Vortrag beim Frühjahrsmeeting 2007 (616 KB) - IFZN - Johannes ...

α-Sekretase-Spaltung
des Amyloid-Vorläuferproteins in Blutplättchen
als diagnostischer Marker
bei der Alzheimer-Erkrankung
Dr. Elżbieta Kojro, Prof. Dr. Falk Fahrenholz
Institut für Biochemie
Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Dr. med. A. Fellgiebel, Prof. Dr. L. G. Schmidt
Institut für Psychiatrie
Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Gliederung
• Amyloid-Vorläuferprotein (APP) Prozessierung
• Verwendung von Blutplättchen als biologisches Material
• Konzept des neuen Biomarkers und Ergebnisse

Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP)
nicht-amyloidogener Weg
amyloidogener Weg
neuroprotective
APPsα
Neuronal cell death,
Cognitive abnormalities
p3
Nach: S. Gandy, J. Clin. Invest. 2005; 115: 1121-1129.

Aktivierung der α-Sekretase
neuroprotektives
APPsα
p3
α-Sekretase
APP[V717I]
ADAM10
x
APP[V717I ]
Postina et al., 2004, J. Clin. Invest.

Relative Aβ Immunreaktivität in Komponenten des
humanen Blutes
Bestandteil des
Blutes
Anzahl Zellen
pro ml Blut
Absorbtion
bei 450 nm
Prozent
von gesamt
Blutplättchen 3,0 x 10 8 5240 ± 531 89,6 ± 9.1
Leukozyten 7,5 x 10 6 192 ± 29 3,3 ± 0,5
Erythrozyten 5,0 x 10 9 ≤ 60 ≤ 1,0
Plasma — 362 ± 52 6,2 ± 0,9
nach Chen et al., 1995

APP-Prozessierung in Blutplättchen
APPsα, Aβ

Gemeinsamkeiten von Blutplättchen und Neuronen
• Sie können Neurotransmitter speichern und freisetzen
• Sie exprimieren entsprechende Transporter von
Neurotransmittern und einigen Neuronen-verwandten
Proteinen, wie den NMDA-Rezeptor

Aβ Homöostase
Abbildung aus: Tanzi et al., 2004, Neuron 43: 605.
RAGE:
LRP:
Receptor for advanced glycation end product
LDL-receptor-related protein

Veränderungen in Physiologie und Funktion der
Blutplättchen bei der Alzheimer-Erkrankung
• Verminderte Cytochrom-Oxidase Aktivität
• Störung des cytoplasmatischen Calciumflux
• Abnormitäten des Cytoskeletts
• Abweichende Glutamat-Transporter Aktivität
• Reduzierte Phospholipase-C Aktivität
• Erhöhte Proteinkinase-Spiegel im Cytosol

α-Sekretase ADAM10 in Blutplättchen
Colciaghi et al., 2001

APPsα in Blutplättchen und CSF
bei AD Patienten und Kontrollen
Colciaghi et al., 2001

HPLC-Analyse: Spaltung eines von Aβ abgeleiteten
Peptids durch ADAM10
↓
rel. Abs. [220 nm]
*
EVHHQK LVFFAEDVGSNK-NH 2
*
1
2
Lammich et al., 1999, PNAS 96, 3922

Strategie des α-Sekretase-Assays
α-Sekretase-Spaltstelle
↓
X ······ KL ······ (Biotin)R-NH2
1. Spaltung durch α-Sekretase
X ······ K
L ······ (Biotin)R-NH2
(ungespaltenes Substrat)
X ······ KL ······ (Biotin)R-NH2
2. Avidin Sepharose
(Entfernung des ungespaltenen Substrats)
X ······ K
X = [2,3-3H] Propionyl- oder fluorogene Gruppe (EDANS, dansyl)

Radioaktive Markierung von Peptiden
Prinzip:
NH 2 ------------(Biotin)R-NH 2
+
20h RT pH9
O
N O
H
O
O
3 H
H
3
H
H
N-Succinimidyl[2,3- 3 H]-Propionat
NH-------------(Biotin)R-NH 2
O
H 3 H
O
H
3
H
H
Propionyl- [2,3- 3 H]- Peptid
+ N OH
O
Hydroxysuccinimid

Spaltung eines radioaktiv markierten
Peptidsubstrates
Spaltung mit 300ng ADAM10
Spaltung mit 20 µg Blutplättchenmembran
50000
70000
40000
Control
ADAM10, ass. buf.
60000
20µg mem
ligand(5h)
50000
30000
40000
Cpm
20000
cpm
30000
10000
20000
0
10000
10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
10 15 20 25 30 35 40 45 50

Nitsch und Hock, 2001
Die klinische Phase
der Alzheimer-Erkrankung

Quantitative Analyse von APPsα im Liquor
von AD- und MCI-Patienten
125
100
75
50
25
0
Control AD MCI
150
100
50
0
Control AD MCI
Amount of APPsα (% of control)
Amount of APPsα (% of control)
∗
∗∗∗

Verfügbares Material
Patienten Anzahl Blutplättchen CSF Alter
AD 35 + + 67,8
MCI 20 + + 69,6
Proband 23 + 72,6
„Complainer“ 10 + + 62,2