Regulation der chloroplastidären NADPabhängigen Malat ...

Diskussion 166
Interaktion nicht das gleiche Protein verbergen. SDS-Gele trennen zwar die Proteine nach
ihrem Molekulargewicht auf, jedoch reicht diese Trennung nicht, um allen Proteinen eine
ihnen „eigene“ Bande zu zuordnen. Wollte man die Proteine mit gleicher Größe
unterscheiden, müsste eine Isoelektrische Fokussierung erfolgen. Hierbei werden
Proteine zuerst nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt und anschließend einer
Auftrennung nach Molekulargewicht unterzogen (2D-Gele).
Ein großes Problem des South-Western-Blots liegt darin, dass durch die Auftrennung der
Proteine im SDS-Gel zusammengesetzte Proteine in ihre einzelnen Untereinheiten zerlegt
werden und somit der vielleicht nur als Ganzes interagierende Proteinfaktor nicht mehr
vorhanden ist. Solche Faktoren können auch mit einem YOH-Screen nicht detektiert
werden, da im Hefe-Test-System sehr wahrscheinlich nicht die gleichen Bedingungen wie
in planta herrschen, was zu einer nicht korrekten bzw. keiner Translation der Proteine
führen kann.
Die Ergebnisse aus dem YOH zeigten eine große Anzahl von zumeist nicht zu den
klassischen Transkriptionsfaktoren zählenden Proteinen auf. Bei diesen handelte es sich
um im Kern lokalisierte Proteine des DNA-Synthese-Apparates, um ESTs oder auch zum
Teil um im weiteren Sinne redox-modulierte Enzyme, wie vermutlich die cytosolische
GAPDH und die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase. Die Rolle der GAPDH bei der Redox-
Regulation der NADP-MDH-Expression wurde diskutiert (4.3.5).
Zur Untersuchung der Interaktion von Proteinen aus NE mit den NADP-MDH-
Promotorbereich sowie dem kodierenden und dem 3´-UTR-Bereich lagen F 1-F 21 vor
(3.3). Diese deckten im Gegensatz zu den im YOH eingesetzten Fragmenten noch einen
größeren Bereich der 5´-stromaufwärts liegenden Sequenz des NADP-MDH-Gens ab.
Keine der im South-Western erhaltenen Proteinbanden konnte jedoch bis jetzt
identifiziert oder durch andere Methoden belegt werden. Es stehen folglich nur die
Ergebnisse aus dem YOH zum Vergleich zur Verfügung. Allerdings werden im YOH im
Gegensatz zum South-Western-Blot Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo dargestellt.
Tabelle 22 stellt die Ergebnisse aus beiden Methoden für die Fragmente 1, 5, 7, 9 und 10
vergleichend dar.
Einige der MW der Proteinfaktoren des YOH stimmen mit denen aus dem South-Western-
Blot in etwa überein. Einigen MW wurden mehrere Proteinfaktoren aus dem YOH
zugeordnet, da eine exakte Identifizierung nicht möglich ist. Proteine, die stationär im
Kern vorkommen oder in diesen transportiert werden, sind fett gedruckt. Bei diesen
deutet ihr Vorkommen im Kern darauf hin, dass sie tatsächlich an einer Regulation des
NADP-MDH-Gens beteiligt sein könnten. Die hier aufgestellte Tabelle soll nur ein Hinweis
für die mögliche „Identität“ von Proteinfaktoren sein, die durch den South-Western
ermittelt wurden. Weitere Beispiele für ein Übereinstimmen der YOH-Ergebnisse und der
South-Western-Blots stellen BAMP 1-1 und BAMP 1-2 dar. So konnten Molekulargewichte,
die denen von BAMP 1-1 und BAMP 1-2 entsprechen durch die South-Western-gestützte
Analyse innerhalb der ersten 500 bp vor dem Transkriptionsstart gezeigt werden. Ob es