פרק06. תגובת השרשרת של הפולימראז (PCR)

פרק 6מה הם הנתונים והשיטות העומדות לרשות המאבחנים הגנטיים?‏ נתמקד במקרה הפרטי של מחלתהסיסטיק פיברוסיס CF) (Cystic Fibrosis: ‏(לייפת כסייתית).‏ החולים במחלה סובלים מהפרשות ריריותבדרכי הנשימה ומקשיי נשימה.‏ המחלה מתאפיינת בכך שהיא מתפתחת אצל אלה שיש להם מוטציהבכל אחד משני האללים ‏(מחלה רצסיבית)‏ של גן הקרוי .CFTR נמצא כי בכל אחד משני האללים אצלהחולים במחלה יש מוטציה נקודתית ‏(מוטציהפיברוסיס היא אחת המחלות הגנטיות נקודתית פירושו הבדל של בסיס אחד בין אלל לא סיסטיקביותר ובאוכלוסיות מסוימות כ-‏‎1‎ מ-‏‎2,500‎ תקין לאלל תקין)‏ אשר אחראית ליצירת חלבון CFTR הנפוצותחולה במחלה.‏ הורשת המחלה היא בדגם אנשיםפגום.‏ לאחר שנים רבות של מחקר שבמהלכן נבדקוהמחלה מתקיימת אצל אלה שיש להם מוטציה רצסיבי:‏אחד משני עותקי הגן המעורב במחלה ‏(מוטציה מאות חולים,‏ אותרו באוכלוסיה 29 סוגים של מוטציות בכלהאללים).‏ הגן CFTR המעורב במחלה מקודד נקודתיות בגן זה.‏ כך,‏ לכל נשא של המחלה שהוא בשניה-‏CFTR הממוקם בקרום התא.‏ חלבון ה-‏CFTR לחלבוןבעצם בריא מהבחינה הקלינית יש באלל של הגן ל-‏על מעבר יוני כלוריד וחשוב לתפקודם התקין של אחראיהעדר של צורה תקינה שלו משבשת במיוחד CFTR אחת מ-‏‎29‎ מוטציות מאופיינות אפשריות.‏ האלל התאים.‏תפקודם של תאים המרפדים את צינורות הריאה.‏ השני תקין אצל מי שמוגדר נשא.‏ יעוץ גנטי יעיל הוא אתכך מצטברת שכבת ליחה עבה בריאות של חולי משוםכזה שמסוגל לקבוע האם אחד מבני הזוג הוא נשאפיברוסיס הסובלים בשל כך מקשיי נשימה.‏ סיסטיקהליחה מתרבים בקלות חיידקים דבר שגורם של אלל מוטנטי.‏ אם שני בני הזוג הם נשאים,‏ על בנוכחותתכופים בריאה.‏ היועץ הגנטי לידע את בני הזוג כי בשלבים מוקדמים לזיהומיםשל ההריון על האשה לערוך בדיקה גנטית לעוברשבמסגרתה יערך מבחן להתכנות שני אללים מוטנטיםבעובר.‏ באם תוצאת מבחן זה חיובית,‏ נהוג לשקול הפסקת הריון.‏מה הם היבטים הטכניים לעריכת מבחן להתכנות מוטציה באללים של הגן המעורב בסיסטיקפיברוסיס?‏ נתמקד כאן באחת השיטות המהירות העושה שימוש ב-‏PCR ושפותחה לזיהוי מוטציותנקודתיות בעלות אופי ידוע מראש באתרים ספציפיים.‏ שיטה זו מאפשרת את הגברת ה-‏DNA רקבמקרים בהם יש מוטציה.‏ הגברה זו נקראת בשם הגברה מותנית מוטציות.‏ סיכום עקרונות השיטהמובא באיור 6.5. לצורך ההגברה המותנית משתמשים בתחל מיוחד בעל רצף הנגזר מהאלל המוטנט.‏כך,‏ משתמשים בתחל שבקצה '3 שלו מצוי הבסיס היחודי למוטנט.‏ התחל האחר נגזר מרצף תקיןוהגדרה של רצף תקין היא רצף שמעולם לא אופיינה בו מוטציה אצל חולים במחלה.‏ בדוגמה שבאיור6.5, לפרט הנבחן אלל תקין ביחס למוטציה הנבדקת ואלל מוטנטי.‏ הפרט הוא אם כן ‏"נשא".‏ תוצרPCR יתקבל רק מ-‏DNA שמקורו באלל המוטנטי שכן,‏ למרות שהתחל שנועד לזהות אלל מוטנטי יעבורהצמדות גם לאלל התקין,‏ הצמדות זו לא תהיה מלאה והDNA פולימראז לא יוכל ‏"לתפוס"‏ את קצה '3של התחל ולהאריכו וזאת מכוון שקצה חשוב זה אינו נצמד לגדיל ה-‏DNA ‏(איור 5.6).מה צריך לעשות על פי השיטה הנ"ל כדי לענות לשאלה אם אדם מסוים הוא נשא ‏(של אלל מוטנט)‏למחלת הסיסטיק פיברוזיס?‏ בשימוש בשיטה להגברה מותנית מוטציות יש להשתמש ב-‏‎29‎ זוגותתחלים כשכל זוג נועד לבחון התכנות מוטציה מסוימת באתר מסוים.‏ אך האם יש לבצע 29 תגובותPCR נפרדות כשמשתמשים ב-‏DNA שהופק מפרט מסוים?‏ התשובה לכך היא לא.‏ ניתן בהחלט להכניסלתוך מבחנה אחת יותר מזוג אחד של תחלים שנועדו לזהות מוטציה ובמקרה שכזה נקרא ה-‏PCR בשםPCR) Multiplex PCR שנועד לאפשר הגברה בו זמנית יותר ממקטע DNA אחד).‏ לאבחן התכנות מוטציהב-‏CFTR משתמשים ב-‏‎4‎ תגובות ‏(ב-‏‎4‎ מבחנות)‏ כשבכל מבחנה תת קבוצה של 29 זוגות התחליםעל אחת הדרכים לאבחון מוטציות בגן המעורב במחלה ניתן ללמוד מהמקרה הפרטי של הגן המקודד ל-‏CFTR‏.‏ מוטציות 57בשני אללים של הגן CFTR גורמות להופעת מחלת הסיסטיק פיברוסיס.‏ מוטציה באלל אחד מגדירה פרט כנשא.‏ הנשאהוא בריא.‏ באוכלוסיה יש 29 סוגים שונים של מוטציות מאופיינות בגן זה.‏