פרק06. תגובת השרשרת של הפולימראז (PCR)

פרק 6מדעיות,‏ חבריו לעבודה הטילו ספק בהמצאתו.‏ חודשים ארוכים עברו עד שהצליח להוכיח באופן נסיונישה-‏PCR אכן ניתן לביצוע.‏ כשהיו בידיו ההוכחות הנסיוניות הדרושות,‏ הוא זכה לברכת הממונים עליו,‏פטנט נרשם והפיתוח הוצג בפני מדענים בכירים.‏ בשלב הבא,‏ הוקם צוות מדענים בחברה שבה עבדששקד על שכלול השיטה ומציאת תנאים אופטימליים ליישומה.‏ לבסוף,‏ כשהוכח שה-‏PCR היא שיטהשאינה רק ברת ביצוע אלא גם מעשית מאד,‏ היו מדענים שתמהו:‏ ‏"אז איך זה שלא חשבתי על זהבעצמי?"‏ בשנת 1993, זמן קצר יחסית לאחר פריצת הדרך של קרי מוליס,‏ הוא נקרא לשטוקהולםלקבל מדי מלך שוודיה את פרס הנובל לכימיה.‏ כיום לא ניתן לתאר עבודה במעבדה העוסקת בביולוגיהמולקולרית או בבית חולים ואפילו במעבדה לזיהוי פלילי ללא ,PCR כפי שאפשר ללמוד מהיישומיםהרבים שיש ל-‏PCR‏.‏עקרונות ומהות ה-‏PCRתהליך ה-‏PCR משמש לייצור של מספר רב של עותקים של מקטע DNA רצוי במבחנה.‏ ייצור מספררב של עותקיDNA רצוי מתאפשר על ידי שכפול חוזר ונשנה של מקטע DNA ומכונה לעיתים גם הגברהשל מקטע .DNA במהלך PCR טיפוסי יש ריבוי ניכר של המקטע הרצוי שבמהלכו מיוצרות במבחנהכמיליארד מולקולות DNA חדשות בתוך שעות ספורות.‏ מה הם המרכיבים והתנאים הנחוצים לשכפולDNA במבחנה?‏ במה שונה שכפול DNA במבחנה משכפול DNA בתא?‏ התשובה המלאה לשאלה זומצויה בטבלה 6.1.במרכיבים ומאפייניםשכפול DNA בתאשכפול DNA במבחנהDNA דו-גדיליDNA דו-גדיליחומר מוצאדרישה להתחלת השכפולמרכיבים הכרחיים נוספיםתחלים שהם אוליגו-נוקלאוטידים‏(טבעיים בתא)‏DNA פולימראז,‏ נוקלאוטידיםמטיפוס dNTP ויוני מגנזיוםתחלים שהם אוליגו-נוקלאוטידים‏(סינתטיים)‏DNA פולימראז,‏ נוקלאוטידיםמטיפוס dNTP ויוני מגנזיוםהפרדת גדילים לצורך שכפולבאמצעות אנזימים וחלבונים אחריםבאמצעות שינוי טמפרטורה (95°C)שכפולתיקון טעויות בזמן שכפולכל ה-‏DNA של התא משוכפלפעם אחתתיקון יעיל מאדמשוכפל רק מקטע מוגדר,‏קטן יחסית,‏ מספר רב של פעמיםרק לחלק מאנזימיה-‏DNA פולימראז הנמצאיםבשימוש יש יכולת מוגבלת לתיקון טעויותטבלה 6.1: הדומה והשונה בין שכפול DNA בתא ושכפול DNA במבחנה.‏שכפול מקטע DNA במבחנה שמאפייניו מובאים בטבלה 6.1, הוא חשוב אך אינו בגדר מהפכה.‏ קרי שהצטיין בחשיבה 43מקורית,‏ חזה כי חזרה על תהליך השכפול מספר פעמים תאפשר הגברה ושיבוט מקטע DNA רצוי ‏(הגברה פירושהעליה במספר עותקי המקטע הרצוי כפונקציה של החזרות על השכפול).‏ שכפול חוזר ונשנה של מקטע DNA במבחנההמכונה גם הגברה הוא העקרון המרכזי של השיטה הקרויה .PCR

פרק 6ג.‏ הגברה באמצעות מחזורי שכפול בשרשרתמחזור שכפול ראשוןמחזור שכפול שנימחזור שכפול 30,95˚c 30 שניות,60˚c 30 שניות,72˚c 60 שניות *,95˚c 30 שניות,60˚c 30 שניות,72˚c 60 שניות *,95˚c 30 שניות,60˚c 30 שניות,72˚c 60 שניות *א.‏ הפרדת גדיליםב.‏ הצמדות תחליםג.‏ סנתזת DNAעותק אחדמ-‏DNA מקור2 עותקים חדשיםשל DNA בעקבותהשכפול4 עותקים חדשיםשל DNA בעקבותהשכפול2 30 עותקים חדשיםשל DNA בעקבות30 מחזורי שכפול(1,073,741,824 עותקים)‏א.‏ הפרדת גדיליםב.‏ הצמדות תחליםג.‏ סנתזת DNAמחזור שכפול ראשוןמחזור שכפול שנימחזור שכפול 30* משך סנתזת ה-‏DNA תלוי באורך המקטע המיועד להגברהד.‏ מכשיר PCRבלוק מתכת לתוכומכניסים את המבחנותמבחנה ובה מרכיביתגובת PCRצגלוח להזנת נתוני המערךהנסיוני הנדרש‏(טמפרטורות,‏ זמנים,‏ ומספר חזרות)‏איור 6.2 המשך:‏ תגובת השרשרת של הפולימראז .(PCR)ג.‏ הגברה באמצעות מחזורי שכפול בשרשרת.‏ מתואר מערך הגברה של 30 מחזורי שכפול.‏ד.‏ מכשיר PCR המאפשר מעבר מהיר ואוטומטי בין טמפרטורות על פי המערך הנסיוני הנדרש.‏כמתואר באיור 6.2, מחזור שכפול אחד במהלך ה-‏PCR מורכב מהפרדת גדילים,‏ הצמדות תחלים וסנתזת .DNA קיומם 45של מחזורי שכפול בשרשרת,‏ כשתוצרי מחזור שכפול אחד משוכפלים במחזור הבא אחריו,‏ מאפשרים הגברה של כמותמקטע DNA רצוי.‏ כך,‏ מעותק אחד של DNA ניתן תיאורטית אחרי 30 מחזורי שכפול לקבל כמיליארד עותקי .DNA

פרק 6כמו כן נדרש לשכפול במבחנה:‏5. בופר המכיל יוני מגנזיום הנדרשים לפעילות ה-פולימראז.‏6. מכשיר PCR בו ממקמים את המבחנות עם מרכיבי תגובת ה-‏PCR והמאפשר מעבר מתוזמן,‏אוטומטי ומהיר בין טמפרטורות שונות.‏שכפול ה-‏DNA במהלך ה-‏PCR נעשה במחזורים.‏ כל מחזור מורכב מ-‏‎3‎ שלבים ‏(ראו איור ‎6.2‎ב'‏ ו ג'):‏1. הפרדת גדילים :(Denaturation) הפרדת הגדילים מאפשרת למולקולת DNA דו-גדילי להיפרד ל-‏‎2‎מולקולות DNA חד גדילי.‏ ההפרדה נעשית ב-‏‎95°C‏.‏2. הצמדות התחלים :(Annealing) שני תחלים בעלי רצף מוגדר ‏(פרי תכנון מוקדם)‏ שארכם כ-‏‎20‎נוקלאוטידים נצמדים ל-‏DNA חד גדילי.‏ ההצמדות היא לרצף DNA המשלים לרצף התחל.‏ התחליםמתוכננים כך שייצמדו במרחק מוגדר זה מזה.‏ רצף התחלים קובע את מקום ההצמדות ל-‏DNAוהמרחק ביניהם קובע את גודלו של מקטע ה-‏DNA שיוגבר.‏ ההצמדות נעשית בטמפרטורה שביןל-‏‎65°C‏.‏ 50°C3. סנתזת :(DNA synthesis) DNA שלב זה נקרא לעיתים גם שלב הארכה (elongation) שכן בשלב זהה-‏DNA פולימראז מזהה את קצה '3 של התחלים הצמודים ל-‏DNA ומאריך אותם באמצעותהוספת נוקלאוטידים ועל פי המידע המצוי בכל אחד מהגדילים המשלימים של DNA המטרה.‏סנתזת ה-‏DNA נעשית בטמפרטורה שבין 68°C ל-‏‎72°C ובסיומה מתקבלים עותקים חדשים שלDNA משוכפל.‏מתיאור השלבים עולה כי בכל מחזור שכפול יש צורך בשינוי הטמפרטורה בין שלב לשלב.‏ לכן,‏המבחנה ובה מרכיבי ה-‏PCR מוכנסת למכשיר PCR שצילום שלו ניתן לראות באיור ‎6.2‎ד'.‏ מכשיר זהמצויד בגופי חימום ומערכת קירור המבוקרים על ידי מערכת הניתנת לתכנות.‏ המכשיר מאפשרמעברים מהירים בין הטמפרטורות הרצויות לפי מערך ניסיוני שניתן להגדיר מראש.‏ כמו כן,‏ בשלהצורך בטמפרטורות גבוהות במהלך השכפול במבחנה משתמשים באנזים DNA פולימראז העמידלחום.‏ לקבלת כמויות ניכרות של DNA רצוי באמצעות שכפול DNA במבחנה חוזרים על התהליךהתלת-שלבי ‏(מחזור שכפול)‏ מספר פעמים.‏DNA פולימראז העמיד לחום מופק מחיידקים הגדלים לדוגמה,‏ אם חומר המוצא כלל עותק אחד האנזיםמים חמים שהטמפרטורה שלהם היא בסביבות 75°C.בלבד של ה-‏DNA המיועד להגברה הרי שקל במעיינותהעמיד לחום הראשון שהוכנס לשימוש לצורך הגברה האנזיםלחשב מה יהיה מספר עותקי ה-‏DNA הרצויDNA במבחנה היה ה-‏DNA פולימראז שהופק מהחיידק שללאחר כל מחזור שכפול ‏(איור ‎6.2‎ג').‏ כך,‏ לאחרהאופטימלית לפעילות אנזים זה היא 72°C והאנזים המחזור הראשון יתקבלו שני עותקים של הטמפרטורהלשמר מידה ניכרת של פעילותו גם לאחר שהות קצרה יכולה-‏DNA‏,‏ לאחר שני מחזורים 4 עותקים ולאחרלפעם ב-‏‎95°C‏.‏ כעבור שנים מספר הוכנסו סוגים נוספים מפעםDNA פולימראז עמידים לחום Supertherm) Pow, ואחרים)‏ שלושה מחזורים נקבל 8 עותקים.‏ אם נמשיך שלבעלי תכונות דומות לתכונות ה-‏Taq וחלקם בעלי תכונות בצורת חישוב זו נמצא כי לאחר 30 מחזורי שחלקםכגון יכולת טובה לתקן טעויות בזמן השכפול.‏ קיומו של משופרותשכפול עשויים להתקבל בתנאים אופטימלייםDNA פולימראז עמיד לחום היה אחד הגורמים העקריים אנזיםאת האוטומציה של תהליך ה-‏PCR‏.‏ למעלה ממיליארד עותקים.‏ מספר העותקים שאפשרושיתקבל בתנאים אופטימליים לאחר n מחזורים.Taq polymerase ושזכה לכינוי Thermus aquaticusהפרדת גדילים והצמדות תחלים מצריכים שימוש בטמפרטורות גבוהות.‏ מכשיר ה-‏PCR מאפשר אוטומציה של המעברמהיר ומתוזמן בין הטמפרטורות השונות הדרושות במהלך ההגברה ‏(איור ‎6.2‎ד').‏ הצורך בטמפרטורות גבוהות במהלךההגברה חייב למצוא אנזימים שהטמפרטורה האופטימלית הנדרשת להם לשם סנתזת DNA גבוהה אף היא.‏ אנזימיםמסוג זה המשמשים ב-‏PCR מקורם בחיידקים הגדלים במעיינות מים חמים.‏46

פרק 6זה מול זה על שני הגדילים.‏ כך,‏ שיעור הטעות לאחר שכפול של DNA בתא ‏(שיעור המוטציות)‏שלא תוקנו הוא רק בסיס/נוקלאוטיד אחד לכל 3 מיליארד בסיסים!‏ לעומת זאת,‏ במהלך שכפולבמבחנה האנזים היחיד שעשוי לתקן טעויות הוא ה-‏DNA פולימראז עצמו.‏ לא כל האנזימיםהמשמשים ב-‏PCR בעלי יכולת תיקון טעויות ואם משתמשים באנזים בעל יכולת תיקון טובה הואיאפשר שמספר הטעויות לא יעלה על 1 ל-‏‎6000‎ נוקלאוטידים.‏ שיעור מוטציות זה עדיין גבוה מאדבהשוואה לשיעור המוטציות בתא.‏4. תוצרי הגברה לא רצוים ‏(בעיות אפשריות בספציפיות ההגברה):‏ למעט מקרים מיוחדים,‏ התחליםעבור הגברת מקטע DNA מסוים מתוכננים בקפדנות כך שתהיה התאמה מוחלטת בין רצףהתחל לבין רצף אחד ויחיד ב-‏DNA המקור ובו הרצף המשלים לתחל.‏ תכנון שכזה מאפשר,‏במרבית המקרים ולמעט הטעויות האפשריות שאוזכרו בסעיף 3, קבלת תוצר PCR אחד,‏ שהואהתוצר הרצוי.‏ אולם,‏ לעיתים נוצרת הצמדות בין התחלים לבין יותר מזוג רצפים ב-‏DNA המקור.‏בדרך כלל אירועי ההצמדות הנוספים הםעלולים לעבור ‏"הצמדות חלקית"‏ שבה נצמדים מטיפוס של ‏"הצמדות חלקית"‏ בה מעורבים תחליםמקצת הבסיסים של התחלים ל-‏DNA המקור ‏(בהצמדות רק מקצת מהנוקלאוטידים שבתחל והם רקמעורבים כ-‏‎60%‎ מהבסיסים בתחל).‏ הצמדות חלקית כזו כזומתקיימים באתרים שונים מאלה שתוכננוביציבות נמוכה יחסית.‏ אך למרות זאת היא עלולה מתאפיינתלעיתים קבלת תוצר PCR בלתי רצוי.‏ כדי להמעיט להשתתף בהצמדות תקנית ומלאה.‏ לאפשרהאפשר את אפשרות קיומם של אירועי הצמדות חלקיים הצמדות חלקית לרצפים לא רצויים עלולה ככלרצויים,‏ מקפידים לקיים הצמדות תחלים בטמפרטורה ולאלאפשר יצירתם של תוצר או תוצרי הגברהיחסית והמותאמת לאורכו של התחל.‏ ככל שהתחל גבוההיותר ניתן ורצוי להעלות את הטמפרטורה שבה לא רצויים והם עלולים להתקבל בנוסף ארוךאת ההצמדות,‏ וזאת כדי למנוע אירועי הצמדות לתוצר הרצוי או במקומו.‏ לפיכך,‏ מקפידים מקיימיםרצויים.‏ כמו כן,‏ נמנעים מלהשתמש בתחלים הקצרים לאלבדוק את תוצרי ההגברה באמצעות ג'ליםנוקלאוטידים שעלולים לאפשר אירועי הצמדות לא מ-‏‎17‎וקבלת תוצרי הגברה לא רצויים.‏ ‏(האם התקבל מקטע DNA רצוי ובגודל רצוייםהצפוי?).‏ לעיתים לא מסתפקים באפיון גודלומוודאים קבלת התוצר הרצוי על פי קביעת רצף ה-‏DNA שלו.‏שאלה 6.1:מה הן לדעתכם התכונות של מוליס כאדם וכמדען שאפשרו לו להגיע להישג מדעי מרשים בפיתוחה-‏PCR‏,‏ שיטה מולקולרית מהפכנית?‏שאלה 6.2:הניחו כי בהליך PCR מסוים חומר המוצא הוא 4 עותקים של DNA המיועד להגברה.‏ כמה עותקי DNAרצוי אנו מקווים לקבל בתנאי הגברה אופטימליים לאחר 12 מחזורי הכפלה?‏שאלה 6.3:1. שכפול DNA בתא של יונק למשל נעשה בטמפרטורה של 37°C ואילו שכפול DNA במבחנה מצריךטמפרטורות גבוהות עד 95°C. הסבירו את הצורך בטמפרטורות גבוהות במהלך שכפול במבחנה6.16.26.3מגבלה נוספת שיש לשימוש ב-‏PCR היא הופעתם לעיתים של תוצרי הגברה לא רצויים.‏ תוצרים אלה מקורם באירועיהצמדות בלתי מתוכננים של התחלים לאתרים לא רצויים ב-‏DNA המקור.‏ בהצמדות הלא רצויה של תחלים משתתפיםרק מקצת הנוקלאוטידים בתחל.‏ ניתן להימנע ממרבית התוצרים הלא רצויים על ידי שימוש בתחלים ארוכים יחסיתושימוש בטמפרטורה גבוהה יחסית בעת ההצמדות.‏48

פרק 6וציינו גורמים בתא שמאפשרים שכפול בטמפרטורות נמוכות בהרבה.‏2. בעת פיתוח הליך ה-‏PCR ובתקופה הראשונה לשימוש ב-‏PCR היה צורך להוסיף מנה טרייה שלאנזים לאחר כל מחזור שכפול.‏ הסבירו מה הייתה הסיבה לכך?‏3. תהליך ה-‏PCR נכנס לשימוש נרחב רק כשהשתכלל ונעשה אוטומטי.‏ הסבירו מדוע ומה היה הגורםהמכריע שאפשר שכלול ואוטומציה?‏6.4שאלה 6.4:למרות העוצמתיות של ה-‏PCR ישנם מצבים בהם ההגברה אינה אופטימלית.‏ אלו מהגורמים הבאיםעלול להפחית במספר העותקים של ה-‏DNA הרצוי שעשוי להתקבל באמצעות ?PCR2. DNA המקור נלקח ממומיה כבת 2500 שנה.‏3. מקטע ה-‏DNA הרצוי להגברה הוא כבן 15,000 בסיסים.‏4. למבחנה הוכנסה כמות כפולה של יוני מגנזיום מזו הנחוצה לפולימראז לשכפל את המקטעהרצוי.‏5. לתחלים שבשימוש מספר רצפים ב-‏DNA המקור שאליהם הם יכולים לעבור הצמדות לא מלאהנמקו את תשובותיכם.‏6.5שאלה 6.5:בשאלה 4 בפרק 5 דווח על מאמצי החוקרת הנדסית לקבוע מעורבות גנים מסוימים בקביעת גודלפרי.‏ היא עשתה זאת על-ידי אפיון גנים מצמחים בעלי פירות קטנים ואשר בהם אתרה מוטציותשנוכחותן גורמת לאובדן ביטוי תוצר גן תקין.‏ החוקרת שבה לשדה השיחים ואיתרה צמחים מענייניםאחרים שהפרי שלהם גדול מהממוצע ומיד רצתה לשבט מחדש גנים שעשויים להיות רלוונטיים למופעהפירות הגדולים.‏ ההיגיון שמאחורי שיבוט מחדש לצרכים כאלה הוצג בשאלה 5.4. מכוון שמופע הפריהגדול התגלה לאחר המצאת ה-‏PCR ומכיוון שה-‏PCR מקנה יכולות לשיבוט מהיר ללא צורך בספריות,‏היא בחרה בדרך זו לשיבוט מחדש של גנים רצויים.‏ אם הנדסית לא תשבט באמצעות ספריות אלאתשבט באמצעות ,PCR על אילו מהכלים והתהליכים הבאים היא תוכל לוותר ומדוע?‏.1 הפקת DNA2. בקטריופאג‘ים3. גלאי רדיואקטיבי.4 DNA פולימראז5. סינתזת אוליגו-נוקלאוטידים6. קביעת רצף המקטע המשובט7. פלסמידים וחיידקים49

פרק 6PCR במשפט וברפואהכמעט מהיום בו הומצא,‏ השימוש ב-‏PCR יצא אל מחוץ לגבולות מעבדתו של המדען זאת בעיקר בשלרגישותה הגבוהה של השיטה והעובדה כי כדי לבצע PCR די בכמות DNA מזערית ואין צורך ש-‏DNAזה יהיה נקי.‏ למעשה די בכמות DNA כזו הקיימת בכתמי דם,‏ בטיפות רוק או בשורש של שערה כדילהגביר DNA באמצעות PCR ולהפיק ממנו מידע.‏ מידע זה עשוי,‏ לדוגמה,‏ להפליל או לזכות חשוד בביצועפשע.‏ כמו כן,‏ די אפילו בתא בודד שנלקח מעובר בן שמונה תאים שנוצר בהפריית מבחנה כדי לבדוקבאמצעות PCR נוכחות גנים בעלי מוטציה בגנום העובר.‏ מידע אבחוני זה יכול לאפשר להחליט אםלהשתיל את העובר ברחמה של אישה.‏ ואלה הם רק מקצת היישומים שנמצאו ל-‏PCR‏.‏ישומים בזיהוי גנטי ופליליהמקום הוא זירת פשע שלאחר מאבק והחוקרים מהמעבדה לזיהוי פלילי מגיעים.‏ מה הן הבעיותבפניהן ניצבים החוקרים?‏ החוקרים אוספים שערה חשודה.‏ פעילות מאומצת מאפשרת להם לאתרחשודים בביצוע הפשע ומומחי הרפואה המשפטית לוקחים דגימת דם מכל אחד מהם.‏ כעת אפשרלהשוות בין ה-‏DNA שמקורו בשורש השערה שנמצאה בזירת הפשע לבין ה-‏DNA שהופק מדמם שלהחשודים ‏(ישום השוואתי).‏ הנחת העבודה היא שלצד דמיון ברצף ה-‏DNA של אנשים שונים יש פהושם ב-‏DNA של פרט אחד רצפים שונים מאילו שבפרט אחר.‏ זוהי שונות טבעית שנוצרה במהלךהדורות באמצעות מוטציות שאינן מזיקות באופן גורף ושאחראיות ליצירת ‏"פולימורפיזם"‏ ‏("רב-‏צורתיות",‏ של DNA כמובן).‏ איתור מהיר של השונות בין הרצפים אצל פרטים שונים והשוואתהלמאפייני הרצף של הראיה המשפטית הם הבסיס ליישומים בתחום החוק והמשפט.‏ בפועלמתמקדים בשונות הקיימת בין פרטים ברצפים קצרים החוזריםנפוץ הוא מטיפוס שבו 1האחד בעקבות השני בסמיכות מקום וקרויים רצפים קצרים,‏ פולימורפיזםכ-‏‎1200‎ בסיסים בגנום שונה מאדם נשנים ועוקבים ובאנגלית Short Tandem Repeats ובקצרה .STR מתוךלמשנהו.‏ שונות כזו נקראת SNPאחדה-‏STR הם רצפים בני כמה עשרות או מאות של בסיסיםאין מתמקדים ברפואה משפטית המצויים באותו חלק הארי של הגנום שאינו מקודד לחלבונים.‏ לרובמסוג זה.‏ מובאת כאן דוגמה של רצף מסוים,‏ רצף שלשם המחשה הוא בשונותמצוי בכרומוזום 13 של אדם מסוים ‏(פרט a):.(Single Nucleotide Polymorphysm)CCGTAAATCCCTAATCAATCAATCAATCAATCAATCTTGGCATGAרצף זה יכונה רצף א'.‏ הרצף החוזר על עצמו הוא .AATC ה-‏STR מודגש וזהו STR שבו 6=n כאשר n הואמספר החזרות.‏ רצף א'‏ מצוי על כרומוזום 13 במיקום מסוים המוגדר על ידי הרצפים משני צידי הרצףהחוזר על עצמו.‏רצף ב'‏ המצוי אף הוא באותו אדם אך בכרומוזום 13 השני שבתא כלומר בכרומוזום ההומולוגי נראהכך:‏CCGTAAATCCCTAATCAATCAATCAATCTTGGCATGAל-‏PCR מגוון יישומים ברפואה,‏ בזיהוי גנטי ‏(קביעת אבהות,‏ לדוגמה)‏ ובזיהוי פלילי.‏ בזיהוי גנטי ובכלל זה בזיהוי פלילישל פרטים נבחנים משתמשים ב-‏PCR כדי להגביר מקטעי DNA המכילים STR .STR הם רצפים קצרים,‏ נשנים ועוקביםכמודגם בעמוד זה לגבי הרצף החוזר .AATC52

פרק 6ה-‏STR מודגש והוא מאותו טיפוס של ה-‏STR המצוי ברצף א'‏ אבל 4=n. ברצף ב',‏ מימין ומשמאל ל-‏STR קיימת זהות לרצף א'.‏ בשל הדמיון בין רצף א'‏מוגדרים כצורות חלופיות של מקטע DNAלרצף ב'‏ ובשל העובדה שהם נמצאים באותו מקום אלליםגן.‏ ניתן לראות באלל ‏"גרסה של "DNA או ‏"עותק של על כרומוזומים הומולוגיים,‏ רצפים א'‏ ו ב'‏ הם אלליים אובתא לכל גן שני אללים ‏(שתי גרסאות)‏ הממוקמים ."DNA‏(רצף א'‏ יוגדר כאלל 1 ורצף ב'‏ יוגדר כאלל 2).מובאים כאן רצפים ג'‏ ו-ד'‏ מאדם אחר ‏(פרט b)המצויים אף הם בכרומוזום 13 ובאותו מיקום:‏רצף ג':‏אחד משני כרומוזומים הומולוגיים ‏(דומים).‏ אחד בכלהתקבל מהאב והאחר מהאם.‏ באותו אופן מהכרומוזומיםל-‏DNA אחר בתא,‏ כולל DNA שבו ,STR יש שני אללים גםשמקורם בכל אחד מהכרומוזומים ההומולוגיים.‏ ‏(גרסאות)‏המקרים יש שוני קל בין שני האללים של גן או DNAברובאחר בתא.‏ אלליCCGTAAATCCCTAATCAATCAATCTTGGCATGAרצף ד':‏CCGTAAATCCCTAATCAATCAATCAATCAATCTTGGCATGAרצפים ג'‏ ו-ד'‏ בפרט b מגדירים שני אללים נוספים ‏(אללים 3 ו-‏‎4‎‏).‏ ואכן לגבי STR מסוים יתכנו באוכלוסיהאללים רבים!‏המטרה בזיהוי גנטי של פרט נבחן היא לנצל את ה-‏PCR לאפיון סוג האללים של STR שיש לפרט נבחן.‏בזיהוי פלילי אפיון אללים של STR אצל חשוד והשוואתו ל-‏ STR בדגימה המשמשת כראיה משפטית הםהבסיס להסקת מסקנות משפטיות.‏ כיצד כל זה מתבצע?‏ כמתואר באיור 6.4, תהליך זיהוי פרט נבחן עלפי האללים של STR שלו מורכב מ-‏‎3‎ שלבים עיקריים.‏ ראשית,‏ יש להגדיר סוג ה-‏STR בו רוצים להתמקדולדעת את זהות הרצפים משני צידי הרצף החוזר על עצמו ‏(‏‎6.4‎א').‏ שנית,‏ יש לבצע הגברה של מקטעהמכיל STR וזאת באמצעות PCR ‏(‏‎6.4‎ב')‏ ולבסוף לבחון את תוצרי ה-‏PCR בג'ל ‏(‏‎6.4‎ג').‏ בזיהוי פלילי דגםתוצרי ה-‏PCR בג'ל מאפשר להשוות בין דגם פסים שמקורו ב-‏DNA של פרטים נבחנים ‏(חשודים)‏ לביןדגם הפסים שמקורו בראיה המשפטית.‏להרחבה וסיכום,‏ הפעולות המתבקשות לאפיון גנטי של פרטים ‏(ולא רק חשודים בביצוע פשעים)‏באמצעות אפיון STR הן ‏(היעזרו באיור 6.4):1. תכנון תחלים שנגזרים מהאזורים שמשני צידי ה-‏STR‏.‏ לדוגמה,‏ כדי לאפשר קבלת מקטע DNAבגודל מינימלי של 150 נוקלאוטידים על תחל אחד להיגזר מרצף המצוי כ-‏‎75‎ בסיסים מימין ל-‏STRועל האחר להיגזר מרצף המצוי כ-‏‎75‎ משמאל ל-‏STR‏.‏לכל פרט יש שני אללים של STR מסוים ‏(להגדרה מהו אלל ראו תיבה צדדית בעמוד זה).‏ אם האללים של פרט מסוים 53שונים זה מזה הרי שבכל אלל מספר חזרות שונה של ה-‏STR המסוים.‏ במקרה כזה,‏ כשמשתמשים בתחלים שנצמדיםלשני צידי ה-‏STR הנבחן להגביר DNA שמקורו בפרט נבחן יתקבלו 2 מקטעים בגדלים שונים.‏

פרק 62. ביצוע תגובות PCR נפרדות ובהן דגימות DNA מכל אחד מהפרטים הנבחנים ובמקרה של זיהוימשפטי גם תגובת PCR ובה DNA מהראיה המשפטית.‏3. הפרדה בג'ל של תוצרי ה-‏PCR שהתקבלו לאחר שלב ב'.‏ אם נערך מבחן לסוג אחד בלבד שלSTR מתקבלים שני תוצרי DNA עיקריים ‏(הנראים בג'ל כשני פסים),‏ אחד מכל אלל,‏ או תוצר אחדכאשר שני האללים זהים.‏ ככל שמקטע DNA מסוים שהתקבל גדול יותר פירושו שיש בו יותרחזרות של .STR4. השוואה בין גדלים של תוצרי PCR שמקורם בפרטים הנבחנים השונים ‏(השוואת דגם הפסים).‏בזיהוי פלילי משווים את התוצרים מפרטים נבחנים לתוצרים שהתקבלו מהראיה המשפטית.‏5. הסקה של מסקנות משפטיות או אחרות.‏6.66.7שאלה 6.6:אתם מתאמצים לשבט מחדש מקטע מגן לצורך איתור מוטציות אפשריות.‏ בצעתם הגברה באמצעותPCR וניסיתם לקבוע את רצף הבסיסים של ה-‏DNA תוצר ההגברה אך לרוע המזל נכשלתם.‏ בדיקה בג'לגילתה לכם את הסיבה:‏ ה-‏PCR הביא להגברת שני מקטעי .DNA אתם מניחים כי אחד המקטעים הואתוצר הגברה בלתי רצוי והאחר הוא התוצר הרצוי.‏ לרוע המזל,‏ התוצרים קרובים זה לזה בג'ל באופןשאי אפשר להפיק את התוצר הרצוי בנפרד מהלא רצוי.‏ מה תעשו כדי ‏"לנקות"‏ את התוצרים ולקבועאת הרצף שלהם?‏שאלה 6.7:מי ביצע את הפשע?‏ באיור ‎6.4‎א'‏ מוצג מקרה פרטי בו קיימים בכלל האוכלוסיה 6 אללים שבהםרצף ה-‏STR החוזר על עצמו הוא .AGTC מימין ומשמאל לרצף החוזר על עצמו קיימים רצפים ייחודייםהזהים בקרב האללים השונים.‏ לכל פרט ‏(חשוד)‏ שני אללים מתוך ששת האללים האפשריים,‏ שיכוליםלהיות שונים זה מזה או זהים זה לזה.‏ אתם מעוניינים להגביר מקטעי DNA שמקורם באללים בכלחשוד וכן להגביר DNA שמקורו באללים המצויים בשערה המשמשת כראיה המשפטית.‏ לאחר השוואהמולקולרית זו יתאפשר לכם,‏ אולי,‏ לקבוע מי ביצע את הפשע.‏הניחו כי משתמשים בתחל שקצה '5 שלו מצוי 70 בסיסים משמאל למקבץ ה-‏STR ובתחל שקצה '5שלו 80 בסיסים מימין למקבץ ה-‏STR .קבעו לפי איור ‎6.4‎ג':‏1. מי מבין ארבעת החשודים בביצוע הפשע זכאי מכל אשמה?‏2. לגבי כל חשוד קבעו על פי גודל המקטע כמה חזרות של רצף ה-‏STR מהטיפוס AGTC יש בכל אחדמהאללים שלו.‏כדי להבין ביתר פירוט כיצד מתבצע זיהוי גנטי ובכלל זה זיהוי פלילי,‏ מומלץ לשוב ולעיין באיור 6.4 ובמקביל לעיין 55בסיכום הדרישות (1-5) לאפיון גנטי של פרטים באמצעות אפיון STR ‏(ראו עמוד זה).‏

פרק 6שאלה 6.8:התשובה שלכם לשאלה 6.7 זיכתה 3 מבין החשודים מכל אשמה.‏ החשוד שהאשמה הוטלה עליוטען כי למרות ממצאי הבדיקה הגנטית הוא חף מפשע ואף נקב בשמו של חשוד נוסף שטרם נעצר.‏לכשנערכה בדיקת ה-‏STR גם לחשוד הנוסף התגלה כי דגם ה STR‏-שלו זהה אף הוא ל-‏STR של הראיההמשפטית.‏ על פי מידע זה שמקורו בטיפוס אחד בלבד של STR לא ניתן היה לקבוע מי משני החשודיםאשם בביצוע הפשע.‏ השופט רגז מאד על אנשי המעבדה לזיהוי פלילי על שהסתפקו במבחן ל-‏STRמטיפוס אחד בלבד בגנום והורה לעשות מבחן השוואתי חוזר לשני החשודים לגבי 3 טיפוסי STR שוניםב-‏‎3‎ אתרים שונים בגנום.‏ בהנחה שכל פרט הוא הטרוזיגוט ‏(בעל שני אללים שונים,‏ שלא כהומוזיגוטלו שני אללים זהים)‏ לגבי כל אחד משלושת ה-‏STR השונים ובהנחה כי מטעינים באותה באר בג'ל אתתוצרי ההגברה של כל שלושת ה-‏STR השונים של פרט מסוים,‏ כמה פסים רלוונטיים של DNA יתקבלובכל עמודת ג'ל טיפוסית בה DNA של חשוד?‏ ציירו סכמטית תוצאות מבחן השוואתי שכזה לגבי שניהחשודים והראיה המשפטית ‏(שבו מידע מ-‏‎3‎ אתרי (STR שעל פיו החשוד הנוסף הופלל בעוד שהחשודהמערער זוכה מאשמה.‏6.8יישומים בתחום הרפואיהיישומים בתחום הרפואי נחלקים לשניים:‏ זיהוי בתחום המחלות הזיהומיות וזיהוי בתחום המחלותהגנטיות.‏ בתחום המחלות הזיהומיות העיקרון המנחה הוא לזהות באמצעות PCR וירוס ספציפי אוחיידק ספציפי מחולל מחלה.‏ אצל חולים,‏ לדוגמה,‏ משתדלים לזהות מיהו גורם המחלה שאחראילמחלה.‏ לעומת זאת,‏ במזון חשוד כמקולקל מנסים לזהות גורמי מחלה באמצעות PCR כדי לדעת אםיש להמנע משימוש במזון.‏ לצורך כך משתמשים בתחלים ספציפיים למחולל מחלה אפשרי בניסיוןלהגביר DNA באמצעות PCR שיעיד על קיום מחולל מחלה.‏ האבחון בצורה זו הוא מהיר ועשוי להשפיעעל סוג הטיפול שינתן לחולה.‏ אחת הדוגמאות מתייחסת לאיתור נשאים של וירוס ה-‏HIV‏,‏ הוירוסמחולל האיידס.‏ ניתן לקחת דגימת דם של הנבדקמקרים מקובל לקיים מבחן אימונולוגי להמצאות ולקיים תגובת RT-PCR באמצעות תחלים המשלימים בהרבהכנגד וירוס ה-‏HIV בדמם של נבדקים.‏ נוכחות נוגדנים רצפים הנמצאים רק בוירוס ה-‏HIV‏.‏ DNA תוצר PCR נוגדניםמעידה על קיום הוירוס.‏ מאידך,‏ לעיתים מעדיפים בדםיתקבל רק אם בדמו של הנבדק קיים וירוס ה-‏HIV‏.‏באמצעות PCR על פני אבחון אימונולוגי מכיוון אבחוןאימונולוגי ל-‏HIV אינו ישים בחודשים הראשונים שמבחןההדבקה,‏ שכן המערכת האימונית לא הספיקה בתחום המחלות הגנטיות שמור ל-‏PCR תפקיד לאחרנוגדנים.‏ יתרה מכך,‏ כיום ידועים עשרות זנים של וירוס חשוב בבדיקה גנטית-רפואית של פרטים.‏ בעקר לייצרשתרופות מסוימות יעילות כנגד אחדים אך לא כנגד ה-‏HIVחשוב הדבר כשמעוניינים לדעת אם פרט מסויםהזנים השונים נבדלים ברצף ה-‏RNA שלהם וניתן לכן אחרים.‏בתחלים שנועדו לזהות קיומו של זן זה או אחר.‏ הוא נשא של מוטציה המעורבת במחלה תורשתית.‏ להשתמשיכול לשמש לכן לאבחון זן ה-‏HIV המצוי בדמו של ויותר מכך,‏ האם הורה הוריש לצאצאיו עותק מוטנטי RT-PCRולאפשר התאמת תרופה מתאימה לחולה הנבדק.‏ נבדקשל גן והאם העובר עתיד לחלות בשל ‏"מוטציותשקבל מהוריו"?‏ כמובן שלגבי מחלה מסוימת נחוץמידע מוקדם לצורך מבחנים גנטיים מסוג זה.‏ לאחר קריאת הקטע הבא תוכלו להעריך את סוג המידעהדרוש.‏בתחום הרפואי מקובל להשתמש בהגברה תלוית PCR לזיהוי גורמי מחלה שונים.‏ העיקרון בבסיס ישום זה הוא המצאותרצפי DNA ייחודיים בגורמי מחלה ‏(חיידקים,‏ וירוסים)‏ שניתן להגבירם באופן סלקטיבי באמצעות .PCR בתחום המחלותהגנטיות משתמשים ב-‏PCR לאבחון המצאות מוטציות אצל פרטים שונים וגם אצל עוברים לפני השרשתם ברחם.‏56

פרק 6מה הם הנתונים והשיטות העומדות לרשות המאבחנים הגנטיים?‏ נתמקד במקרה הפרטי של מחלתהסיסטיק פיברוסיס CF) (Cystic Fibrosis: ‏(לייפת כסייתית).‏ החולים במחלה סובלים מהפרשות ריריותבדרכי הנשימה ומקשיי נשימה.‏ המחלה מתאפיינת בכך שהיא מתפתחת אצל אלה שיש להם מוטציהבכל אחד משני האללים ‏(מחלה רצסיבית)‏ של גן הקרוי .CFTR נמצא כי בכל אחד משני האללים אצלהחולים במחלה יש מוטציה נקודתית ‏(מוטציהפיברוסיס היא אחת המחלות הגנטיות נקודתית פירושו הבדל של בסיס אחד בין אלל לא סיסטיקביותר ובאוכלוסיות מסוימות כ-‏‎1‎ מ-‏‎2,500‎ תקין לאלל תקין)‏ אשר אחראית ליצירת חלבון CFTR הנפוצותחולה במחלה.‏ הורשת המחלה היא בדגם אנשיםפגום.‏ לאחר שנים רבות של מחקר שבמהלכן נבדקוהמחלה מתקיימת אצל אלה שיש להם מוטציה רצסיבי:‏אחד משני עותקי הגן המעורב במחלה ‏(מוטציה מאות חולים,‏ אותרו באוכלוסיה 29 סוגים של מוטציות בכלהאללים).‏ הגן CFTR המעורב במחלה מקודד נקודתיות בגן זה.‏ כך,‏ לכל נשא של המחלה שהוא בשניה-‏CFTR הממוקם בקרום התא.‏ חלבון ה-‏CFTR לחלבוןבעצם בריא מהבחינה הקלינית יש באלל של הגן ל-‏על מעבר יוני כלוריד וחשוב לתפקודם התקין של אחראיהעדר של צורה תקינה שלו משבשת במיוחד CFTR אחת מ-‏‎29‎ מוטציות מאופיינות אפשריות.‏ האלל התאים.‏תפקודם של תאים המרפדים את צינורות הריאה.‏ השני תקין אצל מי שמוגדר נשא.‏ יעוץ גנטי יעיל הוא אתכך מצטברת שכבת ליחה עבה בריאות של חולי משוםכזה שמסוגל לקבוע האם אחד מבני הזוג הוא נשאפיברוסיס הסובלים בשל כך מקשיי נשימה.‏ סיסטיקהליחה מתרבים בקלות חיידקים דבר שגורם של אלל מוטנטי.‏ אם שני בני הזוג הם נשאים,‏ על בנוכחותתכופים בריאה.‏ היועץ הגנטי לידע את בני הזוג כי בשלבים מוקדמים לזיהומיםשל ההריון על האשה לערוך בדיקה גנטית לעוברשבמסגרתה יערך מבחן להתכנות שני אללים מוטנטיםבעובר.‏ באם תוצאת מבחן זה חיובית,‏ נהוג לשקול הפסקת הריון.‏מה הם היבטים הטכניים לעריכת מבחן להתכנות מוטציה באללים של הגן המעורב בסיסטיקפיברוסיס?‏ נתמקד כאן באחת השיטות המהירות העושה שימוש ב-‏PCR ושפותחה לזיהוי מוטציותנקודתיות בעלות אופי ידוע מראש באתרים ספציפיים.‏ שיטה זו מאפשרת את הגברת ה-‏DNA רקבמקרים בהם יש מוטציה.‏ הגברה זו נקראת בשם הגברה מותנית מוטציות.‏ סיכום עקרונות השיטהמובא באיור 6.5. לצורך ההגברה המותנית משתמשים בתחל מיוחד בעל רצף הנגזר מהאלל המוטנט.‏כך,‏ משתמשים בתחל שבקצה '3 שלו מצוי הבסיס היחודי למוטנט.‏ התחל האחר נגזר מרצף תקיןוהגדרה של רצף תקין היא רצף שמעולם לא אופיינה בו מוטציה אצל חולים במחלה.‏ בדוגמה שבאיור6.5, לפרט הנבחן אלל תקין ביחס למוטציה הנבדקת ואלל מוטנטי.‏ הפרט הוא אם כן ‏"נשא".‏ תוצרPCR יתקבל רק מ-‏DNA שמקורו באלל המוטנטי שכן,‏ למרות שהתחל שנועד לזהות אלל מוטנטי יעבורהצמדות גם לאלל התקין,‏ הצמדות זו לא תהיה מלאה והDNA פולימראז לא יוכל ‏"לתפוס"‏ את קצה '3של התחל ולהאריכו וזאת מכוון שקצה חשוב זה אינו נצמד לגדיל ה-‏DNA ‏(איור 5.6).מה צריך לעשות על פי השיטה הנ"ל כדי לענות לשאלה אם אדם מסוים הוא נשא ‏(של אלל מוטנט)‏למחלת הסיסטיק פיברוזיס?‏ בשימוש בשיטה להגברה מותנית מוטציות יש להשתמש ב-‏‎29‎ זוגותתחלים כשכל זוג נועד לבחון התכנות מוטציה מסוימת באתר מסוים.‏ אך האם יש לבצע 29 תגובותPCR נפרדות כשמשתמשים ב-‏DNA שהופק מפרט מסוים?‏ התשובה לכך היא לא.‏ ניתן בהחלט להכניסלתוך מבחנה אחת יותר מזוג אחד של תחלים שנועדו לזהות מוטציה ובמקרה שכזה נקרא ה-‏PCR בשםPCR) Multiplex PCR שנועד לאפשר הגברה בו זמנית יותר ממקטע DNA אחד).‏ לאבחן התכנות מוטציהב-‏CFTR משתמשים ב-‏‎4‎ תגובות ‏(ב-‏‎4‎ מבחנות)‏ כשבכל מבחנה תת קבוצה של 29 זוגות התחליםעל אחת הדרכים לאבחון מוטציות בגן המעורב במחלה ניתן ללמוד מהמקרה הפרטי של הגן המקודד ל-‏CFTR‏.‏ מוטציות 57בשני אללים של הגן CFTR גורמות להופעת מחלת הסיסטיק פיברוסיס.‏ מוטציה באלל אחד מגדירה פרט כנשא.‏ הנשאהוא בריא.‏ באוכלוסיה יש 29 סוגים שונים של מוטציות מאופיינות בגן זה.‏

פרק 6‏(לדוגמא 7 זוגות תחלים שנועדו לזהות התכנות אחת מ-‏‎7‎ מוטציות אפשריות שונות במבחנה אחת ו-‏‎8‎זוגות כאלה במבחנה שנייה וכו').‏לגבי פרט מסוים,‏ בהעדר תוצרי הגברה יחשב הפרט בריא שאינו נשא.‏ אולם תוצאה זו מוטלת בספקכל עוד אין מידע ודאי שה-‏PCR ‏"עבד"‏ כנדרש כלומר שהיה מספיק DNA מהפרט הנבדק ושהאנזים היהתקין וכו'.‏ כדי לוודא תקינות ה-‏PCR מבצעים ביקורת חיובית.‏ מכניסים לכל מבחנה זוג תחלים האמוריםלהגביר מקטע בין אם האלל מוטנטי ובין אם הוא תקין שכן לקבלת מקטע שכזה משתמשים בתחליםשנגזרו במדויק מאזורים בהם מעולם לא אובחנה מוטציה.‏ כך,‏ לכל פרט נבחן מפרידים בג'ל את תוצריה-‏PCR בארבעה טורי הפרדה.‏ בכל טור הפרדה בג'ל יש למצוא לפחות פס DNA אחד,‏ תוצר ה-‏PCRשנועד לביקורת ושלא נועד לזהות מוטציה.‏ אם באחד מטורי ההפרדה,‏ ולא משנה באיזה,‏ מתגלהפס DNA נוסף תוצר PCR הרי שזוהי עדות לקיומה של מוטציה מסוימת באחד מהאללים.‏ התחלים לזיהויא.‏ אלל תקין ואלל מוטנטי בפרט נבחןרצף תקיןאלל א'‏‏(תקין)‏אלל ב'‏‏(מוטנט)‏A - T - C -G-G-A T -A-G-C - C - TA - T - C -G-G-GT -A-G-C - C - CC -G-G-T -A -A G-C - C -A- T - TC -G-G-T -A -A G-C - C -A- T - Tמתוארים רצפיהנוקלאוטידים שמהםנגזרים התחליםמוטציההאתרים אליהם יצמדו התחליםA - T - C -G-G-G(5')(3')תחל להגברה ‏(תחל 1)תחל ל"זיהוי"‏ מוטציה והגברה ‏(תחל 2)G-C - C -A- T - T(3')(5')מבצעים PCR עםתחלים א'‏ ו-ב'‏ב.‏ PCR לאיתור מוטציה מסוימתPCR בנוכחותאלל תקיןA - T - C -G-G-AA - T - C -G-G-GT -A-G-C - C - Tהארכהאין הארכהC -G-G-T -A -A G-C - C -A- T - TG-C - C -A- T - Tאין הגברה‏(לא מקבלים DNAתוצר (PCRיש הגברה !‏(מקבלים DNA תוצר(PCRהארכההארכהPCR בנוכחותאלל מוטנטיA - T - C -G-G-GA - T - C -G-G-G T -A-G-C - C - CC -G-G-T -A -A G-C - C -A- T - TG-C - C -A- T - Tאיור 6.5: זיהוי מוטציות שחושדים בקיומן באמצעות PCR שנועד להגברה המותנית בנוכחות מוטציות.‏השיטה להגברה המותנית בנוכחות מוטציות מאפשרת להגבי DNA באמצעות PCR רק אם ה-‏DNA מכיל מוטציה שחושדיםבקיומה.‏ לצורך כך משתמשים בתחל שבקצה 3 שלו בסיס משלים לבסיס באלל המוטנטי.‏ המשך האיור בעמוד הבא.‏כדי לזהות אם פרט מסוים הוא נשא למוטציה מסוימת באחד האללים של CFTR מבצעים הגברה מותנית מוטציותכמתואר באיור 6.5. להגברה מותנית משתמשים ב-‏‎29‎ זוגות תחלים שונים המחולקים בין 4 מבחנות שונות ואת תוצריההגברה מפרידים בג'ל.‏ נוכחות בג'ל של תוצר הגברה מותנית מעידה על קיומה של מוטציה ‏(איור ‎6.5‎ג').‏58

פרק 6ג.‏ תוצרי PCR שנגזרים מהגן המקודד ל-‏CFTR ושמקורם בהגברה ובהגברה מותנית מוטציותAפרט 1B CDAפרט 2B CDAפרט 3B CDAפרט 4B CDAפרט 5B CDAפרט 6B CDמקטע DNA תוצר הגברת ביקורתאיור 6.5 המשך:‏ זיהוי מוטציות שחושדים בקיומן בגן המקודד ל-‏CFTR אצל פרטים שונים באמצעותהגברה מותנית.‏DNA מפרטים שונים הופק לצורך זיהוי מוטציות שחושדים בקיומן בגן המקודד ל-‏CFTR‏.‏ ארבע מנות DNA מפרט נבחן שמשולהגברה באמצעות PCR ב-‏‎4‎ מבחנות שונות.‏ לכל מבחנת ,A) ,B ,C (D PCR הוכנסו 8-9 זוגות תחלים לכפל מטרות:‏ להגברתביקורת ולהגברה תלוית מוטציות.‏ לשם כך נעשה שימוש בזוג אחד של תחלים המאפשר קבלת מקטע DNA ללא קשר אם ישאו אין מוטציה ‏(הגברת ביקורת).‏ שאר זוגות התחלים שבמבחנה (7-8) הם ייחודיים ואינם נמצאים במבחנות אחרות.‏ הם נועדולאפשר הגברה רק אם יש מוטציה או מוטציות מתוך 7 או 8 שאתן נוכחותן בוחנים במבחנה אחת.‏ PCR בנוכחות יותר מזוג תחליםאחד נקרא .Multiplex PCR תוצרי ה-‏PCR מופרדים בג'ל כמתואר באיור.‏ מערך מיוחד זה של 4 תגובות Multiplex PCR במקבילנועד לבחון את קיומן האפשרי בפרטים שונים של אחת או שתי מוטציות מסוימות ב-‏CFTR מתוך 29 מוטציות שונות באוכלוסייה.‏לדוגמה,‏ פרט 1 הוא בעל מוטציה באלל אחד כפי שניתן להסיק מקיום תוצר הגברה מותנית במבחנה B.המוטציות השונות שבאותה מבחנה תוכננו כך שכל זוג תחלים שנועד לזיהוי מוטציה ספציפית יאפשרקבלת מקטע DNA בגודל מסוים,‏ ייחודי.‏ למקטע שכזה,‏ המייצג מוטציה ספציפית,‏ מרחק נדידה ייחודי בג'ל.‏6.9שאלה 6.9:במספר אנשים נערך מבחן להתכנות מוטציה באללים של הגן המעורב בסיסטיק פיברוסיס.‏ אנשיהמעבדה אפשרו הגברה תלוית PCR והשתמשו בתחלים שנועדו לזהות מוטציות.‏ לפי איור ‎6.5‎ג',‏ התוכלולסווג את הפרטים הנבדקים לבריאים,‏ נשאים וחולים?‏ כמה מוטציות שונות אותרו במבחן שתוצאותיומוצגות באיור?‏במקביל להגברה המותנית בנוכחות מוטציות מקיימים הגברה שנועדה לאפשר תוצר ביקורת ללא תלות בנוכחות 59מוטציות.‏ תפקידה של הגברת ביקורת זו ‏(איור ‎6.5‎ג')‏ להעיד על כשירות ותקינות ה-‏DNA ויתר מרכיבי תגובת ה-‏PCR‏.‏הגברת ביקורת נחוצה להגדיל את אמינות התוצאות של ההגברה המותנית.‏

פרק 6שאלה 6.10:סיימתם את לימודיכם בהנדסה גנטית ואתם יוצאים לטיול באחת ממדינות דרום אמריקה.‏ בפגישהשנזדמנה לכם עם אחד מראשי קהילה יהודית מקומית הוא מתלונן שאנשי הקהילה נמנעים מאכילתהמבורגרים במסעדות המקומיות בשל החשש שאינו מוכן מבשרן של חיות כשרות.‏ לאחר מחשבהקצרה אתם מציעים לראש הקהילה למסור לו מידע אמין ועל בסיס יומי על המקומות בהם מוגשהמבורגר מבשר חיות כשרות.‏ הוא נענה בהתלהבות להצעתכם ואתם ממהרים להקים את חברת‏"המבורגר שמח בע"מ".‏ מהי האסטרטגיה שתבחרו עבור ‏"המבורגר שמח"‏ למבחנים המבוססים עלדגימות מזון?‏ מהו המידע שלו אתם נזקקים?‏ מהם הכלים הדרושים לביצוע המבחנים?‏ מה הן הביקורותהחיוביות והשלילות במערך הנסיון והבדיקה?‏שאלה 6.11:קביעת קרבה משפחתית בכלל וקביעת אבהות בפרט נעשית כיום באמצעות PCR של .STR6.106.111. הסבירו כיצד ניתן עקרונית וטכנית לנצל את ה-‏STR שיש בפרטים שונים כדי לקבוע קרבהמשפחתית.‏12345איור שאלה 6.11: ג'ל ובו מקטעי DNA תוצרי PCR המכילים .STR2. באיור שאלה 6.11 מתוארת תוצאת הבדיקה של STR מסוים במשפחה מסוימת.‏ האיור מתארג'ל ובו מקטעי DNA שהתקבלו לאחר הגברת DNA באמצעות .PCR באיור רואים תוצאת מבחןSTR שנערך לאם וארבעת ילדיה.‏ באילו עמודות מיוצגים אללים של הילדים ובאיזו עמודה מיוצגיםהאללים של האם?‏ הסבירו.‏3. ציירו לצד איור שאלה 6.11 עמודה ובה ייוצגו האללים שיתקבלו ב-‏PCR של STR שיערך תוך שימושב-‏DNA מהאב.‏ הסבירו כיצד קבעתם זאת.‏60

פרק 66.12שאלה 6.12:ישנם הורים נושאי אלל של גן מסוים בו מוטציה ‏("אלל מוטנטי,‏ אלל פגום")‏ ואם נכלל אלל שכזה בתאהזרע ו/או בתא הביצית הוא עלול להכתיב הופעת מחלה בצאצא.‏ כיום ניתן בחלק מהמקרים להימנעמלידת תינוקות חולים וזאת בעזרת שיטות העושות שימוש בהפריית מבחנה ובדיקה באמצעות .PCRכך,‏ ניתן לבצע הפריית מבחנה ובה לקבל עובר בן 8 תאים וניתן מעובר זה להסיר תא לצורך הגברהתלוית PCR לאיתור מוטציות ובעקבות תוצאותיהם להחליט אם כדאי להשריש את העובר בן שבעתהתאים ברחם ‏(במצב זה חסר בתא אינו מפריע להתפתחות העוברית).‏ מכאן עולה כי אם לאם בריאהאלל פגום של גן מסוים על אחד מכרומוזומי ה-‏X שלה כדאי לערוך בדיקה של מין העובר מכיוון שאםהעובר הוא זכר (XY) יוולד תינוק חולה.‏ את הבדיקה רצוי לערוך מוקדם ככל האפשר וניתן לעשותה בכלשלב,‏ גם לאחר הפריית מבחנה ולפני ההשרשה ברחם,‏ וזאת באמצעות PCR העושה שימוש בתחליםשנגזרים מרצפים ייחודיים הנמצאים רק על כרומוזום Y. כך ניתן לזהות את העוברים הזכרים,‏ שבמקרהפרטי זה הם עתידים לפתח מחלה ‏(על מחלה כזו נהוג לומר שהיא בתאחיזה לכרומוזום ה-‏X‏).‏1. סכמו את המידע,‏ השלבים והמרכיבים הנחוצים לבדיקת התכנות עובר בעל פוטנציאל לפתחמחלה מסוימת.‏2. אב לשמונה בנות מאד רוצה בבן − האם תספקו לו שירות אבחון מין תרום השרשתי להבטחתלידת בן?‏ העלו שיקולים רפואיים,‏ מוסריים ופסיכולוגיים (....) בעד ונגד.‏61

פרק 6עוצרים,‏ מסמנים,‏ ממשיכים...‏כלים ב“ארגז הכלים“‏DNA פולימראז עמיד לחוםאוליגו-נוקלאוטידים המשמשים כתחליםDNAמכשיר PCRתהליכים ושיטותהפרדת גדיליםהצמדות תחליםסנתזת DNA על ידי ה-‏DNA פולימראזשלושת שלבי מחזור שכפולPCRהתהליך הדו-שלבי RT-PCRהגברה תלוית מוטציותחומריםנוקלאוטידיםיוני מגנזיום ובופרמושגיםמחזור שכפולהגברהאללנשא ‏(של אלל פגום)‏עקרונותשכפול חוזר ונשנה במבחנהשיבוט במבחנה ללא צורך בספריותהיצמדות תחלים תלוית השלמה ביןבסיסיםשמות ומונחיםSTRMultiplex PCRוירוס ה-‏HIV מחולל האיידסמחלת הסיסטיק פיברוסיסהגן CFTRיישומיםשיבוט באמצעות PCR במהירותובפשטותPCR לשיבוט מחדש לאיתור מוטציותPCR לשיבוט לצורך ביטוי חלבוןRNA לאפיון איכות וכמות PCRPCR של STR לאבחון גנטי ובכלל זה זיהויפליליPCR לזיהוי גורמי מחלה ספציפייםPCR לזיהוי מהיר של מוטציות טיפוסיותבאמצעות הגברה מותנית מוטציותPCR לאבחון גנטי של עוברים לפניההשרשה ברחם62