Bakterien
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<strong>Bakterien</strong>
Entdeckung der genetischen Transformation<br />
Prokaryoten nehmen aus ihrer Umgebung<br />
oft genetischen Material auf um ihren<br />
Genom verändern zu können – Adaptation<br />
zur veränderten Umgebung<br />
Entdeckung des Gentransfers:<br />
Frederick Griffith, 1928,<br />
Streptococcus pneumoniae<br />
DNA ist das genetische Material: Oswald<br />
Avery (MacLeod und McCarty) 1944<br />
Streptococcus<br />
Riesige Bedeutung in der Medizin:<br />
Verbreitung der Antibiotikaresistenz und<br />
der Pathogenität
Allgemeine Genpool der <strong>Bakterien</strong><br />
E. coli Stämme können bis zu 30-40% Unterschiede in ihrem Genom haben –<br />
trotzdem sind alle E. coli<br />
Das menschliche Genom und das der Maus heben weniger als 30-40 %<br />
Unterschiede.<br />
In den <strong>Bakterien</strong> können in nur wenigen Generationen neue metabolischen<br />
Wege erscheinen und Gene verlohren gehen<br />
Im Genom von zwei, genetisch sehr unterschiedlichen <strong>Bakterien</strong> können bis zu<br />
60-70 % homologe Gene anwesend sein!<br />
Der Begriff „Species” ist im Fall von <strong>Bakterien</strong> sinnlos:<br />
OTU = operational taxonomic unit, aufgrund 16S rRNA Gensequenzen<br />
Vertikaler und horizontaler Gentransfer:<br />
DNA aus der Umgebung<br />
Gene die evolutionsmässig vorteilhaft sind verbreiten sich unter Mikroorganismen<br />
„wertlose” Gene gehen schnell verloren<br />
Die Tatsache, dass die natürliche Transformation in unter verschiedene Bedingungen<br />
lebende <strong>Bakterien</strong> detektiert wurde (inkl. Archaea) lasst vermuten, dass die<br />
Transformationsfähigkeit während der Evolution früh entstanden ist.
Tree of Life aufgrund 16S rRNA Gene<br />
Sogar ausgestorbene Arten<br />
passen in dieses System<br />
Prokaryote Archea können<br />
klar unterscheidet werden<br />
Carl Woese
Prokaryot-Zellen bei 0, 37 und 130 °C
Gene die sich an die Umwelt anpassen
Das bakterielle Metagenom<br />
Die Nummer von bakteriellen OTUs in dem menschlichen Körper wird ungefähr auf 40 000<br />
geschätzt. Ein durchschnittliches Bakterium besitzt etwa 4-5 Tausend Gene (0.5 -10 000 )<br />
• Man vermutet, dass sie über fast 200 Millionen Gene verfügen, 10 000-mal so viel wie<br />
wir Menschen<br />
• In der Wirklichkeit kodieren warscheinlich nur weniger als eine Millionen bakteriellen<br />
Gene : sie haben viele<br />
Homologen Gene<br />
(Gene die eine positive<br />
Selektion ausüben werden<br />
in mikrobialen Populationen<br />
schnell verbreitet, sogar in<br />
genetisch nicht-verwandten<br />
Zellen)<br />
Unterschiedliche „Spezien”<br />
die in ähnlicher Umgebung<br />
leben entwickeln einen<br />
ähnlichen Metabolismus:<br />
konvergente Evolution
Gen-Aufspürung, eine neue bioinformatische Methode kann alte<br />
horizontale Genübertragungsmomente auch unter sehr<br />
unterschiedlichen Arten aufspüren<br />
Das endosymbiotische Bakterium Wolbachia hat Teile seines Genoms in zahlreiche<br />
Stämme von Drosophila ananassae, die Wespe Nasonia und der Wurm Brugia malayi<br />
eingebracht
Transfer von Gene, mobile Gene<br />
• Manche Gene werden zwischen verschiedenen Zellen<br />
durch randome Ereignisse übergebracht<br />
(DNA von toten Zellen wird aufgenommen und integriert<br />
von lebendigen Zellen)<br />
• Andere Gene „bewegen” sich ständig (Transposone),<br />
oder sie vermehren sich (Retrotransposone) um ihre<br />
Chance in andere Zellen gelingen zu können zu vergrössern<br />
• Gene sind entstanden welche für Proteine kodieren die<br />
solche Strukturen (sex pili) formen die den Transfer<br />
zwischen Zellen ermöglichen<br />
• Gengruppen wurden entwickelt die das eigene<br />
Überleben sichern, falls die Wirtszelle sterben sollte<br />
(lysogene Phagen)<br />
• mehrere egoistische Gene benutzen den Wirt nur damit<br />
sie sich vermehren können<br />
(bacterielle Viren = Bacteriophage)
Genaustausch unter Prokaryoten<br />
Transformation:<br />
Aufnahme von DNA aus<br />
(toten) Zellen<br />
Konjugation:<br />
Transfer von DNA<br />
(unter lebendigen Zellen)<br />
Transduktion:<br />
Genübertragung<br />
(durch Infektion)
„Markern” von <strong>Bakterien</strong><br />
prototroph - „wilder Typ" <strong>Bakterien</strong> haben minimale Nahrungsbedingungen,<br />
charakteristisch für die Arten (oft: nur Wasser, anorganische Salze, C = Energie und N<br />
Quelle).<br />
Minimale Bedingungen können variieren (Stickstoff fixation, Photosynthese, anaerobe<br />
Umstände, usw.) Pathogene Organismen benötigen in der Regel viele komplexe Zutaten.<br />
auxotroph – mutanter Stamm, benötigt bestimmte Zutaten die von dem wilden Typ nicht<br />
benötigt werden.<br />
Genetische Markern:<br />
Resistenz<br />
Antibiotika, Faktore aus der Umgebung:<br />
Osmose, pH,Schwermetalle, UV, Hitze,<br />
Detergente, Phagen<br />
Andere: Farbe, Bewegungsfähigkeit,<br />
Plaquemorphologie, Enzyme
„Markern” von <strong>Bakterien</strong><br />
Sichtbare Markern<br />
wildes and mutantes Wachsen ist anders: Kolonie Grösse,<br />
wild und mutant weisen Enzymunerschiede auf, andere Metaboliten: Farbe oder Färbung<br />
selektierbare Markern<br />
permissive und restriktive Medien, Umstände<br />
wildes oder mutantes Allel bedeutet selektiven Vorteil
<strong>Bakterien</strong>genetik
Die erste „Kreuzung” der <strong>Bakterien</strong>:<br />
rekombination (Lederberg & Tatum)<br />
Die Stämme A und B<br />
wurden gemeinsam in<br />
einer Flüssigkultur vermehrt<br />
Prototrophe <strong>Bakterien</strong> sind<br />
mit 10-7Wahrscheinlichkeit<br />
Entstanden<br />
Weder Stamm A noch B können<br />
auf Minimalmedium wachsen<br />
Biotin: Vitamin H<br />
Thiamin: Vitamin B1
Entdeckung der Konjugation<br />
U-tube Experiment - William Hayes, 1953<br />
Der filter erlaubt den Austausch von<br />
subzellulären Materialien,verhindert aber die<br />
Vermischung der Zellen.<br />
Keine Rekombination detektiert (keine<br />
prototrophe Kolonien).<br />
Formation von Rekombinanten benötigt<br />
physischen Kontakt der Zellen von<br />
verschiedenen Stämmen.<br />
Der Transfer geht nur in eine Richtung! "Sexual„-als Unterschied zwischen den Zellen<br />
A = Donor („Männchen"), B = Rezipient („Weibchen").<br />
Fertilität geht in den „Männchen” Zellen oft verloren – unabhängig von anderen<br />
Merkmalen
Entdeckung der Konjugation<br />
Bestimmung der Richtung des<br />
Gentransfers/Konjugation (Hayes)<br />
„A” Zellen: Streptomycin resistent<br />
„B” Zellen: Streptomycin sensitiv<br />
Gemeinsame Vermehrung der Zellen bildet KEINE Wildtypkolonie auf Minimalmedium<br />
mit Streptomycin<br />
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”<br />
„A” Zellen: Streptomycin sensitiv<br />
„B” Zellen: Streptomycin resistent<br />
Gemeinsame Vermehrung der Zellen bildet Wildtypkolonien auf Minimalmedium mit<br />
Streptomycin<br />
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”<br />
„A” Zellen + Streptomycin: sterben<br />
Mischung der toten „A” + lebendige „B” Zellen ergibt Wildtypkolonien<br />
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”
Veränderung der genetischen<br />
Information: die Konjugation<br />
Die F+-Zellen von E. coli besitzen zwei<br />
genetische Elemente, das Chromosom und<br />
das F(Fertilitäts)-Plasmid/Faktor. Direkter<br />
Kontakt mit der F - Zelle über<br />
Konjugationsbrücke, Sex-Pili (Protein-Rohre).<br />
F + Donorzelle überträgt den Fertilitätsfaktor (F-<br />
Plasmid) in die Empfängerzelle als<br />
einzelsträngige DNA. Der Empfänger<br />
synthetisiert den zweiten Strang.<br />
Während der Konjugation wandelt sich der F -<br />
Stamm in F+. Der Transfer beginnt an der<br />
oriT (transfer) Stelle des F-Plasmids
Die Konjugationsbrücke von E. coli<br />
Die Donorzelle überträgt ihre einzelsträngige DNA in die Empfängerzelle<br />
über die Konjugationsbrücke, Sex-Pilus (ein Proteinrohr)
Entdeckung der Konjugation mit hoher Frequenz<br />
Luca Cavalli-Sforza: unerwartet hohe Transformationsfrequenz (1000 x), sehr niedriger oder<br />
kein Transfer von Fertilität<br />
Integration des F-Plasmids ins Chromosom:<br />
Hfr-Zelle (high frequency of recombination)<br />
mit einer 10-3Wahrscheinlichkeit<br />
Während der Paarung/Konjugation überträgt die Hfr-<br />
Zelle ihre einzelsträngige DNA in die F—Zelle.<br />
Die Übertragung beginnt mit der oriT-Sequenz.<br />
Keine Sexualität sondern Parasexualität.<br />
Die Übertragung dauert ~100 Minuten, aber wird<br />
spontan unterbrochen.<br />
Konsequenz: ein vollkommenes, ringförmiges<br />
Chromosom, zusätzlich mehr oder weniger lange lineare<br />
DNA-Abschnitte, die Zelle ist Merozygot, nur teilweise<br />
Diploid
Genetische „Kartierung”<br />
F-Plasmide können sich in verschiedene Positionen des<br />
Genoms integrieren.<br />
Abhängig von der Stelle und Orientation werden<br />
verschiedene Gene in verschiedene Sequenzen<br />
übergebracht.<br />
Falls der Plasmid sich in das Chromosom integriert werden<br />
die Fertilitätsgene zuletzt transferiert.<br />
Die Chance auf dies ist sehr niedrig, meisstens wird die<br />
Konjugation früher unterbrochen.<br />
Bei F-Plasmiden die sich selbstständig replizieren ist es<br />
genau der Gegenteil: Donor-Fähigkeit wird oft transmittiert,<br />
da das Origo von den Fertilitätsgen nicht durch den<br />
Chromosom separirt ist.<br />
Konjugation ist das meisstverbreitene und wichtigste<br />
Ereignis für Antibiotikaresistenz.
Genetische „Minutenkartierung”<br />
Während der Konjugation folgen sich die einzelnen Gene von Donor zu<br />
Rezipient. Wird die Konjugation unterbrochen werden nur manche Gene<br />
übergebracht.<br />
90 Minuten wurden benötigt um das ganze E. coli Genom zu<br />
transferieren.
Transfer von Fertilitätsgene<br />
In Hfr Stämme werden die Fertilitätsgene zuletzt übergebracht:<br />
Hohe Effizienz des Gentransfers, niedrige warscheinlichkeit, dass F auch<br />
übergebracht wird.<br />
Unabhängige F-Plasmide:<br />
Niedrige Effizienz des Gentransfers, F wird mit derselben Warscheinlichkeit<br />
übergebracht. Bei <strong>Bakterien</strong> ist die Konjugation bei Weitem die meisst<br />
effektive Art der Genübertragung.
Genkartierung durch unterbrochene<br />
Konjugation<br />
Donorzelle: str- s; Empfängerzelle:<br />
Str-r; Wildtyp Donorzellen werden mit<br />
Streptomycin getötet ab und zumales<br />
Schütteln der Zellkultur: die Konjugation wird<br />
Unterbrochen.<br />
Der F--Stamm kann ausschliesslich in der<br />
Anwesenheit von Methionin, Leucin und<br />
Arginin, auf Streptomycin Wachsen.<br />
Nach 9 Min. Paarung: met+ Rekombinanten;<br />
18 Min: arg+;<br />
24 Min: leu+Rekombinanten<br />
Die Genkarte: met-9 Einheit (Min.) -arg–6<br />
Einheit -leu
Genkartierung durch Rekombination<br />
In dieser Konjugation wird das leuGen als letztes übertragen<br />
Selektion: Minimalmedium + Arginin, Methionin, Streptomycin (nur leu+kann<br />
wachsen)<br />
Analyse der Kolonien mit Replika-Plattierung auf verschiedene Medien
Genkartierung durch Rekombination<br />
Die unterbrochene Konjugation ergibt bloss raue Kartierungsdaten; die Gene die näher als 1-2<br />
Einheit/Min. liegen können nicht kartiert werden<br />
Ein Abschnitt von ~1 Min. kann durchschnittlich 40-50 E. coli Gene enthalten<br />
Rekombinationskartierung, wie bei Eukaryonten, ermöglicht Kartierung naher<br />
Gene<br />
Selektion: Minimalmedium +Arg.+Met. + Str., wo ALLE leu+-Rekombinanten<br />
Wachsen können<br />
Alle mögliche Rekombinantenkategorien:<br />
90%: leu+ arg+ met+<br />
4 %: leu+ arg--met--<br />
6 %: leu+ arg+ met--<br />
0.25 %: leu+ arg--met+ (Die seltenen, vierfachen Rekombinanten)<br />
Kartenabstände: leu 4 E. arg 6 E. met (keine Information über Reihenfolge!) Kartenabstände:<br />
leu 4 E. arg 6 E. met (keine Information über Reihenfolge!)<br />
Reihenfolge der Gene: leu+ arg-met+ , aufgrund der seltenen Rekombinanten