09 Penicilin - Institut für Biotechnologie der RWTH

Praktikum Biotechnologie Übung 9 Blatt 8/10
Myceltrockengewicht
Zur Bestimmung des Myceltrockengewichts werden 20-50 mL Suspension über ein Rundfilter auf der
Vakuumnutsche filtriert; das Filtrat dient weiteren Untersuchungen und wird deshalb weggenommen,
bevor das abfiltrierte Mycel zur Entfernung von CaCO 3 mit 1%iger Salzsäure gewaschen wird. Das
gewaschene Mycel wird von dem Papierfilter vorsichtig mit einer Pinzette abgezogen bei 105 °C im
Aluschälchen über Nacht getrocknet. Nach dem Abkühlen im Exsikkator wird es gewogen. Da bei der
Nullprobe zu wenig Mycel im Fermenter ist, wird dieser TG-Wert mit Hilfe von Zentrifugenröhrchen
bestimmt. Das Filtrat wird sterilfiltriert in Eppendorf-Cups aufbewahrt. Pro Probe benötigt man beim
Hemmhoftest mind. 1 mL.
Plattendiffusionstest
Der Penicillingehalt wird mit Hilfe des Plattendiffusionstests ermittelt. Hierzu werden genau 25 mL
steriler Standard-I-Nähragar (2% Agar) in sterile Petrischalen mit planem Boden abgefüllt, erstarren
und mit der Agarfläche nach oben 3 Tage abtrocknen gelassen. Pro Gruppe werden ca. 35 Platten be-
nötigt.
Der Testorganismus Bacillus subtilis ATCC 6633 wird in 50 mL St-I-Bouillon eingeimpft und 3 h bei
28 °C geschüttelt. Dann werden 5 mL vorbereiteter St-I-Agar (St-I-Bouillon mit 1 % Agar) aufge-
schmolzen, auf 50 °C temperiert (im Wasserbad einstellen) und mit 0,1 mL Kultur beimpft. Dieser
beimpfte Nähragar wird gleichmäßig über die erste Schicht verteilt. Man lässt ihn dann ca. 15 min er-
starren. Mit Hilfe eines sterilen Korkbohrers (Durchmesser: 10 mm) werden 2 Löcher ausgestanzt und
dann mit 0,2 mL einer Standard-Penicillinlösung befüllt, die 2,0; 1,5; 1,0; 0,5; 0,25 IE/mL enthält.
Diese Standardkurve ermittelt jede Gruppe für sich. Andere Petrischalen werden mit den zu
prüfenden Lösungen beschickt. Es wird eine Vierfach-Bestimmung durchgeführt, d.h. für jede zu
messende Lösung werden 2 Agarplatten benötigt. Zur Entwicklung wird bei 25 °C 16 - 18 h bebrütet.
In dieser Zeit diffundiert das Penicillin aus den ausgestanzten Löchern in die Agarschicht und unter-
drückt das Wachstum der Testorganismen, wodurch im Umkreis der Löcher keimfreie Zonen, die
Hemmhöfe, entstehen. Die Durchmesser der erhaltenen Hemmhöfe werden ausgemessen; sie sind
Gradmesser für die Wirkungsstärke der angewandten Penicillinlösung. Mit Hilfe einer aus 10 - 20
Standardplatten aufgestellten Eichkurve wird die Aktivität in IE/mL bei den Kulturfiltraten (ggfs.
nach Verdünnung) ermittelt.
Herstellung der Penicillinstammlösung:
- 118,8 mg Penicillin-G-Natriumsalz (FLUKA, 99 %ig) einwiegen
- auf 100 mL im Messkolben auffüllen ⇒ 2000 IE/mL
- Verdünnung: 1 : 1000 ⇒ 2 IE/mL
Stand: 18.06.2009