Lumineszenz – Möglichkeiten der vorbeugenden ... - PerkinElmer

Abb. 2: Aufbau eines modernen Szintillationszählers
In Abbildung 3 wird gezeigt, wie zwei
gleichzeitige Lumineszenzereignisse auf
eine PMT treffen können. Es gibt für zwei
Lumineszenzereignisse genau 2 2 = 4
Kombinationsmöglichkeiten. Wie zu sehen
ist, führen nur zwei dieser Wege zu einem
Koinzidenzsignal, das heißt, selbst bei
zwei Signalen ist die Wahrscheinlichkeit
nur 50%, dass wir auch wirklich ein Signal
detektieren. Im Falle von drei
Lumineszenzsignalen gibt es bereits 2 3 = 8
Kombinationsmöglichkeiten, von denen
wieder zwei keine Koinzidenz zeigen. Hier
ist die Wahrscheinlichkeit also nur noch
25%, dass wir kein Signal sehen. Mit
zunehmender Zahl an gleichzeitigen
Signalen (gleichzeitig innerhalb der
Koinzidenzzeit) nimmt die
Wahrscheinlichkeit, dass wir kein Signal
sehen, sehr schnell ab. Dieser Effekt, dass
bei geringen Photonenzahlen, kein
Koinzidenzsignal gesehen wird, wird in
der Regel als Koinzidenzschwelle
bezeichnet. Diese Koinzidenzschwelle ist
beim niederenergetischen
3 H übrigens
dafür verantwortlich, dass wir im
Vergleich zu anderen β−Emittern
vergleichsweise schlechte Zählausbeuten
erhalten, da die niedrige Energie von 3 H
nur für die Bildung von relativ wenigen
Photonen ausreicht.
Signal nur an der
linken PMT. Keine
Koinzidenz!!!
Signal nur an der
rechten PMT. Keine
Koinzidenz!!!
Signal an beiden
PMT´s.
Koinzidentes
Signal!!!
Signal an beiden
PMT´s.
Koinzidentes
Signal!!!
Abb. 3: Mögliche Detektionskombinationen von zwei gleichzeitigen Ereignissen
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Mit einer einfachen Beziehung kann
abgeschätzt werden, wie stark die
Lumineszenzaktivität einer Probe zum
Messergebnis beiträgt:
Lumineszenz = C1⋅ C2 ⋅ 2t
C1 = Zählrate PMT1
C2 = Zählrate PMT2,
t = Koinzidenzzeit
Für eine Probe mit einer
Lumineszenzaktivität von 100 000 CPM an
jeder PMT ergibt sich damit:
10 5 ⋅ 10 5 ⋅ 2 ⋅ 20/60 ⋅ 10 −9 = 6,67 CPM
Dieser Wert an Lumineszenz würde bei
vielen einfachen Szintillationszählern
vermutlich noch nicht signifikant auffallen,
da der Wert noch unter dem üblichen
Background vieler Geräte ist. Doch bei
einer Aktivität von 10 6 würde bereits eine
Lumineszenzaktivität von über 600 CPM
erreicht werden. Derartig hohe
Lumineszenzaktivitäten in radioaktiven
Proben sind durchaus keine Seltenheit und
können durch chemische Reaktionen oder
durch Anregung mit starken Lichtquellen
gefördert werden. Es gibt unterschiedliche
Arten wie Lumineszenz erzeugt werden
kann.
Von den vielen Arten der Lumineszenz
wie der Radio-Lumineszenz,
Chemilumineszenz, Photolumineszenz,
Elektro-Lumineszenz (Lumineszenz durch
Anlegen eines elektrischen Feldes),
Thermo-Lumineszenz (Lumineszenz durch
Temperaturerhöhung), Tribo-Lumineszenz
(Lumineszenz durch Zerreiben oder
Zerkleinern), Kristallo-Lumineszenz
(Lumineszenz durch Kristallisieren),
Aquo-Lumineszenz (Lumineszenz durch
Lösen einer Substanz), Sono-Lumineszenz
(Lumineszenz durch Bestrahlung einer
Probe mit Ultraschall) oder der Galvano-
Lumineszenz (Lumineszenz durch
Elektrolyse), sind im wesentlichen nur die
drei zuerst genannten Arten in der
Flüssigszintillationstechnik von
Bedeutung. Findet die chemische
Reaktion, die Lumineszenz hervorruft in
einer lebenden Zelle statt, so spricht man
auch von Biolumineszenz. Zur Messung
von Chemi- und Biolumineszenz mit dem
Szintillationszähler siehe auch
Applikationsnote 29. 1)
Eliminierung von Lumineszenz durch
die Probenvorbereitung
Bei einer radioaktiven Probe wollen wir
natürlich in der Regel keine Lumineszenz
sehen. Am Besten ist es immer, wenn
schon die Probe so vorbereitet werden
kann, dass keine Lumineszenz mehr
auftritt. Jede elektronische Korrektur ist
zwar für den Notfall immer noch besser als
gar nichts, kann aber auch Nachteile mit
sich bringen. Vor allem im Low Level
Bereich, wo bereits geringe Anteile an
Lumineszenz stören können, ist eine
Probenvorbereitung in der Regel der
bessere Weg. Ein möglicher Weg ist zum
Beispiel Lumineszenz abklingen zu lassen.
Vor allem Photolumineszenz, erzeugt zum
Beispiel durch eine Probe im Sonnenlicht,
klingt relativ schnell ab. Wichtig ist, dass
die Proben zum Abklingen im Dunkeln
stehen und dort auch bis zur Messung
bleiben. Sobald Licht an die Probe kommt,
kann diese erneut zum Leuchten angeregt
werden.
Abb. 4: Abklingen von Lumineszenz
Auch die verwendeten Cocktails, die leicht
anregbare aromatische Substanzen
enthalten, sollten im Dunkeln aufbewahrt
werden. Cocktailbehälter von PerkinElmer
sind in der Regel lichtundurchlässige
schwarze Plastikbehälter bzw. bei größeren
Mengen Metalltonnen. Der
Abklingvorgang kann auch im
Szintillationszähler durchgeführt werden.
3

Es ist möglich im Protokoll eine „Delay
Time“ zu setzen. Die Probe wird dann in
die lichtdichte Messkammer gefahren, dort
wird aber mit der Messung gewartet, bis
die Delay Time verstrichen ist.
Eine andere Möglichkeit zu überprüfen,
wie der Abklingvorgang voranschreitet ist
die „SPC Decay“ Option im TriCarb
Szintillationszähler. Hierzu siehe auch
Applikationsnote 22. 2)
Wenn sie nicht so lange warten können, bis
die Lumineszenz abgeklungen ist, gibt es
häufig auch Mittel diesen Vorgang zu
beschleunigen.
Die richtige Wahl des Cocktails, kann hier
sehr behilflich sein. Cocktails zeigen sehr
unterschiedliches Abklingverhalten. Ist
bekannt, dass eine Probe Lumineszenz
zeigt, so kann Hionic Fluor eingesetzt
werden. In keinem Cocktail klingt
Lumineszenz so schnell ab wie in Hionic
Fluor. Auch für Solubilizer wie Soluene-
350 und Solvable, bei deren Einsatz häufig
mit Lumineszenz zu rechnen ist, bewirkt
Hionic Fluor ein schnelleres Abklingen. Zu
Details über die gesamte Cocktailpalette
von PerkinElmer LAS sei auch auf
Applikationsnote 16 3) verwiesen.
Eine andere Möglichkeit Lumineszenz
schnell zu unterdrücken ist die
Veränderung der Temperatur. Wenn ein
Erhitzen der Probe möglich ist, kann die
Reaktion, die zur Bildung der
Lumineszenz führt, beschleunigt werden
und zu einem schnellen Ende gebracht
werden. Wichtig ist auch hier die Probe im
Dunkeln zu belassen, da sonst die Reaktion
immer wieder von neuem aktiviert wird. Ist
eine Erhöhung der Temperatur
ausgeschlossen, zum Beispiel weil die
Probe sehr empfindlich ist, so kann auch
versucht werden die Probe zu kühlen.
Durch Kühlen wird die Geschwindigkeit
der Lumineszenzreaktion stark
herabgesetzt, wodurch die Zählereignisse,
die auf Lumineszenz basieren, verringert
werden. Die Art und Weise wie
Lumineszenz bekämpft werden kann,
hängt auch stark davon ab, wodurch die
Lumineszenz verursacht wurde. Bei der
länger anhaltenden Lumineszenz handelt
es sich in der Regel um
Chemilumineszenz. Wenn es gelingt die
chemische Reaktion zu beenden, wird auch
die Lumineszenz verschwinden.
Eines der häufigsten Probleme ist der pH-
Wert. Lumineszenz tritt, abgesehen von
wenigen Ausnahmen, fast ausschließlich
im alkalischen Bereich bei pH-Werten > 7
auf. Ansäuern der Probe kann oft helfen
die Reaktion zu unterbinden. Auch hier
kann wieder ein Cocktail helfen, falls die
Probe empfindlich auf Säure reagiert oder
zum Beispiel Fällungsreaktionen zu
erwarten sind. Die Reihe der Ultima Gold
Cocktails ist im schwach sauren Bereich
gepuffert und beachtliche Mengen von
basischen Substanzen können
aufgenommen werden, bevor der Cocktail
einen basischen pH-Wert erreicht. Diese
Möglichkeiten sind natürlich
ausgeschlossen, wenn die Zugabe von
Säure bzw. die Verwendung saurer
Cocktails zum Austreiben der radioaktiven
Substanz führen kann. Basische Medien
wie Ethanolamin, Natronlauge etc. werden
zum Beispiel zum Binden von
14 CO 2
verwendet. Ansäuern einer solchen Probe
führt unweigerlich zum Verlust von 14 CO 2 .
In diesen Fällen müssen andere der
erwähnten Verfahren eingesetzt werden.
Ebenfalls ein großes Problem kann die
Anwesenheit von Peroxiden sein. Dieses
Problem tritt vor allem dann auf, wenn
zuvor gefärbte Proben, zum Beispiel
Blutproben, oder durch Solubilisation
gefärbte Proben mit Wasserstoffperoxid
(H 2 O 2 ) entfärbt wurden. Oft kann
überschüssiges Wasserstoffperoxid durch
verkochen entfernt werden, auch sollte nur
soviel Wasserstoffperoxid wie unbedingt
nötig für die Entfärbung eingesetzt werden.
Für genaue Vorschriften zum Entfärben
von Proben siehe auch Applikationsnote
3. 4) Häufig entstehen während der
Entfärbung aber auch stabilere Peroxide,
zum Beispiel über die Oxidation
organischer Säuren, die nicht mehr so
einfach zu entfernen sind. Beseitigung der
Lumineszenz ist dann nur über Inkubation
bei erhöhter Temperatur im Dunkeln
möglich.
Bei Redoxreaktionen kann durch Zugabe
eines Reduktionsmittels die Lumineszenz
beseitigt werden.
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Bei all diesen Reaktionen muss darauf
geachtet werden, dass es zu keinen
Fällungen kommt, damit die Messung im
Cocktail in homogener Phase stattfinden
kann. Auch kann die Zugabe von Säuren
zu stark basischen Lösungen zu einer sehr
hohen Ionenkonzentration führen, wodurch
die Aufnahmekapazität des Cocktails
überschritten werden kann. Es ist daher zu
empfehlen, die Homogenität der Probe zu
überprüfen.
Detektion und Korrektur von
Lumineszenz durch das Messgerät
Natürlich kann es vorkommen, dass alle
Maßnahmen der Probenvorbereitung nicht
ausreichen, Lumineszenz vollständig zu
unterdrücken. Moderne Szintillatinszähler
sind deshalb alle in der Lage Lumineszenz
zu detektieren und auch zu korrigieren.
Die einfachste Möglichkeit Lumineszenz
sicher auszuschalten, ist über die
Einstellung der Energiefenster möglich.
Lumineszenz ist sehr niederenergetisch
und oberhalb von 5 KeV praktisch nicht
vorhanden. Bei Isotopen wie 14 C oder 35 S
kann man in der Regel leicht auf diesen
Energiebereich verzichten, ohne die
Zählausbeute zu sehr einschränken zu
müssen. Bei 3 H Verbindungen ist dies in
der Regel nicht möglich. Der Verlust an
Zählausbeute wäre in der Regel zu groß,
vor allem, wenn die Proben auch noch
gequencht sind. Zumindest bei 3 H Proben
ist man daher auf ein anderes Verfahren
angewiesen. Dies geschieht mit Hilfe eines
verzögerten Koinzidenzschaltkreises. In
Abbildung 5 ist gezeigt, wie durch die
normale
Koinzidenzschaltung
gelegentliche Signale an nur einer PMT
nicht detektiert werden. Nur in den beiden
Fällen mit Koinzidenz „Ja“, wo an beiden
PMT´s ein Signal gemessen wird, kommt
es zu einer Übermittlung des Signales
durch den logischen Schaltkreis an den
Vielkanalanalysator.
PMT1 Signal X X X X X
PMT2 Signal X X
Koinzidenz Ja Ja
Abb. 5: Nur zwei radioaktive Pulse werden bei geringer Lumineszenz detektiert
Wenn jetzt jedoch die
Lumineszenzaktivität starkt zunimmt, so
wird ein Ergebnis wie in Abbildung 6
erhalten. Ist die Lumineszenzaktivität groß
genug, so steigt die Wahrscheinlichkeit,
dass zwei Lumineszenzereignisse
innerhalb der Koinzidenzzeit von 20 ns
gleichzeitig auftreten und damit einen
radioaktiven Zerfall und ein
Koinzidenzsignal vortäuschen. In dem
unteren Beispiel werden jetzt statt der zwei
wirklichen Zerfälle plötzlich fünf
radioaktive Ereignisse registriert.
PMT1 Signal X X X X X X X X X X X
PMT2 Signal X X X X X X X X X X
Koinzidenz Ja Ja Ja Ja Ja
Abb. 6: Zwei wirkliche Zerfälle und drei zufällige Ereignisse durch Lumineszenz
Gelöst werden kann das Problem durch
einen zusätzlichen logischen Schaltkreis in
dem das Signal der einen PMT verzögert
wird. In Abbildung 7 wurde das Signal der
PMT1 um 20 ns verzögert. Das heißt, alle
vorher gleichzeitigen radioaktiven Signale
sollten nicht mehr gemessen werden. Alle
Signale die jetzt noch auftreten, sollten
durch zufällige Koinzidenzen verursacht
werden. Da Lumineszenz ja sowieso nur
detektiert wird, wenn die
Lumineszenzaktivität sehr hoch ist und
damit also eine sehr gute
Lumineszenzstatistik existiert, sollte die
Zahl der zufälligen Koinzidenzen in
Abbildung 6 und im zeitverzögerten Fall in
Abbildung 7 etwa gleich groß sein.
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Da wir jetzt auf diese Weise einmal die
Gesamtzahl der Koinzidenzen (5),
bestehend aus wirklichen und zufälligen
Koinzidenzen, sowie die Zahl der
zufälligen Koinzidenzen (3) ermitteln
können, ist auch die Zahl der wirklichen
Koinzidenzen (2) aus der Differenz der
beiden leicht zu ermitteln.
PMT1 Signal X X X X X X X X X X X
PMT1 verzögert X X X X X X X X X X
PMT2 Signal X X X X X X X X X X
Koinzidenz Ja Ja Ja
Abb. 7: Betrachtung der Koinzidenz zwischen PMT2 und PMT1 zeitverzögert
Mit der Hilfe dieser recht einfachen
Schaltung ist die Korrektur der Lumineszenz
auf allen TriCarb Systemen von
PerkinElmer LAS möglich. Die
Lumineszenzdetektion ist auf allen Geräten
der TriCarb Serie installiert. Die Korrektur
der CPM Daten dagegen ist bei einigen
Geräten eine Option. Eine Nachrüstung
dieser Option ist möglich und kann über die
Serviceabteilung durchgeführt werden. Bei
Interesse an dieser Option wenden Sie sich
bitte an den für sie zuständigen Account
Manager bzw. Servicetechniker von
PerkinElmer oder verwenden sie die
Kontaktinformationen am Ende dieser
Applikationsnote.
Literatur
1.) PerkinElmer LAS (Germany)
GmbH, 63110 Rodgau-Jügesheim,
LSC Applikationsnote 29, Der
Einsatz von Szintillationszählern
für die Messung von Chemi- und
Biolumineszenzreaktionen, August
2005.
2.) PerkinElmer LAS (Germany)
GmbH, 63110 Rodgau-Jügesheim,
LSC Applikationsnote 22, Die
QuantaSmart Software für
Szintillationszähler der TriCarb
Serie, Mai 2005.
3.) PerkinElmer LAS (Germany)
GmbH, 63110 Rodgau-Jügesheim,
LSC Applikationsnote 16,
Cocktails für die Messungen im
Szintillationszähler, Dezember
2004.
4.) PerkinElmer LAS (Germany)
GmbH, 63110 Rodgau-Jügesheim,
LSC Applikationsnote 3, LSC
Probenvorbereitung durch
Auflösung der Probe, Juli 2004.
Weltweites Hauptquartier: PerkinElmer Life Sciences, Inc., 549 Albany Street, Boston, MA 02118-2512 USA (800) 551-2121
Europäisches Hauptquartier: PerkinElmer Life Sciences, Imperiastraat 8, B-1930 Zaventem Belgien
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