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Biologie I/B: Klassische und molekulare Genetik, molekulare Grundlagen der Entwicklung
Theoretische Übungen SS 2013, Termin 7
Biologie I/B: Klassische und molekulare Genetik, molekulare
Grundlagen der Entwicklung
Theoretische Übungen
SS 2013
Fragen für die Übungsstunde 7 (08.07 - 10.07.)
DNA - Techniken und Enzyme, Gentechnik (Lernziele 6 und 7)
A) Restriktionsanalysen
1. Sie haben ein Plasmid mit einem 1300 bp langem Insert erhalten. Zur
Charakterisierung des klonierten Segments isolieren Sie das Insert und legen eine
Restriktionskarte an. Mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI sowie
anschließender Gelelektrophorese bestimmen Sie Anzahl und Größe der Fragmente,
die EcoRI und BamHI allein und in Kombination bilden. Diese Daten sind in der
Tabelle erfasst. Zeichnen Sie ausgehend von diesen Daten eine Restriktionskarte.
Geben Sie die Positionen der Schnittstellen der Restriktionsenzyme im Verhältnis
zueinander und die Entfernung zwischen ihnen in Einheiten von Basenpaaren an.
Restriktionsenzym(e)
Größen der
Restriktionsfragmente (bp)
EcoRI 350, 950
BamHI 200, 1100
EcoRI und BamHI 150, 200, 950
2. Wofür brauchen Bakterien Restriktionsenzyme?
a) zur Synthese von DNA
b) zur Synthese von RNA
c) zur Proteinsynthese
d) zum Abbau von Fremd-DNA
e) zum Abbau von Fremdproteinen.
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3. Eine der im Folgenden dargestellten Restriktionskarten stimmt mit den
Bandenmustern überein, die das Gel der dazugehörenden Abbildung nach Spaltung
mit mehreren Restriktionsendonukleasen aufweist. Die verwendeten Enzyme sind
aufgeführt.
a) Analysieren Sie das Bandenmuster auf dem Gel, wählen Sie die richtige Karte
aus und begründen Sie ihre Wahl!
b) Bei einem Southern Blot, den man von diesem Gel ausgehend herstellte,
hybridisierten die hellen (rosa) Banden mit dem Gen xyz. Markieren Sie den
Bereich, in dem das Gen xyz liegt!
Mögliche Restriktionskarten:
Agarosegel nach Elektrophorese:
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H + P + E
HindIII
PstI
EcoRI
H +P
E + P
H + E
Größenmarker
(Kbp)
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4. Sie haben Plasmid-DNA mit den Restriktionsendonukleasen PstI (P), EcoRI (E) und
HindIII (H) einzeln und paarweise doppelt geschnitten und die dabei entstandenen
Fragmente auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe der
Größenmarker können Sie jetzt alle Schnittstellen in die vorgegebene zirkuläre
Plasmidkarte eintragen.
Zeichnen Sie bitte auch noch in die linke Hälfte des Agarosegels ein, welche Banden Sie
sehen würden, wenn Sie die Plasmid-DNA zusätzlich mit allen drei Enzymen gleichzeitig
geschnitten und ebenfalls auf das Gel aufgetragen hätten.
EcoRI
Plasmidkarte
Schematische Darstellung des Agarosegels
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5. Sie haben ein 10,5 kb Plasmid (supercoiled) aus E. coli isoliert. Das Plasmid enthält
eine unikale Schnittstelle für EcoRI.
Das Plasmid wird bei 37°C in vier getrennten Reaktionsansätzen inkubiert, auf einem
Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV sichtbar gemacht.
In welcher Spur wurde das Ergebnis welcher Reaktion aufgetrennt? Begründen Sie
Ihre Wahl!
A
B
C
D
nur Puffer
DNaseI (nur kurze Inkubationszeit!!)
Topoisomerase I
EcoRI
4

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B) Southern-Blot Analyse
1. Sie interessieren sich für die Vererbung bestimmter Merkmale in Familien.
Im ersten Experiment wollen Sie überprüfen, in welcher Form ein bestimmtes Gen vorliegt.
Für diese Untersuchung stehen Ihnen zwei Sonden (5’-Sonde und 3’-Sonde) zur Verfügung
(siehe Abbildung Restriktionskarte).
Sie isolieren die DNA aus Zellen der Mundschleimhaut einer Person, führen die in der
Tabelle angegebenen Restriktionsspaltungen mit den Enzymen EcoRI (E), PstI (P) und
HindIII (H) aus und analysieren mittels Southern Blotting die hybridisierenden Banden.
Bitte tragen Sie in die Tabelle ein, welche Banden (Angaben in Kbp) Sie erwarten:
Restriktionskarte:
H
E E H E
P
5’-Sonde
P P
P 3’-Sonde P
0 0,5 1 2 3 4 Kbp
Restriktionsspaltung mit
Fragmentlängen in Kbp, die mit der
5’ Sonde 3’ Sonde
hybridisieren
HindIII
PstI
EcoRI
HindIII + PstI
HindIII + EcoRI
EcoRI + PstI
2. Vergleichen Sie Southern blot und Northern blot. Grenzen Sie die Anwendungsgebiete der
beiden voneinander ab.
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C) RFLP
Im zweiten Experiment analysieren Sie den Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
(RFLP), der mit einem anderen Merkmal gekoppelt ist und erhalten folgendes Bild einer
Familie:
*
4,3 Kbp
3,7 Kbp
3,1 Kbp
2,8 Kbp
2,5 Kbp
Erläuterung: gefüllte Kästchen (♂) bzw. Kreise (♀) sind Träger des Merkmals.
Fragen:
a) Gibt es Kopplung zwischen dem Merkmal und einer Bande?
Wenn ja, welche?
b) Was fällt Ihnen bei der Tochter auf, die mit einem * gekennzeichnet ist?
Nennen Sie zwei mögliche Ursachen für Ihre Beobachtung!
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D) Sequenzieren
Ihre Aufgabe ist es, ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu sequenzieren. Zu diesem Zweck
haben Sie das Fragment in einen geeigneten Vektor kloniert und das rekombinante Plasmid
gereinigt.
Sie wählen die Sanger-Methode, um Ihr Fragment zu sequenzieren. In der folgenden
Abbildung ist ein Ausschnitt des Plasmids gezeichnet. Fett und groß gedruckt ist die
Sequenz Ihres Fragments, dünn und etwas kleiner die (bekannte) Sequenz des Vektors
1. Geben Sie die Sequenz eines 8 Basen langen Primers an, der als Start für die
Sequenzreaktion geeignet ist und Ihnen erlaubt, möglichst viele Basen vom Beginn des
Fragmentes zu lesen. Beschriften Sie das 5’- und 3’-Ende des Primers
3’ ......GGCTAACGTATAGATCCTAGGTACAAACCTGA...... 5’
2. Nach der Anheftung des Primers teilen Sie den Reaktionsansatz in 4 Portionen und geben
diese in 4 Reaktionsgefäße, in denen sich, jeweils spezifisch für die 4 Basen, ein Gemisch
verschiedener Nukleotide und DNA-Polymerase befinden. Kreuzen Sie in der folgenden
Tabelle an, welche Nukleotide sich in den jeweiligen Reaktionsgefäßen befinden:
32 P-dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
„A“ „C“ „G“ „T“
3. Nach erfolgter Inkubationszeit tragen Sie die Reaktionsgemische auf ein Polyacrylamidgel
auf, trennen sie elektrophoretisch auf und machen die DNA-Banden autoradiographisch
sichtbar. In der folgenden Abbildung sehen Sie das Ergebnis der Autoradiographie.
Lesen Sie die Sequenz ab,
a) schreiben Sie sie in das unten vorgegebene Feld und
b) markieren Sie in 1), welchen Bereich ihres Fragmentes Sie lesen
können.
Denken Sie an die Beschriftung der 3’- und 5’-Enden!
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A C G T Minus-Pol
Laufrichtung
- des Gels
Plus-Pol
Gelesene Sequenz:
E) PCR
Sie sollen ein DNA-Fragment vervielfältigen und entscheiden sich für die PCR-Methode.
1. Was brauchen Sie neben der DNA für den Reaktionsansatz? Beschreiben Sie kurz
die einzelnen Schritte der PCR.
2. Warum wird bei der PCR keine Helicase benötigt?
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