Broschüre Achema - TTN-Hessen

Abb. 3: MTP-Photometer mit Messplatte eines
p-Nitrophenylphosphat-Assays: links: p-Nitrophenol-
Standard in steigender Konzentration, rechts:
Inkubationsansätze mit steigenden Substratkonzentrationen,
zu denen das Enzym alkalische Phosphatase
pipettiert wurde.
Chemische Reaktionen in lebenden Organismen
werden durch Enzyme katalysiert.
Diese erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeiten
um ein Vielfaches und gewährleisten
meist eine hohe Selektivität: nur
bestimmte Substrate (Edukte) werden zu
definierten Produkten umgesetzt.
Zum genauen Verständnis, zur exakten
Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
können die gleichen Substrate außerhalb
des Organismus – in vitro – vorgelegt und
ihre Umsetzung mit geeigneten Assays
erfasst werden. In vielen Fällen lassen sich
die Produkte von den natürlichen Substraten
nur durch aufwändige Methoden und
zeitverzögert – z.B. durch chromatographische
Aufreinigungen – unterscheiden.
Um zeitnah viele enzymatische Reaktionsansätze
parallel zu verfolgen, die Daten
zudem durch Mehrfachbestimmung statistisch
abzusichern, bewähren sich Testsysteme
mit künstlichen Substraten, zu denen
die photometrischen Mikrotiterplatten
(MTP)-Assays mit Derivaten des para-
Nitrophenols (pNP) gehören.
NO 2
OH
-
Enzymkinetische
Messungen mit
Mikrotiterplattenassays
NO 2
Abb. 2: Deprotononierung des p-Nitrophenols zum p-Nitrophenolatanion und dessen mesomere Resonanzstrukturen
Mit diesen Verbindungen werden vorzugsweise
Aktivitäten von Hydrolasen, der
3. von insgesamt 6 Enzymklassen erfasst
(Abb. 1).
Das nach hydrolytischer Spaltung des
pNP-Derivats freigesetzte p-Nitrophenol
liegt im neutralen bis basischen Bereich
als p-Nitrophenolatanion vor und weist
eine wesentlich höhere Elektronendichte
im aromatischen Kern auf (Abb. 2). Als
Konsequenz intensiviert sich die Lichtabsorption
und verschiebt sich vom UV-
Bereich (Absorptionsmaximum: 320 nm)
in den Bereich sichtbaren, blauen Lichts
(Absorptionsmaximum: 400 nm), als starke
Gelbfärbung erkennbar, und kann photometrisch
erfasst werden (Abb. 3), zeit -
aufgelöst während einer bei neutralen
bis basischen pH-Werten durchgeführten
Enzymreaktion. Bei Enzymreaktionen unter
sauren Bedingungen wird die Reaktion
durch Erhöhen des pH-Wertes beendet
und unmittelbar im Anschluss photometrisch
ausgewertet (Endpunkt-Assay).
O -
N +
O
O R
+
O
H 2
HO - C -
H 2 O
O -
Hydrolase
R OH
Abb. 1: Enzymatische Hydrolyse eines p-Nitrophenolderivats (Ethers, Esters)
O
+
O-
N
O
CH -
O -
+ O
N
O
+
N + O -
O
OH
Prof. Dr. Axel Blokesch
blokesch@fb2.fh-frankfurt.de
T 069 1533 3681
Fachhochschule Frankfurt am Main
University of Applied Sciences
Fachbereich 2, Bioverfahrenstechnik
Nibelungenplatz 1
60318 Frankfurt am Main
www.ttn-hessen.de | ACHEMA 2012 | Halle 9.2, Stand A66 7
O
HC -
+
O-
N
O
O -
+
O-
N
O

8
reaction rate
reaction rate
120 nmol/(l*s)
100 nmol/(l*s)
80 nmol/(l*s)
60 nmol/(l*s)
40 nmol/(l*s)
20 nmol/(l*s)
0 nmol/(l*s)
0 µmol/l 100 µmol/l 200 µmol/l 300 µmol/l 400 µmol/l
120 nmol/(l*s)
100 nmol/(l*s)
80 nmol/(l*s)
60 nmol/(l*s)
40 nmol/(l*s)
20 nmol/(l*s)
0 nmol/(l*s)
0 mmol/l 5 mmol/l 10 mmol/l 15 mmol/l
Preisgünstig und gut zu handhaben sind Assays mit dem Enzym
Alkalische Phosphatase und dem Substrat p-Nitrophenylphos -
phat, die in der medizinischen Diagnostik von Blutseren und als
Hilfsmittel in der Immundiagnostik eingesetzt werden. Abweichend
von den standardisierten Bedingungen dieser Routineassays
variieren die Studierenden im Laborpraktikum des 3. Fachsemesters
(Bachelorstudiengang Bioverfahrenstechnik) systematisch
einzelne Parameter und erarbeiten sich grundlegende
Kenntnisse der Enzymkinetik:
p Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender
Substratkonzentration bis zum Sättigungsbereich
(Michaelis-Menten-Kinetik, siehe Abb. 4)
p Einfluss von Cofaktoren auf die Enzymreaktion
p Unterscheidung von kompetitiver (Beispiel: Abb. 5)
und nicht-kompetitiver Hemmung
In der Folge sind gezielt Enzyme und Assays ausgewählt worden,
die für eine anwendungsorientierte Forschung relevant sind:
p Auf dem Gebiet der roten (d.h. medizinischen) Biotechnologie:
Erfassen einer spezifischen proteolytischen Aktivität, der Spaltung
der Peptidbindung auf Carboxylseite der Aminosäure
Lysin, die u.a. von einer Reihe von Matrix-Metalloproteasen
(MMP) katalysiert wird. MMP spalten Strukturproteine (Kollagene,
Elastine) der extrazellulären Matrix und sind für die
Remodellierung des Gewebes wichtig. Erhöhte Werte im Blutserum
oder anderen Körperflüssigkeiten weisen jedoch auf
krankhafte Veränderungen wie Tumore oder Entzündungen
ENZYME KINETIC ASSAYS ON MICROTITER PLATES
Chemical reactions in living organisms
are catalyzed by enzymes. Appropriate
assays enable us to determine their activity
– e.g. during a purification process or
in a technical application, calculate kinetical
constants and characterize the effect
of inhibitors or activating cofactors.
In photometric microtiter plate (MTP)
assays using derivatives of p-nitrophenol
as artificial substrates, many reactions
reziprocal reaction rate
2,5 E+07 (l*s)/mol
2,0 E+07 (l*s)/mol
1,5 E+07 (l*s)/mol
1,0 E+07 (l*s)/mol
5,0 E+06 (l*s)/mol
y = 305,44x + 1E + 07
R 2 = 0,9747
0,0 E+00 (l*s)/mol
0 l/mol 10000 l/mol 20000 l/mol 30000 l/mol 40000 l/mol 50000 l/mol
Abb. 4 (oben): Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat durch Alkalische
Phosphatase in Abhängigkeit der Substratkonzentration – in direkter (links) und doppelt-reziproker
(rechts) Auftragung
Abb. 5 (links): Produkthemmung: Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat
durch Alkalische Phosphatase in Abhängigkeit der Phosphatkonzentration – für zwei unterschiedliche
Substratkonzentrationen: 50 µmol l -1 (◆) und 400 µmol l -1 p-Nitrophenylphosphat (●) – Bis zu einer
Konzentration von ca. 0,1 mmol l -1 des Inhibitors Phosphat handelt es sich um eine kompetitive
Hemmung, die durch Erhöhung der Substratkonzentration aufgehoben werden kann.
Die Maximalgeschwindigkeiten v max liegen in diesem Bereich jeweils bei 100 nmol l -1 s -1 und sinken erst
bei weiterer Erhöhung der Phosphatkonzentrationen (0,5 bis 12,5 mmol l -1 ) auf 30 bis 10 nmol l -1 s -1
(nicht alle Daten und deren Auswertung hier aufgeführt).
may be monitored simultaneously (timeresolved
in case of neutral to alkaline
reaction conditions, as end-point assays
in case of acidic reaction conditions and
subsequent addition of alkaline solution).
Students start their laboratory course
with alkaline phosphatase cleaving pnitrophenylphosphate
to learn the fundamentals
of enzyme kinetics. Assays with
peptide derivatives of p-nitrophenol make
hin. Ausgewählte MMP werden daher als Biomarker spezifisch
mit Antikörpern detektiert. Diese Immundiagnostik – vorzugsweise
direkt am Krankenbett (POC = Point of Care) durchgeführt,
können Entwickler und Hersteller sinnvoll ergänzen,
indem sie die Qualität der MMP, d.h. ihrer Antigene, durch
Befunde der Enzymanalytik absichern.
p Auf dem Gebiet der weißen Biotechnologie (Grund- und Feinchemikalien,
Nutzung nachwachsender Rohstoffe):
Bestimmung von Phospholipase- und Lipaseaktivitäten
In der Halbraffinierung von Pflanzenölen ist die Entschleimung
(engl. degumming) ein Prozessschritt, der sowohl für die
anschließende Produktion von Speiseöl als auch von Biodiesel
wichtig ist. Entfernt werden dabei Phospholipide (z.B: Phosphatidylinositole,
Lecithine), die die Abtrennung der Fette von der
wässrigen Phase behindern. Die Entfernung der Phospholipide
lässt sich durch deren partielle enzymatische Hydrolyse effizienter
gestalten. Für die anschließende Biodieselproduktion relevant
ist die Umesterung der Fette (Triglyceride) zu Fettsäuremethylestern
(FAME = Fatty Acid Methyl Ester), die von Lipasen
katalysiert werden kann. Für Titerplattenassays wurde ein p-NP-
Ester mit einer repräsentativen Fettsäure, der Palmitin- oder
Hexadecansäure gewählt. Die Assays geben Auskunft über die
Stabilität der Phospholipasen und Lipasen gegenüber den
beim Emulgieren auftretenden mechanischen Beanspruchungen
und den Temperaturen, pH-Werten, Solventien während
der Reaktion. Sie helfen damit, ihren Einsatz zu optimieren.
sure that matrix metalloproteases used as
antigens in immuno assays (inflammation
or tumor markers) have kept their enzymatic
activity. Other assays involve fatty
acid esters of p-nitrophenol as substrates
for phospholipases and lipases, enzymes
used e.g. in a semi refining step (degumming)
of plant seed oil and in the transesterification
of lipids to biodiesel (fatty acid
methyl ester = FAME), respectively.

Split.It
Automatisiertes System zur Zellpassage
Ziel innerhalb des vom Bundesministerium
für Wirtschaft und Technologie geförderten
ZIM-Projekts Split.It ist die Entwicklung
eines automatisierten Systems zur
Passage von gängigen adhärenten Zelllinien.
Die Firma InnoCyte kooperiert dabei
mit dem biologischen Labor des Fachbereichs
2, Bioverfahrenstechnik der Fachhochschule
Frankfurt am Main, der Hochschule
Esslingen (Institut für angewandte
Forschung, IAF) sowie Geräteherstellern
und Produktdesignern. Split.It stellt ein
erschwingliches stand-alone Benchtop-
Gerät dar, mit einfacher und flexibler
Handhabung, welches durch in-situ Reinigung
sicheres und kontaminationsfreies
Arbeiten, mit dem Verzicht auf teure Verschleißteile
garantiert.
Für den zunehmenden Zellkulturbedarf an
tierischen und humanen Zellen in der
industriellen, biologischen und medizinischen
Forschung, sowie bei der Produktion
von Biopharmaceuticals, ist eine
zukünftige automatisierte Herstellung großer
Mengen an Zellmaterial unerlässlich.
Auch im Hinblick auf Standardisierung
und Qualitätssicherung der Produkte ähnlich
GMP (Good Manufacturing Practise)
und GLP (Good Laboratory Practise) bzw.
GCCP (Good Cell Culture Practise) wird
künftig eine Automatisierung der kritischen
Routineprozesse erforderlich sein.
Aus diesem Grund bestehen zahlreiche
Bestrebungen, den Prozess der Zellkultur
durch eine geeignete Automatisierung
effizienter, standardisierter und kostengünstiger
zu realisieren.
Erste Systeme für die automatisierte Zellkultur
umfassen vollautomatisierte industrielle
Geräte für mittleren bis hohen
Durchsatz (HTS = Hochdurchsatz-Screening),
wohingegen teilautomatisierte
Lösungen für die kritischen manuellen Prozessschritte
zwar vom Markt gewünscht,
aber noch nicht verfügbar sind. So stellt
auch die routinemäßige Passage von Zellen
einen nach wie vor langwierigen, arbeitsintensiven
und manuellen Prozess dar, der
unter strengen aseptischen Bedingungen
durchgeführt werden muss. Hier setzt das
Produkt Split.It – automatisierte Passage
von Zellkulturen an, um in einer kleinen,
flexiblen und kostengünstigen Lösung die
Qualität und Produktivität von Zellkultur -
laboren zu fördern und Forschung und
Entwicklung nachhaltig zu verbessern.
Cell line HeLa: Mycoplasmas negative DAPI-staining
Cell line CHO: Mycoplasmas negative DAPI-staining
Prof. Dr. Ilona Brändlin
ilona.braendlin@fb2.fh-frankfurt.de
Fachhochschule Frankfurt am Main
University of Applied Sciences
Fachbereich 2: Informatik und
Ingenieurwissenschaften
Studiengang Bioverfahrenstechnik
Nibelungenplatz 1
60318 Frankfurt am Main
T 069 1533-2203 (Labor)
T 0160 97030180
www.fh-frankfurt.de
InnoCyte GmbH
Dr. Michael Fritsche, Dipl.-Ing. Roland Huchler
Nobelstraße 12
70569 Stuttgart
T +49 711 970-1129
info@innocyte.com
www.ttn-hessen.de | ACHEMA 2012 | Halle 9.2, Stand A66 9

10
Grundlage für dieses Forschungsprojekt war eine von der Firma
InnoCyte entwickelte Basistechnologie, welche den zentralen Prozess
der „Passage“ der automatisierten Zellkultur mit einem
Bruchteil des bisher dafür notwendigen Aufwands realisiert. Der
Ansatz basiert auf dem konsequenten Einsatz von fluidischen und
pneumatischen Komponenten für alle Teilschritte der notwen -
digen Umfüllprozesse.
Das Funktionsmuster erlaubte eine prinzipielle Überprüfung der
Arbeitsweise der Technologie in dem Sinne, dass die zentralen
Schritte der Zellkulturpassage, wie
p Entnahme des Kulturmediums und Spülung des Zellrasens,
p Ablösen der Zellkultur durch Trypsin,
p Abklopfen der Zellen durch mechanisch-pneumatische
Aktoren,
p Inhibierung des Trypsins durch Zugabe von serumhaltigem
Kulturmedium,
p Vereinzeln der Zellen durch Resuspension, und
p Verteilen der Suspension auf neue Zellkulturflaschen
abgebildet werden konnten.
Cells/mm 2
Amount of Cells x 10 6
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0
0,2
13
10.000.000.000
Amount of Cells
1.000.000.000
100.000.000
10.000.000
1.000.000
100.000
0
Proliferation Graph of A431-cell line
Split.It
Control
1
Day
2 3
Proliferation Graph of A431-cell line
Split.It
14 15 16 17 18 19
Passage
Proliferation Graph of HUVECs
Control
Control
Split.It
1 2 3 4 5 6
Passage
AUTOMATED CELL CULTURE TECHNIQUE
The automated expansion of adherent
cell lines in a simple, safe and time-saving
manner was developed in cooperation
with the University of Applied Sciences
Frankfurt am Main, the Institute of Applied
Sciences (AIF) Esslingen, InnoCyte GmbH
and 2 renowned companies founded by
BMWi. This brand-new innovative device
Split.It automatically performs the central
steps in the production of cell cultures,
In Zukunft soll das System über seine Funktion hinaus auch durch
die einfache Funktionsweise für den Anwender bestechen:
p Einlegen der zu passagierenden, konfluenten Zellkultur -
flasche („Mutterflasche“), eine Corning RoboFlask (100 cm 2 ),
p Auswahl der gewünschten Anzahl „Tochterflaschen“,
p Eingabe oder Auswahl des Protokolls,
p STARTEN,
p Entnahme der Tochterflaschen,
p Automatischer Ablauf des Desinfektions- und Reinigungsprogramms.
Die notwendigen Parameter werden dabei flexibel, das heißt
zellspezifisch eingestellt, zum Beispiel:
p Anzahl und Volumina der gewünschten Waschschritte,
vor dem Passagieren,
p Medienvolumina,
p Reagenzienvolumina und dessen Inkubationszeit
(z.B. Trypsin etc.),
p Anzahl der Abklopfschritte („shake-off“),
p Anzahl der Resuspensionsschritte,
p Split-Verhältnis (von 1:1 bis 1:12).
Das Forschungsprojekt hat nun zum Ziel, dieses Funktionsmuster
in einen funktionstüchtigen Demonstrator zu überführen, der es
der Firma InnoCyte ermöglicht ein Serienprodukt auf den Markt
zu bringen und einen breiten Anwenderkreis zu erschließen!
HeLa splitted
automated with “Split.It”
30 min.
4h
48 h
HeLa splitted
conservative – manually
provided in an affordable stand-alone
benchtop system. This reduces the risk of
contamination and errors involved with
manual processing, achieving improved
productivity and quality of cell lines.