פרק06. תגובת השרשרת של הפולימראז (PCR)

פרק 6כמו כן נדרש לשכפול במבחנה:‏5. בופר המכיל יוני מגנזיום הנדרשים לפעילות ה-פולימראז.‏6. מכשיר PCR בו ממקמים את המבחנות עם מרכיבי תגובת ה-‏PCR והמאפשר מעבר מתוזמן,‏אוטומטי ומהיר בין טמפרטורות שונות.‏שכפול ה-‏DNA במהלך ה-‏PCR נעשה במחזורים.‏ כל מחזור מורכב מ-‏‎3‎ שלבים ‏(ראו איור ‎6.2‎ב'‏ ו ג'):‏1. הפרדת גדילים :(Denaturation) הפרדת הגדילים מאפשרת למולקולת DNA דו-גדילי להיפרד ל-‏‎2‎מולקולות DNA חד גדילי.‏ ההפרדה נעשית ב-‏‎95°C‏.‏2. הצמדות התחלים :(Annealing) שני תחלים בעלי רצף מוגדר ‏(פרי תכנון מוקדם)‏ שארכם כ-‏‎20‎נוקלאוטידים נצמדים ל-‏DNA חד גדילי.‏ ההצמדות היא לרצף DNA המשלים לרצף התחל.‏ התחליםמתוכננים כך שייצמדו במרחק מוגדר זה מזה.‏ רצף התחלים קובע את מקום ההצמדות ל-‏DNAוהמרחק ביניהם קובע את גודלו של מקטע ה-‏DNA שיוגבר.‏ ההצמדות נעשית בטמפרטורה שביןל-‏‎65°C‏.‏ 50°C3. סנתזת :(DNA synthesis) DNA שלב זה נקרא לעיתים גם שלב הארכה (elongation) שכן בשלב זהה-‏DNA פולימראז מזהה את קצה '3 של התחלים הצמודים ל-‏DNA ומאריך אותם באמצעותהוספת נוקלאוטידים ועל פי המידע המצוי בכל אחד מהגדילים המשלימים של DNA המטרה.‏סנתזת ה-‏DNA נעשית בטמפרטורה שבין 68°C ל-‏‎72°C ובסיומה מתקבלים עותקים חדשים שלDNA משוכפל.‏מתיאור השלבים עולה כי בכל מחזור שכפול יש צורך בשינוי הטמפרטורה בין שלב לשלב.‏ לכן,‏המבחנה ובה מרכיבי ה-‏PCR מוכנסת למכשיר PCR שצילום שלו ניתן לראות באיור ‎6.2‎ד'.‏ מכשיר זהמצויד בגופי חימום ומערכת קירור המבוקרים על ידי מערכת הניתנת לתכנות.‏ המכשיר מאפשרמעברים מהירים בין הטמפרטורות הרצויות לפי מערך ניסיוני שניתן להגדיר מראש.‏ כמו כן,‏ בשלהצורך בטמפרטורות גבוהות במהלך השכפול במבחנה משתמשים באנזים DNA פולימראז העמידלחום.‏ לקבלת כמויות ניכרות של DNA רצוי באמצעות שכפול DNA במבחנה חוזרים על התהליךהתלת-שלבי ‏(מחזור שכפול)‏ מספר פעמים.‏DNA פולימראז העמיד לחום מופק מחיידקים הגדלים לדוגמה,‏ אם חומר המוצא כלל עותק אחד האנזיםמים חמים שהטמפרטורה שלהם היא בסביבות 75°C.בלבד של ה-‏DNA המיועד להגברה הרי שקל במעיינותהעמיד לחום הראשון שהוכנס לשימוש לצורך הגברה האנזיםלחשב מה יהיה מספר עותקי ה-‏DNA הרצויDNA במבחנה היה ה-‏DNA פולימראז שהופק מהחיידק שללאחר כל מחזור שכפול ‏(איור ‎6.2‎ג').‏ כך,‏ לאחרהאופטימלית לפעילות אנזים זה היא 72°C והאנזים המחזור הראשון יתקבלו שני עותקים של הטמפרטורהלשמר מידה ניכרת של פעילותו גם לאחר שהות קצרה יכולה-‏DNA‏,‏ לאחר שני מחזורים 4 עותקים ולאחרלפעם ב-‏‎95°C‏.‏ כעבור שנים מספר הוכנסו סוגים נוספים מפעםDNA פולימראז עמידים לחום Supertherm) Pow, ואחרים)‏ שלושה מחזורים נקבל 8 עותקים.‏ אם נמשיך שלבעלי תכונות דומות לתכונות ה-‏Taq וחלקם בעלי תכונות בצורת חישוב זו נמצא כי לאחר 30 מחזורי שחלקםכגון יכולת טובה לתקן טעויות בזמן השכפול.‏ קיומו של משופרותשכפול עשויים להתקבל בתנאים אופטימלייםDNA פולימראז עמיד לחום היה אחד הגורמים העקריים אנזיםאת האוטומציה של תהליך ה-‏PCR‏.‏ למעלה ממיליארד עותקים.‏ מספר העותקים שאפשרושיתקבל בתנאים אופטימליים לאחר n מחזורים.Taq polymerase ושזכה לכינוי Thermus aquaticusהפרדת גדילים והצמדות תחלים מצריכים שימוש בטמפרטורות גבוהות.‏ מכשיר ה-‏PCR מאפשר אוטומציה של המעברמהיר ומתוזמן בין הטמפרטורות השונות הדרושות במהלך ההגברה ‏(איור ‎6.2‎ד').‏ הצורך בטמפרטורות גבוהות במהלךההגברה חייב למצוא אנזימים שהטמפרטורה האופטימלית הנדרשת להם לשם סנתזת DNA גבוהה אף היא.‏ אנזימיםמסוג זה המשמשים ב-‏PCR מקורם בחיידקים הגדלים במעיינות מים חמים.‏46