Abschlussbericht (pdf) - AGES
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2.9 DNA-Extraktion mittels Qiagen DNeasy ® Blood & Tissue-Kit<br />
Die im Reaktionsgefäß enthaltenen 1,5 ml des Überstandes der Bienensuspension<br />
wurden bei 20 000 g für 2 Minuten zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Der<br />
Überstand wurde verworfen, das Pellet in 180 µl enzymatischem Lysis Puffer, zu dem<br />
zuvor Lysozym (20 mg/ml) zugesetzt worden war, suspendiert und eine Stunde bei<br />
37 °C inkubiert. Darauffolgend wurden 25 µl Proteinase K und 200 µl Buffer AL<br />
hinzugefügt, gut geschüttelt und 30 Minuten lang bei 56 °C inkubiert. Anschließend<br />
wurden 200 µl Ethanol (99,8 %) zugesetzt und erneut geschüttelt. Die erhaltene<br />
Suspension wurde in eine DNeasy Mini Spinsäule, welche in einem 2 ml Collection-<br />
Tube (beides im Kit enthalten) platziert ist, überführt und bei 6 000 g für 2 Minuten<br />
zentrifugiert. Das Collection-Tube samt Inhalt wurden verworfen. Die DNeasy Mini<br />
Spinsäule wurde auf ein neues Collection-Tube gesteckt und 500 µl des<br />
Waschpuffers AW1 hinein pipettiert. Es wurde nochmals bei 6 000 g für 2 Minuten<br />
zentrifugiert und danach das Collection-Tube mit dem Inhalt verworfen. Dann wurde<br />
die DNeasy Mini Spinsäule erneut auf ein neues Collection-Tube gesteckt und 500 µl<br />
des zweiten Waschpuffers AW2 hinein pipettiert. Es folgte eine Zentrifugation bei<br />
20 000 g für 4 Minuten, um die Membran zu trocknen, wonach bei Entnahme der<br />
DNeasy Mini Spinsäule besondere Vorsicht galt, um die Membran nicht wieder zu<br />
benetzen. Das Collection-Tube und der Inhalt werden verworfen. Die DNeasy Mini<br />
Spinsäule wurde auf ein 1,5 ml Reaktionsgefäß platziert und 100 µl des<br />
Elutionspuffers wurden auf die Membran pipettiert. Abschließend wurde bei<br />
Raumtemperatur für 1 Minute inkubiert und bei 6 000 g für 2 Minuten zentrifugiert<br />
um das Extrakt, eine DNA Suspension, aus der Membran zu eluieren. Das eluierte<br />
Extrakt wurde bei -20 °C gelagert.<br />
2.10 Master-Mix und real-time PCR<br />
Projekt: Molekularbiologische Untersuchungen zum möglichen Vorkommen von Melissococcus plutonius (Erreger der<br />
Europäischen Faulbrut) an Bienen in Österreich
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