Entwicklung einer in vitro Methode zur Simulation von Verdauung ...

Aus der Professur für Tiergesundheit und Tierschutz
der Agrar- und Umweltwissenschaftlichen Fakultät
Thesen der Dissertation
Entwicklung einer in vitro Methode zur Simulation von
Verdauung und Resorption gentechnisch veränderter
Pflanzen
vorgelegt von
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Agrarwissenschaften doctor agriculturae (Dr. agr.)
an der Agrar- und Umweltwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Rostock
Dipl. Biochem. Andre Kacholdt und Dipl. Ing. agr. Mandy Bruch
aus Rostock
Rostock, den 08.06.2012

Zur Zulassung von gentechnisch veränderten Pflanzen ist eine Risikoabschätzung, gerade
unter dem Gesichtspunkt der Verbesserung der Akzeptanz in weiten Teilen der Bevölkerung,
sehr wichtig. Um ein quantifizierbares Verfahrens zur Detektion von Wechselwirkungen der
gentechnisch veränderten Proteine mit dem Darmepithel und der Resorption aller durch die
Expression des Fremdgens veränderten Stoffe und deren Auswirkungen auf den
Organismus zu entwickeln, bedarf es einer strukturierten Vorgehensweise. Es sollte ein
Verfahren entwickelt werden, das die in vitro Messung von ansonsten nur im Tierversuch zu
erhebenden Daten über Verdauungs- und Resorptionsvorgänge im Darm gestattet. Die
Risikoabschätzung muss umfassend sein und auch die Frage klären, ob es Gefahren bei
beabsichtigter oder auch unbeabsichtigter Aufnahme von gentechnisch veränderten
Pflanzen in den Verdauungstrakt von Organismen gibt. Zur Verringerung von Tierversuchen
soll ein in dieser Arbeit entwickeltes quantifizierbares in vitro Verfahren angewendet werden.
Bei der Entwicklung der hiervorliegenden in vitro Verdauungsmethode und bei der
Untersuchung des Abbaus von Proteinen und Pflanzen, sowie dem Vergleich der Ergebnisse
mit Ergebnissen anderer Untersuchungen konnten die folgenden Thesen erarbeitet werden:
1. Die zu entwickelte in vitro Verdauungsmethode soll sich aufgrund des Einsatzes von
gentechnisch veränderten Pflanzen als Futtermittel und in der Humanernährung am
Verdauungssystem des Monogasters orientieren. Das Schwein wurde aufgrund seiner
großen physiologischen Parallelen zum Menschen als Modelltier genutzt. Die
natürlichen Vorgänge im Gastrointenstinaltrakt wurden analysiert, insbesondere die
Zusammensetzung der sezernierten Enzyme und Pufferlösungen wurde genauestens
untersucht.
2. Die stattfindenden Verdauungsschritte in der Maulhöhle (30 min Inkubation mit -
Amylase, gelöst in PBS und einem pH-Wert von 6,8) im Magen (3 h Inkubation mit
Pepsin, gelöst in HCl, pH-Wert 2,0) und im Duodenum (2 h Inkubation mit
Pankreatin/Gallenextrakt, gelöst in Hydrogencarbonatpuffer mit pH-Wert 6,8) sind mit
relativ geringem Aufwand in vitro zu simulieren. Durch die Verdauungsenzyme werden
die drei Hauptnährstoffe Kohlenhydrate, Proteine und Fette, soweit sie durch den
Aufschluss in die wässrige Phase überführt werden, abgebaut. Die Reaktionsprodukte
konnten zu allen erfolgten Abbaureaktionen nachgewiesen werden. Dabei sind die in
vitro Vorgänge auf molekularer Ebene durchaus mit denen in vivo vergleichbar.
3. Bei der Simulation der Verdauung, wie sie im Dünndarm stattfindet, tritt folgendes
Problem auf. Die Bauchspeicheldrüse sezerniert eine Vielzahl von Enzymen, die nicht
alle käuflich zu erwerben waren. Ein Kompromiss ist die Verwendung von Pankreatin,
einem Enzymgemisch, gewonnen aus dem Pankreas. Ein kompletter Abbau von
Proteinen kann mit Verwendung dieses Enzymgemisches erreicht werden, da es alle
Verdauungsenzyme des Pankreas enthält, aber eine Zuordnung der proteolytischen
Gesamtaktivität auf die einzelnen Enzyme ist nicht möglich.
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4. Soll bei der Verdauungssimulation der Abbaugrad des Futtermittels maximiert werden,
und möglichst nahe am natürlichen Vorbild gearbeitet werden, so muss die verwendete
Methode den Abbau durch -Amylase beinhalten. Durch diesen vorgeschalteten
Verdauungsschritt kann der Abbaugrad bei den darauffolgenden Verdauungsschritten
signifikant erhöht werden, und damit näher an die Vorgaben der natürlichen Verdauung
angenähert werden, der allerdings nicht erreicht wird.
5. Die Freisetzung von intakten Proteinen in den Verdauungstrakt und eine damit
verbundene eventuelle Resorption ist nicht zu verhindern. Der Aufschluss erfolgt im
Magen, freiwerdendes Protein wird sofort von Pepsin abgebaut. Dieses wird durch die
Erhöhung des pH-Wertes (Hydrogencarbonat aus der Pankreas) inaktiviert. Aus dem
aufgeschlossenen Substrat aus dem Magen wird weiterhin intaktes Protein freigesetzt,
welches aber nur langsam durch die pankreatischen Enzyme abgebaut wird. Freies,
intaktes Fremdprotein ist daher immer im Dünndarm vorhanden. Deshalb sollte die
mögliche Resorption ebenfalls untersucht werden, wenn fremde Proteine in eine Pflanze
eingebracht werden.
6. Gentechnisch in Pflanzen eingebrachte Proteine unterschieden sich im Bezug auf den
Abbau durch die Verdauungsenzyme und die Freisetzung in das umgebende wässrige
Medium nicht von den natürlich enthaltenen Proteinen einer Pflanze. Es konnten keine
Unterschiede im Abbauverhalten zwischen dem Gesamtprotein und dem Fremdprotein
aus gentechnisch veränderten Pflanzen festgestellt werden.
7. Der mögliche Abbau der Proteine durch die Verdauungsenzyme ist eine Eigenschaft der
jeweiligen Proteine selbst. Sie wird weitestgehend durch die Aminosäuresequenz und
die sich daraus ergebende Tertiärstrukur der Proteine bestimmt. Aus diesem Grund wird
sich diese Eigenschaft beim Transfer in einen anderen Organismus nicht grundlegend
ändern.
8. Zur Feststellung der Resorptionseigenschaften können Bestandteile der jeweiligen
gentechnisch veränderten Pflanze verwendet werden. Da die Pflanzenteile
aufgeschlossen werden, ist spätestens beim Übertritt der Proteine ins wässrige Medium
kein Unterschied mehr zum Einsatz von gereinigten Proteinen zu erkennen. Nur die
Konzentration der Proteine in der wässrigen Lösung unterscheidet sich.
9. Da im Duodenum intaktes Protein freigesetzt wird, ist es zur Bestimmung der
Allergenität notwendig, drei verschiedene Verdauungsprofile zu untersuchen.
komplette in vitro Verdauung von Maulhöhle bis Dünndarm
nur mit den Pankreasenzymen, dabei wird der Pankreasverdau der im
Duodenum freigesetzten intakten Proteine simuliert
ohne Verdauungsenzyme, um den Einfluss der intakten Proteine, die im
Duodenum vorliegen, auf die Allergenität zu untersuchen
10. Die Resorption kann unter Verwendung von Ussing-Kammern simuliert werden. Es
wurden keine den in vivo Daten wiedersprechende Ergebnisse gefunden. Die in vitro
stattfindenden Transporte konnten aus versuchstechnischen Gründen, u.a. zu geringe
Konzentration der Fremdproteine, in vivo nicht verifiziert werden.
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11. Am isolierten Darmgewebe sind die Transporte der rekombinanten Proteine untersucht
worden. Dabei konnten geringe Transport von GFP und VP 60 detektiert werden. Um
den Transport weiter zu charakterisieren, wurde das Versuchsdesign abgeändert, aber
keine es wurden Unterschiede in den Transportraten zwischen den Geweben mit und
ohne Payersche Plaques festgestellt. Aufgrund der in den Plaques enthaltenen M-Zellen
war hier ein höherer Proteintransport erwartet worden.
12. Die Eignung der Ussing-Kammer als Untersuchungsmethode ist prinzipiell gegeben,
aber die Vitalität des untersuchten Epithels bedarf genauster Untersuchungen, da der
bisher verwendete Marker (Anstieg des Kurzschlussstromes I nach Zugabe von
Theophyllin) nicht zur alleinigen Beurteilung des Gewebezustandes ausreicht. Die
histologischen Untersuchungen zeigen trotz positiver Reaktion auf die Theophyllin-
Zugabe ein anderes Bild.
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