Regulation der chloroplastidären NADPabhängigen Malat ...

Material & Methoden 34
eingebaute Mononukleotide wurden durch eine Gelfiltrationschromatographie über NAP-
5-Säulen abgetrennt. Die Sonde wurde vor Gebrauch 10 min bei 100 °C denaturiert.
Die Auftrennung von RNA erfolgte in denaturierenden Formaldehyd-Agarose-Gelen. Um
eine Kontamination mit RNasen zu verhindern, wurden alle Puffer mit DEPC-H2O
angesetzt und alle Gebrauchsgegenstände mit DEPC-H2O gespült. Insgesamt wurden
30 µg Gesamt -RNA in DEPC-H2O aufgenommen; anschließend wurden folgende Puffer
und Lösungen zugegeben:
3 µl 10 x MEN
7 µl 37 % Formaldehydlösung
20 µl Formamid
1 µl Homidiumbromid
Nach einer 10 minütigen Denaturierung bei 56 °C und anschließender Abkühlung auf Eis
wurde 4 µl RNA-Ladepuffer zu den Proben gegeben und das Gel damit beladen.
Formaldehyd-Gel:
1,5 % (w/v) Agarose
72 % DEPC-H2O
10 % 10 x MEN
18 % Formaldehyd (37 %)
10 x MEN-Puffer:
0,2 M MOPS
50 mM Na-Acetat
10 mM EDTA
Die Hybridisierung von Northern-Blots erfolgte in Church-Puffer bei 42 °C. Unspezifisch
gebundene DNA wurde durch Waschen der Membranen bei 68 °C in SSC-Lösungen (20 x
SSC-Stammlösung: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) mit absteigenden
Konzentrationen (3-fach bis 0,1-fach, jeweils mit 0,1 % SDS) abgewaschen. Schließlich
wurden Filme (X-OMAT/XAR-5, Kodak) drei bis fünf Tage bei -80 °C aufgelegt, und so die
Membranen analysiert.
Church-Puffer:
0,25 mM Na2HPO4
1 mM EDTA
1 % BSA
7 % SDS
pH 7,5
Um die Nylon-Membranen anschließend mit anderen Sonden hybridisieren zu können,
wurden sie eine Stunde bei 68 °C mit „Strip“-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 %
Formamid, 1 % SDS) inkubiert.