasmática máxima 

Cloruro de calcio 

Dióxido de carbono 

cP CentiPoise 

DAD Detector de arreglo de diodos 

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium 

EDTA Acido etilendiamintetraacético 

FT-IR Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier 

°GL Grados Gay-Lussac 

GSH Glutatión reducido 

H + 

Protón 

hOCT Transportador humano de cationes orgánicos 

1 H-RMN Espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones 

HBFA Acido heptafluorobutírico 

HBSS Solución salina balanceada de Hank 

HEPES Acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico 

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución 

KBr Bromuro de potasio 

kDa Kilo Dalton 

KH2PO4 Fosfato dihidrógeno de potasio 

M Molar 

mM Milimolar 

m 2 

Metro cuadrado 

MDR Proteínas de multiresistencia a fámacos 

MeCN Acetonitrilo 

8



MES Acido 2-(N-morfolino)etansulfónico 

MgCl2 

mL Mililitro 

Cloruro de magnesio 

nm Nanómetro 

NaOH Hidróxido de sodio 

NaHCO3 Bicarbonato de sodio 

Na2HPO4 Fosfato dibásico de sodio 

NH2 

Amino 

Papp Coeficiente de permeabilidad aparente 

PEPT Transportador de péptidos 

ppm Partes por millón 

rpm Revoluciones por minuto 

rRNA Acido ribonucléico ribosomal 

% RSD Desviación estándar relativa 

tmax 

Tiempo en alcanzar la concentración máxima 

TEER Resistencia eléctrica transepitelial 

TMQ N-trimetilquitosano 

µg Microgramo 

µL Microlitro 

µm Micrómetro 

9



RESUMEN 

En el presente trabajo se evaluó la influencia de un derivado semisintético 

del polímero catiónico Quitosano sobre la permeabilidad intestinal del antibiótico 

polipeptídico Capreomicina sulfato en modelos in vitro e in vivo. El cloruro de N- 

trimetilquitosano es obtenido por metilación sucesiva del grupo amino libre con 

yodometano en medio básico, obteniendo un producto que es soluble en un rango 

de pH más amplio que el polímero original. Con el fin de aumentar su carácter 

mucoadhesivo y su acción promotora de la permeación, se utilizó una vía sintética 

que alquila en forma selectiva la amina y no los hidroxilos del carbono 3 y 6, que 

producen una disminución en la potencia, llevando a utilizar cantidades mayores 

que limitan su potencial como excipiente. El derivado no metoxilado de N- 

trimetilquitosano disminuyó reversiblemente la resistencia eléctrica transepitelial 

de monocapas celulares CaCo-2 en concentraciones no superiores a 0,003 % p/v, 

indicando que al no haber impedimento estérico la potencia del polímero es mayor 

debido a la alta densidad de carga del grupo trimetilo, pero a costa de un intervalo 

de acción estrecho y alta toxicidad. Los resultados del estudio de permeación in 

vitro realizado en sistemas bicamerales “Transwell ® ” sugieren que la 

permeabilidad de Capreomicina sulfato es baja, aunque no se estableció si hay 

otros mecanismos involucrados, como transportadores de membrana. Al utilizar 

concentraciones crecientes de cloruro de TMQ en el rango de 0,001 – 0,003 % p/v 

se apreció un leve aumento en el transporte de Capreomicina pero con alta 

variabilidad. En ratas Sprague-Dawley hembra, al usar concentraciones de N- 

trimetilquitosano equivalentes a 0,005 y 0,01 % p/v, hubo un aumento errático de 

las concentraciones plasmáticas que puede atribuirse a las bajas concentraciones 

usadas y a una interacción previa del polímero con las mucinas del lumen 

intestinal. 

10



SUMMARY 

In the present work, we evaluated the effect of a semisynthetic derivative of 

the cationic polymer Chitosan on intestinal permeability of Capreomycin sulfate, a 

polypeptide antibiotic, using in vitro and in vivo models. N-trimethyl chitosan 

chloride (TMC) is obtained by alkylation of the free amino groups with iodomethane 

in basic conditions, and the obtained product is soluble in a wider pH range than 

the original polymer. In order to improve it mucoadhesive and permeation 

enhancer properties, we used a synthetic pathway that selectively alkylated the 

amino groups and not the hydroxyl groups in carbons 3 and 6 which decreased the 

potency of the polymer, leading to use higher quantities and limit its potential as a 

functional excipient. This non methoxylated derivative of N-trimethyl chitosan 

chloride reduced in a reversible way the transepithelial electrical resistance of 

CaCo-2 monolayers at concentrations not higher than 0,003 % w/v, indicating that 

the absence of steric hindrance from methoxyl groups improves the effect of TMC, 

but at the expense of a narrow range of action and higher toxicity. The results of in 

vitro permeation studies conducted in bicameral “Transwell ® ” systems suggest that 

the permeability of Capreomycin sulfate is low, but it was not demonstrated if other 

mechanisms like membrane transporters are involved. By using increasing 

concentrations of TMC in the range of 0,001 to 0,003 % w/v, was observed a slight 

increase in the transport of Capreomycin, but the differences between groups were 

not statistically significant. In female Sprague-Dawley rats, using concentrations of 

TMC equivalent to 0,005 and 0,01 % w/v, there was an erratic increase in plasma 

concentrations that can be attributed to the low concentrations used and polymer 

interactions with mucins in the intestinal lumen. 

11



1.- INTRODUCCION 

Desde un punto de vista biofarmacéutico, en la actualidad el desafío más 

importante para los grupos de investigación farmacéutica es optimizar los 

regimenes terapéuticos de principios activos con baja biodisponibilidad. Una pobre 

biodisponibilidad se traduce en baja eficacia y alta variabilidad intra e inter 

individuo, obligando al formulador a seleccionar incomodas vías de administración, 

o incrementar la dosis para equiparar las concentraciones plasmáticas 

encontradas con la administración parenteral o peroral, a costa de indeseables 

efectos adversos locales o sistémicos [1]. De este modo, las estrategias diseñadas 

para enfrentar el problema se basan (en su mayoría) en limitantes determinadas 

por las propiedades fisicoquímicas del compuesto en estudio. La figura 1 muestra 

algunas relaciones entre propiedades fisicoquímicas que influirían en la absorción 

oral de fármacos. 

Carga de la 

molécula 

Ionización Puentes de 

Hidrógeno 

Punto de Fusión 

Solubilidad 

Liposolubilidad 

Tamaño Forma 

Carácter anfifílico 

Distribución de cargas 

Figura 1. Relaciones entre propiedades fisicoquímicas que pueden influir en la absorción 

de un fármaco. 

12



Como se aprecia en la figura, la solubilidad es el parámetro que se ve más 

influido por modificaciones en los otros. Históricamente, los intentos para mejorar 

la biodisponibilidad oral y tópica de moléculas con actividad terapéutica de 

relevancia epidemiológica han tendido a solucionar los problemas de baja 

solubilidad en fluidos biológicos mediante la reducción de tamaño, formación de 

sales solubles en agua, complejación con ciclodextrinas, solubilización micelar, 

incorporación en microemulsiones, síntesis de profármacos, entre otras técnicas 

[2]. Sin embargo, las macromoléculas farmacológicamente activas de naturaleza 

proteica o peptídica, y altamente hidrofílicas, no son capaces de atravesar 

membranas por los mecanismos convencionales debido a su alto peso molecular, 

limitando de este modo su administración por una vía cómoda que no sea la 

parenteral [3-6]. 

1.1.- Mecanismos de absorción de fármacos a través del tracto 

gastrointestinal 

Considerando a cualquier vía extravasal, se entiende como absorción al 

proceso fisiológico por medio del cual un fármaco que es introducido en la 

superficie o en el interior de algún órgano o tejido, penetra en la sangre. Si se 

pretende alcanzar un efecto sistémico administrando un fármaco por vía oral, es 

necesario que este alcance la circulación sanguínea. El proceso de absorción 

puede desarrollarse por vía transcelular o paracelular [6]. 

1.1.1.- Vía Transcelular 

La mayoría de los fármacos se absorben por esta vía y existen tres formas 

de transporte: Difusión pasiva, endocitosis y transporte mediado por Carriers. 

13



1.1.1.1.- Difusión pasiva 

Por esta vía es común que se transporten moléculas de bajo peso 

molecular, hidrofílicas o lipofílicas. Los solutos atraviesan la membrana gracias a 

un gradiente de concentración, y cuando se igualan las concentraciones a ambos 

lados de la membrana se produce un equilibrio dinámico [6]. Este proceso es 

explicado por la primera ley de Fick de difusión (Ecuación 1). 

( g s) 

C C k 

dC 

= − 

dt 

Ecuación 1 

Donde, dC/dt es la velocidad de aparición del fármaco en el sitio de absorción, k 

es la constante de proporcionalidad, Cg es la concentración de fármaco en el sitio 

de absorción y Cs es la concentración sanguínea de fármaco en el sitio de 

absorción. Al observar la ecuación, se aprecia que la velocidad de absorción 

depende de las concentraciones presentes en el compartimento donante, por tanto 

se infiere que es un proceso que sigue una cinética de primer orden. 

Debe notarse que la difusión pasiva es un proceso lento que constituye el 

paso limitante de la absorción en ciertos casos, y debido a la naturaleza lipídica de 

la membrana plasmática, los compuestos menos polares difundirán más rápido 

que los de naturaleza hidrofílica. En este aspecto, la influencia del grado de 

ionización del fármaco es importante ya que dependiendo de su carácter, si es 

ácido o base débil, va a estar más o menos ionizado a un pH determinado, y en el 

último caso su liposolubilidad va a ser mayor. La fracción ionizable de un fármaco 

depende de su pKa, y según la Ecuación de Henderson-Hasselbach, es posible 

calcular la relación de especie ionizada/no ionizada. Por ejemplo, una base débil 

cuyo pKa es 3,5 va a estar más ionizada al pH ácido del estómago y más 

disociada a pH intestinal, favoreciéndose la absorción en el último medio [6]. 

14



1.1.1.2.- Endocitosis 

Involucra a un conjunto de procesos en los cuales la membrana plasmática 

sufre invaginaciones que llevan a la formación de vesículas que encierran a los 

solutos, que son transportados a través de la célula. Existen tres tipos de 

endocitosis: Pinocitosis, endocitosis mediada por receptor y exocitosis. 

Cuando la vesícula ingresa a la célula puede ser digerida por fusión con 

lisosomas, liberando su contenido. Este mecanismo de transporte no es 

significativo para fármacos, excepto si se trata de proteínas [6]. 

1.1.1.3.- Transporte mediado 

Los fármacos son transportados de forma activa o por difusión facilitada 

(Tabla 1) a través de la célula mediante proteínas de la membrana plasmática. Es 

importante en el caso de fármacos hidrosolubles que tienen similitud estructural 

con metabolitos endógenos, y posee las siguientes características: 

Proceso rápido: Más rápido que la difusión pasiva al momento de 

transportar moléculas de igual peso molecular y liposolubilidad. 

Cinética de saturación: Mientras el transportador no esté saturado, la 

velocidad de transporte es proporcional a la concentración de fármaco. 

Especificidad química: Este transporte se caracteriza por ser 

químicamente específico y estereoselectivo. 

Tabla 1. Características del transporte activo y la difusión facilitada [6]. 

Transporte activo Difusión facilitada 

Requiere energía metabólica No requiere energía 

La presencia de inhibidores enzimáticos No se ve afectado por la presencia de 

disminuye su actividad 

inhibidores enzimáticos 

Puede transportar compuestos en contra No puede transportar compuestos en 

de un gradiente de concentración 

contra de un gradiente de concentración 

Caracterizado por la ecuación de Trata de igualar la concentración de 

Michaelis-Menten 

sustancia transportada a ambos lados de la 

membrana. 

15



1.1.2.- Vía paracelular 

Los fármacos son transportados a través de las Uniones Ocluyentes (Tight 

Junctions) que si bien evitan el libre paso de sustancias, son permeables al agua y 

algunos compuestos de bajo peso molecular. 

1.1.2.1.- Estructura de las Uniones Ocluyentes 

En mamíferos, las Uniones Ocluyentes son estructuras constituidas por 

proteínas integrales de membrana, proteínas de anclaje que se unen al 

citoesqueleto de actina, moléculas transmisoras que permiten la regulación 

dinámica del transporte paracelular y aglomeraciones de lípidos [5] (Figura 2). 

Receptor 

PKC 

PKA 

PKG 

MAPK 

MLCK 

Rho/ROCK 

PI3K/Akt 

Citoesqueleto de actina 

Vías de transducción de 

señales que regulan TJ´s 

7H6 CASK 

cingulina 

GEF-H1 

Itch 

MAGI 1-3 

MUPP1 

PAR3/6 

RGS5 

ZONAB 

Proteínas de Uniones Ocluyentes 

ZO-2 ZO-3 

ZO-1 

ZO-1 

γ 

α 

β 

Cateninas 

Proteínas de Uniones Adherentes 

Tricelulina 

Ocludina 

Claudina 

JAM y ESAM 

Cadherinas 

Nectinas 

PECAM 

Zona apical/luminal 

Uniones 

ocluyentes 

Uniones 

adherentes 

Zona basolateral/abluminal 

Figura 2. Estructura propuesta de las Uniones Ocluyentes. Adaptado de Deli, 2009 [5]. 

Entre las proteínas integrales de membrana se destaca la ocludina que en 

un principio se pensó que sólo cumplía funciones de barrera, pero se ha visto que 

algunos estados patológicos se acompañan de un déficit de ocludina [5, 7] . De 

este modo, se infiere que puede cumplir un rol más complejo, a la forma de 

transmisor de señales que regulan el desarrollo de las uniones ocluyentes. 

También, existe un conjunto de proteínas conocidas como claudinas, que son 

16



capaces de determinar la carga eléctrica y la selectividad de tamaño de las 

uniones paracelulares [8]. Hasta el momento se han determinado 24 variantes, de 

las cuales las claudinas 1, 3, 4, 5, 8, 11, 14 y 19 contribuyen a mantener la firmeza 

de las barreras paracelulares. En el tracto gastrointestinal, las claudinas 2, 3, 4, 7, 

8, 12 y 15 se expresan, pero el grado de expresión varía según la región intestinal 

con diferentes localizaciones subcelulares, y el rol que cumplen en la organización 

estructural de la barrera intestinal se considera como un descubrimiento reciente 

[5, 8]. 

Para mantener la estabilidad de las Uniones Ocluyentes y regular su 

permeabilidad, las uniones adherentes (Adherens Junctions) cumplen un rol 

importante [5, 9]. Están compuestas por un grupo de proteínas conocidas como 

cateninas, cadherinas, nectinas y la molécula de adhesión entre plaquetas y 

células endoteliales (PECAM-1). Con respecto a las cadherinas, se ha descrito 

que la pérdida de E-cadherina aumenta de manera considerable la permeabilidad 

de las Uniones Ocluyentes, siendo este un evento relevante en el proceso de 

metastasis. Por su parte, las nectinas son una familia de proteínas que constituyen 

una especie de primer andamiaje para formación de las Uniones Ocluyentes y 

Adherentes, siendo posible encontrar los subtipos 1, 2 y 3 en tejidos adultos 

formados por células epiteliales, endoteliales, hematopoyéticas y neuronales. 

Como se mencionó anteriormente, las Uniones Ocluyentes pueden estar 

sujetas a constantes cambios que modifican su permeabilidad, y por esta razón 

existen mecanismos de transducción de señales capaces de mantener un 

equilibrio dinámico. Entre los sistemas más estudiados se incluyen la vía de las 

protein kinasas A, C y G, Rho kinasa, kinasa de cadenas livianas de miosina y el 

sistema MAPK de protein kinasa activado por mitógenos [10]. No obstante, dado 

que el efecto de estas vías de transducción varía según el tejido y líneas celulares, 

hasta el momento no se han establecido de manera concreta sus funciones en 

cada caso. 

17



1.2.- Barreras epiteliales del tracto gastrointestinal 

En la sección anterior se describieron los mecanismos que rigen el 

transporte de fármacos a través del tracto gastrointestinal. Si se considera el 

hecho que el epitelio constituye una barrera para el paso de compuestos, 

entonces esta membrana será más o menos permeable a un compuesto 

dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de este. El área superficial total 

del intestino es aproximadamente 200 m 2 , y excepto por la mucosa rectal y bucal, 

en donde la superficie está constituida por un epitelio estratificado escamoso, el 

resto del tracto gastrointestinal está cubierto por una capa celular de aspecto 

columnar. Las partes más bajas del intestino delgado, yeyuno e ileón, se 

consideran como el principal lugar para la absorción de fármacos debido a su 

mayor permeabilidad paracelular, que se expresa en bajos valores de Resistencia 

Eléctrica Transepitelial (Transepithelial Electrical Resistance, TEER) respecto a 

otras partes del tracto gastrointestinal. La estructura vellosa del yeyuno e ileon 

amplía el área superficial en cuatro y dos órdenes de magnitud, respectivamente, 

comparado con el colon. En el caso del epitelio gástrico, si bien es mucho más 

firme que el intestinal, está descrito que la absorción gástrica puede ser 

significativa en el caso de fármacos administrados desde formas farmacéuticas de 

liberación rápida o compuestos lipofílicos. De este modo, se concluye que las 

diferencias de permeabilidad paracelular en las distintas regiones del tracto 

gastrointestinal son provocadas por la disimilitud anatómica de cada estructura 

que lo compone, la composición lipídica de las membranas plasmáticas y la 

expresión de distintas subespecies de proteínas formadoras de Uniones 

Ocluyentes, particularmente claudinas [5]. 

La permeabilidad paracelular en la mucosa bucal y rectal está más 

disminuida, y sus áreas superficiales son menores, pero aún con estas limitantes 

son consideradas como vías de administración ya que es posible conseguir una 

entrada directa a la circulación sanguínea, consiguiendo un efecto terapéutico 

rápido en terapias que lo requieren y a su vez se evita el efecto de primer paso en 

intestino e hígado. 

18



1.3.- Métodos empleados para determinar mecanismos de 

absorción 

1.3.1.- Perfusión intestinal 

Estos estudios se han utilizado durante años como modelos de absorción, 

especialmente el de rata por su similitud con el hombre en cuanto a permeabilidad 

intestinal y por su facilidad de uso. Su principal ventaja es que utilizan el animal 

completo con sus estructuras tisulares y vasculares casi intactas, por lo que no 

debería haber problemas de viabilidad que afecten los mecanismos de transporte. 

Para realizar el experimento el animal debe estar anestesiado y se aísla una 

porción del intestino, la cual es perfundida con una solución diluida del fármaco, 

para así determinar la diferencia de concentración entre el líquido que entra y el 

que sale [1, 11]. 

1.3.2.- Cultivos celulares CaCo-2 

Propuesta por Hidalgo a fines de la década de los 80, estas células de 

carcinoma de colon humano son capaces de diferenciarse espontáneamente para 

formar una monocapa de enterocitos polarizados similares a los del intestino 

delgado, ya que poseen microvellosidades, sistemas transportadores como los de 

carbohidratos, aminoácidos, péptidos, y el transportador de eflujo glicoproteína P 

[1, 11]. Además, las monocapas celulares CaCo-2 se caracterizan por poseer 

valores de TEER similares a los obtenidos en colon, que son aproximadamente 

300 Ω x cm 2 . Los experimentos de transporte se realizan usando sistemas 

bicamerales conocidos como “Transwells” (Figura 3), en donde la cámara superior 

o apical contiene un soporte poroso de policarbonato o poliéster donde se cultivan 

las células y la cámara basolateral es la zona receptora. El crecimiento de las 

células se establece por un período de 19 a 23 días aproximadamente a 37°C en 

dióxido de carbono al 5% y 95% de humedad ambiental con medios de cultivo 

especiales [11]. Previo al trabajo con las monocapas, el medio de cultivo es 

19



sustituido por soluciones salinas tamponadas y después de un período de 

incubación se sustituyen los tampones por soluciones frescas, añadiendo el 

fármaco disuelto en tampón en la cámara apical. 

Cámara basolateral (receptora) con buffer 

Figura 3. . Esquema de un sistema bicameral Transwell. 

1.3.2.1.- Factores que influyen en el diseño de un experimento con monocapas 

celulares CaCo-2 

Si bien este modelo experimental ha mostrado con los años ser una muy útil 

herramienta para predecir la absorción oral de fármacos a través de la mucosa 

intestinal, es necesario considerar las limitantes intrínsecas del modelo al 

momento de planificar un estudio que tenga como objetivo describir un posible 

mecanismo de transporte, ya sea transcelular o paracelular [12]. Las desventajas 

de los cultivos CaCo-2 incluyen: 

Monocapa de células Caco-2 

Ausencia de una capa de mucus. 

Ausencia del sistema microsomal CyP3A4. 

Expresión variable de enzimas metabólicas. 

Incapacidad de estudiar variaciones regionales, debido a que las 

células no se diferencian de manera heterogénea. 

Cámara apical (donante) 

que contiene buffer 

Soporte de membrana porosa 

20



Excesiva rigidez de los epitelios formados y de la capa de agua 

estática. 

Menor permeabilidad de la monocapa. 

Actualmente, a pesar de estas limitaciones técnicas, los cultivos celulares 

CaCo-2 son considerados como un modelo estándar para la evaluación de 

permeabilidad de fármacos, e incluso con la implantación del sistema de 

clasificación biofarmacéutico (SCB) por Gordon Amidon, se ha demostrado que la 

velocidad de transferencia de masa de un fármaco a través de una monocapa de 

celulas CaCo-2 puede ser considerada como un parámetro de exención para 

realizar estudios de bioequivalencia in vivo. No obstante, con el tiempo se ha 

enfatizado el hecho que las condiciones de trabajo deben aproximarse en la 

medida de lo posible a la fisiología del intestino delgado para así estandarizar el 

modelo en cada caso particular, donde las propiedades fisicoquímicas del fármaco 

pueden ser incompatibles con el medio de cultivo, o este último no es 

fisiológicamente relevante como para obtener resultados extrapolables a la 

realidad en el cuerpo humano [13, 14]. A continuación se describen algunos 

factores a considerar en la realización de un estudio con monocapas CaCo-2, que 

se resumen en la figura 4. 

SOLUBILIDAD 

- Excipientes 

- Co-solventes 

- Albúmina 

ADSORCION 

- Albúmina 

- DMSO 

- Lavados múltiples 

- Pretratamiento con albúmina 

ASPECTOS FISIOLOGICOS 

- pH 

- Sales biliares 

UNION NO ESPECIFICA 

- Albúmina 

CONDICIONES SINK 

- Albúmina 

- Excipientes micelares 

- Cambio de medio 

- Co-solventes 

Figura 4. Factores que influyen en el diseño experimental con monocapas CaCo-2. 

Adaptado de Ingels et al., 2004 [12]. 

21



1.3.2.1.1.- Propiedades fisicoquímicas del fármaco y uso de solubilizantes 

Un considerable porcentaje de principios activos utilizados en terapéutica 

presentan algún inconveniente en cuanto a su solubilidad, limitando el uso de 

monocapas CaCo-2 sólo a fármacos solubles en los buffers de transporte. La 

solución más obvia es utilizar técnicas capaces de aumentar la solubilidad en el 

medio, de las cuales se citan la co-solvencia, complejación con ciclodextrinas y 

solubilización micelar. Sin embargo, no existe un consenso respecto a qué 

concentraciones utilizar ya que estas se han propuesto de manera arbitraria y sin 

considerar su relevancia fisiológica. Además, estos compuestos pueden cumplir 

más de una función, por ejemplo, existe un derivado de la vitamina E (vitamina E 

tocoferil polietilenglicol succinato) que ha sido bien estudiado [12, 15, 16] en 

cuanto a sus propiedades como solubilizante e inhibidor de la glicoproteína-P [15, 

16]. Sus acciones se han visto en el transporte de fármacos como el taxol y 

paclitaxel [17, 18]. En otro ámbito, ciertos tensioactivos como Tween 80 [16], 

dodecilsulfato de sodio y sales biliares (Deoxicolato sódico) son capaces de 

disminuir la TEER, convirtiéndolos en un facilitadores de la permeación [12, 14, 

19]. Debe destacarse que en el caso de las sales biliares, su presencia es 

biológicamente relevante por ser un constituyente de los fluidos secretados en el 

tracto gastrointestinal. 

1.3.2.1.2.- Medio de transporte y relevancia fisiológica 

En los experimentos de transporte se usa como medio una soluciones 

salina tamponada, que generalmente es HBSS (Hank´s buffered saline solution) 

suplementada con 25 mM de glucosa y HEPES o MES a pH 7,4. En un principio 

no se trabajaba con gradiente de pH, pero fue necesario establecer que en la 

cámara apical las condiciones deben asimilarse a las del intestino delgado, ya que 

en ayunas el pH del tracto gastrointestinal superior fluctúa en el rango de 5,0 a 

6,5, con un microclima acídico en la mucosa intestinal de aproximadamente 5,8 – 

6,3. Esto cobra relevancia en el caso de fármacos cuya solubilidad o transporte es 

22



pH dependiente y en la funcionalidad de proteínas transportadoras de la 

membrana intestinal [12, 14, 19]. Como se mencionó anteriormente, problemas de 

solubilidad en fármacos lipofílicos conlleva a que se produzca fenómenos de 

adsorción en la monocapa o paredes del “Transwell” y esto genera una 

problemática difícil de solucionar, dada la naturaleza acuosa de los medios de 

transporte. Se ha propuesto el uso de surfactantes y albúmina [12, 20] para 

disminuir la adsorción. 

Otro aspecto a considerar es la mantención de un gradiente de 

concentración que permita el transporte de fármaco, dado que en condiciones 

fisiológicas el fármaco que ha sido absorbido a través del epitelio intestinal llega a 

la circulación donde es rápidamente extraído de esa zona, creando este gradiente 

que en términos farmacéuticos se conoce como condición “sink”. La ausencia de 

esta condición hace que los resultados tengan un importante sesgo en el caso de 

fármacos poco solubles y altamente permeables, ya que se produce un reflujo del 

compuesto desde la cámara basolateral hacia la apical. Entre las soluciones 

propuestas se ha descrito el cambio de medio en la cámara basolateral durante 

los intervalos de muestreo y también la adición de albúmina en esta cámara [12, 

20]. 

1.4.- Estrategias para mejorar la absorción de fármacos 

macromoleculares e hidrofílicos desde el tracto gastrointestinal 

La absorción de fármacos hidrofílicos es significativamente menor a la de 

otros compuestos, ya que en el caso de estructuras polipeptídicas con pesos 

moleculares superiores a 1000 Da, la única forma de cruzar la barrera epitelial es 

por vía paracelular, y sumado al hecho que estas moléculas son degradadas por 

las enzimas presentes en el tracto gastrointestinal, el resultado es una baja o nula 

biodisponibilidad. Entonces, la modificación reversible de las Uniones Ocluyentes 

que unen a las células que forman el epitelio constituye un enfoque válido para 

conseguir incrementos en la absorción del fármaco de interés. En la tabla 2 se 

23



muestran algunos de los promotores de la permeación gastrointestinal más 

estudiados [5]. 

Tabla 2. Promotores de la permeación gastrointestinal. Adaptado de Deli, 2009 [5]. 

Compuesto Organo/Tejido/Cultivo Fármaco/Marcador 

Duodenal 

∆G in vivo, cánula intraduodenal en ratas Ciclosporina, saquinavir 

AT-1002 

Yeyunal 

in vivo, cánula intraduodenal en ratas Ciclosporina 

Zot ex vivo, conejos, cámara de Ussing Insulina, PEG 4000 

Zonulina ex vivo, conejos, cámara de Ussing Disminución de resistencia tisular 

C-CPE in situ, ratas, ensayo de asa FITC-dextran 4 kDa, 10 KDa 

Caprato sódico in situ, ratas, ensayo de asa FITC-dextran 4 kDa 

Dimetil-β-ciclodextrina in situ, ratas, ensayo de asa Insuina 

Donadores de NO ex vivo, rata, cámara de Ussing 5(6)-carboxifluoresceina 

Ileal 

Zot ex vivo, conejos, cámara de Ussing Disminución de resistencia tisular 

ex vivo, conejos, cámara de Ussing Insulina, inmunoglobulinas, PEG 4000 

Zonulina ex vivo, mono rhesus, cámara de Ussing Disminución de resistencia tisular 

Caprato sódico in vivo, rata Polisacarosa 

Donadores de NO ex vivo, rata, cámara de Ussing 

Colónica 

Zonulina ex vivo, mono rhesus, cámara de Ussing Disminución de resistencia tisular 

Zot in vitro, monocapas CaCo-2 Paclitaxel, doxorrubicina, aciclovir 

C-CPE in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER, FITC-dextran 4 kDa 

Acido oléico in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER, manitol 

Caprato sódico in situ, rata, ensayo de asa FITC-dextran 4 kDa 

in vitro, monocapas CaCo-2 Manitol 

Dodecilsulfato sódico in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER, manitol 

Tween 20 in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER, metformina 

Sales biliares in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER 

Quitosanos in vitro, monocapas CaCo-2 ↓ TEER, insulina 

Donadores de NO ex vivo, rata, cámaras de Ussing 5(6)-carboxifluoresceina 

Rectal 

Enterotoxina de E.coli in vivo, ratón Toxoide tetánico 

Ciclodextrinas in vivo, conejo Insulina 

Caprato sódico in vivo, humanos Amplicilina 

Donadores de NO in vivo, conejo Insulina 

24



Los objetivos moleculares de estos compuestos promotores de la 

permeación incluyen a la mayoría de los constituyentes de las Uniones 

Ocluyentes, y sus acciones ocurren a varios niveles, ya sea por interacciones 

físicas como por modificaciones en vías de transducción de señales [5]. La tabla 3 

resume algunos mecanismos de acción propuestos hasta el momento para cada 

grupo estudiado. 

Tabla 3. Mecanismos de acción de promotores de la permeación. Adaptado de Deli, 2009 [5]. 

Queladores 

Compuesto Objetivo molecular, mecanismo de acción 

EGTA, EDTA, BAPTA ↓[Ca ++ ], PKC, desensamblaje de Uniones 

Acidos grasos, ácidos grasos 

modificados 

Ocluyentes y Adherentes 

Acido oléico Aglomerados lipídicos, PKC, gap junctions 

Caprato sódico PLC, PI3, redistribución de proteínas de Uniones 

Ocluyentes 

Palmitoil carnitina PKC, gap junctions 

Surfactantes 

Dodecilsulfato sódico Reorganización de actina, ↑[Ca ++ ] 

Sales biliares: colato sódico, taurocolato Reorganización de actina, ↑[Ca ++ ] 

Polímeros catiónicos 

Poli-L-lisina, poli-L-arginina PKC, fosfolipasa C 

Quitosano PKC, reorganización de actina, ocludina, zonulina 

Ciclodextrinas 

Dimetil-β- Ciclodextrina Depleción de colesterol, disrupción de Uniones 

Donadores de óxido nítrico 

Ocluyentes 

Cereport, DEA-NONOato, PAPA-NONOatp ↑[Ca ++ ], apertura de Uniones Ocluyentes 

Soluciones hiperosmóticas 

Manitol Src kinasa, fosforilación de β-catenina 

25



En la práctica, los ácidos grasos y las ciclodextrinas son los grupos de 

compuestos con más aplicaciones farmacéuticas descritas, ya que en el caso de 

los ácidos grasos, el ácido oleico ha sido utilizado con éxito en formulaciones 

tópicas, y el caprato sódico ha encontrado su utilidad en preparados administrados 

en el tracto gastrointestinal [21-23]. Sobre el último compuesto, su mecanismo de 

acción ha sido bien caracterizado en monocapas celulares CaCo-2, donde 

produce un aumento reversible de la permeabilidad por redistribución del 

citoesqueleto y algunas proteínas de las Uniones Ocluyentes como ocludina, 

además de abrir las mismas por la vía de la Fosfolipasa C. 

Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos obtenidos desde el almidón, y 

su uso como excipiente farmacéutico está enfocado en su acción como formador 

de complejos de mayor solubilidad. No obstante, se ha evidenciado que son 

capaces de aumentar la permeabilidad, especialmente la dimetil-β-ciclodextrina, 

un derivado que ha mejorado la absorción de insulina y heparinas en mucosa 

nasal e intestinal [5, 24]. 

Otro integrante que se ha posicionado como excipiente farmacéutico es el 

Quitosano, polímero catiónico que goza de aceptación por su compatibilidad 

biológica y versatilidad en cuanto a usos. Su aplicación como mejorador de la 

permeación ha cobrado interés en los últimos 20 años gracias a la posibilidad de 

modificar la estructura base para obtener derivados más compatibles con el 

ambiente fisiológico del organismo y a su vez tanto o más efectivos que el 

precursor. Si bien los resultados han sido prometedores en modelos in vivo e in 

vitro, en la actualidad se han generado algunos cuestionamientos respecto a la 

inocuidad de los derivados de quitosano, pero la dirección que han asumido los 

grupos de investigación dedicados al tema lleva a pensar que en el corto plazo se 

podrá contar con una caracterización definida de la toxicidad en modelos 

animales y líneas celulares. 

26



1.5.- Quitosano 

1.5.1.- Propiedades 

Químicamente, el Quitosano (Figura 5) es estructurado en base a unidades 

de 2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopiranosa y 2-amino-β-D-glucopiranosa unidas 

en los carbonos 1 – 4, y se obtiene por N-desacetilación alcalina de la quitina, el 

principal componente de los exoesqueletos de camarones, jaibas y krills. Si el 

grado de N-acetilación de la quitina es inferior a un 50%, se vuelve soluble en 

soluciones ácidas y se considera como Quitosano. La solubilidad en estas 

condiciones se debe a la protonación del grupo amino (pKa 5.5 – 6.5) que se 

encuentra en las unidades de D-glucosamina, lo cual permite formar sales con 

ácidos inorgánicos y orgánicos. También, el Quitosano se caracteriza por la 

relación entre unidades acetIladas y desacetiladas, así como por su peso 

molecular, parámetros responsables de las propiedades del polímero [3, 25, 26]. 

Figura 5. Estructura química de Quitosano [26]. 

Existen diferentes grados comerciales de Quitosano, que varían en su 

pureza, peso molecular y grado de desacetilación. Esto depende en gran parte del 

método de fabricación, evaluando la presencia de metales pesados, proteínas, 

pirógenos y otros compuestos que no son de interés. 

Desde un punto de vista práctico, las aplicaciones del Quitosano 

comprenden su uso como aditivo para alimentos, agente de purificación de agua, y 

aglutinante o desintegrante en formas farmacéuticas sólidas. A valores de pH 

bajos el quitosano es capaz de formar geles y es usado como medio de transporte 

de principios activos en formulaciones de tipo hidrocoloidal y gel. 

27



1.5.2.- Preparación de Quitosano 

En primer lugar, las proteínas del caparazón de crustáceos como jaiba o 

camarón son removidas mediante un tratamiento con hidróxido de sodio acuoso a 

80 – 90 °C por unas horas. Posteriormente, los comp onentes inorgánicos se 

eliminan por adición de ácido clorhídrico al 3 – 5 %, dando un aspecto claro a la 

quitina procesada. El tratamiento con hidróxido de sodio al 40 – 45 % por 4 – 5 

horas produce la N-desacetilación de la quitina, y el precipitado insoluble que se 

forma es lavado con agua para obtener el Quitosano crudo. Las condiciones 

usadas para la N-desacetilación determinarán el peso molecular y el grado de 

desacetilación del polímero [25]. 

1.5.3.- Propiedades biológicas de Quitosano 

1.5.3.1.- Biodegradabilidad 

Quitosano es un material completamente biodegradable, propiedad que es 

muy importante, principalmente debido a que es un compuesto ausente en 

estructuras vivas como mamíferos. Su estructura constituye una fuente de carbono 

y nitrógeno para varios tipos de bacterias que ya han desarrollado enzimas como 

quitin desacetilasas, quitinasas, quitosinasas, glucosinaminidasas y N- 

acetilglucosinaminidasas. En animales existe la capacidad para hidrolizar 

quitosanos con porcentajes de acetilación superiores a 30%, pero se postula que 

un requisito necesario para lograr la hidrólisis es que haya por lo menos tres 

residuos N-acetilados para que la enzima sea capaz de reconocer el compuesto. 

Esto lleva a inferir que la biodegradabilidad del Quitosano depende de factores 

como el grado de acetilación, peso molecular, estado cristalino, contenido de agua 

y el estado físico superficial del material [25]. 

28



1.5.3.2.- Biocompatibilidad en administración oral 

Entre las aplicaciones descritas del Quitosano, su uso como excipiente de 

productos alimentarios está bien caracterizado. No se han observado reacciones 

adversas producto de la administración oral, y se ha visto en modelos animales 

como conejos que el valor de LD50 para Quitosano es superior que el reportado 

para glucosa. Además, se observó que los órganos digestivos contienen residuos 

de comida más Quitosano floculado, lo cual indica que en el medio ácido 

estomacal quitosano se disuelve. Otro aspecto meritorio que refuerza la 

biocompatibilidad de Quitosano es que hasta el momento no se ha publicado 

algún reporte que demuestre aspectos sobre la metabolización del polímero en 

células intestinales [25]. 

1.5.3.3.- Citocompatibilidad, adhesión celular y proliferación celular en Films de 

Quitosano 

Estudios recientes han demostrado que el Quitosano es compatible con 

células como queratinocitos, fibroblastos y condrocitos. Los test de adhesión 

celular mostraron que este parámetro es inversamente proporcional al grado de 

acetilación en las dos primeras líneas celulares, pero en el caso de los 

fibroblastos, la proliferación celular es menor porque el grado de adhesión es 

mayor. Sin embargo, para los queratinocitos la adhesión es buena con una 

razonable proliferación [25]. 

1.5.3.4.- Propiedades bacteriostáticas y fungistáticas 

Se ha visto que el Quitosano en la mayoría de sus formas físicas muestra 

propiedades bacteriostáticas y fungistáticas. Tales características son 

especialmente interesantes dado que Quitosano es considerado como un 

compuesto de baja toxicidad [25]. Entre los tipos de bacterias y hongos que se han 

mostrado susceptibles al efecto del Quitosano se citan: 

29



• Bacterias: Escherichia, Pseudomonas, Lactobacilos, Estafilococos, 

Micrococos, Enterococos y Clostridium. 

• Hongos y levaduras: Candida, Fusarium, Scombomorus, 

Pseudosciaena, Botritis, Saccharomyces, Pyricularia. 

1.5.4.- Propiedades mucoadhesivas de Quitosano y utilidad como promotor 

de la permeación 

El término bioadhesión se refiere a la capacidad que tiene un material 

biológico o sintético para adherirse a un tejido biológico por un período 

prolongado. Generalmente se considera a los términos bioadhesividad y 

mucoadhesividad como sinónimos, pero un aspecto que distingue a estos 

conceptos es que cuando se habla de un material mucoadhesivo, es porque su 

estructura le permite unirse a membranas mucosas como la bucal, intestinal y 

vaginal. Los polímeros mucoadhesivos han recibido considerable atención debido 

a que son capaces de prolongar el tiempo de residencia y la localización de 

formulaciones de liberación controlada [27]. La interacción entre el compuesto y la 

mucosa puede ocurrir a través de enlaces químicos tipo iónico, covalentes, 

puentes de hidrógeno, dipolo-dipolo (van der Waals) o hidrofóbicos, 

distinguiéndose dos etapas en el proceso de adhesión: 

1. Etapa de contacto: Hay una interacción física entre el material 

mucoadhesivo y la mucosa. 

2. Etapa de consolidación: Se manifiestan ciertos fenómenos que consolidan y 

fortalecen la unión adhesiva, haciendo que su duración sea prolongada. 

A principios de la década del 90, Lehr y colaboradores descubrieron que el 

quitosano en un estado hinchado exhibe propiedades mucoadhesivas en mucosa 

intestinal de porcinos [28]. En la actualidad, se sabe que los efectos de Quitosano 

no sólo se remiten su mucoadhesividad, ya que presenta acciones sobre la 

30



permeabilidad de membranas epiteliales que dependen del pH de las soluciones, y 

este fenómeno se ha visto en el transporte de una molécula utilizada como 

marcador, el 14 C-manitol, que alcanza sus máximos valores cuando el pH es 

inferior al pKa de 6,5 [29]. Quitosano es prácticamente insoluble a valores de pH 

mayores, donde la estructura adquiere una conformación de espiral, que es 

reversible a una configuración más elongada cuando el pH disminuye. Además, a 

valores de pH bajos la densidad de carga es mayor, lo cual favorece el contacto 

con la membrana epitelial. Un factor determinante en la densidad de carga de 

Quitosano es el grado de acetilación, ya que sólo las unidades de N-glucosamina 

pueden cargarse positivamente, y esto también incide en el perfil toxicológico del 

compuesto. Se ha demostrado que los Quitosanos de bajo peso molecular (22 

kDa) y alto grado de acetilación (≥ 35%) carecen de propiedades mejoradoras de 

la absorción, mientras que los Quitosanos de bajo grado de acetilación y/o alto o 

bajo peso molecular incrementan la permeabilidad epitelial del intestino, con un 

nivel de toxicidad que depende más del grado de acetilación que del peso 

molecular. Por tanto, se ha concluido que las características estructurales 

determinantes en el mejoramiento de la absorción no están relacionadas con 

aquellas que determinan su toxicidad, por lo que es posible elegir una 

considerable variedad de Quitosanos con una relación beneficio/riesgo favorable 

[30]. 

El aumento en la permeabilidad celular por acción del Quitosano es 

dependiente de su concentración, pero hay un límite que es justificado por su 

mecanismo de acción, que es la apertura de las uniones paracelulares. Se postula 

que el grupo amino cargado positivamente interacciona con los sitios 

negativamente cargados de las membranas celulares y las uniones ocluyentes del 

epitelio. También, se ha propuesto que el incremento en la permeabilidad a través 

de las uniones ocluyentes se debe a la redistribución de las proteínas F-Actina 

(un componente del citoesqueleto), ZO-1 y ocludina por acción del polímero [5, 31, 

32]. 

Sin embargo, tal como se mencionó anteriormente, el máximo efecto del 

Quitosano se obtiene en medio ácido, bajo su pKa, ya que en un medio neutro o 

31



básico quitosano precipita desde la solución perdiendo sus propiedades. En este 

mismo aspecto, si bien las sales de Quitosano (clorhidrato y glutamato) son 

capaces de reducir la TEER a pH 6.2 [33, 34] y 7,0 [35], no producen ningún 

efecto sobre este parámetro a pH 7,4 [34]. Debido a que el quitosano tiene un 

enorme potencial como excipiente, esta limitante llevó a los grupos de 

investigación a sintetizar nuevos derivados de Quitosano que mantengan o 

superen su efectividad, trabajando en un rango de pH más amplio. 

1.5.5.- Derivados de Quitosano 

En un principio, las modificaciones químicas realizadas a la estructura del 

Quitosano tuvieron como principal objetivo aumentar la solubilidad acuosa del 

polímero. No obstante, de forma paralela se descubrió que la inclusión de ciertos 

grupos funcionales mejora la compatibilidad con principios activos y potencia el 

carácter mucoadhesivo, aumentando el tiempo de residencia en la zona de 

absorción. Como ejemplo de primer caso está el N-carboximetilquitosano, que es 

un derivado concebido por la incapacidad que tienen los productos de amonio 

cuaternario para mejorar la absorción de moléculas aniónicas, ya que la 

interacción con el polímero de carga positiva forma un par iónico de solubilidad 

reducida [36]. También, el N-carboximetilquitosano ha encontrado utilidad como 

excipiente para liberación controlada de fármacos [37], fabricación de membranas 

para regeneración de tejidos [38] y purificación de efluentes industriales. Los sitios 

reactivos para la carboximetilación del Quitosano son los grupos amino e hidroxilo 

presentes en la molecula. Para el segundo caso, se han sintetizado polímeros con 

mayor capacidad mucoadhesiva gracias a la inclusión de grupos tiol en su 

estructura, obteniendo interesantes resultados en polímeros aniónicos como la 

carboximetilcelulosa sódica. Respecto a Quitosano, se sabe que su naturaleza 

catiónica provoca la interacción con las subestructuras aniónicas del mucus, y por 

tal razón, se considera como válida la premisa de mejorar aún más la 

mucoadhesividad del polímero incluyendo grupos tiol en su estructura, los cuales 

interactúan con los grupos del mucus formando enlaces covalentes. Así, se 

32



evidenciaría un efecto potenciado sobre la permeabilidad epitelial [39, 40]. Las 

propiedades del derivado Quitosano-4-tio-butildiamina (Quitosano-TBA) han sido 

evaluadas en modelos biológicos, demostrando que si se asocia el compuesto a 

un mediador de la permeación como glutatión reducido (GSH), aumenta la 

permeabilidad epitelial por vía paracelular de la misma forma como se evidenció 

usando combinaciones de polimeros aniónicos y GSH. Es necesario destacar que 

en todos los casos presentados la mezcla de polímeros y GSH es más efectiva 

que el polímero por si mismo [4]. 

1.5.5.1.- Cloruro de N-trimetilquitosano (TMQ) 

De todos los derivados semisintéticos del Quitosano, el cloruro de N- 

trimetilquitosano es el que ha sido más estudiado en cuanto a sus características 

físicas, métodos de obtención y efecto biológico. TMQ (Figura 6) se sintetiza por 

metilación reductiva del grupo amino con yodometano [41], obteniendo un 

derivado de amonio cuaternario soluble en agua. 

Figura 6. Estructura química del cloruro de N-trimetilquitosano [26]. 

El grado de cuaternización del polímero puede controlarse repitiendo en 

forma sucesiva las metilaciones, pero se ha visto que el derivado obtenido por 

metilación simple es soluble a pH neutro y alcalino [42]. 

33



1.5.5.1.1.- Uso del cloruro de TMQ como promotor de la permeación 

En soluciones preparadas en el rango de 0.5 – 2.5 % p/v ha demostrado 

reducir significativamente la resistencia eléctrica transepitelial de monocapas 

celulares CaCo-2, aumentando así el transporte de algunos compuestos 

hidrofílicos como 14 C-manitol [43-46], el péptido buserelina [47] y la hormona 

insulina [48]. A un pH de 7.4, en el cual quitosano es insoluble, TMQ resultó ser 

tan efectivo como Quitosano a pH 5.6, y un factor que es determinante en la 

efectividad de TMQ es el grado de cuaternización, que si es elevado (60 % 

aproximadamente), puede reducir los valores de TEER incluso a bajas 

concentraciones del polímero (0.05 %), fenómeno que no ocurre en TMQ con 

bajos grados de cuaternización (≈ 12%) [46]. Un estudio realizado con el péptido 

octreótido, análogo de la hormona somatostatina usado para el control de ciertos 

tumores endocrinos del tracto gastrointestinal y el tratamiento de la acromegalia, 

demostró que cuando se utiliza TMQ con 60 % de cuaternización hay un aumento 

significativo de la permeabilidad en cultivos de células CaCo-2, mientras que en 

ratas se aprecia un aumento de la biodisponibilidad por lo menos de 5 veces 

respecto al control [49]. Estos resultados han sido corroborados en otras 

investigaciones que han utilizado modelos de absorción transcorneal, transdermal, 

nasal y bucal [45, 50-53]. 

1.5.5.1.2.- Síntesis de TMQ 

La primera evidencia que afirma la posibilidad de metilar el grupo amino de 

Quitosano fue presentada por Muzzarelli et al., en 1985 mediante una reacción 

con formaldehido, borohidruro de sodio y yodometano [41]. Demostraron que era 

posible lograr una trimetilación de hasta el 60 % de los grupos amino, sumado al 

hecho que se evitaría la escisión de las cadenas de Quitosano y la metilación 

sería efectiva al no interaccionar con los grupos hidroxilo de la estructura. Sin 

embargo, tales postulados no fueron investigados. La figura 7 presenta un 

esquema de la síntesis de Muzarelli. 

34



Etapa 1: Monoalquilación de la amina 

O 

Etapa 2: Cuaternización 

O 

HO 

HO 

OH 

OH 

O 

NH 2 

O 

NH 

CH 3 

H 

H 

HCHO 

CH 3I, NaI 

N-metilpirrolidona 

O 

HO 

NaBH 4 

N-metilquitosano N-trimetilquitosano 

O 

HO 

O 

HO 

OH 

C 

H 2 

OH 

OH 

N 

O 

O 

NH 

CH 3 

O 

N + 

H3C H3C CH3 Figura 7. Síntesis de TMQ propuesta por Muzzarelli et al. 

Adaptado de Belalia et al., 2008 [41]. 

H 

H 

H 

Base de Schiff 

Domard et al., desarrollaron un método basado usando N-metilpirrolidona 

como medio de disolución y yoduro de sodio como catalizador. Se realiza la 

metilación de quitosano con un exceso de yodometano en medio básico. Después 

de varios intentos destinados a mejorar la reproducibilidad del método, el grupo de 

Sieval et al. 1999 desarrollaron un método bien caracterizado que se convirtió en 

el estándar para futuras investigaciones debido a su sencillez [42],. Se resalta la 

particularidad que es posible controlar el porcentaje de cuaternización variando el 

número de etapas de la reacción, y dado que el uso de una base mejora el 

rendimiento de metilación, con una síntesis de dos etapas se obtiene un producto 

razonablemente sustituido. Aumentando el número de etapas a tres, la 

cuaternización supera el 80 % pero con una evidente pérdida de selectividad, ya 

que los grupos hidroxilo de los carbonos 3 y 6 sufren metoxilación, disminuyendo 

de manera considerable la solubilidad del producto. Debido a que la sal yoduro es 

35



poco soluble, se realiza intercambio iónico con cloruro de sodio para así formar el 

producto final que es cloruro de N-trimetilquitosano [42]. 

Dado que las condiciones de reacción involucran el uso de altas 

temperaturas, se evidencia una disminución en la viscosidad del producto final por 

escisión de la cadena polimérica, llevando a que la reproducibilidad de la síntesis 

sea variable y dependiente de la materia prima [54]. La figura 9 muestra la vía 

sintética optimizada por Sieval [42]. 

O 

HO 

O 

HO 

OH 

OH 

O 

O 

NH 

HO 

2 OH 

O 

C 

H 3 

OH 

CH 3 I, NaI, NaOH 

60°C, NMP 

OH 

Figura 8. Síntesis de TMQ propuesta por Sieval et al. 

Adaptado de Verheul et al., 2008 [56]. 

Jia et al. 2001, modificaron la vía sintética de Muzzarelli añadiendo 

hidróxido de sodio en la segunda etapa de síntesis para aumentar la metilación del 

polímero, pero esto conllevó a que el material sufriera metoxilación [55]. No 

obstante, Verheul et al. 2008, determinaron que si es posible obtener un producto 

O 

NH 

O 

O 

HO 

OH 

O 

O 

H3C N 

OH 

CH3 HO 

NH 

O 

O 

OH 

H3C Escisión 

C 

H 3 

O 

O-metilación 

OH 

O 

O 

NH 2 

CH 3 

O 

N + 

H3C H3C CH3 n 

n 

36



íntegro, sin escisión de la cadena polimérica y carente de metoxilación en los 

grupos hidroxilo [56]. En este caso se propone que al sustituir el ácido acético por 

ácido fórmico como medio de disolución en la primera reacción de metilación, se 

evita el uso de borohidruro de sodio como agente reductor, obteniendo de este 

modo un intermediario dimetilado que es disuelto en medio básico para gelificarlo 

y desprotonar la amina sustituida. Posteriormente, el gel es sometido a la segunda 

reacción de metilación usando N-metilpirrolidona como medio de suspensión y 

yodometano como agente alquilante a una temperatura de 40°C. Al no utilizar 

hidróxido de sodio en esta etapa se evita la formación de productos metoxilados. 

O 

HO 

O 

H O 

O H 

O H 

O 

N-dim etilquitosano 

O 

N H 

H O 

2 O H 

O 

N-trim etilquitosano 

O 

H O 

H 3C N 

O H 

C H 3 

O 

H O 

O H 

O 

O 

N 

H O 

H C O H 

3 CH 3 

C 

H 3 

C 

H 3 

C 

H 3 

O H 

O H 

O H 

O 

NH 

O 

O 

CO O H 

CH O 

70°C 

N H 

O 

CH 3 I 

O 

N H 

O 

O 

H O 

O H 

O 

H O 

O H 

40°C, NM P 

O 

H O 

O H 

O H 

O H 

O 

N H 2 

O 

N 

H 3C C H 3 

O H 

O 

N 

H 

+ 

H 3C 

H 3C 

C H 3 

Figura 9. Síntesis de TMQ propuesta por Verheul et al. 

Adaptado de Verheul et al., 2008 [56]. 

n 

n 

n 

37



De forma paralela a las investigaciones de Verheul, Rünnarsson et al. 2008, 

observaron que al usar una mezcla dimetilformamida/agua como solvente y sin un 

catalizador como yoduro de potasio, se reduce de manera significativa la 

metoxilación del polímero [57, 58]. Además, al trabajar a temperatura ambiente no 

se produce escisión de la cadena, independiente del número de etapas que se 

utilicen para la síntesis. De todos los métodos disponibles este se caracteriza por 

su sencillez, pero una limitante es el hecho que sólo ha sido probado en 

Quitosanos de bajo peso molecular u olígómeros [58]. 

Un método alternativo es el propuesto por de Britto et al. 2007, el cual usa 

dimetil sulfato como agente alquilante [59]. Tiene la particularidad de ser muy 

simple de implementar gracias a que se realiza en solo una etapa, a temperatura 

ambiente y sin el uso de reactivos de alto precio. Sin embargo, al igual que 

muchas de las síntesis presentadas, el grado de metoxilación es evidente y difícil 

de controlar. 

1.5.5.1.3.- Caracterización del cloruro de N-trimetilquitosano 

El principal parámetro que caracteriza a este derivado es el porcentaje de 

cuaternización, seguido de su peso molecular. El método más comúnmente 

utilizado para determinar el grado de cuaternización es la espectroscopía de 

resonancia magnética nuclear de protones ( 1 H-RMN), donde se calcula una 

relación entre los desplazamientos químicos asignado a los protones de los 

grupos metilo pertenecientes a la amina cuaternaria que se encuentran a 3,3 ppm 

y los protones unidos al carbono 1 del anillo glucosidico ubicados entre 4,5 y 5,5 

ppm aproximadamente [42, 56, 58]. Para asegurar la máxima resolución posible 

durante el análisis y poder visualizar las bandas espectrales de interés, se 

propone trabajar a 80°C, ya que a temperaturas meno res no es posible distinguir 

las señales en el rango de 4,5 – 5,5 ppm. 

Otra herramienta instrumental que tiene utilidad pero desde un punto de 

vista cualitativo es la espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier 

(FT-IR), la cual permite apreciar la diferencias espectrales entre el derivado 

38



metilado y el producto inicial. En el espectro del cloruro de TMQ, hay una 

disminución en la banda ubicada a 1590 cm -1 que es asignada a la deformación 

angular del grupo amino, y a su vez aparece otra señal a 1475 cm -1 que 

corresponde al estiramiento asimétrico del C-H perteneciente a los grupos metilo 

no presentes en Quitosano. 

1.6.- Capreomicina 

1.6.1.- Propiedades fisicoquímicas 

Capreomicina es un antibiótico de naturaleza peptídica, obtenido desde 

cepas de Streptomyces capreolus. Se caracteriza por ser una mezcla de cuatro 

polipéptidos (IA, IIA, IB, IIB) de los cuales la especie IB predomina y es de interés 

farmacológico junto a la especie IA. Las especies IIA y IIB representan 

aproximadamente el 10 % del total y carecen del aminoácido lisina [2]. 

Figura 10. Estructura química de Capreomicina [2]. 

Se presenta como un polvo blanco o blanquecino, libremente soluble en 

agua e insoluble en la mayoría de los solventes orgánicos. Es estable en agua en 

el rango de pH 4-8, perdiendo esta característica en medios fuertemente ácidos o 

alcalinos. 

39



El espectro ultravioleta de capreomicina sulfato presenta un máximo de 

absorción a 268 nm en soluciones ácidas. En soluciones alcalinas se aprecia 

efecto batocrómico, desplazándose el máximo a 289 nm. 

1.6.2.- Farmacología 

Capreomicina sulfato es un agente bacteriostático utilizado para el 

tratamiento de la tuberculosis producida por cepas de Mycobacterium tuberculosis 

resistentes a los medicamentos (Isoniazida, Rifampicina, Etambutol, 

Estreptomicina) de primera línea. No es un fármaco de elección debido a su 

toxicidad renal y auditiva [2]. 

1.6.3.- Farmacodinamia 

Su mecanismo de acción no se conoce de manera precisa, sin embargo, 

está determinado que Capreomicina interactúa con los ribosomas bacteriales e 

inhibe la síntesis de proteínas. Experimentos han sugerido que Capreomicina 

actúa sobre otras estructuras blanco, lo cual explica su eficacia sobre formas 

resistentes de Mycobacterium tuberculosis [2]. 

La resistencia a Capreomicina se asocia a cambios ribosomales en el rRNA 

16S. Es posible que haya resistencia cruzada con Estreptomicina, pero se ha visto 

que Capreomicina mantiene su actividad in vitro frente a cepas resistentes a 

Estreptomicina, Kanamicina y Amikacina. Otro mecanismo de resistencia es 

mediante la inactivación de la enzima metilasa ribosomal. Capreomicina no exhibe 

resistencia cruzada con otros agentes antituberculosos como Isoniazida, ácido 

aminosalicílico, Etambutol, Cicloserina y Etionamida [2]. 

1.6.4.- Farmacocinética 

En humanos, Capreomicina no se absorbe por vía oral y se desconoce la 

razón de este fenómeno. No obstante, cuando se administra por vía intramuscular, 

40



se obtiene una Cmax superior a la alcanzada por vía endovenosa. No se acumula 

en el organismo incluso después de administrar dosis de 1 gramo por 30 días [2]. 

La excreción de Capreomicina se realiza por vía renal. En 12 horas se 

excreta aproximadamente el 52 % como fármaco inalterado y se desconoce si es 

excretado a través de la leche materna. 

1.6.5.- Toxicidad y reacciones adversas 

Capreomicina comparte varios de los efectos adversos auditivos mostrados 

por los aminoglicósidos. El daño renal aparentemente se debe a una tubulopatía 

que deriva en alcalosis. Se ha visto que en el 36 % de 722 pacientes tratados con 

Capreomicina hay alteraciones del nitrógeno uréico sanguíneo (BUN), alcanzando 

concentraciones por encima de 20 mg/100 mL. Esto es un indicativo que debe 

reducirse la dosis o discontinuar la terapia. Se recomienda realizar un monitoreo 

continuo de la función hepática y electrolitos, ya que el uso prolongado de 

Capreomicina modifica ciertos parámetros y los niveles séricos de potasio [2]. 

Por otra parte, las reacciones hematológicas como leucocitosis o 

leucopenia son de especial cuidado. También se ha reportado eosinofilia, la cual 

disminuye con reducciones de dosis [2]. 

Durante la administración de Capreomicina se ha reportado dolor en la zona 

de punción, así como excesivo sangramiento y abscesos estériles [2]. 

1.6.6- Interacciones 

Existe un alto riesgo de daño renal cuando se administra Capreomicina con 

fármacos como Vancomicina, Cisplatino y aminoglicósidos. Se han reportado 

manifestaciones alérgicas con la administración conjunta de Capreomicina y otros 

antituberculosos, y también es capaz de aumentar el efecto de bloqueadores 

neuromusculares [2]. 

41



1.6.7.- Posología 

Capreomicina sulfato se administra por vía intramuscular, 1 gramo cada 24 

horas por 60 - 120 días, seguido de 1 gramo 2 ó 3 veces por semana. 

42



2.- HIPOTESIS Y OBJETIVOS 

2.1.- Hipótesis de trabajo 

El polímero Quitosano y sus derivados son capaces de modular de manera 

reversible las Uniones Ocluyentes de células epiteliales del intestino delgado, 

aumentando de este modo el transporte paracelular de moléculas con alto peso 

molecular y carácter hidrofílico que no pueden atravesar barreras epiteliales por 

otros mecanismos de absorción. Como el Quitosano no es soluble al pH del 

intestino delgado, la metilación selectiva en la función amino de la molécula forma 

un derivado de amonio cuaternario soluble a pH intestinal conocido como N- 

trimetilquitosano, que en su sal de cloruro, es capaz de incrementar la 

permeabilidad de estas moléculas. Capreomicina sulfato es un fármaco que reúne 

las características fisicoquímicas previamente descritas y por tanto el uso de 

productos basados en Quitosano representan una alternativa viable para aumentar 

su biodisponibilidad oral, que es menor al 1%. 

2.2.- Objetivo general 

Evaluar la influencia del cloruro de N-trimetilquitosano sobre la 

permeabilidad de Capreomicina sulfato en modelos in vitro e in vivo. 

2.3.- Objetivos específicos 

• Implementar y validar una metodología analítica para la determinación de 

Capreomicina sulfato en medios de cultivo celular y matrices biológicas. 

• Realizar la modificación química del polímero Quitosano con un método 

simple y reproducible, para obtener el cloruro de N-trimetilquitosano. 

43



• Determinar la viabilidad de la línea celular de carcinoma humano de colon 

Caco-2 ante la presencia de concentraciones crecientes de Capreomicina 

sulfato y cloruro de N-trimetilquitosano. 

• Evaluar el efecto del cloruro de N-trimetilquitosano sobre la resistencia 

eléctrica transepitelial de monocapas celulares CaCo-2. 

• Evaluar el efecto del cloruro de N-trimetilquitosano sobre la permeabilidad 

de Capreomicina sulfato en monocapas celulares CaCo-2. 

• Realizar un estudio farmacocinético de una forma farmacéutica prototipo 

que contenga un cloruro de N-trimetilquitosano en un modelo animal 

apropiado. 

44



3.- MATERIALES Y REACTIVOS 

3.1.- Material biológico 

• Células de carcinoma humano de colon CaCo-2, obtenidas desde el 

American Type Cell Collection (Rockville, USA) y donadas por el Dr. Julio 

Núñez de la Pontificia Universidad Católica de Chile. 

3.2.- Equipos y fungibles 

• HPLC Merck Hitachi, Japón 

- Bomba cuaternaria Lachrom Elite L-2130 con interfase on board, 

Merck-Hitachi, Japón. 

- Autosampler LaChrom Elite L-2200, Merck-Hitachi, Japón. 

- Detector UV LaChrom Elite L-2400, Merck-Hitachi, Japón. 

- Horno LaChrom Elite L-2300, Merck-Hitachi, Japón. 

• Software de obtención de datos Scientific Software Ez Chrom Elite para 

HPLC LaChrom Elite. 

• Columna Waters XTerra RP-18 150x3,0 mm 3 µm tamaño de partícula, 

Irlanda. 

• Liofilizador FreeZone 4,5 litros, Labconco, USA. 

• Vasos de liofilización con tapa de caucho 600 mL, Labconco, USA. 

• Voltohmetro EVOM, World Scientific Instruments, USA. 

• Electrodo STX-3, World Scientific Instruments, USA. 

• Equipo filtrador WWR, Alemania. 

• Filtros de membrana Nylon 0.45 µm diámetro de poro, Whatman, Inglaterra. 

• Bomba de vacío Brand Vacuubrand modelo ME 2C, Alemania. 

• Agitador magnético Heidolph modelo 04639, Alemania. 

45



• Minishaker IKA modelo MS1, USA. 

• pHmetro WWR modelo 8005 con electrodo Ag/AgCl SympHony WWR, 

USA. 

• Rotavapor Heidolph modelo Laborota 100, Alemania. 

• Estufa de Convección Memmert, Alemania. 

• Membranas de diálsis Cut-off 14.000 Da, Sigma, USA. 

• Frascos de cultivo estériles con filtro T75, Corning, USA. 

• Microtubos Eppendorf 1,5 mL desechables. 

• Tubos estériles Falcon de 15 y 50 mL, Becton-Dickinson, Inglaterra. 

• Balanza analítica Mettler Toledo AB204-S, Suiza. 

• Matraces aforados 100 mL. 

• Matraces Erlenmeyer 125 y 250 mL. 

• Micropipetas Eppendorf Research 0,1-2,5 µL, 0,5-10 µL, 10-100 µL, 100- 

1000 µL, 1000-5000 µL, Eppendorf, Suiza. 

• Micropipetas Brand Transferpette 2-20 µL y 100-1000 µL. 

• Pipetas serológicas estériles 2, 5, 10 y 25 mL Falcon, Becton-Dickinson, 

Inglaterra. 

• Pinzas metálicas. 

• Espátulas metálicas WWR, USA. 

• Mascarillas desechables. 

• Guantes desechables de nitrilo, Titan, USA. 

3.3.- Principios activos 

• Capreomicina sulfato, 855 µg de Capreomicina base por mg, Sigma-Aldrich, 

USA. 

• Quitosano grado farmacéutico de 103,2 kDa (97 % DA) y 400 kDa (85 % 

DA), facilitado por Quitoquímica Ltda., Coronel, VIII Región, Chile. 

46



3.4.- Reactivos 

• Agua nanopura. 

• Acetonitrilo grado HPLC, Merck, Alemania. 

• Acido fosfórico 85 % grado análisis, Merck, Alemania. 

• Acido acético 100 % grado análisis, Merck, Alemania. 

• Acido perclórico, grado análisis, Merck, Alemania. 

• Acido heptafluorobutírico para cromatografía de par iónico 99,5%, Fluka, 

Suecia. 

• Bicarbonato de sodio, Merck, Alemania. 

• Cloruro de calcio dihidratado, Merck, Alemania. 

• Cloruro de sodio, Merck, Alemania. 

• Cloruro de potasio, Merck, Alemania. 

• Fosfato dihidrógeno de potasio, grado analítico, Merck, Alemania. 

• Fosfato dihidrógeno de sodio dodecahidratado, Merck, Alemania. 

• HEPES, Sigma, USA. 

• Hidróxido de sodio en pellets, Merck, Alemania. 

• MES, Merck, Alemania. 

• Sulfato de magnesio heptahidratado, Merck, Alemania. 

• Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose sin glutamina, 

HyClone, USA. 

• L-glutamina 100X, HyClone, USA. 

• Mezcla Penicilina-Estreptomicina 100 X, HyClone, USA. 

• Aminoácidos no esenciales 100 X, HyClone, USA. 

• Suero bovino fetal inactivado por calor, HyClone, USA. 

• Dimetilformamida, grado análisis, Merck, Alemania. 

• Yodometano 99 %, grado análisis, Merck, Alemania. 

47



4.- METODOS 

4.1.- Preparación y caracterización del Cloruro de 

N-trimetilquitosano (TMQ) 

4.1.1.- Síntesis 

El Cloruro de N-trimetilquitosano se preparó mediante el método descrito 

por Runnarsson et al. 2008, con ligeras modificaciones [58], a partir de dos 

Quitosanos con un peso molecular de 103,2 (% DA = 97) kDa y 400 (% DA = 85) 

kDa. Previo a la síntesis, el Quitosano fue sometido a una etapa de lavado, 

disolviendo 12 gramos del polímero en 600 mL de ácido acético 1% p/v. La 

solución se clarificó usando un filtro de profundidad con ayuda de vacío, y el 

filtrado se hizo precipitar con 150 mL de NaOH 1N, lavándose con agua hasta 

llegar a neutralidad. Finalmente, el precipitado se lavó con 500 mL de etanol 

96°GL y fue secado a 50°C con ayuda de un secador d e lecho fluido. El polímero 

procesado se redujo a un tamaño uniforme con ayuda de un tamiz con diámetro 

de malla 180 µm y la cantidad requerida se dispersó en 200 mL de una mezcla 

H2O/N,N-dimetilformamida 50/50, para después adicionar 2 equivalentes de NaOH 

en pellets triturado previamente. Una vez que el NaOH fue disuelto, bajo campana 

y con agitación vigorosa se adicionaron 6 equivalentes de yodometano, 

manteniendo la reacción por un período de 48 horas a temperatura ambiente. Los 

equivalentes de NaOH y yodometano se calcularon en base al número de grupos 

aminos libres, expresados en el grado de desacetilación. Una vez terminado el 

tiempo se detuvo la agitación y el agua de la mezcla binaria fue removida con 

ayuda de un rotavapor, para precipitar el polímero con 1 litro de etanol frío. El 

precipitado fue separado del solvente y se lavó con 200 mL de éter dietílico, y fue 

secado a 40°C para repetir la reacción. En la figu ra 11 se resume el 

procedimiento de metilación realizado a los Quitosanos. 

48



3g quitosano 

4 

3 

2 

1 

5 6 7 

8 

9 11 

4 

3 

2 

1 1 

0 

5 6 7 

8 

9 

200 mL 

H2O/DMF 

(50/50) 

Secar en estufa a 30°C 

2 eq NaOH 6 eq MeI 

4 

3 

2 1 

5 6 7 

8 

11 9 

4 

3 

2 

1 1 

0 

5 6 7 

8 

9 

Reaccionar por 48 hrs. 

Agitación constante 

Lavar con 200 mL 

de éter dietílico 

pp con 1 L EtOH frío 

Figura 11. Esquema de metilación de Quitosano basado en método de 

Rünnarsson et al, 2008 [58]. 

El yoduro de TMQ formado se disolvió en agua para ser dializado mediante 

tubos membrana de “cut-off” 14000 Dalton y 2 litros de agua como medio de 

diálisis por tres días con dos cambios de medio por día. Una vez terminada la 

operación, el dializado se liofilizó para eliminar el agua presente y el producto seco 

se redisolvió en 100 mL de una solución de NaCl 10 % p/v para intercambiar el 

ión yoduro por cloruro, formando así una sal de mayor solubilidad. El cloruro de 

TMQ se dializó mediante el método previamente descrito en el mismo intervalo de 

tiempo, para finalmente liofilizarlo y obtener el polímero modificado. 

Evaporar H2O 

Paralelamente, con el fin de evaluar la falta de selectividad presente en 

otras síntesis, se modificó un Quitosano de peso molecular 400 kDa con el método 

propuesto por de Britto et al, 2007 [59]. En un vaso de precipitado de 250 mL, 

5 gramos de Quitosano fueron dispersados en 20 mL de H2O, para luego adicionar 

de manera gradual 6 gramos de NaOH y 4,4 gramos de NaCl, con agitación 

constante. Una vez homogeneizados los constituyentes, se procedió a agregar 80 

mL de dimetilsulfato y se tapó el vaso con Parafilm más papel aluminio, dejando 

49



reaccionar la mezcla por 6 horas a temperatura ambiente y agitación. El polímero 

modificado fue dializado en 2 L de una solución de NaCl 0,1 N usando membranas 

de diálisis con “cut-off” de 14000 Dalton por tres días con dos cambios de medio 

por día, para finalmente liofilizarlo y obtener el producto seco. 

4.1.2.- Caracterización 

La caracterización del cloruro de TMQ se realizó mediante Espectroscopía 

de Resonancia Magnética Nuclear de protones ( 1 H-RMN), Espectroscopía de 

Infrarrojo con Transformada de Fourier (FT-IR) y determinaciones de viscosidad. 

4.1.2.1.- Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 

Los espectros de 1 H-RMN se obtuvieron disolviendo la muestra en D2O a 

una concentración de 20 mg/mL. El equipo usado fue un espectrómetro Bruker de 

400 MHz, y la temperatura de trabajo fue 80°C. Para el cálculo del porcentaje 

estimado de cuaternización (DQ %) se utilizó la ecuación propuesta por Kotze et 

al, 1998 [46] (Ecuación 2). 

⎡[( 

CH ) 

DQ% 

= ⎢ 

⎣ [ H] 

] 

1 ⎤ 

9 

⎥ 

⎦ 

3 3 • • 

100 

Ecuación 2 

Donde, [(CH3)3] es la integral de los hidrógenos del grupo amino trimetilado a 

3,3 ppm y [H] es la integral de las señales correspondientes al H-1, ubicados entre 

4.7 y 5,7 ppm. 

4.1.2.2.- Espectroscopía de Infrarrojo con Transformada de Fourier 

Los espectros de FT-IR se obtuvieron desde un espectrofotómetro Nicolet 

Nexus, a temperatura ambiente (Nicolet Instrument Co., USA). Cada espectro se 

registró en el rango de 4000 a 450 cm −1 (4 cm -1 de resolución), con un escaneo de 

50



64 veces en modo absorbancia. La preparación de las muestras se realizó de 

manera cuantitativa en tabletas de KBr, mezclando 1 mg de muestra por cada 100 

mg de KBr. 

4.1.2.3.- Viscosidad 

La viscosidad de los polímeros modificados se determinó usando un 

viscosimetro rotatorio Brookfield DV-I Prime de baja viscosidad. Se prepararon 

soluciones de cloruro de TMQ y el respectivo Quitosano usado para la síntesis por 

duplicado a una concentración de 0,15% p/v. Las mediciones se realizaron a 

temperatura ambiente con un spindle Brookfield S61 para soluciones de baja 

viscosidad a una velocidad de 100 rpm. 

4.2.- Determinación de Capreomicina sulfato en muestras de 

cultivos celulares y suero de rata 

La cuantificación de las muestras obtenidas desde los experimentos 

realizados se hizo mediante Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC) con 

detección de arreglo de diodos (Merck-Hitachi, Japón). Las matrices en estudio 

fueron una solución tampón salina de Hanks modificada y suero de rata. Dado que 

Capreomicina sulfato es un compuesto polar de naturaleza peptídica que contiene 

más de una especie farmacológicamente activa, fue necesario utilizar un reactivo 

formador de pares iónicos con el fin de conseguir una separación cromatográfica 

satisfactoria de los analitos de interés. 

4.2.1.- Condiciones cromatográficas 

Para cada matriz en estudio se desarrolló una técnica individual usando el 

método propuesto por Rossi et al. 2004, con modificaciones [60]. La tabla presenta 

las condiciones cromatográficas utilizadas. 

51



Tabla 4. Condiciones cromatográficas propuestas para matrices en estudio. 

Matriz 

HBSS Suero de rata 

Columna Waters XTerra ® 150x3,0 mm 3,5 µm diámetro de 

partícula 

Fase móvil MeCN/KH2PO4 0,2M pH 2,3 + HBFA 0,3% (2/98) 

Flujo 0,4 mL/min 

Temperatura 30°C 27°C 

Detección DAD 268 nm 

Volumen de inyección 15 µL 20 µL 

4.2.2.- Metodología de extracción desde suero de rata 

La extracción de Capreomicina sulfato desde muestras de suero de rata se 

realizó mediante precipitación de proteínas usando ácido perclórico como agente 

precipitante. En un vial Eppendorf de 1,5 mL, a 50 µL de suero se adicionaron 50 

µL de ácido perclórico 7% p/v, para luego agitar con ayuda de un vórtex por 20 

segundos. Finalmente, la muestra se centrifugó a 10000 rpm por 10 minutos, 

inyectando el sobrenadante al cromatógrafo. 

4.2.3.- Cuantificación 

La cuantificación de Capreomicina sulfato se realizó mediante una 

calibración con estándar externo, que se basa en agregar cantidades exactamente 

medidas del estándar que contiene el analito. Se consideró como señal analítica la 

suma de las áreas pertenecientes a Capreomicina IA y IB. 

52



4.2.4.- Validación del Método 

4.2.4.1.- Linealidad 

Es la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta. 

Antes de establecer el intervalo de trabajo, se determinó el rango lineal utilizando 

un stock de diluciones realizadas en solución analítica. Utilizando una solución 

stock de 100 µg/mL preparada en agua desionizada, se realizaron tres curvas de 

calibración en matriz suero a concentraciones de 1, 5, 10, 15, 20 y 30 µg/mL y tres 

curvas en solución salina tamponada de Hank (HBSS) a concentraciones de 0,5; 

1,0; 2,5; 10,0 y 15,0 µg/mL. 

Como parámetro de linealidad se considera el coeficiente de determinación 

r 2 , el cual debe ser mayor a 0,999. No obstante, para evaluar de manera confiable 

la linealidad del intervalo se utilizó ANOVA de regresión. 

4.2.4.2.- Precisión y Exactitud 

• Precisión 

Precisión es la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o 

central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando 

el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra 

homogénea [61]. 

La precisión instrumental se estudió a un nivel de concentración en ambas 

matrices, inyectando esta solución en un mismo día 5 veces. El grado de variación 

se expresa en % RSD y no debería ser mayor al 2 % [61]. 

La precisión del método se determinó en matriz suero de rata con la 

inyección de extractos de suero recargado a diferentes concentraciones (1,0; 10,0 

y 30,0 µg/mL) por quintuplicado en tres días. El grado de variación se expresa en 

% RSD. 

53



• Exactitud 

Exactitud es la diferencia entre el valor obtenido y el valor verdadero. Está 

descrito que para la validación de métodos bioanalíticos, su exactitud no debe 

variar de un 100 ± 15% respecto del valor teórico expresado en la curva de 

calibración [61]. Para asegurar que el método es exacto, se recargó en matriz 

suero tres niveles de concentración de Capreomicina sulfato (1,0; 10,0 y 30,0 

µg/mL) los cuales fueron aislados de la matriz en estudio mediante el 

procedimiento de extracción descrito. Los análisis se realizaron en tres días con 

un n = 5 para cada nivel de concentración. 

4.2.4.3.- Límite de detección y cuantificación 

El límite de detección se calculó considerando una relación señal/ruido de 3 

y el límite de cuantificación con una relación señal/ruido de 10 [61]. La señal usada 

para determinar estos parámetros fue la perteneciente a Capreomicina IA, que se 

encuentra en menor proporción respecto a la especie IB. 

4.3.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad intestinal 

de Capreomicina sulfato en modelos in vitro 

Los experimentos destinados a evaluar el efecto in vitro del cloruro TMQ se 

realizaron en cultivos de células de carcinoma intestinal de colon CaCo-2. 

4.3.1.- Cultivo celular 

Las células CaCo-2 fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 

10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de 

penicilina/estreptomicina y 1% v/v de aminoácidos no esenciales, en frascos T75 

en atmosfera húmeda a 37°C y 5 % de CO 2. 

54



4.3.2.- Viabilidad celular ante Capreomicina sulfato y cloruro de TMQ 

Para asegurar que las células mantendrán su integridad durante el 

experimento ante Capreomicina y TMQ se diseñó un experimento en el cual se 

sometieron las células diferenciadas a concentraciones crecientes del antibiótico y 

el polímero. En placas de cultivo de 12 pocillos se añadió 1 mL de suspensión 

celular a una densidad aproximada de 50000 células/cm 2 y fueron cultivadas hasta 

diferenciación por 21 días, cambiando el medio de cultivo en días alternos. Al 

momento de realizar el experimento se aspiró el medio y se añadió 1 mL del 

antibiótico disuelto en HBSS (NaCl 138 mM; KCl 5 mM; CaCl2 1,3 mM ; MgCl2 1,03 

mM; KH2PO4 0,3 mM; Na2HPO4 0,3 mM; NaHCO3 4 mM; 5.6 mM Glucosa) 

suplementado con 4,5 g de glucosa y MES 10 mM pH 6,2 a concentraciones de 0, 

50, 100, 200, 300, 400, 500 y 600 µg/mL. En otro grupo de placas se agregó el 1 

mL de cloruro de TMQ 103,2 kDa disuelto en el mismo medio descrito previamente 

a concentraciones de 0, 0,001; 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,05; 0,10; 0,15 y 0,20 % 

p/v, con un n = 3 para cada nivel de concentración. Las células fueron incubadas 

por 4 horas a 37°C y 5% de CO 2, y una vez finalizado el tiempo se añadió 0,1 mL 

de tripsina/EDTA 1X a cada pocillo para despegar las células, incubando por 5 

minutos a 37°C. Posterior a esto, se agregaron 900 µL de DMEM y se 

homogeneizó el tripsinizado para obtener una suspensión celular de la cual 100 µL 

fueron mezclados con 100 µL de azul de tripán 0,25 % p/v disuelto en PBS. 

Finalmente, se procedió al recuento celular en el microscopio con ayuda de una 

cámara de Neubauer, donde las células que excluyen el colorante se consideran 

como viables. 

4.3.3.- Efecto del cloruro del TMQ sobre resistencia eléctrica transepitelial de 

monocapas celulares CaCo-2 

Para evaluar el efecto de este derivado sobre las Uniones Ocluyentes de 

las monocapas celulares CaCo-2, se determinó la resistencia eléctrica 

transepitelial en sistemas bicamerales con ayuda de un voltohmetro EVOM (World 

55



Scientific Instruments, USA). Como sistemas bicamerales se utilizaron Transwells 

de 6 pocillos con membrana de policarbonato, 24 mm de diámetro, 4,7 cm 2 área 

efectiva de cultivo y 0,3 µm de tamaño de poro. Previo al cultivo en los soportes se 

acondicionaron con DMEM añadiendo 3 mL en la cámara basolateral y 2 mL en la 

cámara apical, incubando por dos días a 37°C y 5 % de CO2. En cada soporte se 

aplicó 2 mL de suspensión celular a una densidad aproximada de 50000 

células/pocillo, cambiando el medio en ambas cámaras cada dos días. En los días 

21 - 23 de cultivo se realizó el experimento y antes de proceder a medir la 

resistencia eléctrica, la monocapa se lavó 2 veces con 2 mL de HBSS 

suplementado con 4,5 g/L de glucosa más MES 10 mM, pH 6.2. A su vez, la 

cámara basolateral se lavó dos veces con 3 mL de HBSS suplementado con 4,5 

g/L de glucosa más HEPES 10 mM pH 7.4, para finalmente añadir los volúmenes 

descritos de cada solución tampón en su respectiva cámara e incubar por 60 

minutos a 37°C. Para asegurar que todas las monocap as se encuentran íntegras 

previo a la adición de TMQ, se midió la resistencia en cada inserto 30 minutos 

antes, y al tiempo 0 se sustituyó la solución tampón en la cámara apical por 

cloruro de TMQ 103,2 kDa disuelto en HBSS pH 6.2 a concentraciones de 0,001; 

0,002; 0,003; 0,005 y 0,01 % p/v, con un n = 3 para cada nivel de concentración. 

Posteriormente se midió la resistencia eléctrica en presencia del polímero a los 30, 

60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 minutos de aplicarlo, y una vez terminado este 

intervalo se aspiró la solución para lavar dos veces con DMEM no suplementado, 

agregando finalmente los volúmenes respectivos de DMEM suplementado en 

ambas cámaras, midiendo la resistencia eléctrica a 300, 360 minutos y 24 horas 

después. Cada valor de resistencia obtenido se corrigió respecto a un inserto 

blanco que no contiene células, y las monocapas que posean valores de TEER en 

el rango de 200 – 300 Ω x cm 2 se consideraron como aptas para ser utilizadas. 

56



4.3.4.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad celular de 

Capreomicina sulfato 

La influencia del cloruro de TMQ sobre el posible transporte paracelular de 

Capreomicina sulfato se evaluó con el experimento que se describe a 

continuación. Previo al cultivo, los sistemas bicamerales “Transwell” de 6 pocillos 

con membrana de policarbonato, 24 mm de diámetro, 4,7 cm 2 área efectiva de 

cultivo y 0,3 µm de tamaño de poro fueron acondicionados con DMEM añadiendo 

3 mL en la cámara basolateral y 2 mL en la cámara apical, incubando por dos días 

a 37°C y 5 % de CO 2. En cada soporte se aplicó 2 mL de suspensión celular a 

una densidad aproximada de 50000 células/pocillo, cambiando el medio en ambas 

cámaras cada dos días. Al día 21 de cultivo se realizó el experimento y antes de 

añadir la mezcla de Capreomicina sulfato y cloruro de TMQ, la monocapa se lavó 

dos veces con 2 mL de HBSS suplementado con 4,5 g/L de glucosa más MES 10 

mM, pH 6.2. A su vez, la cámara basolateral se lavó dos veces con 3 mL de HBSS 

suplementado con 4,5 g/L de glucosa más HEPES 10 mM pH 7.4, para finalmente 

añadir los volúmenes descritos de cada solución tampón en su respectiva cámara 

e incubar por 60 minutos a 37°C. Para asegurar que todas las monocapas se 

encuentran íntegras, se midió la resistencia en cada inserto 30 minutos antes, y al 

tiempo 0 se sustituyó la solución tampón en la cámara apical por 2 mL de la 

mezcla disuelta en HBSS pH 6.2 a una concentración de Capreomicina sulfato 

equivalente a 300 µg/mL, y de cloruro de TMQ 103,2 kDa en concentraciones de 

0; 0,001; 0,002 y 0,003 % p/v, con un n = 3 para cada nivel de concentración. Al 

momento de agregar la mezcla se procedió a muestrear en la cámara basolateral 

volúmenes de 200 µL con reposición de medio a los 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 

180 y 240 minutos. Las muestras se analizaron con el método HPLC previamente 

descrito para determinar la concentración presente en la cámara basolateral, y que 

ha sido corregida en función del volumen repuesto durante cada toma. El cálculo 

de la permeabilidad se realizó con la siguiente fórmula (Ecuación 3). 

57



P 

app 

dQ 

= 

dt( 

A• 

60•Co 

) 

Ecuación 3 

Donde Papp es el coeficiente de permeabilidad aparente (cm/s), dQ/dt es la 

velocidad de permeación (cantidad permeada por minuto), A es el área de difusión 

de la monocapa en cm 2 , y C0 es la cantidad inicial de Capreomicina sulfato en µg. 

4.3.5.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la absorción intestinal de 

Capreomicina sulfato en modelos in vivo 

Para evaluar el efecto del cloruro de TMQ como promotor de la absorción, 

se utilizaron ratas hembra Sprague-Dawley (peso promedio: 250 g) como modelo 

in vivo. Los animales fueron facilitados por el departamento de Farmacología de la 

Facultad de Ciencias Biológicas. 

Previo al experimento, cada grupo de ratas fue privado de alimento por un 

período de 16 - 18 horas, con acceso total a agua para evitar la deshidratación de 

los animales. Para la recolección de muestras se aplicó la técnica de sangrado de 

cola y recolección por ordeña (Milking), que consiste en hacer presión desde la 

base hasta la punta de la cola, en donde el sangrado se hizo efectivo gracias a 

una incisión transversal realizada en una de las venas caudales a 2 – 3 cm del 

final [62]. Posteriormente, la administración de Capreomicina en conjunto o no con 

TMQ se hizo de manera directa al intestino de la rata, realizando en primer lugar 

una incisión en el abdomen para ubicar el estómago, donde se hizo otra incisión 

cerca del cardias, insertando una cánula de administración cuyo largo fue de 15 

cm para así llegar al yeyuno. Finalmente, con ayuda de una jeringa de 3 mL se 

administró en cada grupo 2 mL de una solución 2,5 mg/mL de Capreomicina 

sulfato con cloruro de TMQ a una concentración de 0; 0,005 y 0,01 % p/v. La 

recolección de muestras se realizó a los 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 y 

360 minutos, tomando en cada punto aproximadamente 0,2 mL de sangre. Para 

58



mantener la volemia constante se adiciona igual volumen de suero fisiológico por 

vía intraperitoneal. 

Para la determinación de los parámetros farmacocinéticos se consideró el 

cálculo del área bajo la curva por el método de los trapezoides, Cmax y tmax. Cada 

experimento se realizó con un n = 3. 

59



5.- RESULTADOS Y DISCUSION 

5.1.- Preparación y caracterización de cloruro de 

N-trimetilquitosano 

5.1.1.- Síntesis y análisis de 1 H-RMN y FT-IR 

De acuerdo a lo presentado por Runnarsson et al. [58], se intentó reproducir 

sus condiciones de manera fidedigna, pero no hubo reacción en los Quitosanos de 

103,2 y 400 kDa por la precipitación del polímero. Después de realizar ensayos 

variando las cantidades de agua y dimetilformamida en proporción 40/60 y 60/40 

respectivamente, no hubo cambios en el resultado final, por lo que se ensayó el 

efecto de la cantidad de NaOH adicionada. Cuando se agregaron 4 equivalentes 

de NaOH se formó de inmediato un gel que imposibilitó seguir con la reacción, sin 

embargo, al agregar 2 equivalentes de la base el polímero se disolvió en la mezcla 

binaria antes de finalizar el tiempo de reacción, lo cual permitió continuar con una 

segunda metilación. En la figura 12 se muestra el resultado del 1 H-RMN realizado 

al quitosano de 103,2 kDa modificado con dos metilaciones. 

+N(CH3)3 

N(CH3)2 

Figura 12. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 103,2 kDa sintetizado en dos et apas según método 

de Rünnarsson et al, 2008 [58]. 

60



Como se observa en el espectro 1 H-RMN (Figura 12), con dos metilaciones 

hay dimetilación del producto y algo de trimetilación. La presencia de dimetilación 

hace inferir que una tercera metilación convertiría el producto en un derivado más 

cuaternizado, y efectivamente esto fue lo que ocurrió al repetir la síntesis con tres 

metilaciones, al obtener un cloruro de TMQ cuyo porcentaje de cuaternización fue 

de 44 %. El producto final, convertido a su sal de cloruro, se disuelve rápidamente 

en agua. En la figura 13 se presenta el espectro del cloruro de TMQ sintetizado 

con tres metilaciones. 

Figura 13. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 103,2 kDa sintetizado en tres e tapas según método 

de Rünnarsson et al, 2008 [58]. 

Al apreciar el espectro, los Peaks asignados a la metoxilación en los 

carbonos 6 y 3 a 3,4 y 3,5 ppm respectivamente, no se encuentran presentes, 

confirmando así que el método sí es capaz de metilar selectivamente el grupo 

amino del quitosano con un grado de cuaternización suficiente para obtener un 

polímero soluble en agua. De forma paralela, y basándose en los resultados 

obtenidos con el quitosano de 103 kDa, se realizó la modificación química en el 

quitosano de 400 kDa con tres metilaciones sucesivas. La figura 14 presenta el 

espectro 1 H-RMN del cloruro de TMQ formado. 

+N(CH3)3 

N(CH3)2 

61



Figura 14. 1 H-RMN a 80°C de TMQ 400 kDa sintetizado en tres eta pas según método de 


Utilizando la ecuación descrita en la sección 4.1.2.1, el porcentaje de 

cuaternización calculado para este producto fue de un 40 %. Al igual que en el 

TMQ 103 kDa, no se aprecia metoxilación en los carbonos 3 y 6, la resolución del 

espectro no es la misma si se compara con la del espectro anterior y eso puede 

llevar a que la estimación de los parámetros en estudio no sea adecuada. De este 

modo, se demuestra que la metodología es capaz de alquilar Quitosanos de 

mayor peso molecular sin necesidad que el sistema solvente disuelva el polímero 

(los Quitosanos fueron dispersados en la primera metilación) ni de variar las 

condiciones por las características del material de partida. 

Los resultados del análisis por FT-IR confirman de manera cualitativa lo 

obtenido por 1 H-RMN. Si se comparan los espectros del material inicial (Figura 15 

y 17) y de TMQ (Figura 16 y 18), en el segundo espectro aparece una banda a 

1479 nm que corresponde al estiramiento asimétrico de los grupos metilo unidos a 

la función amina del polímero. 

+N(CH3)3 

N(CH3)2 

62



Figura 15. Espectro IR de Quitosano 103,2 kDa 

Figura 16. Espectro IR de TMQ 103,2 kDa sintetizado según método de 


63



Figura 17. Espectro IR de Quitosano 400 kDa. 

Figura 18. Espectro IR de TMQ 400 kDa sintetizado según método de 


64



Sin embargo, a pesar de las ventajas respecto a otros métodos [41, 42, 59], 

el tiempo requerido para llegar a obtener el producto final con la síntesis de 

Runnarsson es largo dado que cada metilación es realizada en 48 horas, y si se 

suma el tiempo de diálisis, intercambio iónico y liofilización, en total son 

aproximadamente 12 días de procesamiento. Si se pretende fabricar a gran escala 

un producto de estas características, es probable que se deban utilizar métodos 

de purificación más rápidos, ya que si bien la diálisis asegura que el TMQ está 

libre de cualquier impureza de la reacción que pudiera ser dañina para los cultivos 

celulares o modelos animales a estudiar, es una técnica lenta que consume casi la 

mitad del tiempo total utilizado en el proceso. 

La vía sintética propuesta por de Britto entregó un resultado coherente con 

lo publicado por el autor, al conseguir una modificación del polímero en un tiempo 

menor. No obstante, como se puede advertir en el espectro 1 H-RMN (Figura 19), 

el grado de cuaternización es bajo y con importante metoxilación. Además, el 

grado de dimetilación es alto, lo cual sugiere que un tiempo de reacción mayor 

podría aumentar la trimetilación a costa de un incremento paralelo en la 

metoxilación del producto. 

OCH3 

+N(CH3) 

Figura 19. 1 H-RMN a 80ºC de TMQ 400 kDa sintetizado según de Britto et al, 2007 [59]. 

65



Figura 20. Espectro IR de TMQ sintetizado según de Britto et al, 2007 [59]. 

En resumen, la posibilidad de contar con distintas vías sintéticas permite 

disponer de productos que se ajustan a las necesidades de cada investigación. El 

método de Rünnarsson demuestra que hay seguridad en cuanto a mantener 

ciertas variables que disminuirían la homogeneidad del producto final, y el método 

desarrollado por de Britto no requiere de reactivos cuyo valor comercial sea alto. 

El control de la metoxilación es un aspecto que debería ser estudiado en mayor 

profundidad, debido a que no siempre será un fenómeno indeseado y hasta el 

momento no hay síntesis capaces de metoxilar de forma controlada el polímero. 

También, un objetivo a cumplir en futuros estudios es reducir los tiempos y número 

de etapas para obtener un TMQ sin metoxilación, porque los métodos existentes 

carecen de los atributos mencionados al obligar a usar más reactivos que deben 

ser eliminados inmediatamente, y a que las pérdidas de masa por manipulación 

sean altas. 

66



5.1.2.- Viscosidad 

La tabla 5 presenta los resultados en cP de las determinaciones de 

viscosidad realizadas en los polímeros modificados mediante las síntesis de 

Rünnarsson y de Britto. 

Tabla 5. Valores de viscosidad en cP obtenidos para soluciones en estudio. 

Rünnarsson de Britto 

103 kDa 400 kDa 400 kDa 

Quitosano TMQ Quitosano TMQ* Quitosano TMQ 

5,19 ± 0,04 6,51 ± 0,04 12,2 ± 0,07 82,85 ± 0,92 1 2,2 ± 0,07 10,1 ± 0,24 

* Medición realizada a 50 rpm 

En el caso de los cloruros de TMQ sintetizados por el método de 

Rünnarsson hay dos aspectos que destacar. En primer lugar, se aprecia un leve 

aumento en la viscosidad con el derivado de 103 kDa, lo cual implica que no 

habría escisión de la cadena polimérica debido a las condiciones de reacción. Esto 

es de suma importancia en el desarrollo de formulaciones, ya que es deseable 

tener excipientes con características aceptables de uniformidad entre lotes de 

producción, y uno de los problemas más recurrentes que se presenta con los otros 

métodos de síntesis es la dificultad para controlar la escisión parcial del polímero. 

Por otra parte, el derivado de 400 kDa tuvo un aumento significativo de la 

viscosidad respecto al material inicial, fenómeno que puede explicarse por el 

hecho que una molécula de alto peso molecular en un buen disolvente adquiere 

un gran volumen hidrodinámico y por tanto ocurre un aumento en viscosidad de la 

solución. En el caso de polielectrolitos, el volumen hidrodinámico depende no sólo 

del peso molecular, sino también del número y distribución de grupos iónicos en la 

cadena del polímero. Los grupos iónicos cuaternizados de TMQ presentan un 

mayor volumen si se comparan con los grupos NH2 del Quitosano inicial, además 

de causar repulsión entre las cadenas, lo cual da lugar a una expansión de la 

molécula y, en consecuencia, a un incremento de la viscosidad de la solución. 

67



Desde un punto de vista práctico, un aumento de la viscosidad tiene ciertas 

implicancias que pueden favorecer o perjudicar el diseño experimental en 

investigaciones de este tipo. Como el producto se administrará en el intestino 

delgado de un modelo in vivo es deseable que su efecto no sea vea mermado por 

las condiciones del medio, cuyo carácter es dinámico por el constante movimiento 

intestinal. Una menor difusión del polímero a través del intestino delgado 

aumentaría el grado de interacción con el epitelio intestinal. Sin embargo, en los 

aspectos negativos, la mayor viscosidad del polímero dificulta la manipulación y 

aplicación por medio de jeringas o pipetas. 

Finalmente, el cloruro de TMQ obtenido a partir del método descrito por de 

Britto mostró una disminución en los valores de viscosidad, confirmando lo 

propuesto por los autores en cuanto a que las condiciones de reacción producen 

una degradación de la cadena polimérica. 

5.2.- Metodología analítica para la determinación de Capreomicina 

sulfato en muestras de cultivo celular y suero de rata 

5.2.1.- Cromatografía 

Para la determinación de Capreomicina sulfato en distintas matrices, se han 

desarrollado métodos basados en cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), 

espectroscopía UV y electroforesis capilar. 

Las condiciones cromatográficas usadas para el análisis cuantitativo de 

Capreomicina sulfato se desarrollaron en base a las propiedades fisicoquímicas 

del analito. Como se mencionó previamente, Capreomicina sulfato es una mezcla 

de 4 péptidos cuya fracción farmacológicamente activa está constituida por las dos 

especies mayoritarias, que son la IA y IB. Esto obliga a establecer condiciones que 

permitan la resolución total de cada componente y el método más adecuado para 

conseguir este objetivo si se trabaja en cromatografía de fase reversa es la 

elección de un reactivo de par iónico. Al reproducir el método descrito por Rossi et 

68



al. 2004, se vio que el sistema cromatográfico propuesto si fue capaz de separar 

las especies IA y IB entre si, y respecto a las especies minoritarias. Si bien no se 

optimizaron las condiciones de trabajo ni fue realizado un estudio de robustez, se 

estableció que el porcentaje de acetonitrilo en la mezcla y la temperatura de 

trabajo fueron los factores más determinantes en la reproducibilidad de los 

análisis. También, el ácido heptafluorobutírico es un reactivo difícil de manipular y 

altamente sensible a cambios de temperatura, por lo que ese factor tuvo que 

controlarse para disminuir las variaciones en los tiempos de retención. Como se 

trabajó con dos matrices distintas cuyos pH son ácido (suero diluido con ácido 

perclórico) y ligeramente básico (HBSS), fue necesario evaluar la influencia del 

medio en que se encuentra disuelta la muestra. En las figuras 21 y 22 se 

presentan cromatogramas de una recarga en suero de rata y una dilución en 

HBSS, respectivamente. 

mAU 

20 

15 

10 

5 

0 

-5 

DAD-268 nm 

10_3 

Name 

Cp IA 

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 

Minutes 

Cp IB 

Figura 21. Cromatograma de Capreomicina sulfato 10 ug/mL en suero de rata. 

69



mAU 

20 

15 

10 

5 

0 

-5 

DAD-268 nm 

Name 

0 2 4 6 8 10 12 14 

Minutes 

Cp IA 

Cp IB 

Figura 22. Cromatograma de Capreomicina sulfato 5 ug/mL en HBSS. 

Al apreciar los cromatogramas de ambas matrices, es posible distinguir que 

los tiempos de retención varían levemente. Como HBSS es una matriz con alto 

contenido iónico y de solutos (glucosa), es probable que la interacción entre el 

reactivo de par iónico y las especies de Capreomicina se vea afectada en cierto 

modo, aunque el mecanismo por el cual este fenómeno ocurrió no fue estudiado 

en profundidad. En el caso de la matriz suero de rata, los fenómenos previamente 

descritos no fueron tan marcados, si bien la precipitación de proteínas no es una 

técnica extractiva que asegure una remoción total de compuestos interferentes. En 

la actualidad no hay publicaciones que presenten metodologías más acabadas en 

cuanto a extracción de Capreomicina desde matrices biológicas, y dada la 

naturaleza del analito, la metodología de extracción elegida fue la más idónea en 

cuanto a tiempo de procesamiento de la muestra y sencillez. 

Al momento de desarrollar la validación del método se publicó otra 

metodología basada en HPLC de par iónico que utiliza hexanosulfonato sódico 

como reactivo en vez del ácido heptafluorobutírico [63]. Como los sulfonatos de 

cadena corta se adsorben poco en el material de relleno de la columna, las 

70



condiciones presentadas representarían una alternativa viable al uso de ácidos 

polihalogenados. Como el objetivo de esa investigación fue conseguir una 

separación completa de todas las especies que forman parte de Capreomicina a 

un menor costo, se trabajó con gradientes y una columna de 25 cm (5 µm 

diámetro de partícula y 4,6 mm diámetro interno), resultando en que los tiempos 

de retención son prohibitivamente largos para los fines de este trabajo. No 

obstante, es válido inferir que el uso de columnas de menor largo, diámetro de 

partícula y diámetro interno con las condiciones de trabajo propuestas por 

Mallampati et al. 2008, proporcionarían una cromatografía más eficiente, con 

menores tiempos de retención y uso de solventes orgánicos. 

5.2.2.- Linealidad 

En la figura 23 se muestran las curvas de calibración realizadas en suero de 

rata y HBSS, y en la tabla 6 los resultados del análisis de regresión lineal 

ejecutado a ambas curvas. 

Area Cp IA + IB 

7500000 

5000000 

2500000 

Curva de Calibración en suero de rata 

4000000 

A B 

0 

0 10 20 30 40 

[Cp] μg/mL 

Area Cp IA + IB 

5000000 

3000000 

2000000 

1000000 

Curva de Calibración en HBSS 

0 

0 5 10 15 20 

[Cp] μg/mL 

Figura 23. Curvas de calibración en suero de rata (A) y HBSS (B). 

71



Tabla 6. Resultados de regresión lineal en matrices estudiadas. 

Variables 

Suero de rata HBSS 

Pendiente 188800 ± 891.7 268700 ± 1011 

Intercepto Y -30130 ± 14790 -48940 ± 7776 

Ajuste de regresión 

R 2 0,9988 0,9993 

Sy.x 63160 39320 

Intervalo de confianza 95% 

Pendiente 187000 a 190600 266600 a 270700 

Intercepto Y -59830 a -421.8 -64550 a -33320 

El análisis estadístico realizado a las curvas de calibración demuestra que 

existe linealidad en el rango de concentración propuesto para trabajar, sin 

apreciarse desviaciones significativas en el ajuste de regresión. 

5.2.3.- Recuperación desde suero de rata 

La tabla 7 presenta los resultados del estudio de recuperación desde la 

matriz en estudio. 

Tabla 7. Recuperación desde suero de rata. 

[C] agregada 

% Recuperación* 

µg/mL 

1 99,25 ± 18,71 

10 116,85 ± 1,15 

30 99,06 ± 0,95 

*n = 5. Resultados presentados como el promedio ± DS. 

72



5.2.4.- Exactitud y Precisión 

• Precisión instrumental 

Los valores de desviación estándar relativa para las inyecciones realizadas 

en las matrices fueron de 0,37 % en HClO4 (disolvente de extracción para suero 

de ratas) y 0,38 % en HBSS. 

• Exactitud y precisión del método en suero de rata 

La tabla 8 presenta los resultados del estudio de exactitud y precisión del 

método validado en matriz suero de rata. 

Tabla 8. Resultados de exactitud y precisión en suero de rata. 

[C] agregada 

µg/mL 

[C] encontrada 

µg/mL* 

Exactitud % % RSD 

1 0,98 ± 0,09 97,66 8,93 

10 9,19 ± 0,11 91,89 1,16 

30 28,64 ± 0,51 95,48 1,76 

*n = 5. Resultados presentados como el promedio ± DS. 

5.2.5.- Límite de detección y cuantificación 

La tabla 9 presenta los resultados de límite de detección y cuantificación en 

µg/mL para las validaciones en suero de rata y HBSS. 

Tabla 9. Límite de detección y cuantificación para suero de rata y HBSS. 

Matriz 

Límite de detección 

µg/mL 

Límite de cuantificación 

µg/mL 

Suero de rata 0,3 1 

HBSS 0,15 0,5 

73



5.3.- Efecto de cloruro de TMQ sobre la permeabilidad intestinal 

de Capreomicina sulfato en modelos in vitro 

5.3.1.- Viabilidad celular ante Capreomicina sulfato y cloruro de TMQ 

5.3.1.1.- Capreomicina sulfato 

La figura 24 presenta los resultados del experimento de viabilidad celular en 

presencia de concentraciones crecientes de Capreomicina sulfato. 

% Viabilidad Celular 

150 

100 

50 

0 

0 100 200 300 400 500 600 700 

[C] Capreomicina μg/mL 

Figura 24. Viabilidad celular ante concentraciones crecientes de Capreomicina sulfato. 

La viabilidad celular fluctuó en un rango de 82,53 – 99,53 % respecto al 

control y según el análisis estadístico no paramétrico realizado a los datos, no se 

apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre cada grupo de estudio, 

infiriendo de este modo que las concentraciones estudiadas del fármaco son aptas 

para ser utilizadas en los experimentos de permeabilidad en sistemas 

bicamerales. La posibilidad de utilizar concentraciones altas de Capreomicina 

sulfato compensa en cierta medida una limitante no menor en la planificación de 

los experimentos posteriores, que es la baja biodisponibilidad intestinal del 

fármaco. Esto guarda estrecha relación con el desarrollo del método analítico para 

74



la determinación del fármaco, que debe ser capaz de cuantificar concentraciones 

menores al 1% de lo que se administra en la cámara apical. Si se considera el 

hecho que no existe información respecto a la absorción de Capreomicina sulfato 

en modelos in vitro, y que las monocapas CaCo-2 son menos permeables que el 

intestino delgado, podría esperarse que la cantidad de fármaco permeada sea 

menor. 

5.3.1.2.- Cloruro de TMQ 

La figura 25 presenta los resultados del experimento de viabilidad celular en 

presencia de concentraciones crecientes de cloruro de TMQ 103,2 kDa. 

% Viabilidad Celular 

120 

110 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 

[C]TMQ % p/v 

Figura 25. Viabilidad celular ante concentraciones crecientes de cloruro de TMQ 103,2 

kDa. 

A diferencia de los resultados publicados con el derivado metoxilado del 

cloruro de TMQ, en donde utilizan concentraciones superiores a 1% p/v para 

obtener un efecto significativo con baja toxicidad incluso con productos de alto 

peso molecular, en la figura 24 se aprecia que con este derivado de 103 kDa 

existe un claro estrechamiento en el margen de acción, al disminuir la viabilidad 

celular a un 70 % del valor inicial usando una concentración de 0,005 % p/v y con 

una evidente disminución en presencia de concentraciones crecientes. Sin duda, 

75



lo planteado por Verheul et al., en cuanto al efecto de la metoxilación sobre la 

toxicidad del cloruro de TMQ en células CaCo-2 fue corroborado en esta 

investigación, al demostrar que este derivado fabricado sin metoxilación es capaz 

de inducir modificaciones en la arquitectura de las células y las estructuras que las 

mantienen unidas a concentraciones menores, en desmedro de la viabilidad 

celular. Sumado a lo anterior, dado que la presencia de grupos metoxilos 

aparentemente disminuye la interacción entre el polímero y las estructuras objetivo 

por impedimento estérico, con el derivado no metoxilado la influencia del 

porcentaje de cuaternización se vuelve determinante y trasciende al hecho que el 

objetivo de la modificación química es conseguir un aumento de la solubilidad 

acuosa, ya que una mayor densidad de carga aumenta el grado de interacción 

entre el polímero y los elementos que conforman las uniones ocluyentes. 

Durante los últimos años ha surgido un debate en torno a la relación entre 

el porcentaje de cuaternización y la citotoxicidad de TMQ, porque en un principio 

algunos grupos de investigación propusieron que la toxicidad de TMQ era baja 

incluso con porcentajes de cuaternización altos. Sin embargo, esta hipótesis fue 

refutada por Mao et al. 2005, quien encontró que TMQ con grados de 

cuaternización de 40% son potencialmente tóxicos en función de la dosis y el 

tiempo de exposición [64]. En la misma línea Kean et al. 2005, proponen que la 

toxicidad de TMQ es directamente proporcional al grado de cuaternización (mayor 

densidad de carga) en derivados obtenidos a partir de Quitosanos cuyo peso 

molecular es 100 kDa, pero a su vez no encontraron una correlación en el caso de 

oligómeros, estableciendo que productos con bajo peso molecular no poseen una 

toxicidad apreciable [65]. Como corolario, Jintapattanakit et al. 2008, determinó 

que la biocompatibilidad de TMQ tiene estrecha relación con el grado de 

cuaternización y dimetilación, ya que la mucoadhesividad de TMQ tiene una 

relación inversa con el grado de dimetilación y por tanto habrá una menor 

toxicidad si el porcentaje de cuaternización es inferior a un 40 % [66]. De este 

modo, se concluye que cualquier modificación que no altere la densidad de carga 

tendrá una incidencia mínima en la toxicidad, y esta fue la razón por la cual se 

descartó el uso del derivado de 400 kDa. 

76



Como se mencionó en la sección 5.1.1., el cloruro de TMQ obtenido en 

esta investigación tuvo un porcentaje de cuaternización y dimetilación de 44 y 43 

% respectivamente, llevando a inferir que la posibilidad de aumentar el tiempo de 

exposición de las células ante concentraciones crecientes (dentro del rango 

utilizado por los autores citados) del polímero sí tendría un efecto negativo sobre 

la viabilidad de estas, o si no es significativo en términos de sobrevivencia, lo 

puede ser en cuanto a modificaciones irreversibles en la integridad de la 

monocapa celular. El estudio en detalle de estas alteraciones ha sido realizado por 

otros autores con técnicas de inmunohistoquímica en cultivos celulares CaCo-2, 

donde estructuras de interés como la actina, ocludina, claudinas son acopladas a 

inmunoglobulinas que pueden estar conjugadas o no a reactivos fluorescentes 

para su posterior visualización mediante microscopía confocal láser. En primera 

instancia, Kotze et al. 1999, visualizaron con marcadores fluorescentes el efecto 

de un derivado metoxilado de TMQ (60 % de cuaternización) 1 % p/v sobre las 

uniones ocluyentes, demostrando cualitativamente que hay apertura de estas sin 

aparente daño celular [43]. Posteriormente, Dorkoosh et al. 2004, presentaron un 

estudio más acabado utilizando el mismo derivado, y establecieron que TMQ 

produce una acumulación de actina y ocludina en los bordes celulares sin 

evidencias de estrés [67]. También, estos autores detectaron un reordenamiento 

de la proteína Claudina-1 que confirma la apertura de las uniones ocluyentes. En 

ambas investigaciones se demostró que las acciones de TMQ son reversibles 

gracias a mediciones de TEER, sin embargo, no presentaron resultados que 

describan de forma visual la integridad de las monocapas post administración del 

polímero. Hasta la fecha no se han realizado estudios de esta naturaleza con 

derivados no metoxilados de TMQ. 

En resumen, el avance en la caracterización de las relaciones estructura- 

actividad presentes en derivados de quitosano ha permitido establecer cuales son 

las condiciones que debe reunir el material de partida, el método de modificación 

química a usar y el producto final, para obtener resultados que aseguren un amplio 

margen de eficacia y bajo riesgo. Se resalta la importancia de conocer las 

características del Quitosano a utilizar y en especial del peso molecular, porque al 

77



igual que en otros materiales de naturaleza polimérica, el valor informado 

generalmente se refiere al promedio de distintas fracciones presentes, y esta falta 

de homogeneidad tiene directa relación con el método de producción usado por el 

fabricante. Como consecuencia, los experimentos podrían ser poco reproducibles 

incluso con el mismo lote de material. 

5.3.3.- Efecto del cloruro de TMQ sobre resistencia eléctrica transepitelial de 

monocapas celulares CaCo-2 

La figura 26 presenta los resultados del experimento realizado para evaluar 

el efecto del cloruro de TMQ sobre la TEER de monocapas CaCo-2. 

% TEER 

150 Control negativo 

0,001 % p/v 

125 

100 

Remoción del polímero 

0,002 % p/v 

0,003 % p/v 

0,005 % p/v 

0,01 % p/v 

75 

50 

25 

0 

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 

Tiempo (h) 

Figura 26. Reducción de TEER en monocapas celulares CaCo-2 ante concentraciones 

crecientes de cloruro de TMQ. 

Previo a la realización del experimento en los sistemas bicamerales, se 

buscó en bibliografía cuál era la concentración celular más apropiada para formar 

una monocapa viable, encontrando que no hay un consenso sobre este aspecto. 

Los valores presentados fluctúan entre 10 4 – 10 5 células/cm 2 , con diversas 

razones que justifican la elección, de las cuales se citan algunas como el área del 

78



inserto, el material de la membrana, pasaje de las células y la estructura de las 

uniones ocluyentes una vez formada la monocapa. A diferencia de otros 

experimentos que utilizan líneas celulares y el número de células inicial no es tan 

relevante, en los ensayos de transporte es necesario establecer el valor idóneo 

para obtener una monocapa bien estructurada, ya que un déficit de células en la 

suspensión aplicada a las membranas puede resultar en monocapas débiles, y un 

exceso de células llevará a la formación de multicapas [68]. Como no se contaba 

con suficientes transwells para desarrollar un estudio que permita definir las 

condiciones de cultivo más apropiadas se eligió trabajar con una densidad de 

aproximadamente 10 4 células/cm 2 , ya que este valor ha sido considerado por 

varios autores como apropiado en cuanto a la obtención de monocapas aptas. 

Basándose en los resultados obtenidos en el experimento de viabilidad 

celular con cloruro de TMQ, se determinó trabajar con concentraciones no 

superiores a 0,01 % p/v. También, el tiempo de exposición ante el polímero se fijó 

considerando la duración del experimento de transporte, debido a que en ciertas 

publicaciones la remoción del polímero durante las mediciones de TEER se hace 

en un tiempo menor al determinado para la realización de los ensayos de 

transporte. Sobre este aspecto, varios autores han realizado experimentos de 

viabilidad celular con azul de tripán para determinar la integridad de las 

monocapas una vez terminados estos concluyendo que si no hay muerte celular la 

monocapa no está significativamente alterada [46, 49]. No obstante, tal como se 

mencionó en el apartado 5.3.2., la exposición por tiempos prolongados a 

determinadas concentraciones podría conllevar a la manifestación de alteraciones 

irreversibles en la arquitectura de proteínas estructurales de las uniones 

ocluyentes como claudinas y ocludina. Además, producto de la mucoadhesividad 

del polímero, su remoción desde la monocapa puede ser difícil, manteniendo así 

su efecto por un tiempo mayor. 

Tal como se aprecia en la figura 26, el cloruro de TMQ es capaz de reducir 

la TEER de las monocapas estudiadas, determinado así que sí existe una 

eventual apertura de las uniones paracelulares, incluso a concentraciones de 

0,001 % p/v. A medida que aumenta la concentración de TMQ el efecto sobre la 

79



TEER es mayor, pero sin llegar a una reducción total del parámetro en estudio, 

dado que la monocapa aún mantendría parte de su integridad. Cuando el polímero 

es removido y se lava la monocapa para añadir el medio de cultivo suplementado, 

hay una reducción transiente de la TEER que no se debe confundir con el efecto 

del polímero, ya que tal fenómeno puede deberse al stress que son sometidas las 

células durante la etapa de lavado. En la hora 24 del experimento se monitoreó la 

TEER encontrando que hubo recuperación hacia los valores basales en 

concentraciones de TMQ no superiores a 0,003 % p/v, determinando así que el 

efecto es reversible y la monocapa mantendría su integridad en buena medida. Es 

importante hacer notar que hay una reducción significativa en la cantidad de TMQ 

necesaria para producir un efecto sobre las uniones ocluyentes, respecto a las 

concentraciones usadas con el derivado metoxilado. A concentraciones de 0,005 y 

0,01 % p/v no hubo una reducción total de la TEER pero no se recuperó al mismo 

tiempo que las monocapas expuestas a concentraciones menores de TMQ, sino 

que a 48 horas de iniciado el experimento recién se apreció un leve aumento en 

los valores. Estos resultados de cierta forma corroboran lo propuesto en el 

apartado 5.3.2., en donde se menciona que este derivado al presentar una alta 

densidad de cargas positivas interacciona fuertemente con el epitelio, haciendo 

difícil su remoción. Por este motivo, se utilizó como medio de lavado DMEM no 

suplementado, cuyo pH de 7,4 permitiría reducir la ionización del polímero. 

No obstante, si bien se ha demostrado que la potencia de este derivado es 

mayor que la de su par metoxilado, es necesario resaltar ciertos aspectos. Como 

se está trabajando con un sistema in vitro que carece de ciertos elementos 

presentes en condiciones fisiológicas, es esperable que los resultados obtenidos 

tengan un grado de sobreestimación (inferencia que se aplica a los experimentos 

de viabilidad celular con TMQ) ya que las monocapas CaCo-2 no poseen una 

barrera de mucus (cuya carga es negativa) que impida la interacción entre el 

polímero y las uniones ocluyentes. También, el carácter estático del modelo hace 

que la acción del polímero se vea restringida a una zona en particular (la 

monocapa) y no exista difusión de este como en el intestino delgado, donde los 

movimientos peristálticos y la mayor área superficial del órgano disminuyen las 

80



probabilidades que exista una interacción entre el epitelio y el polímero, llevando a 

utilizar concentraciones más altas de este en modelos in vivo. 

A raíz de los resultados obtenidos en esta etapa del trabajo, se definieron 

algunas propuestas a considerar en estudios posteriores que utilicen cloruro de 

TMQ no metoxilado como facilitador de la permeación. Como el polímero muestra 

una marcada actividad a bajas concentraciones, debería considerarse la 

posibilidad de utilizar derivados con un grado de cuaternización más bajo o menor 

peso molecular, evaluando si son capaces de producir reducciones significativas y 

reversibles de la TEER a concentraciones que permitan una eventual interacción 

con el epitelio de la pared intestinal. 

5.3.4.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la permeabilidad celular de 

Capreomicina sulfato en monocapas celulares CaCo-2 

La figura 27 presenta los resultados del experimento de transporte de 

Capreomicina sulfato en monocapas celulares CaCo-2. 

Transporte Cp acumulado (%) 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

0 50 100 150 200 250 

Tiempo (min) 

Control negativo 

TMQ 0,001 % p/v 

TMQ 0,002 % p/v 

TMQ 0,003 % p/v 

Figura 27. Cantidad permeada de Capreomicina sulfato en monocapas celulares CaCo-2 

ante concentraciones crecientes de cloruro de TMQ. 

81



De acuerdo a los antecedentes recopilados sobre la farmacocinética de 

Capreomicina sulfato, sólo se sabe que su biodisponibilidad oral es menor al 1 % y 

las causas de este fenómeno son desconocidas. Debido al carácter exploratorio 

de este trabajo, no se caracterizaron en detalle los mecanismos de transporte de 

Capreomicina sulfato, pero si fue posible obtener algunos indicios sobre su 

comportamiento en el epitelio intestinal. Como se aprecia en la figura 27, de la 

cantidad aplicada en la cámara apical para el control negativo, un 12,5 % atravesó 

la monocapa, indicando en que la permeabilidad del fármaco no es comparable a 

la de compuestos que se absorben exclusivamente por vía paracelular y cuya 

cantidad permeada no supera el 1 %, por ejemplo, el marcador de bajo peso 

molecular manitol. La explicación al fenómeno descrito puede encontrar sustento 

en las siguientes premisas: 

• La relación entre cargas positivas y masa de Capreomicina. Cuando una 

molécula es catiónica, su interacción con la superficie negativa de las 

uniones ocluyentes es mayor, creándose de este modo un gradiente de 

difusión facilitada. Se ha propuesto que el transporte paracelular de 

fármacos catiónicos como Ranitidina y Famotidina ocurre por este 

mecanismo [69]. No obstante, el efecto de la carga sobre el transporte 

puede verse disminuido al aumentar el tamaño de la estructura, ya que su 

radio molecular será mayor que el radio de poro en la unión ocluyente, 

dificultando el paso a través del epitelio. Capreomicina es un péptido 

pequeño, pero con una masa molecular mayor (660 g/mol 

aproximadamente) que el promedio de los fármacos utilizados en 

terapéutica. 

• La presencia de transportadores de membrana involucrados en el proceso 

de absorción de Capreomicina sulfato. 

• La menor exposición del fármaco a las enzimas que suelen estar presentes 

en el intestino delgado entre otras. El páncreas secreta una cantidad 

importante de zimógenos a diferencia de los cultivos celulares, en donde la 

82



actividad metabólica se concentra en la expresión de peptidasas ubicadas 

en el borde de cepillo de los enterocitos. 

• La ausencia de una capa de mucus en las monocapas que dificulte el 

transporte del fármaco. Está descrito que las mucinas del lumen intestinal 

se unen a fármacos de naturaleza iónica, disminuyendo su permeabilidad 

[70]. 

Cuando se aplica el fármaco con cantidades crecientes de cloruro de TMQ, 

hay un leve incremento de la cantidad permeada al aumentar la concentración de 

TMQ, indicando que el transporte paracelular se está viendo facilitado en cierta 

medida por acción del polímero. En la tabla 10 se presentan los coeficientes de 

permeabilidad aparente (Papp) calculados a partir de las curvas de cantidad 

permeada en función del tiempo. 

Tabla 10. Valores de Papp de Capreomicina sulfato en presencia de TMQ. 

TMQ % p/v Papp 10 -6 (cm/s)* Aumento de Papp 

0 3,85 ± 0,34 

0,001 4,80 ± 1,53 1,42 

0,002 5,46 ± 1,28 1,45 

0,003 5,76 ± 1,92 1,5 

* Resultados se presentan como el promedio de tres experimentos ± DS. 

El análisis de los valores obtenidos indicó que si bien hubo un aumento en 

la permeabilidad, este no fue tan significativo como lo descrito en otras 

publicaciones. Además, en los grupos sometidos al efecto de TMQ se aprecia una 

alta variabilidad expresada como desviación estándar, lo cual lleva a pensar que 

no hay diferencias significativas (p > 0,05). La figura 28 presenta de forma más 

clara la tendencia previamente mencionada. 

83



Papp (cm/s) 

- 6 8.0×10 

- 6 6.0×10 

- 6 4.0×10 

- 6 2.0×10 

0 

0 0,001 0,002 0,003 

[C] TMQ % p/v 

Figura 28. Permeabilidad aparente de Capreomicina en presencia de concentraciones 

crecientes de cloruro de TMQ. 

Debido al estrecho margen de seguridad evidenciado en los experimentos 

de viabilidad celular y reducción de TEER, se eligió trabajar sólo usando 

concentraciones donde hubo recuperación en la integridad de la monocapa al 

remover el polímero, ya que si se hubiesen utilizado concentraciones mayores, 

podría haber una sobreestimación de los resultados por el hecho que la viabilidad 

celular es menor y la monocapa perdió su función de barrera. Como 

consecuencia, no fue posible apreciar en su totalidad el efecto del cloruro de TMQ 

como promotor de la absorción. 

Es necesario resaltar que el diseño experimental fue llevado a la práctica 

considerando algunas limitantes como el no contar con un sistema de agitación 

termostatizado, el cual permite emular en cierto grado las condiciones fisiológicas 

intestinales, además de uniformar y reducir el espesor de la capa de agua estática, 

que puede dificultar la acción del polímero sobre las uniones ocluyentes y el 

transporte de Capreomicina. En segundo lugar, la integridad de las monocapas fue 

evaluada sólo mediante determinaciones de TEER que, si bien se consideran 

como una medida válida, generalmente se complementan con el análisis del 

transporte de compuestos que se absorben sólo por vía paracelular como [ 14 C]- 

manitol, el colorante amarillo de lucifer, atenolol, entre otros. En este caso, 

84



ninguna de las monocapas mostró valores de TEER por debajo del rango 

establecido de aptitud, pero es probable que la medición de TEER subestime la 

presencia de imperfecciones en la monocapa, por lo que se hace una necesidad 

contar con los compuestos nombrados. Desafortunadamente, su alto costo y 

dificultad de manipulación limitan su uso, llevando a disponer de infraestructura 

especialmente dedicada al manejo de compuestos radioactivos. 

La posibilidad que la ruta paracelular no sea el único mecanismo 

involucrado en el transporte de Capreomicina sulfato resulta ser viable, porque la 

evidencia disponible ha comprobado que los transportadores de oligopéptidos y 

aminoácidos ubicados en la pared intestinal juegan un papel fundamental en la 

biodisponibilidad de fármacos, ya que una de las estrategias para mejorar la 

absorción de moléculas con actividad farmacológica es crear profármacos 

mediante la esterificación con aminoácidos u oligopéptidos, para que sean 

reconocidos por estos transportadores [71, 72]. En primera instancia, para el caso 

de los transportadores de di/tripéptidos conocidos como PEPT 1 y 2, es poco 

probable que Capreomicina sea un sustrato por ser pentapéptido. Sin embargo, 

como las especies activas de Capreomicina contienen el aminoácido lisina con su 

extremo NH2 libre, es posible que exista cierto grado de afinidad con el 

transportador de aminoácidos catiónicos y neutros b 0+ [73]. También, por el 

carácter catiónico del fármaco, puede considerarse una eventual interacción con 

los transportadores humanos de cationes orgánicos hOCT1 y hOCT3 que se 

ubican en las membranas laterales y borde en cepillo de los enterocitos, 

respectivamente [74]. Fármacos que se administran regularmente por vía oral 

como antivirales derivados de nucleósidos e inhibidores de proteasas son 

sustratos del transportador hOCT1, y en caso del transportador hOCT3, el 

hipoglicemiante metformina, el anticonvulsivante fenitoína y algunos antiarrítmicos 

son sustratos. El efecto de transportadores de eflujo ubicados en la membrana 

apical no debe ser subestimado, ya que las proteínas de multiresistencia a 

fármacos (MDR), pertenecientes a la superfamilia de proteínas ABC (ATP-binding 

cassette) contribuyen de forma importante en la eliminación de xenobióticos, 

afectando la biodisponibilidad de compuestos con actividad terapéutica. En este 

85



ámbito, la glicoproteína P es el principal representante del grupo mencionado, y su 

espectro de afinidad comprende a sustratos de diversa naturaleza química, pero 

con tendencia a estructuras de carácter lipofílico y catiónico. 

En investigaciones posteriores, para validar los resultados conseguidos hay 

que caracterizar con mayor profundidad el o los mecanismos de transporte de 

Capreomicina, mediante estudios de captación (uptake) y transporte bilateral 

(apical-basolateral, basolateral-apical) en presencia de inhibidores competitivos de 

los sistemas transportadores presuntamente involucrados. 

5.3.5.- Efecto del cloruro de TMQ sobre la absorción intestinal de 

Capreomicina sulfato en modelos in vivo 

De acuerdo a lo mencionado en apartados previos, los experimentos 

realizados in Vitro tienden a sobreestimar los fenómenos que ocurrirían in vivo, y 

el trabajar con cultivos celulares CaCo-2 no es excepción. La ausencia de ciertas 

enzimas, de una capa de mucus que proteja el epitelio intestinal y una capa de 

agua estática más gruesa obliga a tomar decisiones con más juicio al momento de 

diseñar los experimentos in vivo. El derivado metoxilado de TMQ es menos 

potente y se requieren concentraciones altas para conseguir el efecto deseado, 

complicando así los intentos por escalar a una forma farmacéutica viable desde el 

punto de vista farmacotécnico, biofarmacéutico y económico. A una concentración 

de 1,5 % p/v, el cloruro de TMQ es capaz de aumentar la biodisponibilidad in vivo 

(ratas) de fármacos como Octreótido [49], cuya naturaleza química es peptídica, y 

es lógico pensar que a esas cantidades de TMQ las probabilidades de 

interaccionar con el epitelio y provocar un efecto sobre las uniones ocluyentes son 

altas. Sin embargo, considerando el hecho que en casi la totalidad de estos 

estudios la administración de la mezcla física polímero-fármaco se realiza 

directamente al intestino de la rata, cuando se haga el intento de administrar esta 

asociación en un voluntario humano aparecen dos escollos muy difíciles de 

soslayar. 

86



• Una forma farmacéutica cuyo peso es alto es muy difícil de formular porque 

hay un compromiso entre la funcionalidad de los excipientes y la cantidad 

de principio activo que contiene la forma farmacéutica. A una concentración 

de 1.5 % p/v, es virtualmente imposible administrar el cloruro de TMQ en 

una forma farmacéutica como comprimidos, cápsulas duras o blandas. Las 

opciones se reducen a la administración de microgránulos recubiertos o 

polvos para dispersión. En el caso de la formulación de polvos para 

dispersión, el principio activo y el polímero se verán expuestos a la acción 

del contenido gástrico, favoreciendo la degradación de uno o más 

componentes de la mezcla. 

• La formulación debe ser lo suficientemente mucoadhesiva como para 

mantenerse un tiempo prolongado en el epitelio intestinal. 

Entonces, si se pretende utilizar excipientes funcionales como promotores 

de la absorción, es ideal contar con un compuesto que sea potente y ojala esté 

disponible para ejercer de inmediato su efecto sin necesidad de esperar la 

desintegración de la matriz que lo contiene, o si se encuentra en estado sólido, 

debería tener alta mucoadhesividad y bioadhesividad. Se han desarrollado 

formulaciones basadas en micropartículas fabricadas con polímeros 

mucoadhesivos capaces de mantenerse por un tiempo prolongado en el sitio de 

absorción, y el resultado ha sido un aumento en la biodisponibilidad de fármacos 

poco permeables [75, 76]. Como el cloruro de TMQ es un polímero catiónico con 

propiedades mucoadhesivas y capaz de modular la permeabilidad de barreras 

epiteliales, la posibilidad de administrar el fármaco y polímero en un sistema de 

dispensación como cápsulas blandas donde ambos compuestos ya están 

disueltos, o microgránulos, representa una interesante aproximación que no ha 

sido investigada en profundidad. Los únicos antecedentes que han descrito el uso 

de una formulación piloto que utilice TMQ como excipiente han sido 

proporcionados por Thanou et al. 1999, y van der Merwe et al., 2004 [3, 77]. El 

primer grupo administró una formulación que contenía una alta concentración de 

TMQ directamente al yeyuno de cerdos, obteniendo un aumento en la 

87



biodisponibilidad del fármaco Octreótido, pero determinaron que las cantidades 

necesarias para conseguir el efecto eran demasiado altas para incluirlas en una 

forma farmacéutica viable [77]. En tanto, el segundo grupo de investigación utilizó 

una aproximación farmacotécnica para establecer una forma de administrar el 

polímero, desarrollando productos en estado sólido como minitabletas y gránulos. 

Concluyeron que los gránulos presentaron mejores propiedades tecnológicas en 

cuanto a masa total usada e incorporación a una forma farmacéutica, pero hasta la 

fecha no hay resultados de estudios in vivo que usen este producto [3]. Así, 

nuevamente surgió una interrogante que fue respondida hasta cierto punto en esta 

etapa del trabajo: Como se requieren concentraciones bastante menores del 

derivado no metoxilado para ejercer su efecto in vitro, y en el intestino hay una 

capa de mucus cargada negativamente que sirve de barrera, ¿Es probable que el 

polímero alcance a llegar al epitelio dado que interaccionó con las capas 

superficiales de mucus? Dado que los experimentos in vitro carecen de este 

elemento protector, y la consistencia de las soluciones utilizadas quizás no sea la 

suficiente como para facilitar la retención en la mucosa por un tiempo prolongado, 

se decidió utilizar concentraciones mayores del polímero dentro del rango utilizado 

en los estudios de TEER, respetando el límite de viabilidad celular determinado 

previamente, que fue 0,01 % p/v. 

De los dos grupos de ratas sometidos a concentraciones de 0,005 y 0,01 % 

p/v de TMQ, si bien hubo un leve aumento en la absorción de Capreomicina 

respecto al control, este fue errático y no se presentó en todas las ratas expuestas 

al efecto del polímero. Como el procedimiento quirúrgico no permitió utilizar a cada 

rata como su propio control, administrando el fármaco en presencia o ausencia de 

TMQ, es esperable que la variabilidad interindividual dificulte el análisis de los 

resultados. Como corolario, el número de ratas utilizado para conformar los grupos 

de estudio (3 ratas) se considera como el mínimo necesario para obtener 

estimados confiables de los parámetros investigados, y en situaciones donde la 

variabilidad es elevada se debería usar un número mayor de individuos. 

Con los antecedentes recopilados, se infiere que la probable causa de la 

incapacidad del cloruro de TMQ usado para aumentar la absorción es la baja 

88



concentración usada en los grupos estudiados, porque no se forma una solución lo 

suficientemente viscosa como para mantenerse retenida en una zona particular 

del intestino, y no es capaz de interpenetrar la barrera de mucus intestinal, 

evitándose el contacto con los enterocitos. Está descrito que polímeros catiónicos 

como Quitosano pueden ser inactivados por la presencia de mucinas luminales del 

tracto gastrointestinal [26, 27], y si la cantidad de compuesto presente es 

insuficiente, no habría un efecto significativo en condiciones fisiológicas. Por tanto, 

se refuerza la idea propuesta en el apartado 5.3.3., sobre evaluar el uso de TMQ 

no metoxilado de menor peso molecular o bajo grado de cuaternización, porque si 

bien la potencia disminuría (no al nivel del derivado metoxilado), también la 

toxicidad será menor, llevando a usar una masa mayor del polímero para que 

evidencie sus capacidades como material mucoadhesivo y promotor de la 

absorción intestinal. Es decir, si usando el derivado metoxilado a concentraciones 

de 1,5 % p/v en modelos in vivo es posible conseguir un aumento de la 

biodisponibilidad, con el derivado no metoxilado el objetivo es utilizar 

concentraciones no superiores a 0,5 % p/v para tener un efecto equivalente. De 

este modo, el desarrollo de una forma farmacéutica basada en TMQ será viable. 

89



6.- CONCLUSIONES 

En base a los objetivos planteados y resultados obtenidos se concluye que: 

1. Las condiciones cromatográficas desarrolladas permitieron separar y 

resolver las especies activas de Capreomicina sulfato en las matrices de 

interés. Las metodologías validadas mostraron ser exactas, precisas y 

capaces de cuantificar el analito en concentraciones aceptables para el 

estudio. 

2. Fue posible realizar la modificación química del polímero quitosano con una 

vía sintética capaz de metilar la función amino de manera selectiva, sin 

metoxilación en los grupos hidroxilos ubicados en los carbonos 3 y 6. Para 

los Quitosanos de 103,2 y 400 kDa fue posible obtener un porcentaje de 

cuaternización de 44 y 40 % respectivamente, estableciendo que la 

eficiencia de metilación no se vería tan afectada por el peso molecular del 

polímero. En ambos casos, el producto final es soluble en agua pero la 

viscosidad del derivado de 400 kDa aumentó respecto al valor obtenido con 

el material de partida, sugiriendo que la mayor densidad de carga del grupo 

N-trimetilo contribuye a la manifestación de este fenómeno. 

3. Capreomicina sulfato puede ser utilizada en un amplio rango de 

concentraciones sin afectar la viabilidad celular de las monocapas CaCo-2. 

Sin embargo, el cloruro de TMQ 103,2 kDa a concentraciones de 0,01 % 

p/v redujo la viabilidad celular a un 70 % del valor inicial, estableciendo que 

la potencia y toxicidad de este derivado no metoxilado es mayor que la de 

su par metoxilado, según los antecedentes recopilados en bibliografía. La 

ausencia de impedimento estérico hace que este derivado sea más 

mucoadhesivo con porcentajes de cuaternización menores, en desmedro 

de la toxicidad. 

90



4. El cloruro de TMQ sintetizado es capaz de reducir la TEER de monocapas 

celulares CaCo-2 incluso a concentraciones de 0,001 % p/v. De este modo 

se corrobora que la ausencia de metoxilación deriva en un producto más 

potente. Al remover el polímero se aprecia una recuperación hacia los 

valores basales de TEER en concentraciones no superiores a 0,003 % p/v. 

5. La cantidad permeada de Capreomicina sulfato en monocapas celulares 

CaCo-2 fue menor a un 13 % de la cantidad total administrada, indicando 

que el proceso de absorción puede estar mediado tanto por difusión pasiva 

en las uniones ocluyentes (vía paracelular), como por transportadores de 

membrana. El transporte de Capreomicina sulfato en monocapas CaCo-2 

aumentó levemente en presencia del cloruro de TMQ, siguiendo una 

proporcionalidad en función de la concentración del polímero. Sin embargo, 

la alta variabilidad en los resultados hace que estas diferencias no sean 

significativas. 

6. En ratas Sprague-Dawley hembra, si bien hubo un aumento en la absorción 

intestinal de Capreomicina sulfato por efecto del cloruro de TMQ, este fue 

errático y no determinante para establecer si realmente esta acción se debe 

al polímero. 

91



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