Abschlussbericht (pdf) - AGES

MELISSAMvvvvvvvv 

Molekularbiologische Untersuchungen zum möglichen 

Vorkommen von Melissococcus plutonius (Erreger der 

Europäischen Faulbrut) an Bienen in Österreich 

Molecular investigations on the possible incidence of Melissococcus plutonius 

(causative agent of European foulbrood in honeybees) on bees in Austria 

Abschlussbericht 

Laufzeit des Projektes: 1.9.2011-31.8.2013 

Hemma Köglberger 1) , Jasmina Leutgeb 1) , Irmgard Derakhshifar 1) , Richard A. 

Gottsberger 2) , Michael Schwarz 3) , Rudolf Moosbeckhofer 1) 

1) Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz 

2) Abteilung für molekularbiologische Diagnose von Pflanzenkrankheiten 

3) Fachbereich Daten, Statistik und Risikobewertung 

Projektleiterin und korrespondierende Autorin: 

DI Hemma Köglberger 

AGES, Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz 

Spargelfeldstraße 191, 1220 Wien 

Tel. : 050 555-33 127 

Email: hemma.koeglberger@ages.at 

Abschlussbericht 1 von 45

Seite 1 von 45 

Inhaltsverzeichnis 

1 Einleitung .......................................................................................... 3 

1.1 Erreger .................................................................................................... 3 

1.2 Symptome und Krankheitsbild ................................................................... 4 

1.3 Bekämpfung ............................................................................................ 6 

1.3.1 Bekämpfungsverfahren in der Schweiz und Großbritannien ................... 6 

1.4 Erregernachweis ...................................................................................... 7 

1.4.1 Mikroskopie ....................................................................................... 7 

1.4.2 Molekularbiologische Untersuchungsmethoden .................................... 7 

2 Material und Methode ....................................................................... 8 

2.1 Probenmaterial ........................................................................................ 8 

2.2 Probenherkunft und Symptombeschreibung ............................................... 9 

2.3 Referenzmaterial für die Untersuchungen ................................................ 12 

2.3.1 Positives Referenzmaterial ................................................................ 12 

2.3.2 Negatives Referenzmaterial .............................................................. 13 

2.4 Ergebnisklassifizierung ........................................................................... 13 

2.5 Geräte, Materialien und Reagenzien ........................................................ 13 

2.5.1 Geräte und Materialien ..................................................................... 13 

2.5.2 Reagenzien ...................................................................................... 14 

2.6 Primer und Sonde .................................................................................. 15 

2.7 Herstellung der benötigten Arbeitslösungen ............................................. 16 

2.7.1 Enzymatischer Lysis Puffer für DNA-Extraktion ................................... 16 

2.7.2 Primer (Master-Mix-Komponenten für PCR)........................................ 17 

2.7.3 MGB-Sonde (Master-Mix-Komponente für PCR) .................................. 17 

2.8 Probenvorbereitung ................................................................................ 17 

2.9 DNA-Extraktion mittels Qiagen DNeasy ® Blood & Tissue-Kit ...................... 18 

2.10 Master-Mix und real-time PCR .............................................................. 18 

2.10.1 Master-Mix ...................................................................................... 19 

2.10.2 Real-time PCR Bedingungen ............................................................. 20 

2.11 Etablierung der PCR-Methode .............................................................. 21 

2.11.1 Etablierungsschritt 1 ........................................................................ 21 




2.11.5 Aufgetretene Probleme und ihre Lösung ............................................ 26 

2.12 Erreger-Nachweis in Bienenproben aus Österreich ................................ 27 

3 Ergebnisse ....................................................................................... 27 

3.1 Ergebnis der Untersuchungen von Bienenproben aus Österreich nach 

Bundesländern ................................................................................................ 30 

3.2 Symptombeschreibung und Untersuchungsergebnis ................................. 32 

4 Diskussion ....................................................................................... 33 

5 Zusammenfassung .......................................................................... 36 

6 Danksagung .................................................................................... 38 

7 Abkürzungen und Begriffserklärungen ........................................... 39 

8 Literatur .......................................................................................... 40 

Projekt: Molekularbiologische Untersuchungen zum möglichen Vorkommen von Melissococcus plutonius (Erreger der 

Europäischen Faulbrut) an Bienen in Österreich


9 Anhang ............................................................................................ 43 

9.1 Fragebogen ........................................................................................... 43 




1 Einleitung 

Die Europäische Faulbrut (EFB), auch als Sauerbrut bezeichnet, ist eine Erkrankung 

der Bienenbrut, hervorgerufen durch das Bakterium Melissococcus plutonius (Trüper 

und de’Clari; 1998). Die Erkrankung ist seit über 100 Jahren bekannt und die 

klinischen Symptome wurden erstmals 1885 von Cheshire und Cheyne beschrieben 

(zitiert nach Roetschi et al., 2008). Weltweit ist EFB in den meisten Honig 

produzierenden Ländern in Bienenvölkern zu finden (McKee et al., 2003). In 

manchen Staaten stellt sie ein großes Problem dar, beispielsweise in Großbritannien 

(FERA, 2013) und in der Schweiz, wo eine Meldepflicht besteht und eine Bekämpfung 

gemäß der Tierseuchenverordnung durchgeführt werden muss (Imdorf et al., 2005). 

In Österreich ist die Europäische Faulbrut im Bienenseuchengesetz BGBl. Nr. 

290/1988 (Novelle 2005) nicht unter den anzeigepflichtigen Krankheiten angeführt. 

Im Falle eines schweren Ausbruches könnte jedoch gemäß § 3. (1) die generelle 

Anzeigepflicht zum Tragen kommen (Zitat: „Anzuzeigen ist … 3. Jedes drohende oder 

erfolgte Absterben von mindestens 30 vH der Völker eines Bienenstandes“. 

Für Österreich liegen aufgrund der nicht vorhandenen Meldepflicht keine gesicherten 

Daten über das Auftreten von EFB vor. Insgesamt wurden an der Abteilung 

Bienenkunde und Bienenschutz im Zeitraum 2006 bis Ende 2011 89 Brutproben auf 

EFB untersucht. Von diesen war bei zwei Proben der PCR-Nachweis für Melissococcus 

plutonius positiv. Die zwei positiven Einsendungen stammten aus Fügenberg in Tirol 

bzw. Schneegattern in Oberösterreich (Derakhshifar, 2012, unveröffentlicht). 

1.1 Erreger 

Von Cheshire und Cheyne (1885) wurde Bacillus alvei als Erreger der Europäischen 

Faulbrut genannt. White (1912) identifizierte allerdings Bacillus pluton als 

Krankheitsursache. Nach der ersten erfolgreichen Isolation wurde das Bakterium 

aufgrund seiner Morphologie als Streptococcus pluton (Bailey, 1957) bezeichnet und 

von Bailey nach eingehender Studie seiner Biologie und Epidemiologie (1957) in 

Melissococcus pluton umbenannt (Bailey & Collins, 1982). Diese Bezeichnung wurde 




wiederum von Trüper und de’Clari (1998) aus taxonomischen Gründen zu 

Melissococcus plutonius abgeändert. 

1.2 Symptome und Krankheitsbild 

Ein markantes Indiz für EFB ist ein lückiges Brutnest (siehe Abb. 1). Es entsteht, 

wenn die Bienen erkrankte bzw. abgestorbene Larven aus den Zellen entfernen. 

Offene Brutzellen beherbergen gelb bis bräunlich verfärbte Maden, die schlaff an der 

Zellwand - meist mit dem Rücken zur Zellöffnung - liegen (siehe Abb. 2). Die 

Körpersegmentierung ist kaum zu erkennen. Durch die hohe Bakteriendichte im 

Darm scheint ein grau-gelber 2-3 mm großer Klumpen durch die Larvenhaut 

hindurch. Bereits abgestorbene Larven bilden eine dunkelbraune, meist nicht 

fadenziehende, breiartige Masse, die dann zu einem am Zellboden locker sitzenden 

Schorf eintrocknet (siehe Abb. 2) (Ritter, 1994). 

Die Zelldeckel sind eingefallen und teilweise löchrig. Die in den Zellen enthaltenen 

toten Maden und Puppen weisen eine schwarzbraune Verfärbung auf. Sie sind gar 

nicht oder leicht fadenziehend. Nach dem Eintrocknen des Schorfs, lässt sich dieser 

ebenfalls einfach entfernen (Lehnherr & Duvoisin, 2001). An der Innenseite der 

Zelldeckel kann ein schwarzer, lackartiger Überzug zu finden sein (Ritter, 1996). 




Abb. 1: Lückiges Brutnest 

Quelle: AGES, http://www.ages.at/uploads/media/Merkblatt_Europaeische_Faulbrut_Nov_2008.pdf, 

Abb. 2: Leblose, schlaffe Maden in verdrehter Lage; eingetrocknete Schorfe 

Quelle: AGES, http://www.ages.at/uploads/media/Merkblatt_Europaeische_Faulbrut_Nov_2008.pdf, 

In Abhängigkeit mit auftretenden sekundären Erregern variiert der olfaktorische 

Eindruck. Tritt Melissococcus plutonius alleine bzw. mit Enterococcus faecalis auf, so 




entsteht ein säuerlicher Geruch. Daher auch der Name Sauerbrut. Erscheint sekundär 

vorwiegend Bacillus alvei, so entwickelt sich ein fauliger Geruch (Ritter, 1994). 

1.3 Bekämpfung 

In Österreich stehen keine zugelassenen Medikamente für eine chemische Therapie 

zur Verfügung. Die Europäische Faulbrut unterliegt nur bei seuchenhaftem Auftreten 

im Sinne von § 2 Z. 4 dem Bienenseuchengesetz (BGBl Nr. 290/1988, Novelle 2005). 

Liegt eine schwache Infektion vor, so besteht die Möglichkeit der Selbstheilung 

(Shimanuki, 1990). 

Durch imkerliche Maßnahmen kann die Selbstheilung der Völker unterstützt werden: 

Wechsel der Königin und somit eine Brutunterbrechung; Zuhängen einer Wabe mit 

junger und reifer Brut sowie Fütterung, dies fördere das Ausräumen der erkrankten 

Brut durch Arbeiterinnen; Vermeidung von Pollenunterversorgung, da Eiweißmangel 

EFB fördert sowie Stressvermeidung (Alippi, 1999). 

Bei intensivem Befall erfolgt die Bekämpfung mittels Kehrschwarmverfahrens. Dabei 

werden alle Bienen eines Volkes abgekehrt und der Kunstschwarm auf Mittelwände 

gesetzt. Da die Königin ein Infektionsherd sein kann, wird eine neue junge Königin 

zugesetzt. Der Kunstschwarm wird flüssig gefüttert und alle Waben werden 

eingeschmolzen. Rähmchen und Bienenkästen werden gründlich gereinigt und 

desinfiziert (Ritter 1996). 

1.3.1 Bekämpfungsverfahren in der Schweiz und Großbritannien 

In der Schweiz und in Großbritannien ist die Europäische Faulbrut eine 

meldepflichtige Krankheit. In Großbritannien wird empfohlen, schwache Völker und 

Völker mit einem hohen Anteil erkrankter Brut abzutöten, Völker mit geringen 

Krankheitsanzeichen können auch medikamentös - unter Beaufsichtigung eines 

Bieneninspektors - behandelt werden. Auch die Sanierung der Bienenvölker über das 

Kehrschwarmverfahren ist zulässig (FERA, 2013). 




In der Schweiz werden kranke und schwache Völker eines Standes abgetötet. Wenn 

jedoch mehr als die Hälfte der Völker eines Standes klinische Symptome zeigen, 

werden alle Völker abgetötet. Die übrigen Völker eines Standes können mit dem 

Kehrschwarmverfahren saniert werden (Tschumi, 2011). 

1.4 Erregernachweis 

1.4.1 Mikroskopie 

Die Diagnostik kann über eine lichtmikroskopische Untersuchung des 

Mitteldarminhalts erkrankter Larven erfolgen, wobei dieser auf einem Objektträger 

ausgestrichen und nachträglich mit wässriger Nigrosinlösung kontrastiert 

beziehungsweise einer Gramfärbung unterzogen wird. Bei 1 000-facher Vergrößerung 

sind die lanzettförmigen Kokken zu erkennen (Ritter, 1996). 

1.4.2 Molekularbiologische Untersuchungsmethoden 

Für die exakte Identifizierung von Melissococcus plutonius steht als 

molekularbiologische Untersuchungsmethode die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 

zur Verfügung. Mit dieser kann der Erreger eindeutig über seine Erbsubstanz 

nachgewiesen werden. 

Die PCR ist eine sehr schnelle und sensitive Methode, mit der kleinste Mengen an 

DNA detektiert werden können. 




2 Material und Methode 

2.1 Probenmaterial 

Bienenproben: 

Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 51 Bienenproben (je eine Probe aus 

einem Volk pro Bienenstand) aus Imkerbetrieben in allen neun österreichischen 

Bundesländern herangezogen. Dabei wurde versucht, eine gleichmäßige 

geographische Verteilung der Probenahmestellen zu erreichen. Eine verdichtete 

Probenahme erfolgte in einem Gebiet in Tirol, für das es bereits ein positiver 

Nachweis aus der routinemäßigen Untersuchungstätigkeit der Abteilung für 

Bienenkunde und Bienenschutz im Frühjahr 2011 vorlag, sowie in Vorarlberg 

aufgrund der Nähe zur Schweiz. 

Die Probenahme wurde von den Imkern und Imkerinnen im Zeitraum zwischen Juli 

bis Anfang September 2011 durchgeführt. Falls am Stand schwache Völker mit einem 

unregelmäßigen Brutbild bzw. klinischen Symptomen vorhanden waren, die einen 

Verdacht auf EFB begründeten, wurde eines dieser Völker beprobt. Waren keine 

auffälligen Völker am Stand zu finden, wurde ein beliebiges Volk gewählt. 

Mindestens 100 lebende Bienen wurden pro Volk aus dem Brutraum von einer 

Brutwabe abgefegt und rasch eingefroren, um sie möglichst schonend abzutöten. 

Ein von den Imkern und Imkerinnen auszufüllender Fragebogen (siehe Anhang) 

lieferte Informationen über den Zustand der Völker. 

Brutproben: 

Es erfolgte keine Untersuchung von Brutproben, da dies nicht Inhalt dieses Projektes 

war. 




2.2 Probenherkunft und Symptombeschreibung 

In Abb. 3 ist die Anzahl der untersuchten Proben nach Bundesländern dargestellt. 

Abb. 3: Herkunft der Bienenproben aus den Bundesländern Österreichs 




Abb. 4 zeigt die regionale Herkunftsverteilung der Proben. Eng benachbarte 

Probenahmepunkte kennzeichnen die Gebiete mit verdichteter Probenahme. 

Abb. 4: Regionale Herkunftsverteilung der Bienenproben aus Österreich 

Weitere Detailangaben bezüglich klinischer Symptome bzw. sonstiger Beobachtungen 

zu jeder Probe sind in Tab. 1 zusammengefasst. 

Legende zu Tab. 1: 

- keine Symptome gemeldet 

k.A. 

keine Angabe 




Probenbezeichnung 

Bundesland 

Stand- 

Gemeinde 

Beschreibung der Symptome, 

Anmerkungen, 

EFB_1 V Göfis starker Totenfall nein 

EFB_2 St Mitterberg lückiges Brutnest ja 

EFB_3 B Bernstein - nein 

krabbelnde flugunfähige Bienen, 

erhöhter Totenfall, Verhaltensstörungen, 

Rückgang des 

Bienenbesatzes im Honigraum 

EFB- 

Symptome 

EFB_4 V Hohenweiler 

nein 

EFB_5 T Schwaz lückiges Brutnest ja 

EFB_6 T Wattenberg - nein 

EFB_7 T Pill - nein 

EFB_8 T Vomp - nein 

EFB_9 T Wattens - nein 

EFB_10 NÖ Peigarten lückiges Brutnest ja 

EFB_11 St Gleinstätten lückiges Brutnest ja 

EFB_12 T Fügenberg lückiges Brutnest ja 

EFB_13 T Fügenberg lückiges Brutnest ja 

EFB_14 T Fügen - nein 

EFB_15 T Fügen - nein 

EFB_16 T Uderns - nein 

EFB_17 T Uderns - nein 

EFB_18 S Neumarkt lückiges Brutnest ja 

EFB_19 OÖ Langenstein lückiges Brutnest ja 

EFB_20 T Landeck 

lückiges Brutnest, 

stehengebliebene Zellen 

ja 

St.Johann/ 

Pongau - nein 

EFB_21 S 

EFB_22 W Wien - nein 

EFB_23 S Elixhausen Kalkbrut nein 

EFB_24 OÖ Gramastetten - nein 

EFB_25 OÖ Brunnenthal lückiges Brutnest ja 

EFB_26 NÖ Haslau - nein 

EFB_27 St Kleinlobming - nein 

EFB_28 OÖ Hörsching - nein 

EFB_29 OÖ Peilstein - nein 

EFB_30 V Altach 

EFB_31 K Moosburg 

viel Totenfall, viele schwarze 

haarlose Bienen 

Brutnest nicht optimal 

geschlossen 

nein 

ja 

Grünau/ 

Gmunden - nein 

EFB_32 OÖ 

EFB_33 OÖ Linz - nein 

EFB_34 OÖ St. Oswald - nein 


Tabelle 1, Teil 1: Detaillierte Angaben zu den Probenherkünften 





BL 

Stand- 

Gemeinde 

Beschreibung der Symptome, 

Anmerkungen 

EFB- 

Symptome 

EFB_36 NÖ Lunz/See k.A. k.A. 

EFB_37 K 

Deutsch 

Griffen - nein 

EFB_38 NÖ 

Neubau 

Kreuzstetten k.A. k.A. 

EFB_39 K Hermagor/Egg - nein 

EFB_40 St 

St. Lorenzen 

im Mürztal 

lückiges Brutnest, 

stehengebliebene Zellen, löchrige 

Zelldeckel 

ja 

EFB_41 NÖ Raxendorf - nein 

EFB_42 NÖ Warth - nein 

EFB_43 B Pinkafeld - nein 

EFB_44 V Ludesch - nein 

EFB_45 NÖ Lichtenau - nein 

EFB_46 V Schwarzenberg - nein 

EFB_47 S Unken - nein 

EFB_48 OÖ 

Zell an der 

Pram - nein 


EFB_50 V Hittisau lückiges Brutnest ja 

EFB_51 W Wien lückiges Brutnest ja 

Tabelle 2, Teil 2: Detaillierte Angaben zu den Probenherkünften 

2.3 Referenzmaterial für die Untersuchungen 

2.3.1 Positives Referenzmaterial 

Das positive Referenzmaterial stammte aus der Schweiz, aus dem Zentrum für 

Bienenforschung, Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP in Bern. Es 

wurden Bienen, Bienensuspensionen und Bienenextrakte mit unterschiedlicher 

Erregerkonzentration bereitgestellt. Frau Dr. Alexandra Roetschi teilte uns auch die 

von ihr ermittelten Ct-Werte der übermittelten Probenmaterialien mit. 

In der Folge werden die Materialien wie folgt bezeichnet, wobei die nachgestellte 

Zahl (x) das Ursprungsmaterial angibt: 

Bienen Roetschi (BR x) 

Suspensionen Roetschi (SR x) 




Extrakte Roetschi (ER x) 

2.3.2 Negatives Referenzmaterial 

Als negatives Referenzmaterial dienten Bienen, die im Rahmen von Vorversuchen 

negativ getestet worden waren. Diese werden in der Folge als Negativkontrollbienen 

bezeichnet. Weiters wurde Milli-Q ® Reinstwasser als negative Reaktionskontrolle 

eingesetzt. 

2.4 Ergebnisklassifizierung 

Proben, bei denen Ct-Werte unter 40 ermittelt worden waren, wurden als 

„nachweisbar“ eingestuft. Bei Ct-Werten ab 40 wurde das Ergebnis mit „schwach 

nachweisbar“ angegeben. Lag bei mehreren Wiederholungen zumindest ein positives 

Ergebnis eines PCR-Durchganges vor, wurde je nach dem niedrigsten erzielten Ct- 

Wert „nachweisbar“ bzw. „schwach nachweisbar“ angegeben. 

2.5 Geräte, Materialien und Reagenzien 

2.5.1 Geräte und Materialien 

[G1] Eppendorf realplex 4 Mastercycler ® epgradient S (real-time PCR) 

[G2] Eppendorf twin.tec ® real-time PCR Platten 96 (weiß, V max : 150 µl) 

[G3] Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film 

[G3] Eppendorf real-time PCR Tube Strips (0,1 ml) + Masterclear Cap Strips 

[G4] Eppendorf Zentrifuge 5430 (für PCR-Platten) 

[G5] Hettich Mikrozentrifuge EBA 12R 

[G6] Fuge One Mikrozentrifuge 

[G7] Laminar Flow dan LAF VFS 906 




[G8] Mikrowaage ST21 Comparator von Mettler & Toledo 

[G9] Thermo Scientific NanoDrop ® 2000 Spektrophotometer 

[G10] pH-Meter 

[G11] HLC Thermo Block 

[G12] Vortex 

[G13] BIOREBA Homogenisator HOMEX 6 230 V 

[G14] Extraction Bags (Interscience) 

[G15] Zentrifugenröhrchen: 25 ml 

[G16] VWR Schraubgefäße: 60 ml, steril 

[G17] Sterile Einweg Messpipetten: 10 ml 

[G18] Eppendorf Safe-Lock Gefäße (Tubes): 1,5 ml, 2 ml 

[G19] Eppendorf Pipettenspitzen (mit Filter): 10 µl, 20 µl, 1-100 µl, 100-1 000 µl 

[G20] Eppendorf Kolbenhubpipetten: 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1 000 µl 

[G21] BN PickPen 1-M 23001 ∙ 1-magnet 

[G22] Brand macro Pipettierhilfe 

[G23] Tube Rack 

[G24] Sterile Pinzetten 

[G25] Sterile Spatel 

[G26] VWR Einweghandschuhe aus Latex 

2.5.2 Reagenzien 

[R1] Qiagen DNeasy ® Blood & Tissue-Kit 

[R2] Promega Wizard ® Magnetic DNA Purification System for Food-Kit 




[R3] TaqMan ® Sonde: MGB-Probe 2068054 (Sequenz 5’→3’: FAM- 

CTTGGTTGGTCGTTGAC-NFQ-MGB- (17)) 

M= 6881 g/mol; n= 6 nmol; c= 100 µmol/L; Farbstoff: 6-FAM 

[R4] Primer MelissoF (Sequenz 5’→3’: CAGCTAGTCGGTTTGGTTCC (20)) 

M= 6114 g/mol; n= 42,4 nmol; T m = 59,4 °C; GC-Gehalt= 55 % 

[R5] Primer MelissoR (Sequenz 5’→3’: TTGGCTGTAGATAGAATTGACAAT (24)) 

M= 7430 g/mol; n= 35,1 nmol; T m = 55,9 °C; GC-Gehalt= 33,3 % 

[R6] Roche TaqMan ® Universal PCR Master-Mix 

[R7] SIGMA life science PCR-Wasser W1754 – 1VL 

[R8] Lysozym (Roche, Cat. No. 10 837 059 001 

[R9] Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl, C 4 H 11 NO 3 ∙ ClH) 

M= 157,6 g/mol 

[R10] Merck Triton X-100 (C 34 H 62 O 11 ) M= 646,87 g/mol; 1 L ≙ 1,05 kg 

[R11] EDTA (C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 ∙ 2H 2 O) 99,0 – 101,0 %; M= 292,25 g/mol 

[R12] Kalilauge (KOH) 5 mol/L; M= 66,099 g/mol 

[R13] Merck Ethanol (C 2 H 5 OH) 99,8 %; M= 46,07 g/mol 

[R14] Milli-Q ® Reinstwasser 

2.6 Primer und Sonde 

Das Primer-Design von MelissoF (5’CAGCTAGTCGGTTTGGTTCC3’) und MelissoR 

(5’CAGCTAGTCGGTTTGGTTCC3’) sowie die TaqMan ® MGB (minor groove binder) 

Sonde (5’ FAM-CTTGGTTGGTCGTTGAC-NFQ-MGB 3’) erfolgte auf Basis des sodA 

Gens, das für die Mangan Superoxid Dismutase kodiert. Die Primer amplifizieren ein 

79-bp Fragment des sodA Gens (Roetschi et al. 2008). 




2.7 Herstellung der benötigten Arbeitslösungen 

2.7.1 Enzymatischer Lysis Puffer für DNA-Extraktion 

o Benötigte Reagenzien: 

» 20 mmol/L Tris(hydroxymethyl)- 

aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl); pH = 8 

» 2 mmol/L EDTA 

» 1,2 % Triton X-100 

» 20 mg/ml Lysozym 

» Kalilauge (KOH); c= 5 mol/L 

» Milli-Q ® Reinstwasser 

o Herstellung: Um ein Gesamtvolumen von 30 ml Lysis Puffer zu 

erhalten wurden 94,56 mg Tris-HCl, 17,53 mg EDTA und 

0,36 ml Triton X-100 in ein 50 ml Becherglas überführt, 

mit Milli-Q ® Reinstwasser auf 29,5 ml aufgefüllt und 

anschließend mit Kalilauge auf pH = 8 eingestellt. Die 

Menge an Lysozym wurde kurz vor dem Gebrauch des 

Lysis Puffers hinzugefügt. 

o Anmerkung: Der Puffer wurde bei -20 °C gelagert. Um die Auftauzeit 

des Reagenzes zu verringern und wiederholtes Auftauen 

und Einfrieren zu vermeiden, wurde dieses auf 2 ml 

Reaktionsgefäße aufgeteilt. 

Lysozym wurde bei +2 °C bis +8 °C gelagert. 




2.7.2 Primer (Master-Mix-Komponenten für PCR) 

Die Oligonukleotide (Primer) wurden gemäß den Herstellerangaben mit jener 

Wassermenge versetzt, die nötig war, um eine Stocklösung mit der Konzentration 

von 100 pmol/µl herzustellen. Aus der Stocklösung wurde die Arbeitslösung 

(Konzentration von 10 pmol/µl) mit einer 1:10 Verdünnung hergestellt. 

o MelissoF: 

o MelissoR: 

Es wurden 424 µl PCR-Wasser zu den vorliegenden 

42,4 nmol, des Oligonukleotids, zugesetzt. 

Es wurden 351 µl PCR-Wasser zu den vorliegenden 

35,1 nmol, des Oligonukleotids, zugesetzt. 

Die Primer wurden bei -20 °C gelagert. 

2.7.3 MGB-Sonde (Master-Mix-Komponente für PCR) 

o Die Sonde wurde 1:100 verdünnt. 

Anmerkung: Der in der Sonde enthaltene Farbstoff ist lichtempfindlich. Die 

Sonde wurde lichtgeschützt bei -20 °C gelagert. 

2.8 Probenvorbereitung 

In Anlehnung an die Methode nach Roetschi et al. (2008) wurden jeweils 100 Bienen 

einer Probe entnommen und diese auf vier Extraction Bags aufgeteilt. 12,5 ml 

Milli-Q ® Reinstwasser wurden in jedes der mit 25 Bienen befüllten Extraction Bags 

überführt und der Inhalt wurde mittels BIOREBA-Homogenisator aufgearbeitet. Die 

erhaltene Bienensuspension wurde in zwei Zentrifugenröhrchen (25 ml) gefüllt und 

anschließend bei 1 100 g für 15 Minuten zentrifugiert. Vom Überstand beider 

Zentrifugenröhrchen wurde insgesamt ein Aliquot von 1,5 ml entnommen und in ein 

2 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. 




2.9 DNA-Extraktion mittels Qiagen DNeasy ® Blood & Tissue-Kit 

Die im Reaktionsgefäß enthaltenen 1,5 ml des Überstandes der Bienensuspension 

wurden bei 20 000 g für 2 Minuten zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Der 

Überstand wurde verworfen, das Pellet in 180 µl enzymatischem Lysis Puffer, zu dem 

zuvor Lysozym (20 mg/ml) zugesetzt worden war, suspendiert und eine Stunde bei 

37 °C inkubiert. Darauffolgend wurden 25 µl Proteinase K und 200 µl Buffer AL 

hinzugefügt, gut geschüttelt und 30 Minuten lang bei 56 °C inkubiert. Anschließend 

wurden 200 µl Ethanol (99,8 %) zugesetzt und erneut geschüttelt. Die erhaltene 

Suspension wurde in eine DNeasy Mini Spinsäule, welche in einem 2 ml Collection- 

Tube (beides im Kit enthalten) platziert ist, überführt und bei 6 000 g für 2 Minuten 

zentrifugiert. Das Collection-Tube samt Inhalt wurden verworfen. Die DNeasy Mini 

Spinsäule wurde auf ein neues Collection-Tube gesteckt und 500 µl des 

Waschpuffers AW1 hinein pipettiert. Es wurde nochmals bei 6 000 g für 2 Minuten 

zentrifugiert und danach das Collection-Tube mit dem Inhalt verworfen. Dann wurde 

die DNeasy Mini Spinsäule erneut auf ein neues Collection-Tube gesteckt und 500 µl 

des zweiten Waschpuffers AW2 hinein pipettiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 

20 000 g für 4 Minuten, um die Membran zu trocknen, wonach bei Entnahme der 

DNeasy Mini Spinsäule besondere Vorsicht galt, um die Membran nicht wieder zu 

benetzen. Das Collection-Tube und der Inhalt werden verworfen. Die DNeasy Mini 

Spinsäule wurde auf ein 1,5 ml Reaktionsgefäß platziert und 100 µl des 

Elutionspuffers wurden auf die Membran pipettiert. Abschließend wurde bei 

Raumtemperatur für 1 Minute inkubiert und bei 6 000 g für 2 Minuten zentrifugiert 

um das Extrakt, eine DNA Suspension, aus der Membran zu eluieren. Das eluierte 

Extrakt wurde bei -20 °C gelagert. 

2.10 Master-Mix und real-time PCR 




2.10.1 Master-Mix 

Nach der Methode von Roetschi et al. (2008) wurde für die real-time PCR ein Master- 

Mix aus folgenden Komponenten angefertigt: 

» 2,3 µl PCR-Wasser 

» 5 µl TaqMan ® Universal PCR Master-Mix 

» 0,1 µl Sonde 

» 0,3 µl MelissoF 

» 0,3 µl MelissoR V ges = 8 µl 

Abhängig von der Probenanzahl n wurde die n+1-fache Menge des Master-Mix 

hergestellt. Die Komponenten wurden gut durchmischt. Anschließend wurde ein 

Volumen von 8 µl in jedes Reaktionsgefäß pipettiert und jeweils 2 µl des zu 

untersuchenden DNA-Extraktes (Template) hinzugefügt, so dass ein Volumen von 

10 µl erreicht wurde. Je nach Probenumfang wurden PCR-Strips (ein PCR-Strip = 8 

Reaktionsgefäße) oder PCR-Platten (eine PCR-Platte = 96 Reaktionsgefäße) 

eingesetzt. Als negative Reaktionskontrolle NTC (no template control) diente der 

reine Master-Mix. Die Reaktionsgefäße wurden verschlossen, kurz zentrifugiert, um 

Blasen zu entfernen, und anschließend mittels real-time PCR analysiert. 

Anmerkung: Es ist zu beachten, dass alle Reagenzien während ihrer Handhabung 

gekühlt werden und die lichtempfindliche Sonde dem Licht nur so kurz 

wie möglich ausgesetzt ist. 




2.10.2 Real-time PCR Bedingungen 

PCR-Programm nach Roetschi et al. (2008) 

1. Initial-Denaturierung, 

10 Minuten, 95 °C 

2. Denaturierung, 

15 Sekunden bei 95 °C 

3. Hybridisierungs- und Syntheseschritt, 

1 Minute bei 60 °C mit anschließender Fluoreszenzmessung 

Zyklenzahl: 45 (Programmschritt 2 und 3) 

Laufzeit: ca. 90 Minuten 

Hintergrund: Epp.twin.tec96_10μL weiß 

Farbkalibration: FAM und ROX (als Referenzfarbstoff) 

Abb. 5: Graphische Darstellung des PCR-Programms 




2.11 Etablierung der PCR-Methode 

Für die Etablierung der real-time PCR-Methode an der Abteilung Bienenkunde und 

Bienenschutz (AGES) wurden vier Etablierungsschritte im Rahmen von Vorversuchen 

durchgeführt. 

1. Vergleich selbst hergestellter Extrakte aus „Suspensionen Roetschi“ 

(SR) mit positivem Referenzmaterial (Extrakte Roetschi, ER), 

unverdünnt und 1:10 verdünnt. 

2. Vergleich der Verwendung von Milli-Q ® Reinstwasser und Elutionspuffer 

zum Eluieren der DNA im Extraktionavorgang 

3. Vergleich von mittels Promega Wizard ® Magnetic DNA Purification 

System for Food-Kit aufgereinigten und nicht aufgereinigten Extrakten 

4. Variation der Primer- und Sondenkonzentration im Master-Mix 

2.11.1 Etablierungsschritt 1 

Der erste Schritt sollte überblicksmäßig klären, ob die von Roetschi et al. (2008) 

veröffentlichte real-time PCR-Methode zur Bestimmung von Melissococcus plutonius 

an der Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz reproduzierbar ist. Weiters 

wurde beobachtet, ob Inhibierungen der PCR Reaktion auftreten. 

Hierfür wurde eine Suspension aus Versuchsbienen (negatives Referenzmaterial) 

vorbereitet und diese gemeinsam mit dem positiven Referenzmaterial 

(„Suspensionen Roetschi“, SR) einer DNA-Extraktion unterzogen. Anschließend 

wurden alle gewonnenen Extrakte und jene von Roetschi 1:10 verdünnt. Sowohl die 

Originale als auch die Verdünnungen wurden mittels real-time PCR analysiert. 

Die Ergebnisse (siehe Tabelle 2) zeigten mit einer Ausnahme (SR 3 unverdünnt), 

dass das positive Referenzmaterial als positiv und das negative Referenzmaterial als 

negativ identifiziert werden konnte. Mögliche Gründe für das abweichende Ergebnis 

in der unverdünnten Probe SR 3 kommen sogenannte Inhibitionsfaktoren (diverse die 




PCR-Reaktion inhibierende Inhaltsstoffe) in Frage. In der Probe SR 3 verdünnt 

konnte das positive Ergebnis des Referenzmaterials bestätigt werden. 

Für ER 2 war der von Roetschi ermittelte Ct-Wert höher, für ER 3 niedriger, als der 

von uns ermittelte Wert. 

Die Verdünnungen wirkten sich unterschiedlich aus. SR 3 wurde im unverdünnten 

Zustand negativ getestet, in der 1:10 Verdünnung jedoch positiv. Dies weist auf die 

PCR inhibierende Inhaltstoffe im unverdünnten Material hin. SR 2, ER 2 und ER 3 

lieferten höhere Ct-Werte in verdünnter Form, was durch die niedrigeren DNA 

Mengen zu erwarten war, wenn keine inhibierenden Inhaltstoffe wirken. 

Auch wenn in einem Einzelfall (SR 3) ohne Verdünnung kein positives Ergebnis 

ermittelt und erst durch die Verdünnung eine Detektion ermöglicht wurde, ließ sich 

aus diesem Versuch kein genereller Vorteil einer Verdünnung ableiten. Daher wurde 

in der Folge mit unverdünnten Extrakten gearbeitet. 

Material 

(Extraktion 

Roetschi) 

Analyse 

Roetschi 

Ct-Wert 

Analyse 

BIEN 

Ct-Wert 

Material 

(Extraktion BIEN) 

Analyse 

BIEN 

Ct-Wert 

ER 2 25,69 18,44 SR 2 34,26 

ER 2_1:10 - 22,43 SR 2 1:10 35,32 

ER 3 15,35 29,52 SR 3 negativ 

ER 3_1:10 - 33,00 SR 3 1:10 27,63 

- - - Negativkontrollbienen negativ 

- - - Negativkontrollbienen 

1:10 

Tabelle 2: Etablierungsschritt 1, ermittelte Ct-Werte 

negativ 


Um den Elutionspuffer (Buffer AE) als möglichen Inhibitor abklären zu können, wurde 

dieser bei der DNA-Extraktion der Probe SR 4 durch Milli-Q ® Reinstwasser ersetzt. 

Mit diesen Extrakten wurde in der Originalkonzentration sowie in der 1:10 

Verdünnung eine real-time PCR durchgeführt. 

Wie in Tabelle 3 angeführt, wurde die Positivprobe wurde als positiv und die 

Negativprobe als negativ identifiziert. 




Es zeigte sich, dass die Signale bei den eigenen Messungen (SR 4 und ER 4) erst bei 

späteren Zyklen auftraten, daher höhere Ct-Werte aufwiesen, als die von Roetschi 

übermittelten Werte. 

Die Verdünnungen ergaben gegenläufige Ergebnisse: im Vergleich zum 

Originalextrakt zeigte die Verdünnung (1:10) bei ER 4 höhere Werte, bei SR 4 jedoch 

niedrigere Ct-Werte. 

SR 4 zeigte generell höhere Ct-Werte als ER 4 (Eigenmessung sowie Daten von 

Roetschi). 

Es ergab sich dadurch zwar kein Hinweis, dass der Elutionsbuffer (AE) Inhibierungen 

verursacht haben könnte und die Elution mit Wasser von Vorteil wäre, die 

Echtproben wurden dennoch mit Reinstwasser eluiert. 

Material 

(Extraktion 

Roetschi) 

Analyse 

Roetschi 

Ct-Wert 

Analyse 

BIEN 

Ct-Wert 

Material 


Eluierung mit Milli-Q ® 

Reinstwasser 


Analyse 

BIEN 

Ct-Wert 

ER 4 24,43 28,01 SR 4 35,50 

ER 4_1:10 - 31,97 SR 4 1:10 33,68 

- - - Negativkontrollbienen negativ 

- - - Negativkontrollbienen 

1:10 

negativ 


Im dritten Etablierungsschritt wurde untersucht, ob die Real-time PCR nach 

Aufreinigung höhere Ct-Werte liefert und mögliche inhibierende Inhaltsstoffe 

eliminiert werden können. 

Hierzu wurden Extrakte unter Zuhilfenahme des Promega Wizard ® Magnetic DNA 

Purification System for Food-Kit aufgereinigt, um diese anschließend in gereinigter 

bzw. ungereinigter Form mittels PCR auszuwerten. 




Zusätzlich wurde die DNA-Konzentration aller Proben mit einem NanoDrop ® 

Spektrophotometer bestimmt. 

2.11.3.1 Durchführung der DNA-Aufreinigung mittels Promega Wizard ® Magnetic 

DNA Purification System for Food-Kit nach den Herstellerangaben 

Es wurden 90 µl des DNA-Extraktes in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, 500 µl 

Lysis Buffer A und 5 µl RNase A hinzugefügt und gut vermischt. Weiters wurden 

250 µl Lysis Buffer B hinzugegeben, für 10 – 15 Sekunden geschüttelt und 

nachfolgend für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 750 µl 

Precipitation Solution hinzugefügt, nochmals geschüttelt und für 10 Minuten bei 

13 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß 

überführt, 50 µl MagneSil PMPs, welches zuvor ausreichend geschüttelt worden 

war, hinzu pipettiert und vermischt. Vom vorliegenden Gesamtvolumen ausgehend 

wurden 80 % an Isopropanol zugesetzt, einige Male geschüttelt und anschließend, 

unter zeitweisem Mischen für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. An dieser 

Stelle wurde der Magnetstab für 1 Minute in die Suspension getaucht. Die 

aufgenommenen Magnetkügelchen wurden nun in ein neues Reaktionsgefäß, 

welches 250 µl Lysis Buffer B beinhaltete, übertragen und zur Entwicklung 1 Minute 

belassen. Das zuvor verwendete Reaktionsgefäß wurde samt Inhalt verworfen. Mit 

Hilfe des Magnetstabes wurden die Magnetkügelchen erneut in ein neues 

Reaktionsgefäß, welches mit 1 ml Wash Solution befüllt war, überführt und für 

1 Minute gewaschen. 

Der Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Die dabei angefallenen 

Reaktionsgefäße wurden mit ihrem Inhalt entsorgt. Anschließend wurde der 

Überstand abgezogen und verworfen. Das Sediment wurde anschließend 5 Minuten 

im Vakuumtrockner bei 65 °C getrocknet. Dann wurden 100 µl Milli-Q ® Reinstwasser 

hinzugefügt, geschüttelt und für 5 Minuten bei 65 °C inkubiert. Zuletzt wurden die 

Partikel mittels Magnetstab aus der Lösung abgetrennt und eliminiert. Somit lag die 

aufgereinigte DNA in wässriger Lösung vor. 




Anmerkung: Zu Beginn wurden - ausgehend vom vorliegenden Volumen des 

Überstandes - 80 % an Isopropanol zugesetzt, wodurch das 

Fassungsvermögen des 2 ml Reaktionsgefäßes überschritten worden 

wäre. Aus diesem Grund wurde das Gemisch auf zwei Reaktionsgefäße 

aufgeteilt und die nachfolgenden Schritte parallel ausgeführt, wobei die 

Inhalte nach dem letzten Waschschritt wieder vereinigt wurden. 

2.11.3.2 Ergebnisse der DNA-Aufreinigung mittels Promega Wizard ® Magnetic 

DNA Purification System for Food-Kit 

Die Ergebnisse der NanoDrop ® -Messung (siehe Tabelle 4) zeigten eine Reduktion der 

DNA-Konzentration nach der Durchführung der Aufreinigung. 

Anhand der PCR-Resultate (siehe Tabelle 4) konnte erneut bei Probe SR 3 

ungereinigt eine Inhibition beobachtet werden. 

Das gereinigte Extrakt von SR 3 erbrachte jedoch ein positives Ergebnis. Die Ct- 

Werte der gereinigten und ungereinigten Extrakte von SR 2 waren fast gleich. Bei 

SR 4 führte die Aufreinigung zu einem höheren Ct-Wert. Aufgrund der teilweise 

gegenläufigen Auswirkungen auf die Messergebnisse (Ct-Werte) und den 

zusätzlichen Arbeitsschritten und Kosten fand die DNA-Aufreinigung keine weitere 

Anwendung. 

Material 


Analyse 

BIEN 

Ct-Wert 

Nukleinsäurekonzentration 

ng/µl 

SR 2 gereinigt 24,30 37,13 

SR 2 ungereinigt 162,00 37,71 


SR 3 ungereinigt 456,70 Negativ 


SR 4 ungereinigt 1049,80 34,32 

Tabelle 4: Etablierungsschritt 3, Nukleinsäurekonzentrationen und Ct-Werte 





Schritt 4 diente zur Ermittlung der optimalen Sonden- und Primerkonzentration im 

Master-Mix, um bestmögliche Messsignale zu erhalten. 

Es wurden vier Varianten der Master-Mix-Zusammensetzung getestet: 

a) 0,1 µl Sonde und jeweils 0,3 µl der Primer (nach Roetschi et al., 2008) 

b) 0,1 µl Sonde und jeweils 0,5 µl der Primer 

c) 0,05 µl Sonde und jeweils 0,5 µl der Primer 

d) 0,05 µl Sonde und jeweils 0,3 µl der Primer 

Die Auswertung der PCR zeigte ein bestmögliches Signal mit den niedrigsten Ct- 

Werten bei Variante a (siehe Tabelle 5). 

Probenbezeichnung Variante Ct-Wert 

ER 2 a 31,06 

b 31,13 

c 36,34 

d 43,60 

ER 3 a 20,13 

b 20,46 

c 26,36 

d 31,88 

ER 4 a 29,27 

b 30,20 

c 34,73 

d 38,00 


2.11.5 Aufgetretene Probleme und ihre Lösung 

Bei der Vorbereitung der Analyseproben ist während eines Zentrifugiervorganges 

eines der Probengefäße geplatzt. Wahrscheinlich war das Gefäß bereits beschädigt. 

Aus diesem Grund wurde die Zentrifuge nach einer äußerst gründlichen Reinigung 

und Desinfektion auf Kontamination geprüft. Hierfür wurden drei Wasserproben als 




Negativproben im Rahmen eines Kontrollversuches zentrifugiert, anschließend 

extrahiert und eine real-time PCR durchgeführt. 

Diese Wasserproben ergaben durchwegs negative Ergebnisse. Daraus ließ sich 

ableiten, dass keine weitere Gefahr einer Kontamination bestand und die Arbeiten 

konnten fortgesetzt werden. 

2.12 Erreger-Nachweis in Bienenproben aus Österreich 

Nachdem die Methode nach Roetschi et al. (2008) erfolgreich an der Abteilung für 

Bienenkunde und Bienenschutz etabliert worden war, konnte mit der eigentlichen 

Untersuchung zum möglichen Vorkommen von Melissococcus plutonius begonnen 

werden. 

Hierzu wurden aus den 51 Bienenproben Suspensionen hergestellt und diese 

nachfolgend einer DNA-Extraktion unterzogen. Es wurden pro Extraktionsdurchgang 

jeweils 12 der zu untersuchenden Proben gemeinsam mit einer Negativ- (nur 

Reagenzien) und einer Positivprobe (Referenzmaterial: Bienen Roetschi) verarbeitet. 

Im Anschluss daran wurde eine real-time PCR durchgeführt. Insgesamt wurden 

sieben PCR- Durchgänge (siehe 4.1) durchgeführt. 

Neun Proben wurden zweimal extrahiert (EFB_43 bis EFB_51), um die 

Extraktionseffizienz zu testen. 

Grundsätzlich wurden 4 PCR-Läufe pro Probenextrakt mit jeweils einer Wiederholung 

pro PCR-Lauf durchgeführt. In einigen Fällen mit unklaren Ergebnissen erfolgten 

weitere PCR-Läufe, um die Ergebnisse abzusichern. 3 Proben (EFB_3, EFB_29, 

EFB_36) wurden im PCR-Durchgang Nr. 4 jeweils in 4 Wiederholungen getestet. 

3 Ergebnisse 

In 14 von 51 (= 27,5 %) untersuchten Proben konnte die DNA des Erregers 

Melissococcus plutonius nachgewiesen werden. Fünf dieser Proben wurden aufgrund 




des ermittelten Ct-Wertes < 40 als „nachweisbar“ für DNA von Melissococcus 

plutonius und neun Proben als „schwach nachweisbar“ (Ct-Werte ≥ 40) eingestuft. In 

37 Proben war Melissococcus plutonius nicht nachweisbar (siehe Tabelle 6). 

Legende zu Tabelle 6: 

Neg. negativ 

- nicht durchgeführt 

Farbcodierung: 

Nicht nachweisbar (nicht n.) 

Nachweisbar, Ct-Werte < 40 

Schwach nachweisbar (schwach n.), Ct-Werte ≥ 40 





PCR-Durchgang 

1 2 3 4 5 6 7 

Ergebnis 

EFB_1 Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. - - Nicht n. 


EFB_3 Neg. Neg. 40,13 Neg.* Neg. - - Schwach n. 









EFB_12 22,47 23,31 23,00 23,29 24,22 - - nachweisbar 




EFB_16 Neg. Neg. Neg. 40,48 41,05 - Neg. Schwach n. 


EFB_18 Neg. 41,58 Neg. Neg. 40,86 - Neg. Schwach n. 

EFB_19 Neg. Neg. Neg. 40,79 Neg. - Neg. Schwach n. 

EFB_20 Neg. Neg. Neg. 40,70 Neg. - Neg. Schwach n. 









EFB_29 Neg. Neg. 43,79 Neg.* - - - Schwach n. 

EFB_30 Neg. Neg. Neg. Neg. - - - Nicht n. 

EFB_31 Neg. Neg. Neg. 42,89 - 41,31 Neg. Schwach n. 





Tabelle 6, Teil 1: Ergebnisse der durchgeführten PCR-Läufe mit Echtproben 





PCR-Durchgang 

1 2 3 4 5 6 7 

Ergebnis 

EFB_36 Neg. Neg. 41,22 Neg.* - 42,05 Neg. Schwach n. 







EFB_43 41,59 Neg. Neg. Neg. - - - Schwach n. 









EFB_43_2 - Neg. Neg. Neg. - Neg. - 









Tabelle 6, Teil 2: Ergebnisse der durchgeführten PCR-Läufe mit Echtproben und 

Ergebnisse 

* 4 Wiederholungen, stets negativ 

3.1 Ergebnis der Untersuchungen von Bienenproben aus 

Österreich nach Bundesländern 

In 14 der 51 untersuchten Bienenproben war DNA der Erregers Melissococcus 

plutonius nachweisbar. Die Ergebnisse waren nach Bundesländern unterschiedlich 

verteilt. 




Die Abb. 6 zeigt die Herkunft der positiven und negativen Proben nach 

Bundesländern. 

Abb. 6: Ergebnisse des Erreger-Nachweises in Bienenproben aus den Bundesländern 

Österreichs 

DNA des Erregers war in vier Proben aus Tirol (EFB 12, EFB 13, EFB 15 und EFB 17; 

Ct-Werte zwischen 21,98 und 32,16) und in einer Probe aus Salzburg (EFB 21; Ct- 

Werte zwischen 34,17 und 36,06) „nachweisbar“. Neun Proben wurden als positiv mit 

dem Ergebnis „schwach nachweisbar“ eingestuft. Diese Proben stammten aus 

Burgenland (EFB 3 und EFB 43; Ct-Werte zwischen 40,13 und 41,59), 

Niederösterreich (EFB 36, Ct-Werte zwischen 41,22 und 42,05), Oberösterreich (EFB 

19 und EFB 29; Ct-Werte zwischen 40,79 und 43,79), Kärnten (EFB 31; Ct-Werte 

zwischen 41,31 und 4,89), Salzburg (EFB 18; Ct-Werte zwischen 40,86 und 41,58) 

und Tirol (EFB 16 und EFB 20; Ct-Werte zwischen 40,48 und 41,05). 




In Abb. 7 werden die regionale Herkunft der Proben und die Ergebnisse dargestellt. 

Abb. 7: Ergebnisse des Erreger-Nachweises in Österreich, geografisch dargestellt 

3.2 Symptombeschreibung und Untersuchungsergebnis 

Abbildung 8 zeigt eine Zusammenschau der von den ImkerInnen an den beprobten 

Völkern beobachteten Symptome mit den Analyseergebnissen. Von insgesamt 14 

Völkern mit klinischen EFB-Symptomen, war in 6 Fällen der Test auf DNA des 

Erregers Melissococcus plutonius positiv („nachweisbar“ oder „schwach 

nachweisbar“). Bei 35 beprobten Völkern wurden keine Symptome festgestellt, davon 

war in 7 Fällen der EFB-Erregerbefund positiv ( „nachweisbar“ oder „schwach 

nachweisbar“). Zu zwei Bienenproben wurden keine Angaben bezüglich der 

Symptomatik gemacht. In einer dieser Proben wurde ebenfalls DNA des Erregers 

Melissococcus plutonius nachgewiesen. 




Abb. 8: Symptombeschreibung durch die ImkerInnen und Untersuchungsergebnis 

4 Diskussion 

Im Vergleich von positiven (von Frau Dr. Alexandra Roetschi zur Verfügung gestellt) 

und negativen Referenzproben konnte die analytische Spezifität der an der Abteilung 

für Bienenkunde und Bienenschutz implementierten real time PCR zum Nachweis von 

Melissococcus plutonius bestätigt werden. 

Anhand der unterschiedlichen Ct-Werte war auch eine relative Quantifizierung der 

Erregermenge möglich (Ct-Werte < 40 = „nachweisbar; Ct-Werte ≥ 40 = „schwach 

nachweisbar“). 

Weitere Schritte für eine absolute Quantifizierung – inklusive Ermittlung der 

Nachweis- und Bestimmungsgrenze - waren nicht Ziel dieser Arbeit und wurden 

nicht durchgeführt. 

Die Ergebnisse zeigten, dass Melissococcus plutonius an Bienen aus österreichischen 

Beständen in unterschiedlicher Häufigkeit und Menge zu finden ist. 




Bei den Proben mit Ct-Werten ≥ 40 ist von sehr niedriger Bakterienmenge 

auszugehen, bei der laut Roetschi (2011, persönliche Mitteilung) kein klinischer 

Krankheitsausbruch zu erwarten ist. 

Budge et al. (2010) zeigten, dass Bienen aus symptomfreien Völkern aus Ständen 

ohne erkrankte Völker in signifikant geringerem Ausmaß positive Erregernachweise 

für Melissococcus plutonius aufwiesen, als Bienen aus symptomlosen Völkern auf 

Ständen mit erkrankten Völkern. Daher ist in Hinblick auf EFB der Bienenstand als 

epidemiologische Einheit zu betrachten. 

Die hohe Sensitivität des Erregernachweises auf Bienen bietet eine Möglichkeit der 

Früherkennung einer potentiellen Gefährdung, aber auch eine Möglichkeit der 

Überprüfung des Erfolges einer Sanierung. 

Bei den der Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz durchgeführten 

Untersuchungen waren in den letzten Jahren nur vereinzelt positive EFB-Befunde 

aufgetreten. Von 89 im Zeitraum 2006 bis Ende 2011 auf EFB untersuchten 

Brutproben waren lediglich bei zwei Proben EFB-Symptome aufgetreten und der PCR- 

Nachweis für Melissococcus plutonius positiv (Derakhshifar, 2012, unveröffentlicht). 

Ein länger zurückliegender Fall lag in Oberösterreich, der jüngste Fall lag in Tirol 

(Frühjahr 2011). Im Umfeld dieses Tiroler Betriebes erfolgte im Rahmen dieser Arbeit 

eine verdichtete Probenahme. Hier war der Erreger der EFB in vier der elf 

untersuchten Proben „nachweisbar“, in einer Probe „schwach nachweisbar“. Sowohl 

Bienenproben aus symptomlosen Völkern als auch aus Völkern mit Symptomen 

waren positiv. Dieser Befund zeigt klar eine erhöhte Prävalenz des Erregers in dieser 

Region mit einem klinischen Ausbruch der Erkrankung. 

Die Hypothese, dass in Vorarlberg aufgrund der Nähe zur Schweiz, in der EFB 

gehäuft auftritt, ein Vorkommen des EFB-Erregers wahrscheinlicher wäre, konnte 

nicht bestätigt werden. In keiner der 5 Proben aus Vorarlberg wurde DNA von 

Melissococcus plutonius nachgewiesen. Für eine statistisch abgesicherte Aussage 

wäre allerdings ein wesentlich größerer Stichprobenumfang erforderlich. 




In der vorliegenden Arbeit bestand ein klarer Zusammenhang zwischen der 

Beobachtung klinischer Symptome durch die ImkerInnen (lückiges Brutnest, 

Erscheinungsbild der unverdeckelten Brutstadien) und dem Erreger-Nachweis. Bei 

Völkern mit klinischen Anzeichen der EFB-Erkrankung konnte das Vorkommen von 

Melissococcus plutonius in den Völkern anhand der Bienenproben in 43 % der Fälle 

bestätigt werden. Hingegen war der Erreger-Nachweis aus Völkern ohne klinische 

Symptome nur in 20 % der Fälle positiv. Ein lückenhaftes Brutnest ist somit als 

wesentliches Indiz für ein mögliches Erregervorkommen zu werten und sollte immer 

beachtet werden und Anlass für weitergehende Untersuchungen auf Brutkrankheiten 

(z.B. Amerikanische Faulbrut, Europäische Faulbrut, Sackbrut, Kalkbrut, Erkrankung 

durch starken Varroabefall oder das Akute Bienenparlayse Virus) sein. 

Grundsätzlich sollten aus Gründen der Krankheitsvorbeugung keine Jungvölker aus 

Völkern mit unruhigem Brutbild gebildet werden und derartige Völker nicht als Zuchtbzw. 

Pflegevölker in der Königinnenzucht verwendet werden. 

Hinsichtlich des Krankheitsverlaufes gibt es für die weltweit verbreitete (Bradbear 

1988, zitiert nach Bailey & Ball, 1991) Europäische Faulbrut unterschiedliche 

Berichte. Diese reichen von letalem Verlauf bis zur Möglichkeit der Selbstheilung 

eines Volkes unter günstigen Bedingungen. 

Da der Erreger unabhängig von der geographischen Herkunft genetisch sehr 

homogen ist und die Variationen der Virulenz von Isolaten gering sind, sind diese 

Unterschiede des Krankheitsverlaufes wohl in den Bienenpopulationen und/oder den 

imkerlichen Maßnahmen begründet (Forsgren, 2010). Dazu sind jedoch weitere 

wissenschaftliche Untersuchungen vonnöten. 

Hinsichtlich Desinfektionsmaßnahmen gibt es interessante Ergebnisse von Charrière 

& Roetschi (2012) aus Kontaminierungsversuchen mit Melissococcus plutonius. 

Dabei zeigte sich, dass die Infektiösität bei Auftrag der Bakteriensuspension auf Holz 

nach einem Jahr Lagerung bei -20° C nicht abnahm, während dies bei 4 °C und bei 

Raumtemperatur in hohem Ausmaß der Fall war. Der Wildstamm zeigte eine 




Reduktion der Bakterien um den Faktor 10 2 , der Typstamm zeigte keine Infektiosität 

mehr. 

Auch im Honig (sowohl Nektar- als auch Honigtauhonig) waren nach einem Jahr 

keine infektiösen Bakterien des Melissococcus plutonius Wildstammes und des 

Typstammes mehr nachweisbar. Dies zeigt, dass bei Sanierungsmaßnahmen bei 

Europäischer Faulbrut dem Faktor Zeit eine große Rolle zukommen kann. 

Grundsätzlich ist mit der Infektiosität von kontaminiertem imkerlichen Material über 

mehrere Monate ist zu rechnen, allerdings wird das infektiöse Bakterienreservoir 

vermindert, wenn beispielsweise Beutenmaterial zumindest ein Jahr nicht in der 

Imkerei verwendet wird. 

Insgesamt zeigt das Ergebnis der vorliegenden Arbeit, dass Melissococcus plutonius, 

der Erreger der Europäischen Faulbrut, in österreichischen Bienenbeständen 

vorkommt. Da für EFB keine Anzeigepflicht besteht und bisher keine systematischen 

Untersuchungen zum Vorkommen von klinischen Symptomen bzw. des Erregers an 

Brut und Bienen durchgeführt wurden, können über die Prävalenz bzw. zur 

möglichen wirtschaftlichen Bedeutung der EFB keine präzisen Aussagen gemacht 

werden. Da von Imkerseite nur sehr sporadisch Verdachtsmeldungen auf EFB 

einlangen bzw. an den von den Amtstierärzten eingesandten Brutproben an die 

Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz Brutproben - auch in AFB-negativen 

Fällen - äußerst selten klinische Symptome der EFB erkennbar sind, dürfte diese 

Erkrankung in Österreich, im Gegensatz beispielsweise zur Schweiz, kein 

wirtschaftliches Problem darstellen. 

5 Zusammenfassung 

Im Rahmen des Projektes wurde das mögliche Vorkommen von Melissococcus 

plutonius, des Erregers der Europäischen Faulbrut (EFB) bei Bienen, in Österreich 

untersucht. Anlass zu diesen Analysen war das verbreitete Auftreten der Erkrankung 

in manchen Teilen der Schweiz, aus dem sich die Frage ableitete, ob dieser Erreger 

auch in Österreich in Bienenvölkern nachweisbar ist. 




Im ersten Schritt wurde an der Abteilung Bienenkunde und Bienenschutz der AGES 

eine molekularbiologische Methode (Real-time PCR) (nach Roetschi et al., 2008) zum 

Erregernachweis etabliert. Zur Methodenvalidierung diente von Frau Dr. Alexandra 

Roetschi (Zentrum für Bienenforschung, Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld- 

Posieux ALP, Liebefeld, CH-3003 Bern) zur Verfügung gestelltes positives 

Referenzmaterial (Bienen, Suspensionen, DNA-Extrakte) aus der Schweiz. 

Im zweiten Schritt diente diese Methode dann zur Analyse der insgesamt 51 

Bienenproben, die von österreichischen Imkern und Imkerinnen aus allen neun 

Bundesländern zur Verfügung gestellt worden waren. Schwerpunkte der Probenahme 

lagen im Grenzgebiet zur Schweiz (Vorarlberg) und in der Umgebung eines 

nachweislich an EFB erkrankten Volkes (Tirol). Nähere Details zu den Proben, deren 

Herkunft und zum Zustand der Völker wurden mit Hilfe eines an die ImkerInnen 

übermitteln Fragebogens erhoben. 

Bei 14 der 51 untersuchten Bienenproben (28 %) brachte die Analyse ein positives 

Ergebnis, das heißt, die DNA des Erregers war nachweisbar. Fünf dieser Proben 

wurden als „nachweisbar“ (Ct-Wert < 40), neun als „schwach nachweisbar“ (Ct-Wert 

≥ 40), eingestuft. Bei 37 Proben (72 %) war das Untersuchungsergebnis negativ. Bei 

6 der 14 positiven Proben (43 %) hatten die ImkerInnen auf den Fragebögen 

angegeben, dass bei den Völkern klinische Symptome an der Brut vorhanden waren. 

Dieses Ergebnis zeigt, dass der Erreger der Europäischen Faulbrut in Österreich 

vorkommt. Zur Häufigkeit des Auftretens einer EFB-Erkrankung liegen keine 

offiziellen Zahlen vor, da die Europäische Faulbrut in Österreich nicht anzeigepflichtig 

ist (Bienenseuchengesetz 1988, Novelle 2005, BSG). 




6 Danksagung 

Wir möchten uns bei all jenen bedanken, die direkt oder indirekt zur Entstehung 

dieses Projektes in Form fachlicher oder anderweitiger Unterstützung beigetragen 

haben. 

Besonderer Dank gilt Frau Dr. Alexandra Rötschi (Zentrum für Bienenforschung, 

Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP, Liebefeld, CH-3003 Bern) für 

das Bereitstellen von Proben und den offenen und sehr freundlichen 

Informationsaustausch. 

Dank gilt ebenfalls dem Imkerdachverband „Biene Österreich“ und dem BMLFUW für 

die Bereitstellung der Förderung aus der Sonderrichtlinie 1234/2007 

(Imkereiförderung). 

Sehr herzlich möchten wir uns bei all jenen Imkern, Imkerinnen und Bienen 

Österreichs herzlich bedanken, ohne die dieses Projekt nicht möglich gewesen wäre. 




7 Abkürzungen und Begriffserklärungen 

AGES: Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit 

BGBl.: Bundesgesetzblatt 

BIEN: Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz, AGES 

BSG: Bienenseuchengesetz 

Ct-Wert: cycle threshold (Beginn des exponentiellen Anstiegs der Kurve) 

DNA: Desoxyribonukleinsäure 

FAM: carboxyfluorescein 

MGB: dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder 

NFQ: Non fluorescent quencher 

PCR: Polymerase Chain Reaction 

vH: von Hundert 

Collection-Tube: Sammel-Röhrchen 

Extraction Bag: Kunststoffsäckchen zur Probenaufarbeitung 

Spinsäule: Zentrifugationssäule 

Tube Rack: Gestell für Reaktionsgefäße 

Tube: Reaktionsröhrchen (meist 0,5 bis 2 ml) 

Anmerkung: Im Text wurden etliche in der Laborpraxis gängige Anglizismen 

verwendet, da diese häufig von Herstellern von Laborgeräten oder Bedarfsprodukten 

genannt werden und somit eine unmittelbare Zuordnung erlauben. 




8 Literatur 

AGES (2008) Merkblatt: Amerikanische Faulbrut, URL: 

http://www.ages.at/uploads/media/Merkblatt_Europaeische_Faulbrut_Nov_2008.pdf 

Zugriff: August 2013 

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Zugriff: August 2013 

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Bailey L. (1957) The isolation and cultural characteristics of Streptococcus pluton and 

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European foulbrood control measures, Journal of invertebrate Pathology 105, 164- 

170 

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cultivation of a new Bacillus (B. alvei), the cause of a disease of the hive bee hitherto 

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Ritter W. (1996) Diagnostik und Bekämpfung der Bienenkrankheiten, Gustav Fischer 

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of Systematic Bacteriology 48, 615. Zitiert nach Roetschi et al. (2008) 




Tschumi, M. (2011) Sanierung der Sauerbrut auf einem Bienenstand, URL: 

http://www.agroscope.admin.ch/imkerei/00316/00325/index.html?lang=de, Zugriff: 

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White G. F. (1912) The cause of European foulbrood, Circular U. S. Department of 

Agriculture 157, 1-15. 




9 Anhang 

9.1 Fragebogen 




Fragebogen 

„Projekt: Mögliches Vorkommen von Melissococcus plutonius“ 

1 Persönliche Angaben (Imker, Imkerin) 

Name: 

Straße: 

PLZ: 

Ort: 

Telefon: 

E-Mail: 

mobil: 

Fax: 

Hausnummer: 

2 Angaben zum Bienenstand 

Bezeichnung des Bienenstandes: 

PLZ-Standgemeinde: 

Katastralgemeinde: 

Bezirk: 

Seehöhe (m): ………………… 

Standgemeinde: 

Bundesland: 

3 Datum der Probenahme: …………………… Volk Nr.: ………………… 

4 sind Symptome der Europäischen Faulbrut am beprobten Volk zu beobachten? 

(zutreffendes ankreuzen) 

verdrehte Rundmaden eingesunkene Zelldeckel löchrige Zelldeckel 

lückiges Brutnest stehengebliebene Zellen lockersitzende Schorfe 

sonstige Anmerkungen: 

………………………………………………………………………………………………………………………. 

………………………………………………………………………………………………………………………. 

………………………………………………………………………………………………………………………. 

Gerne stehen wir Ihnen für Rückfragen zur Verfügung. (E-Mail: 

bienen@ages.at ) 

Tel: Dr. Moosbeckhofer: 050 555/33121 oder 0664/839 80 69 

Dr. Derakhshifar: 050 555/33122 

DI Köglberger: 050 555/33127

Abschlussbericht (pdf) - AGES

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