(BVD) mittels LightCycler Real-Time PCR (pdf) - AGES

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TITELSTORY nimmt meist einen subklinischen Verlauf, gegebenenfalls kommt es, meist in Verbindung mit Sekundärinfektionen, zu Pneumonien und/oder Durchfall („Bovine Virus Diarrhoe“) bzw. zu Störungen in der Blutgerinnung („hämorrhagisches Syndrom“) (Abb. 2). – Die transplazentare Infektion des Embryo/Fetus Abb. 5: Massive Erosionen im Bereich der Maulschleimhaut bei Mucosal Disease führt zu Fruchttod, Aborten, der hergehendenAllgemeinerkranstig frei von dieser Seuche zu be- Geburt mißgebildeter Kälber kung.kommen. („okulozerebelläres Syndrom“) Der unkontrollierte Auftrieb (Abb. 3, 4) oder aber der Geburt Seuchenbekämpfung von PI-Tieren auf Gemeinschafts- persistent mit dem BVD-Virus infi- Aus seroepidemiologischen Studien weiden bzw. die Alpung in den Gezierter Kälber („PI-Tiere“). Virämi- geht hervor, daß in manchen Regiobirgsregionen spielen eine maßgebker bzw. PI-Tiere entstehen ausnen bis zu 90% der Rinder im Laufe liche Rolle bei der BVDV-Verbreischließlich pränatal, eine postna- ihres Lebens eine BVDV-Infektion tung in seuchenfreie Bestände. tale Infektion mit dem BVDV führt durchmachen und dann mit der Bil- Langjährige Erfahrungen in großen lediglich zur transienten Virämie. dung neutralisierender Antikörper Rinderbeständen mit teilweise über Daraus resultiert letztendlich die reagieren. Als wichtigste Faktoren 500 Tieren belegen, daß die aus- Bildung neutralisierender Anti- für die Verbreitung des BVDV gelten schließliche Weiterverbreitung des körper. Als typisch klinische Er- die persistent mit dem Virus infizier- BVDV über transiente immunkomscheinungen haben PI-Tiere meist ten Tiere, da diese zeitlebens hohe petente Tiere letztendlich abbricht, Durchfall, sie kümmern und lei- Konzentrationen an Virus über wodurch einmal mehr die Bedeuden an Pneumonien. sämtliche Körperexkrete und -setung der PI-Tiere als Schlüssel zur – Die Superinfektion eines mit eikrete ausscheiden und somit durch Seucheneradikation belegt wird. nem nzp Virusstamm infizierten eine Neuinfektion trächtiger Rinder PI-Tieres mit einem homologen wiederum zum Entstehen von PI- BVD-Bekämpfung in Tirol zp Virusstamm führt zum Aus- Tieren beitragen. Im Rahmen eines von der Tiroler bruch der sogenannten „Mucosal Dem Auffinden und Ausmer- Landesregierung geförderten frei- Disease“ (MD) (Abb. 5), einer stets zen solcher PI-Tiere kommt somit willigenBVD-Bekämpfungspro- letal verlaufenden und mit schwe- die entscheidende Bedeutung zu, gramms erfolgte seit 1999 eine syren klinischen Erscheinungen ein- um die Rinderbestände längerfristematische Untersuchung aller LABOR AKTUELL 7
8 TITELSTORY Rinder in der Altersgruppe von drei Monaten bis drei Jahren mittels BVD-Antigen ELISA. Durch jährliche Wiederholungsuntersuchung der Bestände konnte der Anteil an PI-Tieren in der Tiroler Rinderpopulation von ursprünglich 1,22% im Jahr 1999 auf 0,23% (Stand 2003) reduziert werden. Bekämpfungsstrategien Aufgrund der meist regional unterschiedlichen Betriebsgrößen und -strukturen gibt es verschiedene Modelle, die darauf abzielen, PI-Tiere ausfindig zu machen und aus der Herde zu entfernen. Tankmilchserologie und Jungtierfenster PI-Tiere durchseuchen höchst wirkungsvoll eine Herde, wodurch sich über den Antikörpernachweis in der Tankmilch bzw. in Serumproben BVD-verdächtige Bestände erfassen lassen. In einer nachfolgenden kombinierten Antikörper/Antigen ELISA-Untersuchung erfolgt die Detektion möglicher PI-Tiere in Antikörper-positiven Beständen mittels ELISA. Dieses Verfahren wurde bereits in Skandinavien mit Erfolg eingesetzt, erfordert jedoch aufgrund des mehrstufigen Verfahrens und der verschiedenen Probenmaterialien (Tankmilch, Serumproben) einen erheblichen Aufwand, vor allem, was Administration und Probenlogistik anbelangt. Da PI-Tiere am häufigsten in der Altersgruppe bis zu drei Jahren anzutreffen sind, ist alternativ bzw. ergänzend zur Tankmilchuntersuchung das sogenannte „Jungtier- fenster“ entwickelt worden. Eine definierte Anzahl von Jungrindern einer epidemiologischen Einheit wird auf BVDV-Antikörper untersucht. Ein erhöhter Anteil an seropositiven Tieren kann einen Hinweis auf ein aktuelles BVD-Geschehen infolge eines PI-Tieres in der Herde geben. Impfung Die Impfung ist ein Verfahren, das in praxi lediglich zur Bestandssanierung angewandt wird, da es aufgrund der Heterogenität ruminanter Pestiviren zu keiner ausreichenden Immunität gegen alle möglichen BVDV-Feldstämme kommt. Ein flächendeckendes Bekämpfungsprogramm erscheint mit der Impfung somit nicht zielführend. PCR-Screening mittels LightCycler ® Real-Time PCR Die Entwicklung von Real-Time Geräten schuf erstmals die Voraussetzung, Massenuntersuchungen mittels PCR durchführen zu können. In der Real-Time PCR wird die konventionelle PCR mit einer sofortigen Detektion der entstehenden Amplifikate kombiniert. Durch den Einsatz von sequenzspezifischen fluoreszenzmarkierten Sonden erreicht man überdies ein Höchstmaß an Spezifität. In unserem Verfahren wird die hohe Sensitivität der Real-Time PCR dahingehend ausgenutzt, gepoolte Proben von bis zu 20 Tieren in einem PCR-Gefäß zu untersuchen. Der Einsatz gepoolter Proben reduziert die Untersuchungskosten im Vergleich zu den im ELISA erforderlichen Einzeltieruntersuchungen erheblich. Die systematische Untersuchung aller über zehn Wochen alten Tiere eines Bestandes vereinfacht zusätzlich die Seuchenbekämpfung im Gegensatz zum diffizilen Bekämpfungsmanagement beim sogenannten „Tankmilch“- Bekämpfungsprogramm. Material und Methode Plasma versus Serum Umfangreiche Validierungsstudien zur Nachweisbarkeit viraler RNA in Serum bzw. Plasma wurden im Vorfeld unseres Screenings durchgeführt, um die optimale Matrix für den Nachweis des BVDV unter Praxisbedingungen respektive den Einfluß von Transportdauer und Transportbedingungen zu erheben. Als optimales Probenmaterial zum Virusnachweis mittels Real- Time PCR erweist sich Plasma aus EDTA-Blutproben, während in Vollblutproben ein verhältnismäßig rascher Abbau der viralen RNA erfolgt. Entnahme und Poolung der Blutproben Die Organisation der Probenentnahme erfolgte durch die Veterinärabteilung der Tiroler Landesregierung und wurde durch Amtstierärzte bzw. ortsansässige praktische Tierärzte vorgenommen. Mittels Vacutainer ® -Blutentnahmesystem (Fa. Greiner) von 45.448 über zwei Wochen alten Rindern aus 9.019 Tiroler Rinderbeständen entnommene EDTA-Blutproben langten im Zeitraum März–April 2004 LABOR AKTUELL A USGABE 2 2004
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