Abschlussbericht (pdf) - AGES

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2.11 Etablierung der PCR-Methode
Für die Etablierung der real-time PCR-Methode an der Abteilung Bienenkunde und
Bienenschutz (AGES) wurden vier Etablierungsschritte im Rahmen von Vorversuchen
durchgeführt.
1. Vergleich selbst hergestellter Extrakte aus „Suspensionen Roetschi“
(SR) mit positivem Referenzmaterial (Extrakte Roetschi, ER),
unverdünnt und 1:10 verdünnt.
2. Vergleich der Verwendung von Milli-Q ® Reinstwasser und Elutionspuffer
zum Eluieren der DNA im Extraktionavorgang
3. Vergleich von mittels Promega Wizard ® Magnetic DNA Purification
System for Food-Kit aufgereinigten und nicht aufgereinigten Extrakten
4. Variation der Primer- und Sondenkonzentration im Master-Mix
2.11.1 Etablierungsschritt 1
Der erste Schritt sollte überblicksmäßig klären, ob die von Roetschi et al. (2008)
veröffentlichte real-time PCR-Methode zur Bestimmung von Melissococcus plutonius
an der Abteilung für Bienenkunde und Bienenschutz reproduzierbar ist. Weiters
wurde beobachtet, ob Inhibierungen der PCR Reaktion auftreten.
Hierfür wurde eine Suspension aus Versuchsbienen (negatives Referenzmaterial)
vorbereitet und diese gemeinsam mit dem positiven Referenzmaterial
(„Suspensionen Roetschi“, SR) einer DNA-Extraktion unterzogen. Anschließend
wurden alle gewonnenen Extrakte und jene von Roetschi 1:10 verdünnt. Sowohl die
Originale als auch die Verdünnungen wurden mittels real-time PCR analysiert.
Die Ergebnisse (siehe Tabelle 2) zeigten mit einer Ausnahme (SR 3 unverdünnt),
dass das positive Referenzmaterial als positiv und das negative Referenzmaterial als
negativ identifiziert werden konnte. Mögliche Gründe für das abweichende Ergebnis
in der unverdünnten Probe SR 3 kommen sogenannte Inhibitionsfaktoren (diverse die
Projekt: Molekularbiologische Untersuchungen zum möglichen Vorkommen von Melissococcus plutonius (Erreger der
Europäischen Faulbrut) an Bienen in Österreich