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07 Skript Herstellung von Wein Sake und Bilanzierung2009c.…

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Übung 7 – <strong>Wein</strong>bereitung <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Stand WS 2009/2010<br />

INTERDISZIPLINÄRES PRAKTIKUM 7. ÜBUNG<br />

HERSTELLUNG VON FRUCHTWEIN UND JAPANISCHEM SAKE UND<br />

BILANZIERUNG DER ALKOHOLISCHEN GÄRUNG<br />

1. Gr<strong>und</strong>lagen<br />

1.1. Fruchtweinbereitung<br />

Die Technologie des <strong>Wein</strong>es, in Fachkreisen allgemein Kellertechnik genannt, wird<br />

in der BRD als Technologie zur Erzeugung qualitativ hochwertiger <strong>Wein</strong>e mit mög-<br />

lichst natürlichen, sortentypischen, in der Zusammensetzung harmonischen Charak-<br />

teristika verstanden. Die Erzeugung <strong>von</strong> <strong>Wein</strong>masse bleibt auf klimatisch begünstig-<br />

te <strong>Wein</strong>baugebiete, z.B. Frankreichs oder Italiens, beschränkt.<br />

In der EG-VO Nr. 3282/73, Art. 3 wird die <strong>Wein</strong>bereitung allgemein als Verarbeitung<br />

<strong>von</strong> frischen <strong>Wein</strong>trauben oder Maischen, Traubenmost, konzentriertem Trauben-<br />

most, teilweise gegorenem Traubenmost, Traubensaft, konzentriertem Traubensaft<br />

oder Jungwein zu <strong>Wein</strong> durch vollständige oder teilweise alkoholische Gärung be-<br />

schrieben. Die angesprochenen Möglichkeiten deuten einen starken technologischen<br />

Eingriff in die <strong>Wein</strong>bereitung an. Kontinuierliche Verfahren sind nur in Versuchsan-<br />

sätzen, kaum aber in der Praxis erkennbar, vorhandene ansatzweise Techniken<br />

bzw. Technologien müssen optimiert eingesetzt werden. Eine besondere Rolle spie-<br />

len die Beereninhaltsstoffe, die sowohl durch biologische Faktoren, wie Sorte, Klima,<br />

Boden <strong>und</strong> Reifezustand der Trauben, als auch durch die verarbeitenden Technolo-<br />

gien, wie Mahlen, Maischen <strong>und</strong> Pressen, bedingt werden.<br />

Im Praktikum soll <strong>Wein</strong> aus Äpfeln nach klassischem Verfahren in ruhenden Behäl-<br />

tern mit Gäraufsatz erzeugt werden. Einfluss auf die Qualität des Endproduktes kann<br />

dabei insbesondere durch den Zucker- <strong>und</strong> Säuregehalt sowie die Lagerdauer ge-<br />

nommen werden.<br />

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1.2. Japanischer <strong>Sake</strong><br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Gr<strong>und</strong>sätzlich benötigt man zur <strong>Sake</strong>herstellung nur Reis, Wasser <strong>und</strong> einen erfah-<br />

renen Fachmann, den Toji (<strong>Sake</strong>-Braumeister). Eine Kurzbeschreibung zur <strong>Sake</strong>-<br />

<strong>Herstellung</strong> sieht folgendermaßen aus:<br />

Als erstes muss der Reis poliert werden, d.h., die äußere Schicht des Reiskorns wird<br />

entfernt. Anschließend wird er gewaschen <strong>und</strong> gedünstet. Der gedünstete Reis wird<br />

dann mit Kouji (Reis, mit einem Schimmelpilz bewachsen) <strong>und</strong> Gärhefe vermischt.<br />

Dieses Gemisch wird in einem Gärbehälter in mehreren Schritten über vier Tage<br />

nochmals mit Reis <strong>und</strong> Wasser vermischt. Die anschließende Fermentation dauert<br />

ca. 18-32 Tage, danach wird der <strong>Sake</strong> abgepresst, filtriert <strong>und</strong> mit Wasser verdünnt.<br />

Besonders hervorzuheben ist der Unterschied zwischen der Fruchtweinbereitung<br />

<strong>und</strong> der <strong>Sake</strong>-<strong>Herstellung</strong>. Beim Fruchtwein werden <strong>von</strong> der Hefe die vorliegenden<br />

Zucker zu Ethanol <strong>und</strong> CO2 verstoffwechselt oder verbleiben als Aromastoffe, beim<br />

<strong>Sake</strong> liegt zunächst kein verstoffwechselbarer Zucker vor. Hier muss zunächst durch<br />

verschiedene mechanische Arbeitsschritte die Stärke im Inneren des Reiskorns ver-<br />

fügbar gemacht werden. Durch verschiedene Enzyme des Schimmelpilz Aspergillus<br />

oryzae wird dann die Stärke zuerst in verschiedene Zucker umgewandelt, die dann<br />

<strong>von</strong> der Gärhefe zu Ethanol verstoffwechselt werden oder als Aromastoffe verblei-<br />

ben. Beide Reaktionen laufen nebeneinander gleichzeitig ab.<br />

Reis ist ein Hauptnahrungsmittel der Japaner, so überrascht es eigentlich nicht, dass<br />

<strong>Sake</strong> während der langen Reisgeschichte entstanden ist. Bis Mitte des letzen Jahr-<br />

h<strong>und</strong>erts wurde <strong>von</strong> den <strong>Sake</strong>-Brauereien der auch zum Essen angebaute Reis zum<br />

<strong>Sake</strong>-Brauen benutzt. Mittlerweile wird dafür fast überall besonders grobkörniger<br />

Reis angebaut.<br />

Die Wasserqualität beeinflusst wesentlich die Qualität <strong>und</strong> den Geschmack des Sa-<br />

ke. Die geographische Lage der Brunnen (früher wurde direkt Flusswasser benutzt)<br />

<strong>und</strong> damit verb<strong>und</strong>en die Wasserhärte <strong>und</strong> Inhaltsstoffe bestimmen damit wesentlich<br />

den Geschmack. Das Wasser sollte Kalium, Kaliumphosphat <strong>und</strong> Salpetersäure ent-<br />

halten <strong>und</strong> einen Härtegrad zwischen 3 <strong>und</strong> 8 besitzen. Eisenhaltiges Wasser ver-<br />

dirbt den Geschmack völlig.<br />

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Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Der Toji (<strong>Sake</strong>-Braumeister) überwacht <strong>und</strong> kontrolliert alle Schritte der <strong>Sake</strong>herstel-<br />

lung. Er entscheidet anhand seiner Erfahrung, wann die verschiedenen Schritte der<br />

<strong>Sake</strong>-<strong>Herstellung</strong> beendet sind <strong>und</strong> die nächsten Schritte beginnen können. Mittler-<br />

weile gibt es zwar auch schon teil- <strong>und</strong> vollautomatisierte <strong>Sake</strong>-Brauereien, doch um<br />

einen hochwertigen <strong>Sake</strong> herzustellen, werden alle Schritte manuell <strong>und</strong> nach Ein-<br />

schätzung des Toji vorgenommen.<br />

Reispolierung. In der äußeren Schicht des Reiskorns befinden sich viele Proteine<br />

<strong>und</strong> Fette, die sich ungünstig auf Geschmack <strong>und</strong> Farbe des <strong>Sake</strong> auswirken. Daher<br />

wird der Reis poliert <strong>und</strong> dabei auf r<strong>und</strong> 70% reduziert, bei höherwertigem <strong>Sake</strong> so-<br />

gar bis auf 60-40%. Der Kern des Reiskorns enthält Stärke <strong>und</strong> darf dabei nicht be-<br />

schädigt werden. Beim Polieren darf sich der Reis auch nicht zu stark erwärmen, da<br />

sonst die Wasseraufnahme beeinträchtigt wird.<br />

Waschen <strong>und</strong> Wässern des Reis'. Zunächst wird durch Waschen des Reis das<br />

durch das Polieren entstandene weißliche Pulver entfernt, anschließend wird der<br />

Reis gewässert. Wie lange gewässert wird, entscheidet der Toji. Je nach Reissorte<br />

<strong>und</strong> Poliergrad kann dies wenige Minuten bis mehrere St<strong>und</strong>en dauern. Der Reis ist<br />

durch die Wasseraufnahme nun zum Dämpfen vorbereitet.<br />

Dämpfen. Der Reis wird nun über heißem Wasserdampf gedämpft. Im Gegensatz<br />

zum Kochen erreicht man damit eine etwas härtere Oberfläche des Korns mit einem<br />

weichen Kern.<br />

<strong>Herstellung</strong> <strong>von</strong> Kouji. Mit der <strong>Herstellung</strong> <strong>von</strong> Kouji wird der gesamte weitere Pro-<br />

zess nachhaltig beeinflusst. Hier entscheidet sich, ob <strong>Sake</strong> <strong>von</strong> guter oder schlechter<br />

Qualität entstehen wird. Das Können <strong>und</strong> die Erfahrung des Toji sind hier wichtig.<br />

Der abgekühlte gedämpfte Reis wird mit Kouji-Schimmelpilz (Aspergillus oryzae) in<br />

Form <strong>von</strong> einem dunklen feinen Puder bestreut. Anschließend wird alles in einen<br />

speziellen Raum mit hoher Luftfeuchte <strong>und</strong> konstanter Temperatur gebracht <strong>und</strong> für<br />

36-48 St<strong>und</strong>en immer wieder vermischt <strong>und</strong> kontrolliert. Das Endprodukt Kouji sieht<br />

dann aus wie Reiskörner, die einen Reifüberzug haben <strong>und</strong> riecht süßlich nach Kas-<br />

tanien. Kouji wird für den <strong>Sake</strong>-Prozess viermal hergestellt <strong>und</strong> wird jedes Mal sofort<br />

frisch verarbeitet.<br />

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Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Hefestartkultur (shubo oder moto). Hierzu werden frisches Kouji, gedämpfter Reis,<br />

Wasser <strong>und</strong> Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) miteinander vermischt, nach ca.<br />

zwei Wochen ist die Startkultur fertig <strong>und</strong> erreicht eine Hefezellenkonzentration <strong>von</strong><br />

ca. 100 Millionen Zellen in einem Teelöffel.<br />

Hauptkultur (moromi). Nachdem gedämpfter Reis, Kouji, Wasser <strong>und</strong> Hefestartkultur<br />

in einen größeren Gärbehälter gefüllt wurde, wird noch dreimal in einem Zeitraum<br />

<strong>von</strong> 4 Tagen gedämpfter Reis, Wasser <strong>und</strong> Kouji zugegeben. Grob geschätzt ver-<br />

doppelt sich dabei jedes Mal der Gäransatz. Die anschließende Fermentation dauert<br />

r<strong>und</strong> 18-32 Tage.<br />

Abpressen <strong>und</strong> Filtration des <strong>Sake</strong>. Nach Abschluss der Gärung (Zeitpunkt wird wie-<br />

der vom Toji bestimmt) wird der <strong>Sake</strong> abgepresst, meist in Kammerfilterpressen oder<br />

bei hochwertigem <strong>Sake</strong> in Säcken aus Leintüchern. Nach dem Abpressen wird der<br />

<strong>Sake</strong> für einige Tage zum Sedimentieren der verbliebenen Feststoffe stehen gelas-<br />

sen, anschließend meist mittels Aktivkohle gefiltert.<br />

Pasteurisation <strong>und</strong> Verdünnung des <strong>Sake</strong>. Überwiegend wird der <strong>Sake</strong> pasteurisiert,<br />

um ihn haltbar zu machen. Nicht pasteurisierter <strong>Sake</strong> schmeckt zwar frischer, muss<br />

aber gekühlt gelagert werden. Nach r<strong>und</strong> sechsmonatiger Lagerung zur Abr<strong>und</strong>ung<br />

des Buketts wird der <strong>Sake</strong> mit Wasser <strong>von</strong> r<strong>und</strong> 20 % (v/v) Alkohol auf ca. 16 % ver-<br />

dünnt <strong>und</strong> meist ein zweites Mal pasteurisiert.<br />

1.3. Bilanzierung der alkoholischen Gärung<br />

1.3.1. Theorie der Bilanzierung<br />

Parallel zur <strong>Wein</strong>gärung soll eine Bilanzierung durchgeführt werden. Als Produkt der<br />

Gärung wird die entstehende CO2-Menge bestimmt. Zur Bilanzierung wird da<strong>von</strong><br />

ausgegangen, dass die Zellmasse beim anaeroben Stoffwechsel annähernd kon-<br />

stant bleibt.<br />

Die Bestimmung der CO2-Menge erfolgt entweder mit einem Trommelgaszähler (Sa-<br />

ke-<strong>Herstellung</strong>) oder durch Wiegen des Gäransatzes (Fruchtwein-<strong>Herstellung</strong>), da<br />

durch Entweichen <strong>von</strong> CO2 eine Gewichtsabnahme stattfindet.<br />

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Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Der allgemeine Nutzen einer Bilanzierung stellt sich in den folgenden Punkten dar:<br />

1) Es ist möglich festzustellen, ob alle Edukte, Produkte <strong>und</strong> Nebenprodukte er-<br />

fasst <strong>und</strong> richtig gemessen wurden. Voraussetzung ist eine sehr genaue Ab-<br />

gasanalytik.<br />

2) Aus dem errechneten Respirationskoeffizienten (RQ) lässt sich ablesen, wel-<br />

che Stoffwechselaktivitäten die mikrobielle Kultur im betrachteten Zeitraum<br />

gerade ausführt (z.B. auf welchem Substrat die Kultur gerade wächst).<br />

3) Aus dem gemessenen (bzw. projektierten) Substratverbrauch pro Zeit lässt<br />

sich die Sauerstofftransferrate (OTR) berechnen. Für die Bioreaktorauslegung<br />

ist dies sehr nützlich.<br />

4) Aus den Sauerstofftransferraten kann man die biologische Wärmeentwicklung<br />

berechnen <strong>und</strong> in Verbindung mit den erforderlichen Leistungseinträgen<br />

(Rührenergie) die Mindestkühlleistung eines Fermenters abschätzen.<br />

5) Man kann abschätzen, ob pH-Änderungen zu erwarten sind, beispielsweise<br />

aus dem Verbrauch oder der Freisetzung <strong>von</strong> NH3.<br />

1.3.2. Funktionsprinzip eines Trommelgaszählers<br />

Das Gaszählergehäuse muss vor der ersten Messung mit einer Sperrflüssigkeit ge-<br />

füllt werden (in den meisten Fällen Wasser). Die Messtrommel, die in dieser Sperr-<br />

flüssigkeit rotiert, bildet mit dieser zusammen die eigentliche Messeinheit. Die Sperr-<br />

flüssigkeit erfüllt zwei Funktionen: Zum einen dichtet sie die aktive Messkammer ab,<br />

zum anderen wird durch den Pegelstand der Sperrflüssigkeit das Volumen der<br />

Messkammer definiert. Erst wenn diese Messkammer komplett gefüllt ist, schließt sie<br />

<strong>und</strong> die Messtrommel dreht sich zur nächsten Kammer. Unter Voraussetzung eines<br />

gasdichten Meßsystems wird somit eine sehr genaue Messung des Gasvolumens<br />

möglich. In Abbildung 1 ist der schematische Aufbau eines Trommelgaszählers ab-<br />

gebildet.<br />

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Abb. 1: Schematischer Aufbau eines Trommelgaszählers<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Das gemessene <strong>und</strong> angezeigte aktuelle Gasvolumen ist das Gasvolumen bei der<br />

aktuellen Gastemperatur <strong>und</strong> dem aktuellen Gasdruck. Das Norm-Volumen eines<br />

Gases ist dagegen das Volumen eines Gases bei Normbedingungen (273,15 K oder<br />

0 °C <strong>und</strong> 1,013 bar):<br />

Die Formel zur Umrechnung des aktuellen Volumens in das Norm-Volumen lautet:<br />

p<br />

a<br />

V N=<br />

Va<br />

⋅ ⋅<br />

p n<br />

T<br />

T<br />

N<br />

a<br />

mit VN Norm-Volumen [L]<br />

Va angezeigtes Volumen [L]<br />

pN Norm-Druck 1013 [mbar]<br />

pa aktueller Gasdruck [mbar]<br />

TN Norm-Temperatur 273,15 [K]<br />

Ta aktuelle Temperatur [K]<br />

Der am Manometer angezeigte Gasdruck ist der Differenzdruck zwischen dem Gas-<br />

druck am Gaseingang <strong>und</strong> dem aktuellen Atmosphärendruck. Das bedeutet, daß der<br />

in die obenstehende einzusetzende aktuelle Gasdruck (pa) der angezeigte Gasdruck<br />

am Manometer plus dem aktuellen Atmosphärendruck in [mbar] ist. Der Differenz-<br />

druck ist durch die gesamte Pegeldifferenz der Wassersäulen im linken <strong>und</strong> rechten<br />

Schenkel des U-Rohrs des Manometers gekennzeichnet.<br />

Seite 6/12


2. Methodik<br />

2.1. Fruchtweinbereitung<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Der Zuckergehalt des eingesetzten Saftes kann unter Verwendung eines enzymati-<br />

schen Testsets, durch HPLC oder auch durch Spindeln analysiert werden. Beim<br />

Spindeln nutzt man die Abhängigkeit der Dichte einer Lösung <strong>von</strong> den darin gelösten<br />

Stoffen. Geht man da<strong>von</strong> aus, dass der mit Abstand größte Teil der gelösten Sub-<br />

stanzen im Fruchtsaft Zucker ist, so kann man vereinfachend sagen, dass ein direk-<br />

ter Zusammenhang zwischen der Zuckerkonzentration <strong>und</strong> der Dichte des Saftes<br />

besteht. Die zur Dichtebestimmung eingesetzte Spindel zeigt auf der Skala Öchsle-<br />

grad an. Ferdinand Öchsle (1774-1852) verbesserte die <strong>von</strong> Mathäus Hahn (1739-<br />

1790) konstruierte Most- oder Öchslewaage. 1 Grad Öchsle entspricht einem<br />

Gramm, um das ein Liter Most schwerer ist als ein Liter reinen Wassers. Beispiel:<br />

Ein Most mit einem spezifischen Gewicht <strong>von</strong> 1090 g hat dann 90 °Öchsle. Die<br />

Öchslewaage ist auf eine Temperatur <strong>von</strong> 20°C geeich t. Bei einer Abweichung <strong>von</strong><br />

z.B. 4° (24°C) nach oben muss 1° Öchsle hinzugezähl t werden. Unter der Voraus-<br />

setzung, dass die Gewichtserhöhung nur durch den Zucker zustande kommt, erhält<br />

man nach der Formel<br />

[%] Zucker = (°Oe/4) - 2<br />

die Zuckerkonzentration des Mostes.<br />

Ein wichtiger Punkt bei der <strong>Wein</strong>herstellung ist auch der Säuregehalt des <strong>Wein</strong>es,<br />

zum einen als Geschmackskomponente, zum anderen durch den Einfluss auf die<br />

Gärung. Bei zu wenig Säure ist der pH-Wert zu hoch <strong>und</strong> das Wachstum <strong>von</strong> Fremd-<br />

keimen gegenüber Hefe, die saures Milieu bevorzugt, begünstigt. Bei zuviel Säure<br />

sinkt der pH-Wert so weit ab, dass Hefewachstum <strong>und</strong> Gärung gehemmt werden.<br />

Im Praktikum soll Apfelwein hergestellt werden.<br />

2.1.1. Vorkultur<br />

Es werden Vorkulturmedien aus 100 mL Saft <strong>und</strong> 0,5 g Hefeextrakt steril hergestellt.<br />

Zwei Gruppen impfen die Vorkultur mit je einer halben Flasche Steinberghefe an.<br />

Die Vorkulturen werden zwei Tage bei RT gelegentlich geschüttelt.<br />

Seite 7/12


2.1.2. Hauptkultur<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Die Äpfel werden gewaschen, geviertelt <strong>und</strong> das Kerngehäuse <strong>und</strong> schlechte Stellen<br />

entfernt. Die Äpfel werden gemahlen <strong>und</strong> abgepresst, der Saft wird in einen 15-L-<br />

Gärballon gegeben. Auf etwa 10 L Saft werden 15 mL Kitzinger Antigel zur besseren<br />

Klärung des Fruchtsaftes bzw. des –weines gegeben. Die Säfte werden auf Zucker-<br />

gehalt <strong>und</strong> Säure untersucht. Der Zuckergehalt des Fruchtsaftes sollte 110 bis 120 °<br />

Öchsle betragen. Dem Fruchtsaft werden weiterhin Hefenährsalz in einer Konzentra-<br />

tion <strong>von</strong> 2 g/10 L <strong>und</strong> Kaliumdisulfit in einer Konzentration <strong>von</strong> 1 g/10 L zugegeben.<br />

Es empfiehlt sich, einen Teil des Saftes abzunehmen <strong>und</strong> in einem kleineren Gefäß<br />

Nährsalze, Kaliumdisulfit <strong>und</strong> Zucker zuzugeben <strong>und</strong> zu lösen <strong>und</strong> dem Ansatz wie-<br />

der zuzufügen.<br />

Nach dem Lösen aller Stoffe werden 100 mL Probe entnommen <strong>und</strong> eine Säurebe-<br />

stimmung sowie eine erneute Zuckerbestimmung mit der Öchslewaage durchgeführt.<br />

Zur Säurebestimmung werden 10 mL Most mit 2 Tropfen Phenolphthalein vermischt<br />

<strong>und</strong> mit 0,15 m NaOH bis zum Farbumschlag titriert. Der Verbrauch an Lauge in mL<br />

entspricht 1,35 g/L Milchsäure (bei 10 mL Probe). Der Apfelmost sollte 7 g Säure/L<br />

enthalten. Bei zu niedrigem Wert wird mit Milchsäure korrigiert.<br />

Die Vorkultur wird zugegeben <strong>und</strong> das Gärgefäß mit wird mit dem <strong>Wein</strong>heber ver-<br />

setzt. Der Ansatz wird bei Raumtemperatur in den Sozialraum der Biotechnologie<br />

gestellt, es werden täglich Proben genommen (Kap. 2.1.3.). Nach etwa 14 Tagen<br />

wird die Hefe abgezogen, bei diesem Abstich muss erneut geschwefelt werden (1 g<br />

Kaliumdisulfit/10 L) <strong>und</strong> nach weiteren 10 Tagen kann verkostet werden.<br />

2.1.3. Analytik<br />

Der Ethanolgehalt wird gaschromatographisch bestimmt, der Zuckergehalt per HPLC<br />

<strong>und</strong> über Bilanzierung durch Wiegen des Gärbottichs (entwichenes CO2):<br />

- jeden Tag eine Probe (10 mL) nehmen (Datum <strong>und</strong> Uhrzeit notieren) <strong>und</strong><br />

Gesamtansatz wiegen<br />

- Probenahme mit 10-mL-Messpipette<br />

- 2 Eppicaps füllen <strong>und</strong> zentrifugieren<br />

- Überstand in neue Eppicaps füllen <strong>und</strong> bis zur späteren Analyse einfrieren<br />

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a) Zuckeranalytik mit HPLC<br />

<strong>Herstellung</strong> <strong>von</strong> Standardlösungen:<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Es wird ein Stammlösungsgemisch mit 3 Zuckern (Glucose, Fructose, Saccharose)<br />

hergestellt. Die Konzentration ist 5 mmol/L für jeden Zucker. Dann werden Standard-<br />

lösungen in den Konzentrationen 5, 10, 25 <strong>und</strong> 50 µM aus der Stammlösung ver-<br />

dünnt <strong>und</strong> 1 mL in HPLC-Vials gefüllt<br />

Einwaage Stammlösungsgemisch<br />

- Glucose-Monohydrat:: 0,0991 g<br />

- Fructose: 0,0901 g<br />

- Saccharose: 0,1712 g<br />

auffüllen auf 100 mL Gesamtlösung mit entionisiertem Wasser<br />

Konz. Zuckergemisch<br />

Verdünnung Menge Zuckergemisch<br />

Wasser ention.<br />

5 µM 1 : 1000<br />

100 µL<br />

900 µL<br />

in 2 Schritten<br />

10 µL<br />

990 µL<br />

10 µM 1 : 500<br />

100 µL<br />

900 µL<br />

in 2 Schritten<br />

20 µL<br />

980 µL<br />

25 µM 1 : 200 5 µL 995 µL<br />

50 µM 1 : 100 10 µL 990 µL<br />

<strong>Herstellung</strong> der Proben:<br />

Die eingefrorenen Proben werden bis auf Raumtemperatur aufgetaut <strong>und</strong> mit entionisiertem<br />

Wasser verdünnt:<br />

-<br />

Proben-Nr Verdünnung Menge Probe Wasser<br />

1 – 3 1 : 10 000<br />

in 2 Schritten<br />

4 – letzte 1 : 5 000<br />

in 2 Schritten<br />

10 – letzte 1 : 500<br />

in 2 Schritten<br />

Messung an der HPLC:<br />

10 µL<br />

10 µL<br />

20 µL<br />

10 µL<br />

100 µL<br />

20 µL<br />

990 µL<br />

990 µL<br />

980 µL<br />

990 µL<br />

900 µL<br />

980 µL<br />

Die Standards <strong>und</strong> Proben werden an der HPLC analysiert. Mit Hilfe der Flächen-<br />

Werte der Zucker-Peaks werden Eichgeraden erstellt <strong>und</strong> die Konzentration der un-<br />

bekannten Proben ermittelt.<br />

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) Ethanolmessung mit GC<br />

<strong>Herstellung</strong> <strong>von</strong> Standardlösungen<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Es werden 100 mL Ethanol <strong>und</strong> 100 mL 1-Butanol in einem Messkolben mit einer<br />

Konzentration <strong>von</strong> 10 mL/L hergestellt. Dazu sollte Ethanol mit möglichst hoher Rein-<br />

heit verwendet werden (kein 96%iger). Das 1-Butanol dient als interner Standard <strong>und</strong><br />

wird auch für die Proben benötigt. Aus diesen beiden Stammlösungen werden dann<br />

Standards (0,1; 0,5; 1,0 mL/L) für die Erstellung einer Eichgerade in GC-Vials ver-<br />

dünnt:<br />

Konz. Ethanol Ethanol (10 mL/l) 1-Butanol (10<br />

mL/l)<br />

Wasser ention.<br />

0,1 mL/L 10 µL 100 µL 890 µL<br />

0,5 mL/L 50 µL 100 µL 850 µL<br />

1,0 mL/L 100 µL 100 µL 800 µL<br />

<strong>Herstellung</strong> der Proben:<br />

Die Proben werden aufgetaut, bis sie Raumtemperatur haben <strong>und</strong> mit entionisiertem<br />

Wasser sowie dem int. Standard 1-Butanol verdünnt.<br />

Proben-Nr Verdünnung Menge Probe Wasser 1-Butanol<br />

1 9:10 900 µL - 100 µL<br />

2 1:10 100 µL 800 µL 100 µL<br />

3 – letzte 1:100 10 µL 890 µL 100 µL<br />

Die Standards <strong>und</strong> Proben werden am GC analysiert. Mit Hilfe der Flächen-Werte<br />

werden Eichgeraden erstellt <strong>und</strong> die Konzentration der unbekannten Proben ermit-<br />

telt.<br />

2.2. <strong>Sake</strong>herstellung<br />

So wie in Kapitel 1.2 beschrieben kann in diesem Praktikum kein <strong>Sake</strong> hergestellt<br />

werden, da es viel zu aufwändig wäre. Dank unseres japanischen Gastprofessors<br />

Herrn Prof. Dr. Kato haben wir jedoch eine Übersetzung einer japanischen Kurzan-<br />

leitung zur <strong>Sake</strong>herstellung für den Hausgebrauch bekommen, nach der in diesem<br />

Versuch <strong>Sake</strong> hergestellt wird.<br />

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2.2.1 Vorkulturen<br />

10 g/L Hefeextrakt<br />

20 g/L Pepton aus Casein (pankreatisch verdaut)<br />

20 g/L Glucose wasserfrei (22,00 g/L Glucose-Monohydrat)<br />

pH-Wert auf 5.5-6.0 einstellen, dann autoklavieren.<br />

Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Es werden 10 x 500 mL Medium in 1000mL Erlenmeyerkolben benötigt. Angeimpft<br />

wird nach Terminplan mit 2 Impfösen Saccharomyces cerevisiae bzw. 2 Impfösen<br />

Aspergillus oryzae, inkubiert werden die Kolben für 2 Tage bei 25°C u nd 200 U/min.<br />

2.2.2 <strong>Herstellung</strong> <strong>von</strong> Kouji<br />

Auf das Reispolieren wird verzichtet <strong>und</strong> stattdessen 400 g Milchreis eingesetzt, der<br />

bereits zu einem höheren Grad poliert ist als herkömmlicher Reis. Er wird gewa-<br />

schen <strong>und</strong> über Nacht gewässert. Anschließend wird er für 30 Minuten gedünstet.<br />

Nach dem Abkühlen wird der Reis mit der Vorkultur Aspergillus oryzae vorsichtig<br />

vermischt <strong>und</strong> für ca. 15 h kugelförmig im Topf aufgeschichtet <strong>und</strong> bei 30 °C inku-<br />

biert. Danach wird der Reis ausgebreitet auf eine Dicke <strong>von</strong> ca. 2 cm <strong>und</strong> für weitere<br />

24 h inkubiert. Sobald das Kouji wie mit Reif überzogen aussieht, ist es fertig <strong>und</strong><br />

kann zur Hauptkultur zugefügt werden. Ist das 2., 3., oder 4. Kouji vor Ablauf der 2<br />

Tage fertig, wird es ggf. kühlgestellt, da sonst ein grünlicher Überzug aus Sporen<br />

entsteht, der den Geschmack beeinträchtigt. Das Kouji sollte süßlich schmecken <strong>und</strong><br />

leicht nach Kastanien duften.<br />

2.2.3 Hauptkultur (moromi)<br />

Weitere 400 g gewässerter <strong>und</strong> gedünsteter Milchreis werden mit dem fertigem Kou-<br />

ji, der Sacharomyces cerevisiae - Vorkultur <strong>und</strong> 1600 mL Wasser vermischt. Der pH<br />

– Wert wird mit Milchsäure auf ca. pH 5.0 eingestellt. Anschließend wird der Trom-<br />

melgaszähler an den Gärballon angeschlossen <strong>und</strong> der Gärballon bei 16 °C in der<br />

Klimakammer inkubiert. Um das Eindringen <strong>von</strong> Schaum in den Trommelgaszähler<br />

zu verhindern, wird eine Schaumfalle zwischen Gärballon <strong>und</strong> Trommelgaszähler<br />

angeschlossen.<br />

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Übung 7 – <strong>Wein</strong>, <strong>Sake</strong> <strong>und</strong> Bilanzierung<br />

Jeweils nach 2 Tagen wird insgesamt noch 3 mal erneut frisches Kouji, 400 g Reis<br />

(gewässert <strong>und</strong> gedünstet) <strong>und</strong> 1600 mL Wasser zugegeben <strong>und</strong> weiter im Klima-<br />

schrank inkubiert. Dies ist nun der endgültige Gäransatz, der bis zum Abschluss der<br />

Gärung (ca. 14 Tage) einmal täglich gerührt werden muss.<br />

Bevor der <strong>Sake</strong> verkostet werden kann, wird er abzentrifugiert, um ihn <strong>von</strong> den<br />

Schwebstoffen zu befreien. Anschließend wird der Ethanolgehalt mittels HPLC be-<br />

stimmt <strong>und</strong> der <strong>Sake</strong> mit Wasser auf 16 Vol% Alkohol verdünnt.<br />

3. Auswertung<br />

Im Protokoll sollen die ermittelten Ausgangsbedingungen des eingesetzten Frucht-<br />

saftes, die vorgenommenen Korrekturen, der Verlauf der <strong>Wein</strong>bereitung anhand der<br />

Zucker- <strong>und</strong> Ethanolkonzentrationen dargestellt <strong>und</strong> diskutiert werden. Aus der Bi-<br />

lanzierung soll die Menge der ursprünglich im Saft vorhandenen Zucker mittels einer<br />

Kohlenstoffbilanz überprüft werden.<br />

Für die <strong>Sake</strong>fermentation sollen zum einen die Messergebnisse der Gasuhr gra-<br />

phisch dargestellt <strong>und</strong> der Verlauf diskutiert werden als auch der erzielte Alkoholge-<br />

halt mit diesen Werten verglichen werden.<br />

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