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Theorie „Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen“
9 Theorie „Solubilisierung biologischer Membranen und
Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen“
9.1 Solubilisierung biologischer Membranen
In Lipiddoppelschichten verankerte Proteine
und Proteinkomplexe lassen sich durch
Detergenzien aus ihrer biologischen Membran
extrahieren. Detergenzien sind amphipathische
Moleküle, die sowohl polare als auch
hydrophobe Gruppen enthalten. Sie
aggregieren bei Überschreitung der kritischen
mizellaren Konzentration (CMC) zu Mizellen.
In solche Mizellen können hydrophobe
Moleküle eingeschlossen werden. Mit ihrem
hydrophoben Schwanz lagern sich
Detergenzien in die Lipiddoppelschicht ein.
Wenn eine ausreichende Menge an Detergens
vorhanden ist, werden Membranen aufgelöst
und es bilden sich Lipid-Detergens- sowie
Lipid-Protein-Detergens- und Protein-
Detergens-Mizellen (9.1). Ein wichtiger
Abb. 9.1: Solubilisierung biologischer Membranen [1]
Parameter bei der Solubilisierung ist das
Detergens-zu-Protein-Verhältnis, angegeben in g/g.
Weiterhin ist aber auch die Art des Detergens von entscheidender Bedeutung. Ionische Detergenzien
solubilisieren zwar sehr effizient, verändern aber gleichzeitig die Struktur von
Membranprotein(-komplex)en, so dass es zu einer Beeinträchtigung ihrer enzymatischen Aktivität bis
hin zur vollständigen Denaturierung kommen kann. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu
erhalten, müssen milde Detergenzien verwendet werden. Besonders gut eignen sich hierfür solche mit
einer nicht-ionischen Kopfgruppe (z.B. Zucker- oder Oxyethylengruppen). Für den jeweiligen
Verwendungszweck muss das richtige Detergens sowie dessen Konzentration experimentell ermittelt
werden. Es sollte möglichst quantitativ das Zielprotein aus der Membran extrahieren, aber gleichzeitig
seine physiologische Funktion nicht beeinträchtigen.
Zur Solubilisierung gibt man eine definierte Menge Detergens zu einer Probe mit isolierten
biologischen Membranen. Durch Inkubation bei geeigneten Temperaturen werden die
Membranproteine allmählich extrahiert. Nicht-solubilisierte Membranbestandteile sowie Aggregate
entfernt man anschließend durch Zentrifugation. Extrahierte Protein(-komplex)e bleiben, eingebettet in
Detergens-Mizellen, im Überstand. Es werden hauptsächlich die beiden milden nicht-ionischen
Detergenzien Digitonin und n-Octyl-β-D-glucopyranosid verwendet (Abb. 9.2).
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Abb. 9.2a: Digitonin
Abb. 9.2b: n-Octyl-β-D-glucopyranosid
Für die Untersuchung der Aktivität der Atmungskettenkomplexe in blau-nativen Gelen wird Digitonin
als Solubilisierungsdetergens verwendet. Die Membranproteine werden aus Rinderherzmitochondrien
(BHM) mit einem Detergens zu Protein Verhältnis von 3 g / g solubilisiert. Durch Zentrifugation
werden Membranreste und unsolubilisierte Proteine abzentrifugiert. Die solubilisierten Proteine
befinden sich im Überstand und werden zur Auftrennung und weiteren Untersuchung auf ein BN-Gel
geladen. Die Solubilisierungseffizienz von Digitonin liegt bei etwa 50%. Dafür bleiben aber
Überstrukturen, wie die Superkomplexe der Atmungskette, erhalten.
n-Octyl-b-D-glucopyranosid wird durch die Betreuer zur Solubilisierung von Bacteriorhodopsin aus
der Purpurmembran verwendet. Anschließend erfolgt im Praktikumsversuch die Rekonstitution von
BR in Liposomen.
9.2 In-Gel Aktivitätstests der Atmungskettenkomplexe
(modifiziert nach: N. G. Heidrich, „Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung,
Charakterisierung und strukturelle Untersuchung“, Dissertation TU Darmstadt, 2011.)
Eine elegante Methode zum Nachweis von Proteinkomplexen ist die histochemische Färbung in
nativen Gelen. Für Atmungskettenkomplexe z. B. existieren verschiedene Tests, bei denen
Redoxreaktionen in Verbindung mit dem jeweiligen aktiven Enzym zu farbigen Niederschlägen
führen. Aufgrund der Färbung der Proteinbande im Gel kann auf das entsprechende aktive Enzym
zurückgeschlossen werden. Mit dieser Methode können ebenfalls Proteinsuperkomplexe, die aus
unterschiedlichen Proteinkomplexen bestehen (z. B. I 1 III 2 IV 1 ), sowohl in der ersten nativen
Dimension, als auch in mehrdimensionalen nativen Elektrophoresen nachgewiesen werden.
Mittlerweile existieren für alle fünf Atmungskettenkomplexe (Komplexe I-V) aus Mitochondrien
entsprechende Aktivitätstest-Protokolle [2].
Für den Praktikumsversuch werden Rinderherzmitochondrien (BHM) solubilisiert, auf ein BN-Gel
aufgetragen und nach dem Gellauf die Tests für die Komplexe I und IV der Atmungskette
durchgeführt. Hierfür wird das fertige Gel erst in Wasser inkubiert und danach in der Reaktionslösung
geschüttelt, bis der farbige Niederschlag deutlich zu sehen ist. Mit der Stopp/Fixierlösung wird die
Präzipitatbildung abgestoppt und die Proteine im Gel fixiert. Zum Schluss wird mit dem Scanner ein
Bild aufgenommen und die Banden zugeordnet. Über eine zeitliche Ermittlung der Ausbildung des
Präzipitats kann die Aktivität quantifiziert werden.
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9.2.1 Aktivitätstest für Komplex I
Der Test beruht auf der Reduktion des gelben Tetrazoliumsalzes NBT zu violettem Formazan durch
das aktive Enzym NADH-Dehydrogenase [3]. Ist eine Proteinbande mit diesem aktiven Enzym im Gel
vorhanden, so färbt sich diese violett. Abbildung 9.3 fasst die ablaufenden Reaktionen während der
Inkubation in der Testlösung bei Vorhandensein von aktivem Komplex I zusammen.
Abbildung 9.3: Ablaufende Reaktionen während des Aktivitätstests für Komplex I. Die NADH-Dehydrogenase
oxidiert das Substrat NADH + H + zu NAD + . Die reduzierte Form von Komplex I nimmt zwei Elektronen des
Tetrazoliumsalzes auf, welches dadurch zu violettem Formazan reduziert wird. Die Struktur für Komplex I ist
nach Efremov et al. (2010)[4] modifiziert.
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9.2.2 Aktivitätstest für Komplex IV
Durch Umsetzung von 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) zum entsprechend oxidierten Polymer wird die
Aktivität des Proteinkomplexes sichtbar (braunes Präzipitat). DAB überträgt Elektronen auf in der
Aktivitätstestlösung vorhandenes Cytochrom c. Komplex IV oxidiert Cytochrom c und nutzt die
Elektronen zur Reduktion von Sauerstoff zu Wasser. In Abbildung 9.4 sind die wichtigsten
Reaktionen dargestellt.
Abbildung 9.4: Nachweis von aktiver Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) durch Oxidation von
3,3’-Diaminobenzidin (DAB) zum entsprechenden Polymer in nativen Gelen. Struktur von Komplex IV
modifiziert nach Tsukihara et al. (1996)[5].
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In Abbildung 9.5 ist ein Beispiel für BN-Gelstreifen beladen mit Rinderherzmitochondrien zu sehen.
Diese Abbildung sollte zur Beschriftung des eigenen Aktivitätstests herangezogen werden.
Abbildung 9.5: Mit 3g/g Digitonin solubilisierte Rinderherzmitochondrien (BHM), aufgetragen auf BN-
Gelstreifen, Coomassie gefärbt, in-Gel Aktivitätstest I und IV (modifiziert nach: AG Dencher)
[1] Bhairi, S.M. und C. Mohan, Detergents-A guide to the properties and uses of detergents in
biological systems. CB0068-2007 INTL Detergents Booklet. 2007, EMD Biosciences, San
Diego, CA.
[2] Wittig, I., et al., Electrophoresis, 28, 3811–3820, (2007).
[3] Grandier-Vazeille, X. und Guérin, M., Anal. Biochem. 242, 248–254 (1996).
[4] Efremov, R.G., et al., Nature, 465, 441–445 (2010).
[5] Tsukihara, et al., Science, 272, 1136–1144 (1996).
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