09 Penicilin - Institut für Biotechnologie der RWTH

RWTH Aachen, Lehrstuhl für Biotechnologie, Worringer Weg 1, 52056 Aachen
PRAKTIKUM BIOTECHNOLOGIE 9. ÜBUNG
1. Grundlagen
1.1. Penicillintypen
Fermentationstechnische Erzeugung von Penicillin G
Penicilline sind Stoffwechselprodukte bestimmter Schimmelpilze der Gattungen Penicillium und
Aspergillus. Zur technischen Produktion werden insbesondere Stämme der Arten Penicillium notatum
und Penicillium chrysogenum verwendet.
Die enorme wirtschaftliche Bedeutung der Penicilline (ca. 3000 Tonnen pro Jahr) basiert auf der anti-
biotischen Wirkung gegenüber vielen grampositiven Bakterien. Penicilline hemmen die Vermehrung
der Bakterien und werden deshalb bei bestimmten Infektionskrankheiten in großem Maße therapeu-
tisch genutzt. Ihre spezifische Hemmwirkung beruht überwiegend auf einer Blockierung der Mura-
min-Biosynthese der Bakterien.
Die verschiedenen Penicilline haben folgende gemeinsame Grundstruktur:
R⎯CO⎯NH⎯CH⎯CH C⎯(CH3)2
⏐ ⏐ ⏐
⏐ ⏐ ⏐
CO⎯N⎯⎯⎯CH⎯COO ⎯
S
Sie setzen sich zusammen aus einem Thiazolidinring (rechts), einem ß-Lactamring (Mitte) und einer
Seitenkette (links). Die einzelnen natürlich vorkommenden Penicilline unterscheiden sich in der Art
des Seitenkettenrestes R.
Seitenkettenrest R Chemischer Name Trivialname
CH 3 -CH 2 -CH=CH-CH 2 - 2-Pentenylpenicillin Penicillin F
CH3-(CH2)3-CH2- n-Pentylpenicillin Dihydropenicillin F
CH3-(CH2)5-CH2- n-Heptylpenicillin Penicillin K
⎯CH2- Benzylpenicillin Penicillin G
HO⎯ ⎯CH2- p-Hydroxybenzylpen. Penicillin X
HO⎯ ⎯O-CH 2 - Phenoxymethylpen. Penicillin V

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Die Wirksamkeit (Aktivität) von Penicillin wurde ursprünglich definiert als die Penicillinkonzentra-
tion, die unter bestimmten Bedingungen das Wachstum eines Teststammes von Staphylococcus
aureus gerade zu hemmen vermochte. Die so festgelegte internationale Einheit (IE) entspricht der
Aktivität von 0,6 µg Penicillin-G-Natriumsalz mit 98%iger Reinheit.
Penicillin G, das bedeutendste Penicillin, ist eine relativ starke Säure mit einem pK-Wert von 2,75.
Sie ist aus wässrigen Lösungen bei pH-Werten zwischen 2 und 3 mit organischen Lösungsmitteln
(Amylacetat, Butylacetat) extrahierbar. Das Natriumsalz und andere Salze von Penicillin G (die bei
einem neutralen pH-Wert vorliegen) sind hingegen unlöslich in diesen Lösungsmitteln und leicht
löslich in Wasser, Methanol und Ethanol. Diese unterschiedliche Löslichkeit der Salze und der freien
Säuren von Penicillin ist Grundlage der Isolierung und Reinigung. Die Penicilline sind relativ
empfindliche Verbindungen, die bei Zimmertemperatur und pH-Werten unter 3 zu Penicill(in)säure
gespalten werden. Bei der Penicillinextraktion im sauren Bereich ist daher Kühlung erforderlich.
Auch im alkalischen Bereich (pH > 8) werden Penicilline gespalten und zwar in diesem Fall zu Peni-
cillosäure; die gleiche Spaltungsreaktion wird auch enzymatisch durch die sog. "Penicillinase", eine
ß-Lactamase, durchgeführt. Dieses Enzym wird von vielen penicillinresistenten Bakterien gebildet.
Besonders wegen der Penicillinaseaktivität vieler Bakterien ist die Penicillinfermentation außer-
ordentlich empfindlich gegen Infektionen und muss deshalb unter sterilen Bedingungen durchgeführt
werden.
Durch ein weiteres Enzym, die Penicillinacylase, wird die Seitenkette der Penicilline abgespalten. Die
Acylase wird insbesondere von Escherichia coli und anderen Enterobakterien gebildet. Bei der Sei-
tenkettenabspaltung resultiert 6-Aminopenicillansäure, aus der teilsynthetisch andere, in der Natur
nicht vorkommende Penicilline (z.B. Methycillin, Ampicillin, Phenethicillin) durch Koppelung mit
einer entsprechenden Seitenkette hergestellt werden.
1.2. Penicillinfermentation
Für die fermentationstechnische Herstellung von Penicillinen, insbesondere Penicillin G, wurden die
ursprünglich verwendeten Wildstämme (1940) im Laufe der Zeit durch immer leistungsfähigere Mut-
anten ersetzt. Während die Ausgangsstämme weniger als 100 IE/mL an Penicillin zu erzeugen ver-
mochten, produzieren die heutigen industriellen Hochleistungsstämme bis zu 20 000 IE/mL; das
entspricht einer Konzentration von über 1% reinem Penicillin im Kulturfiltrat. Bei den Hochleis-
tungsstämmen handelt es sich meist um Abkömmlinge der "Wisconsin-Familie" von Penicillium
chrysogenum, deren Stammbaum in Abb. 1 wiedergegeben ist.
Stand: 18.06.2009

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Abb. 1: Stammbaum der Wisconsin-Familie
In dem Stammbaum (Abb. 1) haben die Kleinbuchstaben zwischen den einzelnen Stämmen folgende
Bedeutung:
s = Selektion ohne Behandlung mit mutationsauslösenden Agenzien
x = Selektion nach Röntgenbestrahlung
uv-I = Selektion nach UV-Bestrahlung bei 275 nm
uv-II = Selektion nach UV-Bestrahlung bei 253,4 - 253,7 nm
NM = Selektion nach Behandlung mit Senfgas
Während in den Anfangsjahren der großtechnischen Penicillingewinnung im Oberflächenverfahren
gearbeitet wurde, erfolgt die Produktion heute ausschließlich im Submersverfahren. Wegen der dabei
auftretenden hohen Viskosität der Mycelsuspension sind turbulente Rührfermenter mit separater
Düsen- oder Ringrohrbelüftung üblich.
Stand: 18.06.2009

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Die Produktionsstufen haben Größen von meist 50 bis 100 m 3 Volumen. Die Vorfermenter (zur An-
zucht und Vermehrung des Pilzes) haben üblicherweise eine um je eine Zehnerpotenz kleinere Größe.
Eine typische Fermenterreihe besteht demnach aus folgenden Einzelstufen (Beispiel) :
Anzuchtlabor - 800 mL in 4 Schüttelkolben
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- 8 L Fermenter (Anzucht)
Betrieb - 80 L Fermenter (Anzucht)
- 800 L Fermenter (Anzucht)
- 8 m 3 Fermenter (Anzucht)
- 80 m 3 Fermenter (Produktionsstufe)
Die Bedingungen, die an die Anzuchtstufen und an die Produktionsstufe gestellt werden, sind unter-
schiedlich. In der Anzuchtphase soll eine möglichst optimale Mycelvermehrung nach Zeit und Aus-
beute, in der Produktionsstufe eine optimale Penicillinausbeute erzielt werden.
Typische Bedingungen gehen aus folgender Tabelle hervor.
Prozentangaben in w/v Anzuchtstufe Produktionsstufe
Glucose (%) 3 - 6 0
Lactose (%) 0 2 - 6
Maisquellwasser 50 %ig (%) 4 - 8 4 - 8
NaNO 3 (%) 0,02 0
KH 2 PO 4 (%) 0,05 0,05
MgSO 4 x 7 H 2 O (%) 0,02 0,02
CaCO 3 (%) 0,2 - 1 0,2 - 1
Temperatur (°C) 26 - 30 24 - 27
Belüftung (V/V min) 0,5 - 1 0,5 - 1
Fermentationsdauer (h) 24 - 36 70 - 150
Die Beimpfung der ersten Stufe im Anzuchtlabor wird in der Regel mit Konidiosporen des Pilzes vor-
genommen, die durch Ausstreichen einer Stammkultur-Abimpfung auf Nähragar und dessen Bebrü-
tung erhalten wird. Da die verwendeten Hochleistungsstämme nur schwer zur Konidienbildung zu
bewegen sind, wurden (empirisch) besondere "Sporulationsmedien" entwickelt. Die Zusammenset-
zung eines solchen Nährbodens ist unter Methoden (Kap. 2.1.) wiedergegeben. Auf Medien dieser Art
wird die Konidienbildung auf Kosten der Mycelbildung gefördert.

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Nach 5 - 7tägiger Inkubation bei 24 - 26 °C werden die Konidien mit sterilem Wasser unter Zusatz
eines oberflächenaktiven Mittels abgespült und als Impfmaterial für die erste Anzuchtstufe benutzt.
Hierbei geht man von der "Faustregel" aus, dass ein Liter Anzuchtmedium mit mindestens 10 9 Koni-
diosporen zu beimpfen ist. Bei geringerer Konidieneinsaat bildet sich leicht sogenanntes Kugelmycel,
das sich relativ langsam vermehrt und einen etwas anderen, für die Penicillinfermentation uner-
wünschten Stoffwechsel aufweist. Demgegenüber ist bei der submersen Zitronensäurefermentation
Kugelmycelbildung erwünscht.
Infolge des großen Wettbewerbs der Produktionsfirmen um den Antibiotikamarkt ist die Industrie
gezwungen, abweichend von den oben skizzierten klassischen Fermentationsmethoden, mit noch
billigeren Rohstoffen zu arbeiten. Als C-Quelle für die Anzucht wird heute überwiegend Melasse oder
Stärkehydrolysat verwendet. Statt der Lactose wird zum Teil Glucose oder Melasse auch in der
Produktionsstufe eingesetzt; allerdings ist dabei ein Zulaufverfahren notwendig, da leicht assimilier-
bare Zucker die Penicillinbiosynthese katabolisch reprimieren.
Eine beträchtliche Ausbeutesteigerung wird durch Zusatz von fertigen Teilstücken des Penicillinmo-
leküls ("precursor") in das Fermentationsmedium erreicht. Als "precursor" kommen insbesondere
Cystein und Valin (für den Thiazolidin- und ß-Lactamring) sowie Phenylessigsäure (für die Seiten-
kette) in Betracht. Optimale Zugabemengen betragen bei Cystein ca. 0,1 % (bezogen auf Substratvo-
lumen) und bei Phenylessigsäure 0,3 - 0,4 %. Bei Valin ist die "precursor"-Wirkung uneinheitlich,
sehr geringe Mengen werden eingebaut, Mengen in der Größenordnung von 0,1 % wirken hemmend.
Die beiden Aminosäuren sind im allgemeinen in den angewandten komplexen N-Quellen (Maisquell-
wasser) in ausreichender Menge enthalten. Phenylessigsäure muss jedoch gesondert zugesetzt werden.
Es ist dabei ungünstig, wenn die gesamte Menge auf einmal zugesetzt wird, weil Phenylessigsäure in
dieser Konzentration den Stoffwechsel des Pilzes stark hemmt. Dieser Seitenketten-"precursor" wird
deshalb in 6 bis 10 Teilmengen im Verlauf der fortgeschrittenen Fermentation - beginnend ca. 24
Stunden nach Beimpfung - als sterile Lösung zugesetzt. Da Phenylessigsäure nahezu wasserunlöslich
ist, verwendet man das wasserlösliche Natriumsalz.
Stand: 18.06.2009

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2. Methodik
2.1. Anzucht von Penicillium chrysogenum
Die Gruppen arbeiten mit:
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Penicillium. chrysogenum DSM 844
Die Gruppen setzen je 2 1-L-Erlenmeyerkolben m. Schikanen mit 250 mL des folgenden Substrates
an:
Glucosemonohydrat 5,00 % (w/v)
Maisquellwasser (50 %ig) 6,00 % (w/v)
NaNO 3
KH 2 PO 4
0,02 % (w/v)
0,05 % (w/v)
MgSO 4 x 7 H 2 O 0,02 % (w/v)
CaCO 3
0,8 % (w/v)
mit Leitungswasser auffüllen und 20 min bei 121 °C sterilisieren
Zum Animpfen werden mit einem Korkbohrer (8 mm ∅) 2x 4 Scheiben einer gut bewachsenen
Agarplatte ausgestochen. In jeden der beiden Erlenmeyerkolben kommen 4 Scheiben. Die Kolben
werden 48 h bei 25 °C bebrütet.
2.2. Hauptfermentation
Die Fermentation wird im Braun- bzw. Infors-Laborfermenter durchgeführt. Es wird eine pH-
Elektrode und die automatische Antischaumdosierung benutzt. Es ist darauf zu achten, dass die
Rührerblätter nicht zu hoch angebracht werden. Es sollte während der Fermentation im
Fermenterinnenraum nicht spritzen. Es sollte das große Ernterohr eingebaut und das kleine Septum
zur Nachdosierung eingebaut sein.
Jede Gruppe bereitet Substrat (1,2 L/1 L) der folgenden Zusammensetzung vor:
CaCO 3
1 % (w/v)
Lactose 3,5 % (w/v)
Glucose Monohydrat 0,1 % (w/v)
KH 2 PO 4
0,4 % (w/v)
Maisquellwasser (50 %ig) 6,0 % (w/v)
Olivenöl 0,2 % (w/v)
mit Leitungswasser auffüllen und 30 min sterilisieren

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Das Arbeitsvolumen beträgt 1,7 L/1,5 L (1,2 L Hauptfermentationsmedium + 0,5 L Vorkultur). Der
Abluftfilter wird in ein Becherglas gelegt.
Alle Gruppen geben während der Fermentation Phenylacetat mit einer sterilen Spritze steril zu. Es
werden 10 g Phenylessigsäure in 30 mL 2,45 M NaOH gelöst (für 4 Gruppen). Der pH-Wert sollte
zwischen 6,0 und 8,0 liegen.
Folgende Fermentationsbedingungen sollen eingehalten werden:
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Temperatur 24 °C
Rührerdrehzahl 800 Upm
Belüftung 1 V/V min
pH ca. 7 (regulieren mit Phosphorsäure)
Das Animpfen sollte möglichst spät am Tag geschehen, da von den Gruppen erstmals 15 h nach Fer-
mentationsbeginn 2,5 mL Phenylacetatlösung steril zugegeben wird. Dazu wird die angegebene
Menge Phenylacetatlösung (sterilfiltriert) in eine Einwegspritze mit Kanüle gefüllt und durch das
Septum in den Fermenter injiziert Die weiteren Zugaben erfolgen ebenfalls in 2,5 mL Portionen in
24 h Abständen.
2.3. Kontrolluntersuchungen
In Abständen von 24 h sind von jeder Gruppe folgende Bestimmungen vorzunehmen:
Für eine sterile Probennahme sollte der Schlauch vor und nach der Probename in 70% Ethanol
getaucht sein.
- Myceltrockengewicht
- pH-Wert
- Penicillingehalt (Plattendiffusionstest)
- mikroskopische Prüfung auf Infektion !!
Außerdem wird am Ende der Fermentation die Brühe so aufgearbeitet, dass jede Gruppe mehr oder
weniger reines penicillinhaltiges Pulver zum Test einsetzen kann.
Es wird eine Nullprobe genommen. Danach wird jeden Tag steril eine Probe genommen.

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Myceltrockengewicht
Zur Bestimmung des Myceltrockengewichts werden 20-50 mL Suspension über ein Rundfilter auf der
Vakuumnutsche filtriert; das Filtrat dient weiteren Untersuchungen und wird deshalb weggenommen,
bevor das abfiltrierte Mycel zur Entfernung von CaCO 3 mit 1%iger Salzsäure gewaschen wird. Das
gewaschene Mycel wird von dem Papierfilter vorsichtig mit einer Pinzette abgezogen bei 105 °C im
Aluschälchen über Nacht getrocknet. Nach dem Abkühlen im Exsikkator wird es gewogen. Da bei der
Nullprobe zu wenig Mycel im Fermenter ist, wird dieser TG-Wert mit Hilfe von Zentrifugenröhrchen
bestimmt. Das Filtrat wird sterilfiltriert in Eppendorf-Cups aufbewahrt. Pro Probe benötigt man beim
Hemmhoftest mind. 1 mL.
Plattendiffusionstest
Der Penicillingehalt wird mit Hilfe des Plattendiffusionstests ermittelt. Hierzu werden genau 25 mL
steriler Standard-I-Nähragar (2% Agar) in sterile Petrischalen mit planem Boden abgefüllt, erstarren
und mit der Agarfläche nach oben 3 Tage abtrocknen gelassen. Pro Gruppe werden ca. 35 Platten be-
nötigt.
Der Testorganismus Bacillus subtilis ATCC 6633 wird in 50 mL St-I-Bouillon eingeimpft und 3 h bei
28 °C geschüttelt. Dann werden 5 mL vorbereiteter St-I-Agar (St-I-Bouillon mit 1 % Agar) aufge-
schmolzen, auf 50 °C temperiert (im Wasserbad einstellen) und mit 0,1 mL Kultur beimpft. Dieser
beimpfte Nähragar wird gleichmäßig über die erste Schicht verteilt. Man lässt ihn dann ca. 15 min er-
starren. Mit Hilfe eines sterilen Korkbohrers (Durchmesser: 10 mm) werden 2 Löcher ausgestanzt und
dann mit 0,2 mL einer Standard-Penicillinlösung befüllt, die 2,0; 1,5; 1,0; 0,5; 0,25 IE/mL enthält.
Diese Standardkurve ermittelt jede Gruppe für sich. Andere Petrischalen werden mit den zu
prüfenden Lösungen beschickt. Es wird eine Vierfach-Bestimmung durchgeführt, d.h. für jede zu
messende Lösung werden 2 Agarplatten benötigt. Zur Entwicklung wird bei 25 °C 16 - 18 h bebrütet.
In dieser Zeit diffundiert das Penicillin aus den ausgestanzten Löchern in die Agarschicht und unter-
drückt das Wachstum der Testorganismen, wodurch im Umkreis der Löcher keimfreie Zonen, die
Hemmhöfe, entstehen. Die Durchmesser der erhaltenen Hemmhöfe werden ausgemessen; sie sind
Gradmesser für die Wirkungsstärke der angewandten Penicillinlösung. Mit Hilfe einer aus 10 - 20
Standardplatten aufgestellten Eichkurve wird die Aktivität in IE/mL bei den Kulturfiltraten (ggfs.
nach Verdünnung) ermittelt.
Herstellung der Penicillinstammlösung:
- 118,8 mg Penicillin-G-Natriumsalz (FLUKA, 99 %ig) einwiegen
- auf 100 mL im Messkolben auffüllen ⇒ 2000 IE/mL
- Verdünnung: 1 : 1000 ⇒ 2 IE/mL
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- diese Stammlösung wird sterilfiltriert und mit sterilem Wasser können die Eichlösungen
hergestellt werden
Aufarbeitung der Kulturbrühe am Ende der Fermentation:
Folgende Lösungen werden für die Extraktion benötigt:
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1) Glycin/HCl-Puffer: Komponente A): Glycin 1M (75,1 g/L) + NaCl 1M (58,5 g/L)
2) Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,5; 1,0 M
3) Butylacetat
Komponente B): HCl 1 M -Puffer pH 1,7; 1,0 M
Herstellen des 1M Glycin/HCl-Puffers, pH 1,7 (50 mL pro Gruppe):
! 50 mL 1M HCl (aus 32 %iger HCl; M= 36,46; d= 1,16)
d.h. 4,911 mL auf 50 mL mit entionisiertem Wasser auffüllen
! 50 mL 1 M Glycin/1M NaCL-Lösung(Glycin: M=70,07 g; NaCl: M=58,44 g)
d.h.3,7535 g Glycin und 2,922 g NaCl auf 50 mL mit entionisiertem Wasser auffüllen
Puffer: 29,15 mL 1 M HCl
20,85 mL 1M Glycin/1M NaCl-Lösung
Herstellen des 1 M Kalium-Phosphat-Puffers pH 7,5 (50 mL pro Gruppe)
! 50 mL 1 M K2HPO4 (M = 174,19 g)
8,709 auf 50 mL mit entionisiertem Wasser auffüllen
! 20 mL 1 M KH2PO4 (M = 136,09 g)
2,7218 g auf 20 mL mit entionisiertem Wasser auffüllen
Puffer: 42 mL 1 M K2HPO4
8 mL 1 M KH2PO4
Es werden 50 mL der Fermentationsbrühe zentrifugiert. Der Überstand wird für die weitere Aufarbei-
tung verwendet. Es wird mit einem Scheidetrichter gearbeitet. Alle verwendeten Lösungen müssen
auf ca. 4 °C gekühlt sein. Es muss zügig gearbeitet werden, da sich die Ausbeute sehr rasch
vermindert. Es werden aus jeder wässrigen Phase Proben gezogen.

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1. Extraktion: 50 mL Kulturfiltrat
Stand: 18.06.2009
+ 50 mL Puffer pH 1,7
+ 75 mL Butylacetat
- kurz gut schütteln (Phasentrennung abwarten,
ca.1 min), wässrige Phase verwerfen (Volumen bestimmen)
2. Extraktion: + 50 mL Puffer pH 7,5
- schütteln und Phasentrennung abwarten, organische Phase verwerfen,
Phasenvolumen bestimmen (→ Probe für Plattendiffusionstest)
In der wässrigen Phase sollte sich das Penicillin befinden. 3mL werden aufbewahrt (Gefrierschrank)
und später auf Penicillingehalt untersucht. Der größere Teil wird in einem geeigneten Gefäß gefrier-
getrocknet und später ebenfalls auf Penicillingehalt untersucht.
Bei den Bestimmungen per Plattendiffusionstest sollten mehrere Verdünnungen getestet werden, um
in den linearen Bereich der Eichgerade zu kommen. Aus den Ergebnissen soll berechnet werden, wie
viel Penicillin im Lyophilisat und in den wässrigen Phasen der Extraktion vorhanden wäre, wenn der
gesamte Fermenterinhalt aufgearbeitet worden wäre. Ebenfalls sollen die aus der Extraktion und
Lyophilisation resultierenden Aktivitätsverluste angegeben werden.