9 Theorie „Solubilisierung biologischer Membranen und ...

Theorie „Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen“
Abb. 9.2a: Digitonin
Abb. 9.2b: n-Octyl-β-D-glucopyranosid
Für die Untersuchung der Aktivität der Atmungskettenkomplexe in blau-nativen Gelen wird Digitonin
als Solubilisierungsdetergens verwendet. Die Membranproteine werden aus Rinderherzmitochondrien
(BHM) mit einem Detergens zu Protein Verhältnis von 3 g / g solubilisiert. Durch Zentrifugation
werden Membranreste und unsolubilisierte Proteine abzentrifugiert. Die solubilisierten Proteine
befinden sich im Überstand und werden zur Auftrennung und weiteren Untersuchung auf ein BN-Gel
geladen. Die Solubilisierungseffizienz von Digitonin liegt bei etwa 50%. Dafür bleiben aber
Überstrukturen, wie die Superkomplexe der Atmungskette, erhalten.
n-Octyl-b-D-glucopyranosid wird durch die Betreuer zur Solubilisierung von Bacteriorhodopsin aus
der Purpurmembran verwendet. Anschließend erfolgt im Praktikumsversuch die Rekonstitution von
BR in Liposomen.
9.2 In-Gel Aktivitätstests der Atmungskettenkomplexe
(modifiziert nach: N. G. Heidrich, „Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung,
Charakterisierung und strukturelle Untersuchung“, Dissertation TU Darmstadt, 2011.)
Eine elegante Methode zum Nachweis von Proteinkomplexen ist die histochemische Färbung in
nativen Gelen. Für Atmungskettenkomplexe z. B. existieren verschiedene Tests, bei denen
Redoxreaktionen in Verbindung mit dem jeweiligen aktiven Enzym zu farbigen Niederschlägen
führen. Aufgrund der Färbung der Proteinbande im Gel kann auf das entsprechende aktive Enzym
zurückgeschlossen werden. Mit dieser Methode können ebenfalls Proteinsuperkomplexe, die aus
unterschiedlichen Proteinkomplexen bestehen (z. B. I 1 III 2 IV 1 ), sowohl in der ersten nativen
Dimension, als auch in mehrdimensionalen nativen Elektrophoresen nachgewiesen werden.
Mittlerweile existieren für alle fünf Atmungskettenkomplexe (Komplexe I-V) aus Mitochondrien
entsprechende Aktivitätstest-Protokolle [2].
Für den Praktikumsversuch werden Rinderherzmitochondrien (BHM) solubilisiert, auf ein BN-Gel
aufgetragen und nach dem Gellauf die Tests für die Komplexe I und IV der Atmungskette
durchgeführt. Hierfür wird das fertige Gel erst in Wasser inkubiert und danach in der Reaktionslösung
geschüttelt, bis der farbige Niederschlag deutlich zu sehen ist. Mit der Stopp/Fixierlösung wird die
Präzipitatbildung abgestoppt und die Proteine im Gel fixiert. Zum Schluss wird mit dem Scanner ein
Bild aufgenommen und die Banden zugeordnet. Über eine zeitliche Ermittlung der Ausbildung des
Präzipitats kann die Aktivität quantifiziert werden.
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