Prof. Dr. H.-P. Bruch Eine - Universität zu Lübeck

Aus der Klinik für Chirurgie
des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein
Campus Lübeck
Direktor: Prof. Dr. H.-P. Bruch
Eine neue Methode zur quantitativen Endotoxinbestimmung
mittels monoklonalem Antikörper WN1 222-5
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein
Campus Lübeck
vorgelegt von
Jan Nolde
aus Berlin
Lübeck 2004

1. Berichterstatter: Prof. Dr. K.H. Staubach
2. Berichterstatter: Prof. Dr. H. Brade
Tag der mündlichen Prüfung: 9.12.2004
1

Meinen Eltern in Dankbarkeit
gewidmet
2

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Fragestellung 7
1.1 Endotoxin: Struktur und Wirkung 7
1.2 Wirkung von Endotoxin 11
1.3 Endotoxin-Toleranz 15
1.4 Bisherige Endotoxin-Test Verfahren 18
1.5 Anti-Endotoxin Antikörper 18
1.6 Fragestellung und Ziel 19
2. Material und Methode 20
2.1 Verwendete Antikörper 20
2.1.1 Wn1 222-5 20
2.1.2 Iso-Antikörper 20
2.1.3 Fluoreszenzantikörper 20
2.2 Verwendete Endotoxine 21
2.2.1 Salmonella fridenau 21
2.2.2 Salmonella abortus equii 21
2.3 Tiere 22
2.3.1 Vorbehandlung der Tiere 22
2.3.2 Präparation und Messungen 23
2.4 Antikörperpräparation 26
2.4.1 Zellisolation 27
2.4.2 Membrangebundener Ansatz 27
2.4.3 Internalisierter Ansatz: 27
2.5 Inkubations-Vorversuche 28
2.5.1 Verdünnungsreihen 28
2.5.2 Internalisierungskinektik 29
2.6 Durchflußzytometrische Analysen 30
2.7 Berechnungen und Statistik 34
3. Eigene Ergebnisse 36
3.1 Überlebenszeit 36
3

3.2 Kardiopulmonale Parameter 37
3.3 Metabolische Parameter 45
3.4 Körpertemperatur 46
3.5 Endotoxinnachweis Inkubation: Verdünnungsreihen 47
3.5.1 Membranständiges Endotoxin 47
3.5.2 Internalisiertes Endotoxin 50
3.6 Endotoxinnachweis Inkubation: Zeitliche Kinetik 54
3.6.1 Membranständiges Endotoxin 54
3.6.2 Internalisiertes Endotoxin 57
3.7 Endotoxinnachweis In-vivo Versuche 59
3.7.1 Präoperative Messungen: Membranständiges Endotoxin 59
3.7.2 Präoperative Messungen: Internalisiertes Endotoxin 61
3.7.3 Intraoperative Messungen: Membranständiges Endotoxin 62
3.7.4 Intraoperative Messungen: Internalisiertes Endotoxin 65
4. Diskussion 68
4.1. Literaturübersicht (frühere Untersuchungen) 68
4.1.1. Endotoxin-Testverfahren 68
4.1.2 Endotoxin-Antikörper 70
4.1.3 Endotoxin-Aufnahme durch Phagozyten 73
4.2. Vergleich der eigenen mit früheren Untersuchungen 74
4.3. Kritische Erörterung der eigenen Befunde und Schlussfolgerungen 79
5. Zusammenfassung 82
6. Literaturverzeichnis 84
7. Anhang 101
8. Danksagung 118
9. Lebenslauf 119
4

Abkürzungsverzeichnis
A. Arterie
Abb. Abbildung
BE Basenabweichung (base excess)
BPI bactericidal permeability increasing protein
BSA bovines Serumalbumin
CI Herzindex (cardiac index)
D-Hep D-glycero-D-manno-heptose
E.coli Escherichia coli
EKG Elektrokardiographie
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ET Endotoxin
FITC Fluoresceinisothiocyanat
g Erdbeschleunigung (9,81 ms -2 )
GlcN Glucosamin
GlcN3N 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-Glucose
Hb Hämoglobinkonzentration
HDL High-density Lipoprotein
HZV Herzeitvolumen
IL Interleukin
i.m. intramuskulär
i.v. intravenös
Kdo 2-keto-3-Deoxyoctonsäure
KG Körpergewicht
L-Hep L-glycero-D-manno-heptose
LAL Limulus amoebocyte lysate
LBP Lipopolysaccharid bindendes Protein
LPS Lipopolysaccharid
mAk monoklonaler Antikörper
MAP arterieller Mitteldruck
mCD14 membranständiges CD14
min Minuten
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
MODS Multiples Organdysfunktions-Syndrom
MOF Multiorganversagen (multiple organ failure)
MOV Multiorganversagen
MPAP pulmonalarterieller Mitteldruck
NaCl Natriumchlorid
paO 2 arterieller Sauerstoffpartialdruck
paCO 2 arterieller Kohlendioxidpartialdruck
PBS Phosphate Buffered Saline
PCWP pulmonal-kapillärer Verschlussdruck
PgvO 2 gemischt-venöser Sauerstoffpartialdruck
PVR pulmonalarterieller Gefäßwiderstand
r-Form rough-form
s-Form smooth-form
S.a.e. Salmonella abortus equii
S. friedenau Salmonella friedenau
SaO 2 arterielle Sauerstoffsättigung
sCD14 gelöstes CD14
5

SgvO 2 gemischt-venöse Sauerstoffsättigung
SV Schlagvolumen
SVI Schlagvolumenindex
SVR systemischer Gefäßwiderstand
TLR4 Toll-like receptor 4
TNF Tumor-necrosis-factor
V. Vena
ZVD zentraler Venendruck
6

1. Einleitung
1.1 Endotoxin: Chemische Struktur
Als Endotoxine bezeichnet man obligate Bestandteile der Zellwand von gramnegativen
Bakterien. Ihr erster Nachweis gelang 1892 Pfeiffer, der zeigte, dass die parenterale Gabe von
Lysaten von Vibrio cholerae am Versuchstier Wirkungen wie Fieber, Blutdruckabfall,
Verbrauchskoagulopathie bis hin zum Schock verursachte [97]. Er nahm an, dass diese
hitzestabile toxische Komponente des Bakteriums innerhalb (Altgriechisch: „Endo“) der Zelle
lokalisiert sein musste. Westphal, Lüderitz und Bister konnten in den 50er Jahren erstmals den
strukturellen Aufbau der Endotoxine aufzeigen [135]. Biochemisch sind Endotoxine
Lipopolysaccharide (LPS), Makromoleküle, die an der äußeren Zellmembran verankert sind
[107]. Dabei zeigen alle Formen von LPS einen grundsätzlich vergleichbaren, aus 3 Anteilen
bestehenden Aufbau (Abb. 1.1.1): Eine O-spezifische Polysaccharidkette, ein Kern(Core-)
oligosaccharid und ein Lipoid A Anteil.
Abb. 1.1.1: Aufbau der chemischen Grundstruktur von Endotoxinen
(nach [1])
7

Der lipophile Anteil Lipoid A ist in die äußere Bakterienzellmembran eingebettet [46];
charakteristisch ist die Anwesenheit eines biphosphorylierten ß-(1,6)-D-Hexosamin-
Disaccharids, bei Enterobacteriaceae ist dies Glucosamin (GlcN) bei anderen Bakterien 2,3-
diamino-2,3-dideoxy-D-Glucose (GlcN3N) oder eine Mischung aus beiden, außerdem
Fettsäuren und Phosphate [107]. Je nach Typ des Bakteriums finden sich eine
unterschiedliche Anzahl von Fettsäuren und Substituenten (siehe Abb. 1.1.2).
Abb. 1.1.2: Chemische Struktur von Lipoid A-Molekülen von (A) E.coli und (B)
N.meningitidis (nach [1]). Die Zahlen in den Kreisen geben hierbei die Anzahl der Acyl-Reste
an.
8

Die im nächsten Abschnitt beschriebenen pathogenen Wirkungen von LPS lassen sich
ausschließlich der Lipoid A Gruppe zuordnen. 1975 bewies Galanos diese bereits 1954 von
Lüderitz und Westphal postulierte Wirkung, indem er mit gelöstem, freiem Lipoid A die
gleichen pyrogenen Wirkungen wie mit LPS erzielte [33]. Dabei zeigte sich, dass die
maximale Wirkung des Lipoid A Anteils nach Synthese unterschiedlicher accylierter
Moleküle von den acylierten Gruppen abhängt. In der Natur ebenso vorkommende pentaacylierte
Lipoid A Moleküle zeigen geringe oder keine Endotoxin-Aktivität, wie z.B.
Chlamydia trachomatis, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus oder Aquifex
pyrophylus [98, 104, 125].
An der 6´-Position aller Lipoid A Moleküle kovalent gebunden ist der hydrophile
Polysaccharid-Anteil des Lipopolysaccharids, der sich in einen Core-Anteil und eine O-
spezifische Seitenkette aufteilen lässt.
Diese Seitenkette repräsentiert den strukturell variabelsten Ort des LPS, und wird aus sich bis
zu 50mal wiederholenden Oligosacchariden gebildet. Die Synthese der O-spezifischen Kette
wird im Bakterium durch den wb* oder rfb Genlokus festgelegt. Bakterielle Mutanten, ohne
wb*-Lokus, synthetisieren daher LPS-Moleküle ohne O-spezifische Seitenkette [103]. Diese
in-vitro wachsenden Mutanten werden aufgrund ihrer Morphologie bei der Kolonisation, als
r(rough)-Form bezeichnet, im Gegensatz zur s(smooth)-Form des Wild-Typs [110].
Einen wesentlich einheitlicheren Aufbau zeigt die Kern-Region: Sie wird in einen inneren
(inner core) und einen äußeren (outer core) Teil aufgegliedert. Die „outer core“ Region
besteht hauptsächlich aus Hexosen, wie D-Glucose, D-Galactose, D-Glucosamin, N-
Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin [13]. Die „inner core“ Region zeigt den
charakteristischsten und strukturell einheitlichsten Teil der Polysaccharidregion: Er besteht
aus – in der Natur äußerst selten vorkommenden – 3-deoxy-D-manno-Octulosonsäure (auch
als 2-keto-3-Deoxyoctonsäure (Kdo) bezeichnet) und L- oder D-glycero-D-manno-heptose
(L,D-Hep bzw. D,D-Hep), gebunden an Phosphat-, Diphosphat- oder Diphosphoethanolamin-
Gruppen [46]. Die Kdo-Region stellt hierbei die eigentliche Verbindung des
Polysaccharidanteils zum Lipoid A Anteil des Endotoxins dar. Abbildung 1.1.3 zeigt, wie
LPS-Moleküle in der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums verankert sind.
9

Abb. 1.1.3: Aufbau der Hülle gramnegativer Bakterien (nach [1])
Die äußere Zellmembran ist dabei asymmetrisch angelegt. Der nach außen gerichtete Lipid-
Anteil wird dabei zu 75% vom Lipoid A Teil der LPS-Moleküle gebildet, während der nach
innen gerichtete Teil aus Phospholipiden und acyl-Moietin der bakteriellen Lipoproteine
besteht, welche die äußere Membran mit dem periplasmatischen Peptidoglykan-Netzwerk
verankern [21].
Die einzige bislang bekannte Gruppe gramnegativer Bakterien, die kein LPS enthalten, sind
einige wenige Subspezies der Sphingomonaden, deren äußere Zellmembran stattdessen
Glycosphingolipide enthalten [56, 57].
10

1.2 Wirkung von Endotoxin
Wie bereits beschrieben, befinden sich Endotoxine an exponierter Stelle an der äußeren
Zellmembran gramnegativer Bakterien. Sie sind verantwortlich für eine Vielzahl von
Wechselwirkungen des Bakteriums mit dem Organismus. Zum einen verhindert Endotoxin
die Phagozytose oder Opsonisation des Bakteriums, zum anderen besitzt es antigene
Eigenschaften. Im Unterschied zu den Exotoxinen grampostitiver Bakterien wird die
pathogene Wirkung der Endotoxine nur dann frei, wenn diese aus der Zellwand herausgelöst
werden [108]. Diese erfolgt im Rahmen des Wachstums [20], oder bei Bakteriolyse im
Rahmen der körpereigenen Abwehr oder antibiotischen Therapie [48]. Die toxische Wirkung,
vermittelt durch den Lipoid A Anteil des LPS [106] wird nicht dadurch ausgeübt, daß LPS
direkt Zellen angreift, zerstört oder sie in ihren Funktionen hemmt, vielmehr schädigt
Endotoxin den Organismus durch die Freisetzung wirtseigener Mediatoren. Entscheidende
Bedeutung erlangt hierbei die Zytokinexpression, darunter die proinflammatorischen
Interleukine IL-1ß und IL-6, der TNF-_, die Lipide Thromboxan A 2 , Leukotrien C 3 , sowie
reduzierende Sauerstoffradikale, Stickoxid (NO) und das O 2 -Radikal [10, 14, 38, 43, 68, 94].
Abbildung 1.2.1 zeigt eine solche, durch gramnegative Bakterien ausgelöste Kaskade des
septischen Schocks.
Abb. 1.2.1 Kaskade der Ereignisse im septischen Schock
In zahlreichen Studien konnte nachgewiesen werden, dass LPS ein wesentlicher Induktor der
pathophysiologischen Reaktionen im Verlauf des septischen Geschehens ist [79]. Nach
11

Eindringen und Zirkulation im Organismus bindet LPS an eine Reihe von Proteinen, zum
Beispiel das „Bactericidal permeability increasing protein“ (BPI), einem zytotoxischen, von
polymorphkernigen Granulozyten produziertem kationischen Protein, das durch Bindung an
LPS dessen biologische Wirkungen verhindert [25]. Damit steht es in direkter Konkurrenz zu
dem strukturell sehr ähnlichen Lipopolysaccharid-bindende-Protein (LBP); ein 60 kD
schweres, in der Leber synthetisiertes, glucosyliertes Akutphaseprotein [120].
Abb. 1.2.2 LBP-katalysierte Reaktionen [140]
Abkürzungen: siehe Text
Das LBP katalysiert dabei eine Reihe von Reaktionen (siehe Abb. 1.2.2): Zunächst die
Desaggregierung von LPS-Komplexen und in Folge die Bindung an High-density
Lipoproteine (HDL), mit darauffolgendem Abbau [138], oder die Bindung an gelöste oder
membranständige CD14-Rezeptoren (sCD14 bzw. mCD14), und schließlich auch den
Transfer von sCD14-LPS-Komplexen zu LPS-HDL Bindungen [140]. Wenn die Menge des
12

freien LPS die Kapazität genannter Neutralisierungssysteme übersteigt, entfaltet es an seinen
Zielzellen (vor allem Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen) seine
immunstimulierende, aber auch toxische Wirkung [31]. Hierbei können auch CD-14 negative
Zellen durch sCD14-LPS Komplexe aktiviert werden, wie dendritische Zellen, glattmuskuläre
Zellen oder Fibroblasten. Die einzige Gemeinsamkeit scheint die Expression des Toll-like
Rezeptors 4 (TLR4) zu sein [30], dem eine Hauptrolle in der Vermittlung der LPS-Wirkung
zukommt [101, 123].
Oben schon erwähnter CD-14 Rezeptor ist darüber hinaus in der Lage außer LPS eine
Vielzahl von bakteriellen- und Pilzstrukturen zu binden. Dazu zählen Polysaccharide [26],
Elemente grampositiver Bakterien [109], Lipoproteine und bestimmte Hefepilzantigene [87].
Neben CD-14 gibt es an Phagozyten eine Reihe weiterer Rezeptorstrukturen, den „Scavenger
Receptor“ und den CD-18-Rezeptor, deren Rolle aber wahrscheinlich nicht die Vermittlung
der sekretorischen Antwort ist [139], sowie einige weitere Oberflächenproteine, deren
biologische Bedeutung bislang nicht geklärt ist. Intrazellulär führt die Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-_-B und verschiedener Kinasen zur Bildung einer Reihe von
Mediatoren [62, 80, 118]: Bereits in kleinsten Mengen wirkt die Freisetzung von Interferon-_
(IFN-_) immunstimulierend, wohingegen die Bildung von TNF-_, Il-1ß, Il-6, Thromboxan
A 2 , Leukotrien C 4 , sowie PAF und Sauerstoffradikalen zu Reaktionen wie Fieber,
Leukopenie, disseminierter intravasaler Gerinnung, Hypotension, Schock, und schließlich
zum Tod führen kann (siehe Abb. 1.2.3).
13

Abb. 1.2.3 Pathophysiologie der Sepsis (nach [108])
Dieses System von Reaktionen, das normalerweise der Abwehr von Infektionen dient,
dekompensiert hierbei in einer unausgewogenen Reaktion, die schließlich im septischen
Schock und dem Tod enden kann.
14

1.3 Endotoxin-Toleranz
Neben den in Kapitel 1.2 erwähnten toxischen Effekten, kann Endotoxin in geringer
Konzentration durchaus auch nützliche Eigenschaften entfalten. Dazu zählen Resistenz gegen
Strahlen-induzierte Knochenmarksdepression [9], immunstimulatorische und Tumornekrotisierende
Effekte in der onkologischen Therapie [90], sowie die Bildung einer
unspezifischen Toleranz gegen Infektionen durch Endotoxine.
Diese Hyposensibilität wird als Endotoxin-Toleranz bezeichnet [40, 53]. Entdeckt wurde
dieses Phänomen Anfang des 20. Jahrhunderts, als man im Rahmen der bakteriellen
Vakzinierung bemerkte, dass zur Aufrechterhaltung des therapeutisch induzierten Fiebers
wiederholte und steigende Mengen an Vakzine notwendig waren [130, 131]. Dabei lassen
sich zwei unterschiedliche Endotoxintoleranzformen voneinander unterscheiden:
1. Die frühe Endotoxin-Toleranz.
Sie ist Antikörper-unspezifisch, tritt wenige Tage nach Stimulierung auf, erreicht ihr
Maximum nach 3-4 Tagen und klingt nach 10-14 Tagen wieder ab [119].
Danach benötigt der Körper diesen Schutzmechanismus nicht mehr, da zwischenzeitlich
spezifische Antikörper gebildet werden konnten. Diesen Mechanismus bezeichnet man als:
2. Die späte Endotoxin-Toleranz.
Sie ist Antikörper-spezifisch und verläuft parallel zum Vorhandensein der O-spezifischen
Polysaccharid-Seitenkette.
1988 konnten Freudenberg und Galanos nachweisen, daß die Ausbildung der Endotoxin-
Toleranz ein Makrophagen-abhängiger Effekt ist [32]. Bislang sind zwei zelluläre
Mechanismen, die für die Vermittlung der Endotoxin-Toleranz verantwortlich gemacht
werden, bekannt. Zum einen die Hyporeagibilität der Makrophagen auf Endotoxin, zum
anderen die Inhibition der Expression toxischer Metaboliten durch Makrophagen [144]. Auf
molekularer Ebene werden diese Effekte durch eine veränderte Aufnahme und Freisetzung
von Arachidonsäuremetaboliten aus spezifischen Phospholipid-Pools [111], sowie einer
veränderten Bildung von Guanin-regulatorischen Proteinen [18] vermittelt, wobei die genauen
Mechanismen noch unklar sind.
15

1.4 Bisherige Endotoxin-Test Verfahren
In der heutigen Zeit immer noch sehr hohe Mortalitätsraten septischer Patienten, sowie ein
Anteil von bis zu 50% dieser Komplikation bei Patienten auf Intensivstationen [12, 17],
unterstreichen die Wichtigkeit einer möglichst frühen Erkennung dieses Krankheitsbildes.
Wenn pro- und antiinflammatorische Mechanismen erst aus dem Gleichgewicht gebracht
worden sind und sich die klinischen Manifestationen der Sepsis zeigen (Tab. 1.4.1), kann es
für therapeutische Intervention schon zu spät sein.
Klinische Hinweise für eine Infektion:
-Temperatur >38,3 °C oder < 35,6 °C
-Tachykardie > 90/min
-Tachypnoe > 20/ min bei Spontanatmung
Mindestens eines der folgenden Zeichen einer Organinsuffizienz:
-Verwirrtheitszustand
-Hypoxie (arterieller pO2 < 72 mm Hg bei Raumluft)
-erhöhter Laktatspiegel
-Oligurie (< 30 ml/ h oder < 0,5 ml/ kg/ h)
Tab. 1.4.1: Kriterien der Sepsis (nach [12])
1964 entdeckten Bang und Levin [5, 63], dass das Blutzellen-Lysat des nordamerikanischen
Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus) in Anwesenheit von LPS geliert. Aus dieser
Entdeckung entwickelte sich der LAL-Test (Limulus amebocyte lysate assay) [64]. Diese
Technik verlangte allerdings, dass die Plasmaproteine der Probe (menschliches Vollblut) mit
Hilfe von Chloroform entfernt wurden, ein Vorgang der bis zu 24 Stunden dauerte. Danach
sollte Endotoxin mit einer Genauigkeit von 0,05 ng/ml gemessen werden können. Levin wies
in weiteren Studien nach, dass der LAL-Test hochspezifisch sei, und auch unter
Antibiotikatherapie keine falsch-negativen Ergebnisse zeigte [65]. Schon zu dieser Zeit waren
16

Hauptkritikpunkte an dem Verfahren die lange Testzeit, sowie die ungenügende Genauigkeit
der Gel-clot Methode.
Dies führte 1977 zur Entwicklung eines chromogenen LAL-Tests [86], der die
Empfindlichkeit durch ein spektrophotometrisches Verfahren um den Faktor 10 verbesserte.
Weitere Empfindlichkeitssteigerungen konnten Anfang der 90er Jahre durch die Verwendung
von neuen Diazo-derivaten der para-nitroanilin Chromophoren erzielt werden [127, 141]. Bei
allen technischen Verbesserungen, blieb als Problem aber immer die mangelnde
Vergleichbarkeit der aus den Pfeilschwanzkrebsen gewonnenen LAL-Reagenzien [54], sowie
die Extraktion der Plasmaproteine, ein zeitaufwendiges Verfahren, das entweder die
interferierenden Substanzen unzureichend eliminierte, oder zu einem Verlust eines Teiles der
Endotoxinmenge führte [51]. Während im Liquor auch unter klinischen Bedingungen bei
Patienten mit Meningitiden verlässliche Ergebnisse erzielt werden konnten [84], zeigten alle
größeren Studien, die Vollblut als Probe verwendeten, keine eindeutigen Ergebnisse und
sprachen dem LAL-Test seinen klinischen Nutzen ab [24, 126]. In den letzten Jahren hat eine
genauere Betrachtung der Limulus-Kaskade eine nur teilweise mit dem Komplementsystem
von Wirbeltieren vergleichbaren Reaktion gezeigt [1], möglicherweise die methodisch
bedeutsamste Einschränkung des LAL-Tests.
Alle anderen klinisch einsetzbaren Sepsistests messen lediglich Reaktionen des Organismus
auf LPS, wie Zytokin- oder Komplementfaktoren-Plasmaspiegel, Akutphase-Proteine oder
Procalcitonin [122, 129].
17

1.5 Anti-Endotoxin Antikörper
Eine neue denkbare Methode Endotoxin direkt zu messen, besteht in der Verwendung eines
spezifisch an Endotoxin bindenden Antikörpers. Polyklonale Antikörper sind als Produkt
verschiedener B-Zell-Klone gegen verschiedene Epitope des Antigens gerichtet und damit für
diagnostische Zwecke zu unspezifisch, darüber hinaus sind sie nicht reproduzierbar. Auch in
therapeutischer Hinsicht ist ihr Nutzen umstritten [15].
Monoklonale Antikörper (mAk) dagegen sind spezifisch gegen ein bestimmtes Epitop
gerichtet. Ihre Herstellung gelang 1975 erstmals durch Köhler und Milstein [77]; hierbei
werden die Zellklone durch Verschmelzung von Plasmazellen der immunisierten Tiere mit
Myelomzellen gebildet. In einem Selektivmedium werden diejenigen Hybridome isoliert, die
sowohl das notwendige Enzym der Plasmazelle, als auch die unbegrenzte
Proliferationsfähigkeit der Myelomzelle besitzen.
Problematisch ist jedoch, dass anti-Endotoxin mAk, die spezifisch an die O-Seitenkette
binden, aufgrund der hohen Variabilität des LPS-Moleküls in diesem Bereich (siehe 1.1), nur
an homologes LPS bzw. Bakterien binden. Ein Beispiel hierfür ist der zwar hoch spezifische
Antikörper gegen Hämophilus influenza b, der sich jedoch für den klinischen Einsatz als zu
wenig sensitiv erwiesen hat [76]. Zur klinisch relevanten Messung von Endotoxin ist
demzufolge ein Antikörper notwendig, der eine breite Kreuzreaktivität besitzt, um an
möglichst vielen verschiedenen LPS-Molekülen und gleichzeitig hochspezifisch
ausschließlich an LPS zu binden. Der Lipoid A Teil des LPS scheidet mangels Spezifität
aufgrund seiner IgM-Klasse aus, sodass nur die core-Region des LPS aufgrund ihres
einheitlichen Aufbaus einen idealen Ansatzpunkt bietet. Bisherige Versuche einen solchen
Antikörper herzustellen, hatten aufgrund mangelnder Kreuzreaktivität, nur begrenzter
Spezifität der Core-Bindung und dem Unvermögen die S-Form des LPS zu binden, bislang
wenig Erfolg [3, 99, 114]. DiPadova et al. [22] gelang es 1993 erstmals einen murinen mAk
mit den genannten Eigenschaften herzustellen, der für unsere Versuchsreihe eingesetzt wurde
(siehe Kapitel 2.1.1).
18

1.6 Fragestellung und Ziel
Aufgrund der hohen Letalität der Septikämien von gram-negativen Erregern, und dem Mangel
an validen, klinisch durchführbaren Testverfahren, war es Ziel der vorliegenden Arbeit ein
neues, hochsensitives und –spezifisches Testverfahren, mit Hilfe eines murinen monoklonalen
anti-core LPS-Antikörpers zu entwickeln.
Erstmalig sollte an einem standardisierten Schweinemodell die LPS-Aufnahme in Leukozyten
während eines experimentell geschaffenen Endotoxinschocks quantifiziert, und die
Sensitivität dieses neuartigen Testverfahrens bestimmt werden.
Da bislang lediglich Hypothesen das Phänomen einer verlängerten Überlebenszeit im Zustand
der Endotoxin-Toleranz erklären, sollte darüber hinaus ein möglicherweise unterschiedliches
Verhalten der LPS-Aufnahme in Leukozyten nach Endotoxin-Toleranz Induktion untersucht
werden.
19

2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Antikörper
2.1.1 WN1 222-5
Zur selektiven Endotoxinmarkierung wurde ein muriner monoklonaler Antikörper (WN1 222-
5) in einer Konzentration von 1 mg/ml verwendet, der uns freundlicherweise von Prof. H.
Brade aus dem Forschungszentrum Borstel zur Verfügung gestellt wurde. Er gehört zur
IgG2a-Klasse und wurde bis zur Präparation bei 4°C gelagert. Seine Herstellung gelang
Padova et al. 1993 [22]. Hierbei wurden Mäuse mit den Stämmen aller E.coli Kernstrukturen
(E.coli F576, E.coli F653, E.coli F470, E.coli F2513 und E.coli O18rf) und zusätzlich mit
Salmonella minnesota R60 geimpft. Die daraufhin gewonnenen Klone wurden anhand ihrer
Kreuzreaktivität selektiert. WN1 222-5 bindet im Maus-Tiermodell an sämtliche E.coli,
Salmonella und Shigella core-Strukturen [4]. Dieser Antikörper diente in unserer
Versuchsreihe als Primärantikörper, und wurde in einem zweiten Versuchsschritt mit einem
sekundären Fluorochrom-markierten Antikörper (siehe Kapitel 2.1.3) markiert, dessen
Aktivität durchflusszytometrisch gemessen wurde.
2.1.2 Iso-Antikörper
Um unspezifische Reaktionen des Sekundärantikörpers auszuschließen, wurde jede
Antikörperpräparation parallel mit einem nicht-LPS Antikörper der Klasse IgG2a als
Nullprobe durchgeführt. Hierzu wurde der Antikörper 03020D der Firma Pharmingen
(Mingen) mit der Konzentration von 1mg/ml verwendet. Dieser Antikörper wurde nach
Vorschrift des Herstellers bei 4 °C gelagert.
2.1.3 Fluoreszenzantikörper
Zur Fluoreszenzmarkierung diente ein Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (M32204) der IgG2a-
Klasse in der Konzentration 1mg/ml von der Firma Caltag Laboratories, (Burlingame, USA).
Dieser Antikörper wurde bei 4°C im Dunkeln gelagert, auch die Präparation fand ohne
direktes Raum- oder Tageslicht statt. Dieser Sekundär-Antikörper ist Phycoerythrin-markiert,
20

sein PE-Emissionsspektrum wurde, wie unter Kapitel 2.6 beschrieben, mithilfe eines
Durchflusszytometers gemessen.
2.2 Verwendete Endotoxine
2.2.1 S.enterica serovar friedenau
Zur Induktion des Endotoxinschocks wurde bei sämtlichen Versuchstieren, sowie bei allen
Inkubationsreihen das Endotoxin von S.enterica serovar friedenau (Stamm H909) in einer
Konzentration von 1 mg/ml verwendet, dass uns wiederum von Prof. H. Brade aus dem
Forschungszentrum Borstel zur Verfügung gestellt wurde.
Dieser Ansatz wurde bei 4 °C gelagert. Am Versuchstag erfolgte die Verdünnung mit
isotonischer, pyrogenfreier Phosphat-Pufferlösung (PBS-Dubelco Behringwerke AG,
Marburg) auf eine Konzentration von 1 µg/ml. Die für die Inkubationen der in-vitro
Vorversuche erforderliche Mengen wurden direkt aus diesem Ansatz pipettiert. In gleicher
Weise wurde eine Konzentration von 10 µg/ml für die in-vivo Versuche eingestellt. Ein
Volumen von 50 ml dieses Ansatzes wurde nach 30-minütiger Mischung im sterilen
Magnetrührer per Perfusor als kontinuierliche Endotoxin Challenge-Dosierung dem
Versuchstier zugeführt. Aufgrund der Hitze- und Photosensibilität wurden sämtliche
Endotoxinansätze erst zum Gebrauchszeitraum hergestellt und Reste nach Versuchsende
verworfen.
2.2.2 S.enterica serovar abortus equii
Zur Endotoxintoleranzinduktion wurde Endotoxin von S.enterica serovar abortus equii
verwendet, das uns ebenfalls von Prof. H. Brade aus dem Forschungszentrum Borstel zur
Verfügung gestellt wurde. Auch dieses Endotoxin, in einer Konzentration von 1 mg/ml
vorliegend, wurde bei 4 °C gelagert, erst zur jeweiligen Immunisierung wurden
Konzentrationen von 25, 50, 150 und 250 ng/ml zur Toleranzinduktion der Versuchstiere
eingestellt.
21

2.3 Tiere
Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den §§7-9 des Tierschutzgesetzes in der
Fassung vom 18.8.1986 (BGBI 1, S.1319) durchgeführt.
Die Untersuchungen erfolgten dabei in Anlehnung an ein seit 1986 etabliertes Endotoxin-
Großtiermodell [67, 124]. Hierzu wurden 10 weibliche, norddeutsche Hausschweine
verwendet, die käuflich von der Firma Nordfleisch erworben und bis zum Versuchsbeginn in
Gemeinschaftsboxen im Tierstall der Medizinischen Universität zu Lübeck untergebracht
wurden. Die Standarddiät der Tiere bestand aus Altromin® (Altromin GmbH, Lage) und
freiem Zugang zu Wasser. Das Gewicht der Tiere betrug bei Versuchsbeginn durchschnittlich
25 kg [+/- 5kg].
2.3.1 Vorbehandlung der Tiere
Die 10 Versuchstiere wurden in zwei gleich große Gruppen aufgeteilt:
Toleranzgruppe:
Zur Induktion der Endotoxintoleranz erhielten 5 Tiere 120 Stunden vor Versuchsbeginn (v.V.)
5 ng/kg KG S.enterica serovar abortus equii (S.a.e.), 96 Stunden v.V. 10 ng/kg KG S.a.e., 72
Stunden v.V. 30 ng/kg KG S.a.e. und 48 Stunden v.V. 50 ng/kg KG S.a.e. peripher intravenös
appliziert, nach vorhergegangener Kurznarkose mit Ketamin (Ketanest®, Parke-Davis,
München 20 mg/kg KG, i.m.). Am Vortage des Versuches blieben die Tiere nüchtern, bei
freiem Zugang zu Wasser (siehe Abb. 2.3.1.1).
Kontrollgruppe:
Die 5 Tiere der Kontrollgruppe erhielten zu den gleichen Zeitpunkten jeweils 0,5 ml 0,9%
NaCl-Lösung/kg KG in gleicher Verfahrensweise (siehe Abb. 2.1).
Jeweils vor Gabe des Endotoxins von S.a.e. bzw. der NaCl-Lösung, wurden den Tieren an
allen vier Impftagen Blutproben zur Ermittlung der Endotoxin-Basiswerte entnommen.
22

Gruppeneinteilung und Behandlungsschema
Abb. 2.3.1.1
2.3.2 Präparation und Messungen
Die Narkoseeinleitung am Versuchstag erfolgte wiederum durch 20 mg/kgKG Ketamin
(Ketanest®, Parke-Davis, München) in den Muskulus trapezius der Tiere. Die Versuchstiere
wurden in Rückenlage auf einer Wärmematte bei 37°C gelagert und fixiert. Nach Anlage
eines periphervenösen Zugangs in einer Ohrvene, sowie der einmaligen intravenösen Gabe
von 0,2 mg/kgKG Etomidate (Hypnomidate®, Janssen GmbH), erfolgte die Rasur des
gesamten Abdomens, sowie der Oberschenkelinnenseiten und des Halses. Danach wurden
diese Areale mit Polyvidon-Iod 10% (Betaisodonna®) desinfiziert. Abgedeckt mit sterilen
Klebetüchern, wurde unter sterilen Kautelen folgenden Präparationsschritte durchgeführt:
In der Mittellinie, unterhalb des Kehlkopfes erfolgte eine ca. 5 cm lange Hautinzision. Nach
Durchtrennung des Subkutangewebes und des Platysmas, wurden beidseits die Musculi
sternocleidomastoidei stumpf nach lateral verdrängt. Nach Darstellung der Trachea erfolgte
eine türflügelartige Inzision und die Plazierung eines 7 mm Endotrachealtubus (Mallinkrodt,
Athlone, Irland). Nach Kontrolle der korrekten Lage durch Auskultation und Blockung des
Cuffs, erfolgte die kontrollierte Beatmung mit dem Gerät EVA (Drägerwerk, Lübeck). Das
Atemzugvolumen wurde auf 12,5 ml/kgKG, die inspiratorische Sauerstoffkonzentration auf
30% und die Atemfrequenz auf 12/min festgelegt. Alle 30 Minuten wurden 5
Atemexkursionen mit einem PEEP von 5 cm H 2 0 zur Atelektaseprophylaxe durchgeführt. Die
Inspirationsluft war laut Herstellerangaben erwärmt und angefeuchtet. Abschließend wurde in
fortlaufender Technik mittels eines 2/0 Mersilene® (Ethicon, Norderstedt) Fadens die
Hautinizision verschlossen und der Tubus fixiert.
23

Ab diesem Zeitpunkt erhielten die Tiere eine kontinuierliche Sedierung per Perfusor
(PerfusorED, Braun AG, Melsungen) mittels Applikation von 0,01-0,015 mg Fentanyl
(Fentanyl-Janssen®), 0,3-0,4 mg Midazolam (Dormicum®) sowie 0,1 mg Pancuronium
(Pancuronium Organon®), jeweils pro kgKG und Stunde. Zur Volumensubstitution wurde
den Tieren als Dauerinfusion per Infusomat (Infusomat II, B. Braun AG) 3 ml/kg KG/h
Salviamin® infundiert.
Paramedian erfolgte sodann dorsal des rechten Kieferwinkels eine ca. 7 cm lange Inzision,
nach Durchtrennung des Subkutangewebes sowie des Platysmas, wurde die V. jugularis
communis, sowie der Konfluens aus V. jugularis externa und interna dargestellt. Nach
Stichinzision an dieser Stelle, wurde eine 8,5 French Arrow®-Katheterschleuse (Arrow
International Inc., Reading, Pa, USA) eingeführt und über diese ein Swan-Ganz-Katheter (7
French) zur Messung des zentralen Venendrucks (ZVD), des pulmonal-kapillären Wedge-
Drucks (PCWP), der gemischt venösen Sauerstoffsättigung (svO 2 ) und des Herzzeitvolumens
(HZV) in die Pulmonalarterie unter EKG-Kontrolle (Monitor: SireCust 732, Siemens)
eingeschwemmt. Das HZV wurde hierbei mittels Thermodilutionsmethode als Mittelwert von
drei aufeinander folgenden Messungen mit jeweils 10 ml 0°C kalter NaCl-Lösung gemessen.
Im Bereich der linken A. femoralis communis erfolgte ebenfalls eine 7 cm lange Inzision,
nach Darstellung des Gefäßes und Stichinzision wird an dieser Stelle ein 5 French arterieller
Katheter (Vygon®) zur kontinuierlichen arteriellen Druckmessung, sowie Gewinnung der
Blutproben für die Blutgasmessungen eingebracht und mittels Ligaturen am Gefäß fixiert. Der
Verschluß der Hautinzision erfolgte mit einer fortlaufender Naht.
Durch eine 5 cm lange suprapubische Inzision wurde nach Auseinander-drängen der Musculi
recti abdominis und Darstellung der Harnblase, ein 10 Charrière Cystofix-Blasenkatheter
(Braun, Melsungen) eingelegt und mittels Tabaksbeutelnaht gesichert. Die Hautinzision
wurde verschlossen, zur Bilanzierung erfolgte der Anschluß eines Unometers® (Braun,
Melsungen).
Zur Messung der Temperatur wurde den Tieren rektal eine Temperatursonde eingelegt
(Monitor: SireCust 732, Siemens).
Nach einer einstündigen Stabilisierungsphase erfolgte die Endotoxininfusion mittels
Dauerinfusion per Perfusor (PerfusorED, Braun AG, Melsungen) von 1000 ng/kgKG
Salmonella friedenau durch die Ohrvene.
Ab diesem Zeitpunkt wurden die hämodynamischen Parameter: Herzfrequenz (HF), mittlerer
arterieller Blutdruck (MAP), Herzzeitvolumen (HZV), mittlerer zentralvenöser Blutdruck
(ZVD), mittlerer pulmonalarterieller Blutdruck (MPAP), mittlerer pulmonalkapillärer Wedge-
24

Drucks (PCWP), die Temperatur (T), sowie die gemischt venöse Sauerstoffsättigung (SvO 2 )
mittels Monitor (SireCust 732, Siemens) halbstündlich bestimmt und registriert. Stündlich
wurden die Blutgase: arterielle Sauerstofsättigung (SaO 2 ), pH-Wert, Basenüberschuß (B.E.),
Kohlendioxidpartialdruck (pCO 2 ) Sauerstoff-partialdruck (pO 2 ) und die Konzentration von
Glucose und Laktat (ABL625, Radiometer Copenhagen, Dänemark) durch Blutabnahme aus
der A. femoralis communis bestimmt. Ebenso wurde die Diureseleistung stündlich gemessen.
Zu Beginn der Endotoxininfusion und zur 1., 4. und 8. Stunde erfolgten zusätzlich arterielle
Blutabnahmen, die im Eisbad gekühlt, zur quantitativen Endotoxinbestimmung mittels
Durchflusszytometrie und WN1-Antikörper dienten.
Alle obengenannten Blutabnahmen erfolgten mittels sterilen Sarstedt®-Monovetten.
Zum Versuchsaufbau siehe Abb. 2.3.2.1
Abb. 2.3.2.1: Schematischer Versuchsaufbau des
Endotoxin-Schockmodells am Schwein
25

2.4 Antikörperpräparation
Sämtliche Laboruntersuchungen erfolgten im chirurgischen Forschungslabor der
Medizinischen Universität zu Lübeck. Dabei wurden alle Präparationsschritte, falls nicht
anders angegeben, im Eisbad bei 4°C unter sterilen Kautelen auf einer Arbeitsbank (NuAire
Inu-425-400E, NuAire, Plymouth, England) mit kontinuierlicher Luftabsaugung durchgeführt.
Sämtliche Geräte und Reagenzien waren steril und pyrogenfrei.
26

2.4.1 Zellisolation
10 ml Versuchstierblut, das sofort nach Abnahme im Eisbad gekühlt wurde, wurde im
Verhältnis 1:1 mit RPMI-1640 Medium (Behringwerke AG, Marburg) gemischt und über 10
ml Ficoll-Separationslösung (PAA-Lab, Linz Österreich) geschichtet und 30 Minuten bei 200
G und 4°C zentrifugiert. Nach Präparation der mononukleären Zellen und zweimaligem
Waschen, wurde die Konzentration auf 1x10 6 Zellen/ml eingestellt und jeweils 1 ml entweder
zum Nachweis von membrangebundenem oder internalisiertem Endotoxin verwendet.
2.4.2 Membrangebundener Ansatz:
1x10 6 Zellen wurden mit 1 µg WN1 222-5 und 1 ml PBS-Lösung (PBS-Dubelco
Behringwerke AG, Marburg) gemischt. Zur Ermittlung unspezifischer Bindungen, wurde
parallel dieselbe Zellzahl mit 1 µl Kontroll-Antikörper derselben Subklasse (IgG2a M010712)
und 1 ml PBS-Lösung gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4°C, wurde
der Ansatz mit PBS gewaschen, und anschließend mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd für 20
Minuten fixiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden beide Ansätze mit einem
Fluoreszenz-antikörper inkubiert. Hierzu wurden jeweils 10 µl Fluoreszenz-antikörper
(IgG2a, M32404) für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert, nach erneutem Waschen mit PBS,
erfolgte die Konservierung des in 0,5 ml PBS-Lösung resuspendierten Pellets mit 0,5 ml 4%
Paraformaldehyd.
2.4.3 Internalisierter Ansatz:
Hierbei wurden 1x10 6 Zellen zunächst in 0,5 ml PBS gelöst und mit 0,5 ml 4%
Paraformaldehyd für 20 Minuten fixiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die in
0,5 ml PBS-Lösung resuspendierte Zellen mit 0,5 ml 1% Saponin-Lösung für 20 Minuten
permeabilisiert. Daraufhin erfolgte über einen Zeitraum von 20 Minuten die Inkubation, wie
oben beschrieben mit WN1- bzw. Kontroll-Antikörper. Nach einmaligem Waschen mit PBS
wurde ebenfalls wie bei der membranständigen Präparation der Fluoreszenzantikörper mit den
beiden Ansätzen inkubiert, und nach nochmaligem Waschen mit PBS wurden die in 0,5 ml
27

PBS-Lösung resuspendierten Pellets mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd konserviert, um
daraufhin wie in Kapitel 2.6 beschrieben durchflusszytometrisch gemessen zu werden.
2.5 Vorinkubationsversuche
Vor der Durchführung der eigentlichen in-vivo Messungen beim Versuchstier im induzierten
Endotoxin-Schock, wurde zur Überprüfung der Sensitivität der verwendeten Antikörper eine
Versuchsreihe mit in-vitro inkubiertem Versuchstierblutproben durchgeführt.
2.5.1 Verdünnungsreihen
Vollblutinkubation
Hierzu wurden jeweils 1 ml Phosphat-Pufferlösung (PBS-Dubelco Behringwerke AG,
Marburg) mit jeweils 0 , 0,05 , 0,1 , 0,2 , 0,4 und 1,0 µg LPS (S.enterica serovar friedenau)
zusammen mit 1 ml noch nicht mit Endotoxin belastetem Versuchstierblut für 30 Minuten bei
37°C inkubiert. Die mononukleären Zellen der so erhaltenen inkubierten Proben wurden
mittels Dichtegradientseparation (Ficoll, d=1,077 g/ml) wie in Kapitel 2.4.1 beschrieben
präpariert.
Seruminkubation
Um mögliche Einflüsse von mononukleären Zellen auf Serumproteine und umgekehrt besser
abschätzen zu können, und zwar in Abhängigkeit ob diese bereits mit Endotoxin belastet
waren oder nicht, führten wir zusätzliche Serum-Inkubationen nach folgendem Muster durch
(siehe Abb. 2.5.1.1):
28

ET-unbelastete
MNC
ET-belastete
MNC
ET-unbelastetes
Serum
Serum - /
Zellen -
Serum – /
Zellen +
ET-belastetes
Serum
Serum + /
Zellen -
Serum + /
Zellen +
Abb. 2.5.1.1 Serum-Inkubationsschema
(ET: Endotoxin, MNC: mononukleäre Zellen)
Hierzu wurde Versuchstierserum mittels 15-minütiger Zentrifugation mit 200 G bei 4 °C aus
9 ml Vollblut hergestellt, welches aus einer Endotoxin-unbelasteten Blutabnahme, bzw.
Blutabnahme nach 8-stündiger Endotoxininfusion (siehe Kapitel 2.3) gewonnen wurde (ETunbelastetes
/ ET-belastetes Serum).
Mononukleäre Zellen wurden wie unter Kapitel 2.4.1 beschrieben präpariert; gewonnen
ebenfalls aus einer Endotoxin-unbelasteten Blutabnahme, bzw. aus einer Blutabnahme nach
8-stündiger Endotoxininfusion (siehe Kapitel 2.3).
Wie in Abbildung 2.3 dargestellt, wurden so vier Kombinationen aus MNC und Serum nach
folgendem Verfahren inkubiert:
0,9 ml RPMI-Medium wurden mit 0,1 ml Versuchstierserum und jeweils 0 , 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ;
0,4 ; 1,0 und 5,0 µg LPS (S.enterica serovar friedenau) 30 Minuten bei 37°C vorinkubiert,
daraufhin wurden jeweils 1x10 6 Zellen hinzugegeben und nach Durchmischung weitere 30
Minuten bei 37°C inkubiert.
2.5.2 Internalisierungskinektik
Um eine Aussage über die Internalisierungsgeschwindigkeit des Endotoxins treffen zu
können, wurde die unter 2.5.1 beschriebene Vollblutinkubation für die LPS-Konzentrationen
0,1 und 0,5 µg zusätzlich für Inkubationszeiten von 1, 5, 10 und 15 Minuten durchgeführt.
29

Aus allen unter Kapitel 2.5.1 und 2.5.2 erhaltenen Proben wurden nach zweimaligem
Waschen mit PBS jeweils 1x10 6 Zellen gewonnen, und wie in 2.4.2 und 2.4.3 für den
membrangebundenen bzw. internalisierten Ansatz beschrieben, weiterpräpariert.
2.6 Durchflusszytometrische Analysen
Je Probe wurden 5000 Ereignisse mit Hilfe eines Durchflusszytometers (FacsScan®, Becton
Dickinson) erfasst. Die erhaltenen Daten wurden mittels CellQuest-Software (Becton
Dickinson) auf einem G3-Macintosh (Apple Computers, Inc.) analysiert. Dazu wurden alle
Ereignisse durch ihre Streulichteigenschaften mittels zweidimensionaler „Scatter-Plot“-
Darstellung in Zell-Subpopulationen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) aufgeteilt
(„ge-gated“) (Abb. 2.6.1), und die jeweilige Fluorenszenz-Intensität des PE-markierten
Antikörpers gemessen [39].
30

Abb. 2.6.1: Exemplarische Scatter-Plot Darstellung
Die Fluoreszenzintensität wurde als Mittelwert in „mean channels“ berechnet, von denen die
entsprechenden Mittelwerte des Kontroll-Antikörpers subtrahiert wurden, um unspezifische
Färbungsartefakte zu eliminieren (Abb. 2.6.2).
31

Abb.2.6.2: Ermittlung der Fluoreszenzintensität durch Subtraktion des Kontroll-Antikörpers
(Pfeil oben: mittlere Fluoreszenz des WN1-Antikörpers,
Pfeil unten: mittlere Fluoreszenz des Kontroll-Antikörpers)
Desweiteren wurde der Anteil der spezifisch gefärbten Zellen im jeweiligen Gate im
Verhältnis zum Kontroll-Antikörper gemessen (Abb. 2.6.3). Hierzu wurde der Fluoreszenz-
Wert, unter dem sich 95% der Kontroll-Antikörper Zellen befanden, als Grenzwert definiert,
und der Anteil der Zellen des WN1-Antikörpers oberhalb derselben Grenze gemessen.
32

Abb. 2.6:.3: Ermittlung des Anteils der markierten Zellen der jeweiligen Subpopulation im
Verhältnis zum Kontroll-Antikörper (Kreis unten: Anteil der markierten Zellen des Kontroll-
Antikörpers über „Cut-off“-Grenze,
Kreis oben: Anteil der markierten Zellen des WN1-Antikörpers oberhalb derselben Grenze)
Zum jeweiligen Messzeitpunkt lag so eine Aussage über den prozentualen Anteil der
markierten Zellpopulation, sowie der Intensität der Markierung, also das Ausmaß der
Antikörperbindung, vor.
33

2.7 Berechnungen und Statistik
Folgende Parameter wurden berechnet:
Systemischer Gefäßwiderstand:
SVR = (MAP – ZVD) x 60 /HZV [dynes s cm -5 ]
MAP arterieller Mittledruck
ZVD zentralvenöser Druck
HZV Herzzeitvolumen
Pulmonalarterieller Gefäßwiderstand
PVR = (MPAP-PCWP) x 60 / HZV [dynes s cm -5 ]
MPAP mittlerer pulmonalarterieller Druck
PCWP pulmonal-kapillärer Verschlussdruck
Schlagvolumen
SV = (HZV x 1000) / HF [ml]
HF Herzfrequenz
rechtsventrikuläre Schlagarbeit
RVSW = SVI x MPAP x 0,0136 [g m kg -1 ]
SVI Schlagvolumenindex
0,0136 Umrechnungsfaktor von mmHg in metrishe Einheiten
Schlagvolumenindex
SVI = SV/BSA
BSA Meeh´sche Formel für Körperoberfläche
(0,0947 x kgKG 0,667 beim Schwein)
linksventrikuläre Schlagarbeit
LVSW = SVI x MAP x 0,0136 [g m kg -1 ]
34

Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe der Statistik-Software SPSS® (SPSS Inc.,
Release 10.0.5) erstellt.
Bei den statistischen Vergleichen der Ergebnisse fand dabei der U-Test von Mann und
Whitney Verwendung.
Auf eine Prüfung der Normalverteilung wurde zugunsten einer strengen Kontrolle der
Ausgangswerte verzichtet. Bei mangelnder Erfüllung dieser Voraussetzung wurden die
betreffenden Tiere aus dem weiteren Versuch ausgeschlossen.
Zur Darstellung möglicher statistischer Unterschiede zu verschiedenen Zeitpunkten des
Versuches wurde der Paardifferenztest nach Wilcoxon verwendet.
Auf die Darstellung der Standardabweichungen im Ergebnisteil wurde aus Übersichtsgründen
verzichtet, sämtliche Mittelwerte und Standard-abweichungen sind im Anhang noch einmal
aufgelistet.
Die unterschiedlichen Überlebenszeiten der Toleranz- und Kontrolltiere wurde nach dem
Log-Rank-Test von Kaplan-Meier berechnet. Statistisch signifikante Unterschiede wurden bei
einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p

3. Ergebnisse
3.1 Überlebenszeit
Im Vergleich zur nicht-präkonditionierten Kontrollgruppe überlebten Tiere der
Toleranzgruppe signifikant länger (p=0,018). Die mittlere Überlebenszeit von Tieren der
Kontrollgruppe betrug 276 min, Tiere der Toleranzgruppe überlebten im Mittel 492 min
(siehe Abb.3.1.1). Bemerkenswert ist die Tatsache, dass alle Tiere der Toleranzgruppe im
Intervall zwischen 420 und 510 min nach Beginn der Endotoxin-Infusion verstarben, also
innerhalb von 90 Minuten, während die Tiere der Kontrollgruppe im Intervall zwischen 210
und 360 min verstarben, also in einem mit 150 Minuten deutlich längeren Intervall.
Abb. 3.1.1 Darstellung der Überlebenszeiten mittels Kaplan-Meier Diagramm
36

3.2 Kardiopulmonale Parameter
Arterieller Mitteldruck
Bei ähnlichen Ausgangswerten ließ sich bei beiden Gruppen in den ersten 210 min eine nur
geringfügige, aber stetige Verminderung des arteriellen Mitteldrucks beobachten. Daraufhin
zeigten die Tiere der Kontrollgruppe einen deutlichen Abfall des arteriellen Mitteldrucks um
mehr als 30 mmHg innerhalb von 30 min, wohingegen bei Tieren der Toleranzgruppe ein
solcher Abfall erst nach einem 120-minütigen leichten Anstieg von etwa 10 mmHg auftrat.
Dieses Verhalten führte bei 240 und 270 min zu einem signifikanten Unterschied zwischen
den beiden Gruppen (p=0,05 bzw. p=0,027).
Abb. 3.2.1
Verlauf des mittleren arteriellen Blutdrucks während kontinuierlicher
Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
(* = p≤0,05)
37

Herzfrequenz
Die Herzfrequenz der Tiere beider Gruppen stieg nach Beginn der Endotoxininfusion
kontinuierlich an, wobei dieser Anstieg bei Tieren der Kontrollgruppe schneller auftrat, und
so zu signifikanten Unterschieden bei 90, 210 und 240 min im Vergleich zur Toleranzgruppe
führte (p=0,009, p=0,032, p=0,014).
Abb. 3.2.2
Verlauf der Herzfrequenz während kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit
S.friedenau (* = p≤0,05 , ** = p≤0,01)
38

Herzzeitvolumen
Das Herzzeitvolumen von Tieren der Kontrollgruppe zeigte einen deutlichen Anstieg von ca.
4 l/min auf fast 6 l/min innerhalb der ersten 120 min, um danach kontinuierlich abzufallen.
Die Tiere der Toleranzgruppe zeigten in dieser Zeit einen wesentlich stabileren Verlauf, nach
60 min unterschieden sich die Gruppen signifikant (p=0,036) mit im Mittel 4,24 im Vergleich
zu 5,54 l/min.
Abb. 3.2.3
Verlauf des Herzzeitvolumens während kontinuierlicher Endotoxin-Infusion
mit S.friedenau (* = p≤0,05)
39

Systemischer Gefäßwiderstand
Der Verlauf des systemischen Gefäßwiderstandes unterschied sich in den ersten Stunden
zwischen beiden Gruppen nur geringfügig. Bei vergleichbaren Ausgangswerten von 1208
bzw. 1113 dynes s cm -5 bildete sich trotz kleinerer Schwankungen ein Plateau, welches nach
210 min durch einen Abfall der Kontrollgruppe und gleichzeitig mit einem Anstieg der
Toleranzgruppe beendet wurde. Nach 240, 270 und 300 min unterschieden sich die Gruppen
signifikant (p=0,014, p=0,016, p=0,025).
Abb. 3.2.4
Verlauf des systemischen Gefäßwiderstandes während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
(* = p≤0,05)
40

Pulmonal-kapillärer Verschlußdruck
Die Tiere der Kontrollgruppe zeigten direkt nach Beginn der Endotoxin-Infusion einen
kurzen, deutlichen Anstieg des pulmonal-kapillären Verschlußdruckes, um kurz darauf wieder
unter das Ausgangsniveau abzufallen. In der Gruppe der toleranten Tiere war dieser Anstieg
wesentlich weniger steil und weniger ausgeprägt. Nach 30 und 120 min unterschieden sich die
Meßwerte zwischen den Gruppen signifikant voneinander (p=0,034, p=0,043).
Abb. 3.2.5
Verlauf des pulmonal-kapillären Verschlußdrucks während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
(* = p≤0,05)
41

Pulmonalarterieller Mitteldruck
Bei beiden Gruppen stieg der pulmonalarterieller Mitteldruck zu Beginn der Endotoxin-
Infusion deutlich an, die Tiere der Toleranzgruppe zeigten jedoch einen geringen
Maximalwert (24 vs. 27 mmHg), sowie ein ausgeprägteres und schnelleres Abfallen auf
Werte im Bereich der Ausgangslage. Nach 120 min unterschieden sich die Werte der beiden
Gruppen signifikant voneinander (p=0,021).
Abb. 3.2.6
Verlauf des pulmonalarteriellen Mitteldrucks während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
(* = p≤0,05)
42

Arterieller Sauerstoffpartialdruck
Bei ähnlichen Ausgangswerten um 110 mmHg zeigten die Verläufe des arteriellen
Sauerstoffpartialdrucks ähnliche, leicht abfallende Meßwerte, wobei die Gruppe der
toleranten Tiere etwas stabilere Ergebnisse zeigte, die jedoch keine signifikanten
Unterschiede aufwiesen.
Abb. 3.2.7
Verlauf des arteriellen Sauerstoffpartialdrucks während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
43

Gemischtvenöse Sauerstoffsättigung
Bei ähnlichen Ausgangswerten um 65% fielen die Werte der gemischt-venösen
Sauerstoffkonzentration in der Kontrollgruppe wesentlich deutlicher und schneller als in der
toleranten Gruppe ab. Zu den Zeitpunkten 180, 240 und 300 Minuten, führte dieses Verhalten
zu signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen (p=0,028 , p=0,035, p=0,031).
Abb. 3.2.8
Verlauf der gemischtvenösen Sauerstoffsättigung während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
(* = p≤0,05)
Die weiteren gemessenen kardiopulmonalen Parameter sind im Anhang aufgeführt.
44

3.3 Metabolische Parameter
pH-Wert
Während sich der pH-Wert bei Tieren der Toleranzgruppe beginnend bei einem
Ausgangswert von 7.37 erst nach einer zweistündigen Plateauphase langsam verringerte,
zeigten die Tiere der Kontrollgruppe von Beginn an einen kontinuierlich stärkeren Abfall, so
dass es bei 240 Minuten zu einem signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen kam
(p=0,014).
Abb. 3.3.1
Verlauf des pH-Werts während kontinuierlicher Endotoxin-
Infusion mit S.friedenau (* = p≤0,05)
45

3.4 Körpertemperatur
Körpertemperatur
Der Verlauf der rektalen Körpertemperatur von Tieren der Kontrollgruppe zeigte einen
kontinuierlich ansteigenden Verlauf auf Spitzenwerte über 43°C. Die Körpertemperatur der
toleranten Tiere stieg zwar ebenfalls kontinuierlich an, jedoch war dieser Anstieg weniger
steil, hier bildete sich nach 300 Minuten ein Plateau, welches allerdings 42.5°C nicht
überschritt.
Abb. 3.4.1
Verauf der rektalen Körpertemperatur während kontinuierlicher
Endotoxin-Infusion mit S.friedenau
46

3.5 Endotoxinnachweis Inkubation: Verdünnungsreihen
3.5.1 Membranständiges Endotoxin
Die Tabellen 3.5.1.1 und 3.5.1.2 zeigen jeweils die Fluoreszenzintensität bzw. den Anteil der
markierten Zellen der mit steigenden Endotoxin-Konzentrationen inkubierten
Versuchstierblutproben. Sowohl im inkubierten Vollblut-Ansatz, als auch in den vier
verschiedenen Seruminkubations-Ansätzen, ließ sich keine eindeutige Aktivitätszunahme des
Fluoreszenz-antikörpers und damit kein mit der inkubierten Endotoxinmenge korrelierendes
membranständiges Endotoxin nachweisen.
Tab. 3.5.1.1 Darstellung der mittleren Fluoreszenz der inkubierten Versuchstierblutproben
(VB=Vollblut, S=Serum, Z=Zellen (+=LPS-belastet,
-=LPS-unbelastet), G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Tab. 3.5.1.2 Darstellung des Anteils markierter Zellen der inkubierten Versuchstierblutproben
(VB=Vollblut, S=Serum, Z=Zellen (+=LPS-belastet,
-=LPS-unbelastet), G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
47

Unabhängig vom Inkubationsschema und der inkubierten Menge an Endotoxin zeigten
sämtliche Versuche eine mittlere Aktivität von 10-25 „Kanälen“, sowohl für Granulozyten,
Monozyten als auch Lymphozyten. Der parallel bestimmte Anteil der markierten Zellen
erhöhte sich bei steigender Endotoxinkonzentration nur leicht und lag - ausgehend von einem
Wert von etwa 10% für die Nullprobe - bei der Maximalkonzentration von 1 µg Endotoxin
zwischen 20 und 25% unabhängig von der Zellpopulation.
Die mit ansteigenden Endotoxinkonzentrationen durchgeführte Vollblutinkubation zeigte
dabei zu keinem Zeitpunkt deutlich von der Ausgangslage abweichende
Fluoreszenzaktivitäten für membranständiges Endotoxin. Lediglich bei Inkubation von 0,5 µg
und 1 µg Endotoxin ließen sich für Granulozyten mit 31,4 und 45,0 Kanälen, bzw. 26,5 und
39,6 Kanälen für Monozyten erhöhte Aktivitäten feststellen. Der Anteil der markierten
Granulozyten bei Inkubation von 1 µg LPS war dabei mit 45 % erhöht.
Membranständiges Endotoxin wurde bei der Inkubation von unbelasteten mononukleären
Zellen und unbelastetem Serum in keiner Konzentrationsstufe in größeren Mengen
nachgewiesen. Bei Fluoreszenzaktivitäten von 9,2 bis 16,8 Kanälen ohne Zugabe von
Endotoxin, wichen die Fluoreszenzaktivitäten mit 20,4 (Lymphozyten), 36,5 (Monozyten)
und 37,8 Kanälen (Granulozyten) bei Inkubation mit 1 µg Endotoxin etwa um den Faktor 2
von der Ausgangslage ab.
Die Inkubation von bereits mit Endotoxin belasteten Zellen mit Endotoxin unbelastetem
Serum zeigte in keiner Konzentrationsstufe erhöhte Fluoreszenzaktivitäten für
membranständiges Endotoxin.
Wenig membranständiges Endotoxin konnte lediglich bei Inkubation von 1 µg Endotoxin mit
LPS-unbelasteten Zellen und bereits LPS-belastetem Serum bei Monozyten mit 43,4 im
Vergleich zu 15,3 Kanälen nachgewiesen werden. Zu keinem Zeitpunkt wurden mehr als 20%
der Zellen markiert.
Mit Endotoxin inkubierte, bereits zuvor mit LPS belastete mononukleäre Zellen zeigten in
Anwesenheit von bereits LPS-belastetem Serum nur in der höchsten Konzentrationsstufe von
1 µg Endotoxin für Granulozyten mit 48,3 und Monozyten mit 41,2 Kanälen erhöhte Werte.
48

Abb. 3.5.1.1 Exemplarische Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der
markierten Zellen: Trotz steigender Endotoxinkonzentration nur wenig membranständiges
Endotoxin nachweisbar.
49

3.5.2 Internalisiertes Endotoxin
In den Tabellen 3.5.2.1 und 3.5.2.2 sind die Fluoreszenzaktivitäten der mit Endotoxin
inkubierten Proben zur Bestimmung der internalisierten Endotoxinmenge dargestellt.
Tab. 3.5.2.1 Darstellung der mittleren Fluoreszenz der inkubierten Versuchstierblutproben
(VB=Vollblut, S=Serum, Z=Zellen (+=LPS-belastet,
-=LPS-unbelastet), G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Tab. 3.5.2.2 Darstellung des Anteils markierter Zellen der inkubierten Versuchstierblutproben
(VB=Vollblut, S=Serum, Z=Zellen (+=LPS-belastet,
-=LPS-unbelastet), G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Im Gegensatz zu den unter 3.5.1 beschriebenen Ergebnissen für membranständiges
Endotoxin, zeigte sich im internalisierten Versuchsansatz eine deutliche Aktivitätszunahme
bei steigender Endotoxinmenge. Die Nullproben zeigten wie in den membranständigen
Ansätzen eine Aktivität von 10-20 Kanälen. Bis zu einer Endotoxinkonzentration von 0,2 µg
ließ sich ein nahezu linearer Anstieg auf etwa 100 Kanälen erkennen. Mit weiter steigender
Endotoxinkonzentration fiel dieser Anstieg etwas flacher aus, um seinen Maximalwert von
teilweise über 200 Kanälen bei einer LPS-Konzentration von 1,0 µg zu erreichen. Hierbei
50

wurden Monozyten am stärksten markiert, Granulozyten und Lymphozyten erreichten
lediglich Aktivitätswerte von etwa 150 Kanälen. Im Bereich bis 100 ng LPS/ml ließ sich in
Granulozyten anteilsmäßig am meisten Endotoxin nachweisen, wohingegen bei höheren
Konzentrationen das meiste LPS von Monozyten internalisiert wird. Auch in Lymphozyten
fanden sich vergleichbare Mengen Endotoxin; in dieser Zellpopulation ist jedoch der Anteil
der Zellen die Endotoxin aufnehmen deutlich geringer: Während sich schon ab
Konzentrationen von 250 ng LPS/ml in 75-80% aller Granulozyten und Monozyten
internalisiertes Endotoxin nachweisen ließ, waren es bei Lymphozyten nur etwa 50%. Dieser
Anteil von Zellen, die Endotoxin internalisiert haben, erhöhte sich bei allen 3
Zellpopulationen auch bei höheren LPS-Konzentrationen nur minimal. Fluoreszenzaktivität
bzw. Anteil markierter Zellen waren hierbei unabhängig vom Inkubationsschema. Eine
Ausnahme bildeten die Inkubationen mit mononukleären Zellen, die zuvor mit LPS belastet
wurden: Hier zeigte sich bis zu einer LPS-Konzentration von 200 ng eine mit je nach
Zellpopulation mit etwa 100 Kanälen im Vergleich deutlich gesteigerte Aktivität als bei
Inkubationen mit vorher LPS-unbelasteten Zellen. Wahrscheinlich als Messungenauigkeit,
bzw. Probenkontamination muss die Seruminkubation mit LPS-unbelastetem Serum und LPSbelasteten
Zellen, inkubiert mit 0.1 µg Endotoxin gesehen werden. Die hier gemessenen
Aktivitäten bewegten sich im Bereich der Nullprobe.
Im Rahmen der Vollblutinkubation zeigte sich hierbei ein nahezu linearer Anstieg des
internalisierten Endotoxins bei steigender LPS-Konzentration. Ausgehend von Werten um 20
Kanälen (Granulozyten 18,7 , Monozyten 16,2 , Lymphozyten 12 Kanäle) stiegen die
Fluoreszenzaktivitäten auf Werte über 200 Kanäle an Granulozyten 145,5 , Monozyten 36,8 ,
Lymphozyten 187,3 Kanäle). Bereits bei Inkubation mit 200 ng LPS wurden 86% der
Granulozyten, 74% der Monozyten und 57% der Lymphozyten markiert.
Die Seruminkubation mit zuvor LPS-unbelasteten Zellen und LPS-unbelastetem Serum zeigte
wiederum einen fast linearen Anstieg für internalisiertes Endotoxin mit Werten bis 164,4
Kanälen für Granulozyten, 212,0 Kanälen für Monozyten und 168,2 Kanälen für
Lymphozyten. Ab 200 ng LPS bildete sich erneut ein Plateau des Anteils der markierten
Zellen, mit Werten von 78% (Granulozyten), 81 % (Monozyten) und 63% (Lymphozyten).
Seruminkubationen mit zuvor mit LPS-belasteten Zellen, und unbelastetem Serum, zeigten
auch ohne Inkubation mit Endotoxin eine Fluoreszenzaktivität von 91,5 (Granulozyten), 85,2
(Monozyten) bzw. 83,8 (Lymphozyten) Kanälen. Sowohl die Fluoreszenzaktivitäten als auch
51

der Anteil der markierten Zellen der einzelnen Populationen bildeten bis zu einer LPS-
Konzentration von 200 ng zunächst ein Plateau, um anschließend weiter anzusteigen.
Wahrschein-lich als Messfehler anzusehen sind die Ergebnisse der Inkubation mit 100 ng
LPS, hier zeigen sich Werte im Bereich einer LPS-unbelasteten Probe.
Die Seruminkubation mit LPS-unbelasteten mononukleären Zellen und belastetem Serum
zeigte ansteigend von Ausgangswerten von unter 20 Kanälen einen zunächst linearen, ab 500
ng LPS etwas abgeflachten Aktivitätsanstieg. Bei Inkubation mit 1 µg LPS zeigten
Monozyten mit 216,5 Kanälen die höchste Aktivität, gefolgt von Lymphozyten (163,0
Kanäle) und Granulozyten (156,7 Kanäle).
Im Rahmen der Seruminkubation von sowohl mit LPS-belastetem Serum wie mononukleären
Zellen wurde bei niedrigen Konzentrationen bis 200 ng LPS ein Plateau von knapp über 100
Kanälen gemessen, unter höheren LPS-Konzentrationen stiegen diese Aktivitäten bis auf
Werte zwischen 170 und 190 Kanälen an. Der Anteil der markierten Zellen war bereits zu
Beginn mit knapp 70 % deutlich erhöht und steigerte sich daraufhin nur noch geringfügig.
52

Abb. 3.5.2.1 Exemplarische Darstellung der der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der
markierten Zellen: Während steigender Endotoxinkonzentration Zunahme des Nachweises
von internalisiertem Endotoxin, bzw. des Markierungsanteils.
53

3.6 Endotoxinnachweis Inkubation: Zeitliche Kinetik
3.6.1 Membranständiges Endotoxin
Tabelle 3.6.1.1 zeigt die Fluoreszenzaktivität bzw. den Anteil der markierten Zellen im
membranständigen Ansatz bei Seruminkubation von 0,1 µg bzw. 0,5 µg Endotoxin mit
Inkubationszeiten von 1, 5, 10 und 15 Minuten.
Tab. 3.6.1.1 Nachweis von membranständigem Endotoxin, bzw. Anteil der markierten
Zellen bei 1, 5, 10 und 15-minütiger Inkubation mit
0,1 µg bzw. 0,5 µg LPS (G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Hierbei ließen sich nahezu linear abfallende Aktivitäten aller drei Zellpopulationen
nachweisen: Erreichten mit 0,1 µg Endotoxin für 1 Minute inkubierte Granulozyten eine
mittlere Aktivität von etwa 80 Kanälen, war nach einer 15-minütiger Endotoxin-Inkubation
mit einem Wert von weniger als 30 Kanälen lediglich eine Aktivität im Bereich der Nullprobe
nachzuweisen. Der Anteil der markierten Zellen nahm analog hierzu ebenfalls mit der Dauer
der Inkubation ab.
Noch deutlicher zeigte sich dieses Effekt bei Inkubation von 0,5 µg Endotoxin: Hier
erreichten die Granulozyten nach 1 Minute Inkubationszeit Aktivitätswerte von über 150
Kanälen, um nach 15 Minuten wieder Werte im Bereich der Nullprobe anzunehmen. Im
Gegensatz dazu veränderten sich die Anteile der markierten Zellen trotz fünffacher Menge
inkubierten Endotoxins nicht wesentlich.
54

Nach 1-minütiger Inkubation mit 0,1 µg Endotoxin zeigten sich für membranständiges
Endotoxin Aktivitätswerte von 78,6 (Granulozyten), 69,7 (Monozyten) bzw. 42,2 Kanälen
(Lymphozyten). Bei zunehmender Inkubationszeit nahmen diese bis auf Werte von etwa 20
Kanälen ab. Einen ähnlichen Verlauf zeigte der Anteil der markierten Zellen, beginnend mit
Werten um 50 % nach 1 Minuten. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wurden hier Werte im
Bereich um 20 % erreicht.
Inkubationen mit 0,5 µg LPS zeigten im zeitlichen Verlauf wiederum einen deutlichen Abfall:
Nach 1 Minute wurden Granulozyten mit 156,4 Kanälen am stärksten markiert, gefolgt von
Monozyten (112,3 Kanälen) und Lymphozyten (49,7 Kanälen). Nach 15 Minuten
Inkubationszeit waren Werte von etwa 20 Kanälen erreicht.
55

Abb. 3.8.1.2 Exemplarische Darstellung des Nachweises von membranständigem
Endotoxin, bzw. Anteil der markierten Zellen bei 1, 5, 10 und 15-minütiger Inkubation mit
0,5 µg LPS.
Im zeitlichen Verlauf abfallende Fluoreszenzaktivitäten.
56

3.6.2 Internalisiertes Endotoxin
Tabelle 3.6.2.1 zeigt die Ergebnisse des Nachweises von internalisiertem Endotoxin nach
verschiedenen Inkubationszeiten.
Tab. 3.6.2.1 Nachweis von internalisiertem Endotoxin, bzw. Anteil der markierten Zellen
bei 1, 5, 10 und 15-minütiger Inkubation mit
0,1 µg bzw. 0,5 µg LPS (G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Bei steigender Inkubationsdauer erhöhten sich die Aktivitätswerte von etwa 20 Kanälen nach
1-minütiger Inkubation bis auf 70 Kanäle nach 15-minütiger Inkubation von 0,1 µg Endotoxin
für Granulozyten und Monozyten, Lymphozyten reagierten mit Aktivitäten von ca. 50
Kanälen etwas schwächer. Analog hierzu wurden bei Inkubation von 0.5 µg Endotoxin nach
15 Minuten Werte von ca. 150 Kanälen für Granulozyten und Monozyten gemessen, Auch
hier zeigten Lymphozyten mit etwa 100 Kanälen eine im Vergleich deutlich schwächere
Aktivität.
Der Anteil der markierten Zellen stieg in ähnlicher Weise von etwa 20% auf Werte um 70 %
an, zeigte aber im Vergleich der Endotoxinkonzentrationen von 0,1 µg und 0,5 µg kaum
Unterschiede.
Der Nachweis des internalisierten Endotoxins bei Inkubation mit 0,1 µg LPS zeigte im
zeitlichen Verlauf ausgehend von Werten um 20 Kanälen bei 1- und 5-minütiger
Inkubationsdauer einen Anstieg auf 72,3 (Granulozyten), 79,4 (Monozyten) bzw. 35,1
(Lymphozyten) Kanälen nach 15 Minuten Inkubations-dauer. In gleicher Form stieg der
Anteil der markierten Zellen der drei Populationen von etwa 25 % auf 63 % (Granulozyten),
72 % (Monozyten), 55 % (Lymphozyten) an.
Bei Inkubation mit 0,5 µg LPS konnte im zeitlichen Verlauf ein Anstieg der
Fluoreszenzaktivität von zu Beginn 24,3 , 19,5 und 21,7 Kanälen auf 72,3 , 79,4 und 35,1
Kanälen (jeweils für Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten) beobachtet werden. Der
57

Anteil der markierten Zellen der drei Populationen stieg dabei von Werten um 20 % bis auf
über 60 % an.
Abb. 3.8.2.2 Exemplarische Darstellung des Nachweises von internalisiertem Endotoxin,
bzw. Anteil der markierten Zellen bei 1, 5, 10 und 15-minütiger Inkubation mit 0,5 µg LPS.
Im zeitlichen Verlauf ansteigende Fluoreszenzaktivitäten.
58

3.7 Endotoxinnachweis: In-vivo Versuche
3.7.1 Präoperative Messungen: Membranständiges Endotoxin
Die Ergebnisse des membranständigen Endotoxinnachweises der 5 Versuchstiere der
Kontrollgruppe bzw. der Toleranzgruppe vor Beginn der kontinuierlichen Endotoxininfusion
sind in der Tabelle 3.7.1.1 dargestellt.
Tab. 3.7.1.1: Mittelwerte des membranständigen Endotoxins bei Tieren der Kontrollgruppe
präoperativ,
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
(G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Sowohl die mittlere Fluoreszenz, als auch der Anteil der markierten Zellen bewegten sich
hierbei im Bereich der Werte der Nullprobe.
Ähnliche Resultate zeigen die Ergebnisse der Toleranzgruppe: Auch hier ließ sich - trotz
Immunisierung der Tiere mit Salmonella abortus equii (siehe Kapitel 2.3.1) - kein Anstieg
bezüglich Fluoreszenzaktivität oder Anteil der markierten Zellen feststellen.
Zu den 4 präoperativen Messzeitpunkten konnte bei Tieren der Kontrollgruppe mit Werten
von ca. 10 Kanälen nur Aktivitäten im Rahmen der Nullprobe nachgewiesen werden. Zu
diesen Zeitpunkten wurden lediglich 8-13 % der Zellen markiert.
In der Gruppe der toleranten Tiere wurden präoperativ Werten von etwa 12 Kanälen und
damit Aktivitäten im Bereich der Nullprobe nachgewiesen. Dabei wurden zwischen 9 und 17
% der Zellen der drei Populationen markiert.
59

Abb. 3.7.1.1: Exemplarische Darstellung der Mittelwerte des membranständiges Endotoxins
bei Tieren der Toleranzgruppe präoperativ,
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
60

3.7.2 Präoperative Messungen internalisiertes Endotoxin
Die Ergebnisse des internalisierten Endotoxinnachweises zu den Zeitpunkten 120, 96, 72 und
48 Stunden vor Beginn der kontinuierlichen Endotoxininfusion, zeigten ebenso wie die
membranständigen Endotoxinnachweise kaum Abweichungen von der Nullprobe. Sowohl die
Aktiviätswerte, als auch die Anteile der markierten Zellpopulationen bewegten sich mit nur
geringen Abweichungen um Werte von 20 Kanälen bzw. 10%. Hierbei zeigten sich keine
Unterschiede zwischen der mit Salmonella abortus equii präkonditionierten Gruppe und der
Kontrollgruppe (Tab. 3.7.2.1).
Tab. 3.7.2.1:
Mittelwerte des internalisierten Endotoxins bei Tieren der Kontrollgruppe präoperativ,
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
(G=Granulozyten, M=Monozyten, L=Lymphozyten)
Präoperativ konnte bei Tieren der Kontrollgruppe zu keinem Zeitpunkt ein Anstieg der
Fluoreszenzaktivität bei Messung von internalisiertem Endotoxin nachgewiesen werden.
Ebenso verhielt sich der Anteil der markierten Zellen mit gleichförmigen Werten um 12 %.
In der Gruppe der toleranten Tiere zeigten sich bei den präoperativen Messzeitpunkten mit
Werten zwischen 10,28 und 19,36 Kanälen nur geringfügige Schwankungen. Zu diesen
Zeitpunkten wurden zwischen 9 und 16 % der Zellen markiert.
61

3.7.3 Intraoperative Messungen membranständiges Endotoxin
Die Abbildungen 3.7.3.1 und 3.7.3.2 zeigen den Verlauf des membranständigen
Endotoxinnachweises während kontinuierlicher Infusion von Endotoxin. Sowohl in der
Kontrollgruppe als auch der Toleranzgruppe ließen sich keine Fluoreszenzaktivitäten, die
stärker von der Nullprobe abwichen nachweisen. Lediglich der Anteil der markierten Zellen
beider Gruppen nahm bei länger andauernder Endotoxininfusion leicht zu, es ließen sich
jedoch keine eindeutigen Tendenzen oder signifikant von der Ausgangslage abweichende
Werte feststellen.
62

Während kontinuierlicher Endotoxin-Infusion veränderten sich die Fluoreszenzaktivitäten
zum Nachweis von membranständigem Endotoxin bei Tieren der Kontrollgruppe kaum. Zu
Beginn wurden Werte von etwa 12 Kanälen gemessen, die nach 360 Minuten mit 23,1 , 26,2
und 24,3 Kanälen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) geringfügig angestiegen waren.
In dieser Zeit stieg der Anteil der markierten Zellen um ca. 10% auf 28 % , 22 % bzw. 26 %
(Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) an.
Abb. 3.7.3.1: Nachweis von membranständigem Endotoxin bei Tieren der Kontrollgruppe
während kontinuierlicher LPS-Infusion.
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
Nur wenig membranständiges Endotoxin nachweisbar
63

In der Gruppe der toleranten Tiere konnte zu keinem Zeitpunkt signifikant von der
Ausgangslage abweichendes membranständiges Endotoxin gemessen werden. Mit Werten um
30 % waren nach 480 Minuten nur geringfügig mehr Zellen markiert als zu Beginn des
Versuches.
Abb. 3.7.3.2: Nachweis von membranständigem Endotoxin bei Tieren der Toleranzgruppe
während kontinuierlicher LPS-Infusion.
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
Nur wenig membranständiges Endotoxin nachweisbar
64

3.7.4 Intraoperative Messungen Internalisiertes Endotoxin
In Abbildung 3.7.4.1 ist der Verlauf der internalisierten Endotoxinkonzentration der
Kontrollgruppe während kontinuierlicher Endotoxininfusion dargestellt. Granulozyten zeigten
hierbei bereits nach 60-minütiger Endotoxininfusion einen deutlichen Anstieg von 19,8 auf
98,8 Kanälen, bei einem p-Wert von 0,043 eine signifikante Abweichung von der
Ausgangslage. Im weiteren Verlauf des Versuches stieg die Fluoreszenzaktivität weniger
stark an, um ein Plateau bei etwa 140 Kanälen zu bilden. Bei 240 Minuten bestand ebenfalls
ein mit einem p-Wert von 0,048 signifikanter Unterschied zur Ausgangslage. Im Gegensatz
dazu wies die Fluoreszenzaktivität der Monozyten einen nahezu linearen Anstieg auf. Nach
60 Minuten stieg die Fluoreszenzaktivität von initial 17,7 auf 39,2 Kanäle an. Ein
signifikanter Unterschied zum Ausgangswert ließ sich allerdings erst nach 240 Minuten mit
einem p-Wert von 0,042 feststellen. Der Maximalwert des internalisierten Endotoxins war
nach 360 Minuten mit 212,6 Kanälen erreicht. Der schwächste Anstieg, und damit die
geringste Endotoxinaufnahme aller Zellpopulationen ließ sich bei den Lymphozyten
nachweisen. Die Fluoreszenzaktivität stieg hier in fast linearem Verlauf von 14,3 auf maximal
88,7 Kanäle an. Zeigten die unterschiedlichen Zellpopulationen in Hinblick auf die
Fluoreszenzaktivität unterschiedliche Verläufe, entwickelten sich die Anteile der markierten
Zellen gleichförmiger; nach 60 Minuten stieg der Anteil der markierten Zellen von etwa 10%
je nach Population auf 51-63% an. Alle diese Anstiege waren in Hinblick auf den
Ausgangswert signifikant (Granulozyten: p=0,042, Monozyten: p=0,043, Lymphozyten:
p=0,042). Bei weiterer Infusion von Endotoxin bildete sich bei etwa 75% ein Plateau, wobei
zu jedem Zeitpunkt ein etwas höherer Anteil Granulozyten markiert wurde.
Abbildung 3.7.4.2 zeigt den Endotoxin-Internalisationsverlauf der Toleranzgruppe.
Granulozyten und Lymphozyten zeigten einen ähnlichen Verlauf wie in der Kontrollgruppe
beschrieben. Monozyten hingegen wiesen einen deutlich schwächeren Anstieg bis zu einem
Maximalwert von lediglich 135,9 Kanälen auf. Der Verlauf des markierten Zellanteils verlief
nahezu gleich dem der Kontrollgruppe: Es zeigten sich gleichförmige Anstiege aller
Zellpopulationen bis auf Maximalwerte von 70-80%, wobei wiederum Granulozyten den
höchsten Markierungsanteil bildeten.
65

Die Tiere der Kontrollgruppe zeigten unter der LPS-Infusion einen deutlichen Anstieg aller
Zellpopulationen auf Werte bis über 200 Kanäle für Monozyten. Dabei wurden etwa 80 %
aller Zellen mit dem Antikörper markiert.
Abb. 3.7.4.1: Nachweis von internalisiertem Endotoxin bei Tieren der Kontrollgruppe
während kontinuierlicher LPS-Infusion.
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
Mit zunehmender LPS-Infusionsdauer Zunahme des internalisierten Endotoxins. (* = p≤0,05)
66

Der Nachweis von internalisiertem Endotoxin bei der Gruppe der toleranten Tiere zeigte
wiederum einen deutlichen Aktivitätsanstieg, Monozyten wurden jedoch mit Werten von
maximal 135,9 Kanälen nach 510 Minuten deutlich schwächer markiert als in der
Kontrollgruppe. Wiederum wurden bis zu 80 % der Zellen markiert.
Abbildung 3.7.4.2: Nachweis von internalisiertem Endotoxin bei Tieren der Toleranzgruppe
während kontinuierlicher LPS-Infusion.
Darstellung der mittleren Fluoreszenz, bzw. Anteil der markierten Zellen
Mit zunehmender LPS-Infusionsdauer Zunahme des internalisierten Endotoxins. (* = p≤0,05)
67

4. Diskussion
4.1 Literaturübersicht (frühere Untersuchungen)
4.1.1 Endotoxin-Testverfahren
Der erste qualitative Endotoxin-Test basiert auf den 1925 publizierten Ergebnissen von
Seibert [121]. Unter standardisierten Bedingungen wird hierbei einem Kaninchen die zu
testende Substanz in eine Ohrvene injiziert, und die rektale Körpertemperatur des Tieres über
einen bestimmten Zeitraum gemessen. Diese Methode ist zwar technisch aufwendig und
liefert kaum vergleichbare Daten, dient aber immer noch z.B. zum Pyrogen-Ausschluss in
Medikamenten [96].
Der am meisten verbreitete Endotoxin-Test ist heutzutage der LAL-Test. Er geht zurück auf
die Entdeckung von Bang und Levin, die 1964 zeigen konnten, dass Infektionen mit gramnegativen
Bakterien im Blut des nordamerikanischen Pfeilschwanzkrebses (Limulus
polyphemus) eine Koagulationskaskade auslösen [5, 63]. Diese Kaskade wird durch Enzyme
in den Amöbozyten dieses Krebses ausgelöst (Abb.4.1.1), das Lysat dieser Amöbozyten bildet
seitdem das Grundprinzip des LAL (Limulus amoebocyte lysate)-Tests.
Abb. 4.1.1 Koagulationskaskade des LAL-Tests
Zunächst wurde der Gelierungnsgrad, später das am Endpunkt dieser Kaskade entstehende
„Clotting-Enzym“ turbidimetrisch gemessen [88]. In den siebziger Jahren entwickelte
Nakamura den sogenannten „chromogenen“ LAL-Test [86]. Hierbei reagiert das „Clotting-
68

Enzym“ mit einem Para-Nitroanilin, dessen Wellenlänge spektroskopisch gemessen werden
kann. Mit diesem Verfahren konnte die Sensitivität des ursprünglichen LAL-Tests gesteigert
werden, und beträgt unter optimalen Voraussetzungen 5 pg Endotoxin/ml [19, 115]. Vom
Grundprinzip handelt es sich bei dem LAL-Test um einen Bioassay, welche zwar keine
lebenden Zellen oder Zellsysteme, jedoch den in Abbildung 4.1 dargestellten „Faktor C“ zur
Auslösung der Koagulationskaskade benötigt. Zur Erzeugung des Testsubstrates ist daher
immer Hämolymphe des Pfeilschwanzkrebses als Ausgangsmaterial notwendig, wodurch die
Vergleichbarkeit verschiedener LAL-Test Chargen nur bedingt möglich ist [54]. Ein weiteres
Problem stellt die Beeinflussung des LAL-Test Ergebnisses durch Plasmaproteine in
Vollblutproben dar. Eine Extraktion dieser Proteine kann jedoch unzureichend sein oder zum
Verlust eines Teils der Endotoxinmenge führen [51]. Die zunächst beschriebene Extraktion
mit Chloroform stellte sich dabei als ein sehr zeitaufwändiges und ungenaues Verfahren
heraus. In der Folgezeit wurden daher verschiedene Verfahren entwickelt um Endotoxin, das
im Blut an Proteinen gebunden und damit für den LAL-Test maskiert ist aus dieser
Proteinbindung herauszulösen, sowie optimale Konzentrationsverhältnisse zwischen
Endotoxin und dem LAL-Reagenz zu schaffen [127]. Etabliert haben sich dabei die Erhitzung
und nachfolgende Verdünnung der Probe, sowie die Präparation mit Protein-
Extraktionslösungen [89]. Über die optimale Verdünnung bzw. Erhitzungstemperatur bei der
Dilutions/ Erhitzungsmethode herrscht jedoch Uneinigkeit, zusätzliche Meßungenauigkeiten
ergeben sich durch Verunreinigungen bzw. Instabilitäten der Extraktionschemikalien,
kommerziell sind solche „Extraktions-Kits“ nicht erhältlich.
In zahlreichen klinischen Studien zeigte sich, dass regelhaft bei einem Teil gesunder
Probanden falsch-positive Ergebnisse in einer Größenordnung von 5-10% auftraten [50, 58,
132]. Auf der anderen Seite lieferte der LAL-Test im klinischen Einsatz bei Patienten mit
klinischen Zeichen einer Sepsis durch gram-negative Erreger in bis zu 50% der Fälle falschnegative
Ergebnisse [6, 24, 42, 126]. Hurley [47] zeigte 1994 mithilfe einer Metaanalyse aus
45 Studien, dass in weniger als der Hälfte aller Patienten mit einer gram-negativen
Bakteriämie auch eine Endotoxinämie mit dem LAL-Test diagnostiziert werden konnte.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass ein Zusammenhang zwischen dem Erreger der
Bakteriämie und dem Nachweis einer Endotoxinämie mit dem LAL-Test bestand: E.coli und
Enterobacter species korrelieren dabei mit nur 41% bzw. 46% der Fälle am wenigsten,
Pseudomonas aeruginosa und Neisseira meningitidis mit 63% bzw. 74% der Fälle am
stärksten.
69

Tiermodelle, in denen mithilfe des LAL-Tests versucht wurde, infundiertes Endotoxin
quantitativ zu messen, wiesen nur einen Bruchteil der Menge des infundierten Endotoxin im
Plasma der Versuchstiere nach [61, 85]. Untersuchungen, in denen radioaktiv-markiertes
Endotoxin infundiert wurde, zeigten, dass sich die Radioaktivität wesentlich länger im Blut,
als eine Aktivität des LAL-Tests nachwiesen ließ [72]. Unter in-vivo Bedingungen bestehen
also erhebliche Zweifel, ob der LAL-Test überhaupt aussagefähige Ergebnisse liefern kann.
Diese unbefriedigenden Resultate führten zu Bestrebungen andere Testverfahren zu
etablieren, die den LAL-Test ersetzen sollten. Beispiele hierfür sind Testverfahren, die
Polymyxin B als Endotoxinadsorber verwenden [61], Chemolumineszenz von Zellkulturen
oder Vollblut [71, 112] sowie der spektroskopische Nachweis von ß-Hydroxy-Fettsäuren der
Lipoid A Komponente des LPS [70]. Keines dieser Verfahren konnte jedoch mit
ausreichender Sensitivität und Spezifität Endotoxin in-vitro wie in-vivo nachweisen. Weitere
klinisch eingesetzte Testverfahren, wie die Bestimmung von Zytokin- oder
Komplementfaktor-, Akutphase-Proteine- oder Procalcitonin Plasmaspiegel geben lediglich
indirekt durch den Nachweis von Endotoxin-vermittelten Mediatoren einen Anhalt über den
Endotoxinspiegel im Blut [16, 35, 44, 136].
Zusammenfassend betrachtet stellt der LAL-Test bis heute den einzigen, klinisch einsetzbaren
zumindest semi-quantitativen Text für Endotoxin dar, dessen Aussagekraft jedoch aufgrund
obengenannter Gründe eingeschränkt ist [19, 89].
70

4.1.2 Endotoxin-Antikörper
Prinzipiell bieten sich Endotoxin-Antikörper als direkte Meßmethode zum quantitativen
Nachweis von LPS an. Da aber Bakteriämien bei Patienten in den meisten Fällen durch
Mischinfektionen mit unterschiedlichen LPS-Stämmen ausgelöst werden, können Antikörper,
die spezifisch an LPS bestimmter Bakterien binden, auch nur für dieses Bakterium LPS-
Spiegel nachweisen. Solche hochspezifischen Antikörper zeigten in-vivo keine ausreichende
Sensitivität [76]. Da Endotoxin-Antikörper sowohl unter diagnostischen als auch
therapeutischen Gesichtspunkten interessant erschienen, versuchten Arbeitsgruppen bereits
seit den achtziger Jahren einen Antikörper herzustellen, der an möglichst viele in der Natur
vorkommende LPS-Moleküle bindet. Zu Beginn wurden hierzu Immunisierungen mit einer
UDP-gal-4-epimerase defizienten J5-Mutante des E.coli Stammes O111:B4 verwandt [3, 37],
später auch Salmonella minnesota R595 [99]. Gemeinsam ist diesen beiden Mutanten, dass
sie nur noch Teile der LPS-Kernregion enthalten [23]. Die Auswahl dieser
Immunisierungsschemata basierte auf Ergebnissen aus tierexperimentellen und klinischen
Versuchen, die gezeigt hatten, dass polyklonale E.coli J5 und S.minnesota Antisera das
Überleben während gram-negativer Sepsis verbesserten [142, 74]. Zu diesem Zeitpunkt war
jedoch noch völlig unklar, ob eine solche Immunisierung überhaupt LPS-neutralisierende
Antikörper erzeugt hatte und welches Epitop bei einer möglichen Kreuzreaktivität involviert
sein könnte. Es stellte sich heraus, dass sämtliche so erzeugte Antikörper tatsächlich nur eine
sehr eingeschränkte Spezifität, bzw. Kreuzreaktivität besaßen [41].
Diese entmutigenden Ergebnisse ließen an der möglichen Existenz eines kreuzreaktiven LPS-
Antikörpers zweifeln.
Vielversprechende Ergebnisse schien ein humaner monoklonaler IgM-Antikörper – HA-1A –
zu bieten, der durch Immunisierung eines freiwilligen Probanden mit E.coli J5 gewonnen
wurde [143]. Die ersten publizierten Daten einer vergleichenden klinischen Studie deuteten
darauf hin, dass dieser Antikörper an Lipoid A sowohl der S- als auch der R-Form einer
Vielzahl verschiedener gram-negativer Baktierien binden würde. Bei genauerer Betrachtung
stellten sich jedoch die Unterschiede zwischen der mit HA-1A behandelten und der Placebo-
Gruppe als statistisch nicht signifikant heraus [8]. Heumann konnte zeigen, dass bei
Verwendung von großen Mengen dieses Antikörpers für die zunächst beobachteten Effekte
nicht-spezifische Kreuzreaktivitäten verantwortlich waren [45]. Auch bei dem murinen Lipoid
A spezifischen Antikörper E5 [137], bei dem zunächst Kreuzreaktivität vermutet wurde,
konnte diese in einer zweiten Studie nicht nachgewiesen werden.
71

Auch gegen Strukturen der Kern-Region des LPS wurden eine Vielzahl von Antikörpern
entwickelt, die letztlich ebenfalls keine Kreuzreaktivität aufwiesen. Allen diesen Antikörpern
war jedoch gemeinsam, dass sie durch Immunisierungsschemata erzeugt wurden, die lediglich
Endotoxin einsetzten, welches nur Teile der LPS Kern-Struktur enthielt.
Die Arbeitsgruppe um di Padova [22] verfolgte einen neuen Ansatz: Grundlage ihres
Immunisierungsschemas war die Verwendung von LPS mit einer vollständig erhaltenen
Kernstruktur. Untersuchungen von Kastovsky [55] hatten gezeigt, dass
Konformationsänderungen der dreidimensionalen Struktur des Endotoxins bei Aufteilung des
LPS-Kerns auftraten. Somit können Antikörper, die nur aus Teilen der LPS-Kernstruktur
hergestellt worden sind, auch nicht die geforderte Kreuzreaktivität aufweisen. Auf dieser
Hypothese aufbauend wurden verschiedene murine monoklonale Antikörper erzeugt [22].
Dabei wurden alle 5 bekannten E.coli Kernstrukturen zur Immunisierung benutzt. Der daraus
hervorgegangene Antikörper WN1 222-5 war der erste kreuzreaktive Anti-Core Antikörper,
der an alle bekannten E.coli, Salmonella und Shigellen-Stämme bindet. Es zeigte sich, dass
dieser Antikörper in-vitro nicht nur die LAL-Test Aktivität, sondern auch die Freisetzung von
Zytokinen wie TNF oder Il-6 hemmt. Tierexperimentell mildert WN1 222-5 bei D-
Galactosamin-sensitivierten Mäusen einen induzierten Endotoxinschock deutlich ab [4].
Erst 2003 konnte Müller-Loenniss das für die Kreuzreaktivität von WN1 222-5
verantwortliche Epitop identifizieren [82]. Dieser Nachweis gestaltete sich deshalb schwierig,
da aufgrund der amphiphilen Natur des LPS eine Auftrennung in definierte Molekülspezies
unmöglich war. Zunächst mussten dazu die LPS-Moleküle deacyliert werden, daraufhin
konnte der Lipoid A Anteil abzentrifugiert und die verbliebenen Oligosaccharide mittels
ELISA, Oberflächen-Plasma Resonanz-Verfahren und Mikrokalorimetrie untersucht werden.
Es stellte sich heraus, dass das gesuchte Epitop aus der Seitenkettenheptose an der
Verbindung vom äußeren zum inneren Kern des LPS bestand (s. Abb.4.1.2.1). Der dabei
relevante Strukturteil α-D-Glcp-(1→3)-[L-α-D- Hepp-(1→7)]-L-α-D- Hepp 4P(1→3) ist in
allen LPS-Molekülen der E.coli-, Salmonellae- und Shigellae spp. enthalten. LPS-Molekülen,
denen diese Seitenkettenheptose fehlt, werden von WN1 222-5 nicht erkannt.
72

Abbildung 4.1.2.1 Für die Bindung mit WN1 222-5 verantwortliches Epitop
im LPS-Molekül (nach [82])
4.1.3 Endotoxin-Aufnahme durch Phagozyten
Der Internalisationsprozess von LPS in Phagozyten ist mit zahlreichen Methoden untersucht
worden. Dazu zählen Elektronenmikroskopie, Dichtegradientenzentrifugation,
Durchflusszytometrie und Konfokalmikro-skopie. Die Internalisation beschreibt die Phase, in
der ein LPS-Molekül - nachdem es mittels eines Liganden an die Zelloberfläche gebunden
wurde - in die Zelle aufgenommen wird. Zunächst konzentrierten sich die Betrachtungen auf
Zellen, die mit hohen Dosen LPS inkubiert wurden und daraufhin elektronenmikroskopisch
untersucht wurden [11, 91]. Mittels radioaktiv markierter LPS-Moleküle konnte Luchi 1993
zeigen [69], dass etwa 1% des membrangebundenen LPS pro Minute in das Innere der Zelle
transloziert wurde. Dieser Prozess wurde sowohl mit als auch ohne Plasma beobachtet, womit
auch ein CD-14 unabhängiger Mechanismus postuliert wurde. Ein Nachteil dieses Verfahrens
besteht darin, dass nicht zwischen außen und innen an der Zellwand adhärentes LPS
unterschieden werden konnte. Durch Laserkonfokalmikroskopie gelang es im Verlauf den
Internalisationsprozess mittels fluoreszenzmarkierter LPS-Moleküle wesentlich genauer
darszustellen [34, 59]. Hierbei zeigte sich, dass sich die Internalisationsgeschwindigkeit des
LPS abhängig vom seinem Aggregationsgrad darstellte: monomeres LPS, z.B. als LPSsCD14
Komplex vorliegend, wird langsam in die Zelle aufgenommen, aggregierte LPS-
Moleküle konnten bereits nach wenigen Minuten in der Zelle nachgewiesen werden.
Aber nicht nur die Geschwindigkeit, auch der Internalisierungsmechanismus selbst erscheint
variabel. Untersuchungen vor allem von Francis, Parton und Poussin [29, 95, 102] zeigten,
dass LPS-Moleküle durch tubuläre Invagination, Caveolen, Clathrin-ummantelte Vesikel und
73

in geringem Maße auch durch Makropinozytose in das Innere der Zelle gelangen können. Der
Hauptanteil des LPS wird hierbei – vor allem in Zellen mit membranständigen CD14-
Rezeptor – mittels Invagination oder in Caveolen internalisiert.
Eine Schlüsselfunktion in der Einleitung der Signaltransduktion kommt hierbei dem Toll-like
Rezeptor 4 im Komplex mit dem MD-2 Protein zu [101, 105]. Dieser Rezeptor befindet sich
auf der Zelloberfläche und wird durch das Zusammenwirken von LPS, LBP und
membranständigem oder löslichen CD14-Rezeptor aktiviert. Er löst verschiedene
intrazelluläre Signal-Proteine (IRAK 1,2,M), MAP-Kinasen, sowie den Transkriptionsfaktor
NF-κB aus, sodaß letzlich Zytokinen (TNFα, Il-1ß,6,8,12,15), Lipidmediatoren (PAF, TXA 2 ,
Leukotrien C 4 , Prostaglandin E 2 ) und Sauerstoffradikalen (O - 2 , OH - , NO) generiert werden,
deren Dysbalance die eigentlich pathophysiologischen Effekte des Endotoxins bedingen.
Ob jedoch die Signaltransduktion erst nach Aufnahme ins Innere der Zelle oder bereits direkt
nach Bindung an Zellrezeptoren stattfindet, ist noch nicht abschließend geklärt [60]. Ebenso
gibt es noch keine gesicherten Erkenntnisse darüber, wie LPS-Moleküle in Phagozyten
abgebaut werden können. Bekannt ist lediglich, dass hierbei sowohl Dephosphorylisierungsals
auch Deacylisierungsprozesse stattfinden. Die Klärung der genauen zeitlichen und
biochemischen Abläufe steht noch aus [60].
Der genaue Mechanismus des Endotoxin-toleranten Zustands von Phagozyten ist ebenfalls
noch Gegenstand weiterer Untersuchungen. Postuliert wird hierbei eine Herunterregulation
von Signaltransduktionsprozessen [134], wobei offensichtlich eine entscheidende Rolle Il-1
assoziierte Kinasen spielen [75, 128]. Möglicherwiese erschöpfen sich diese nach
mehrfachem Endotoxin-Kontakt, sodaß bei erneuter Endotoxin-Exposition eine
Destabilisierung des Mediatoren/Zytokin-Gleichgewicht später oder gar nicht einsetzt [66].
Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Ursache für die abgeschwächten Effekte im
Endotoxin-toleranten Zustand möglicherweise auch durch Veränderungen in der
Rezeptorstruktur der Phagozyten zu suchen ist. Sato et al. [117] konnten im Tierversuch
nachweisen, dass Endotoxin-tolerante Monozyten weniger TLR4-MD Komplexe an der
Zelloberfläche aufwiesen. Im Gegensatz dazu ändert sich die Menge von CD14 and der
Zelloberfläche unter Bedingungen der Endotoxin-Toleranz nicht [73].
74

4.2 Vergleich der eigenen mit früheren Untersuchungen
Zunächst versuchten wir mithilfe verschiedener Verdünnungsreihen, die Sensitivität des
Antikörpers WN1 222-5 für unsere in-vivo Versuche abzuschätzen. Hierbei zeigte sich, dass
auch bei sehr hohen Endotoxinkonzentrationen von bis zu 1µg/ml kein membranständiges
Endotoxin nachgewiesen werden konnte. Parallel dazu durchgeführte Verdünnungsreihen, die
internalisiertes Endotoxin bestimmten, zeigten bereits bei Endotoxinkonzentrationen von 50
ng/ml deutlich höhere Fluoreszenz-aktivitäten als die Nullprobe. Hierbei wurden bis zu 70%
der durchflußzytometrisch gemessenen Zellen markiert, ihre Fluoreszenzaktivität lag mit etwa
40 Kanälen etwa doppelt so hoch wie bei mit LPS unbelasteten Zellen. Bei weiterer Erhöhung
der Endotoxinkonzentration ließ sich ein nahezu linearer Anstieg der Fluoreszenzintensität
auf Werte von bis zu 250 Kanälen beobachten. Der Anteil der markierten Zellen hingegen
erreichte bereits bei Konzentrationen von 200 ng Endotoxin/ml mit Werten von je nach
Population zwischen 60-90% ein Plateau, welches bis zur Maximalkonzentration von 1 µg/ml
in etwa konstant blieb.
Die höchste Fluoreszenzaktivität, also die größte Menge internalisierten Endotoxins zeigten in
den Verdünnungsreihen fast ausnahmslos die Monozyten, wohingegen anteilsmäßig am
meisten Granulozyten markiert wurden.
Keinen Einfluß auf die Menge des nachgewiesenen Endotoxins hatte die Verwendung von
bereits mit LPS belastetem bzw. unbelastetem Serum im Rahmen der Seruminkubation. Unter
Verwendung von bereits zuvor mit LPS-belasteten mononukleären Zellen hingegen, konnte
auch ohne LPS-Inkubation internalisiertes Endotoxin nachgewiesen werden. Auch bei diesem
Inkubationsversuch zeigte sich bei Verwendung von bereits mit LPS-belastetem, bzw.
unbelastetem Serum kein wesentlicher Unterschied (s. Kap. 3.5.2). Ein möglicher Einfluß von
unterschiedlichen Mengen von Plasmaproteinen auf die LPS-Messung konnte somit
ausgeschlossen werden. Eine der großen Fehlerquellen des LAL-Tests schien also bei unseren
Testverfahren keine Bedeutung zu haben [51, 89].
Die daraufhin durchgeführten Inkubationen mit unterschiedlichen Zeiten konnten zum ersten
Mal membrangebundenens Endotoxin nachweisen: Bei einer Endotoxinkonzentration von 100
ng/ml und einer Inkubationsdauer von 1 Minute, zeigten Granulozyten und Monozyten Werte
zwischen 70 und 80 Kanälen; auch Lymphozyten, die Zellpopulation, die bei allen
Inkubationen bislang am wenigsten Endotoxin aufgenommen hatte, zeigten mit einer
mittleren Fluoreszenzaktivität von etwa 40 Kanälen eine etwa doppelt so hohe Aktivität wie
die Nullprobe. Bei zunehmender Inkubationsdauer von 5, 10 bis zu 15 Minuten, reduzierten
75

sich die Aktivitäten aller Zellpopulationen. Nach 10 und 15 minütiger Inkubation waren nur
noch Werte im Bereich der Nullprobe nachzuweisen. Ein parallel dazu durchgeführter
Inkubationsversuch mit 500 ng Endotoxin lieferte ähnlich verlaufende Ergebnisse: hier
zeigten sich mit Werten von bis zu 150 Kanälen für Granulozyten nach 1 minütiger
Inkubation deutlich höhere Werte. Auch hier war nach 10 minütiger Inkubation kein
mebranständiges Endotoxin mehr nachweisbar (siehe Abb. 3.8.1.1.-3.8.1.2). Einen genau
gegensätzlichen Verlauf beschrieb das bei gleichen Konzentrationen gemessene internalisierte
Endotoxin: Hier konnte die erste größere Abweichung nach 10 minütiger Inkubation
gemessen werden, nach 15 Minuten befanden sich die jeweiligen Fluoreszenzaktiviäten im
Bereich der jeweiligen 30 minütigen Inkubation der zuvor durchgeführten Verdünnungsreihen
(siehe Abb. 3.8.2.1.-3.8.2.2). Daraus folgt, dass Endotoxin welches bereits nach Inkubation
von 1 Minute Dauer an der Membran der Phagozyten nachgewiesen werden konnte, nach 5
Minuten zum Teil und nach 10 Minuten vollständig in die Zelle aufgenommen worden ist.
Diese zeitliche Abfolge deckt sich mit den Untersuchungen von Gallay, Kitchens und Pollack
[34, 59, 60, 100]. Mittels Konfokalmikroskopie wiesen diese Arbeitsgruppen bei Monozyten,
THP-1 Zellen sowie CD14 transfizierten Hamsterovarzellen Internalisierungszeiten von 5 bis
10 Minuten nach. Voraussetzung für diesen schnellen Internalisationsweg ist jedoch das
Vorliegen eines membranständigen CD14-Rezeptors, sowie aggregiertes LPS.
Die anschließend durchgeführten Untersuchungen am Versuchstier orientieren sich an einem
seit Jahren in unserer Klinik etabliertem Sepsis-Großtiermodell [124]. Schweine als
Versuchstiere wurden gewählt, da die Sensitivität auf Endotoxin und die kardiovaskuläre
Belastbarkeit dieser Tiere ähnlich der des Menschen ist [27]. Als einzige vom Menschen
abweichende Reaktion wird die pulmonale Hypertension während des Endotoxinschocks
beschrieben [92], ein Phänomen, das wir besonders ausgeprägt bei Tieren der Kontrollgruppe,
mit bereits nach einer Stunde auf über 25 mmHg angestiegenen Werten beobachten konnten
(siehe Abb.3.3.1). Zur Induktion der Endotoxinämie verwendeten wir eine intravenöse,
kontinuierliche Endotoxininfusion, um die aufgenommene Endotoxinmenge genau
quantifizieren zu können.
Tiermodellen, bei denen Endotoxin als Bolus verabreicht wird, mangelt es aufgrund
unterschiedlicher Geschwindigkeit der Verstoffwechselung des Endotoxins an
Vergleichbarkeit [78].
In früheren Tiermodellen wurden häufig exzessiv hohe LPS-Dosen infundiert, bis in Bereiche
von mehreren mg/kg Körpergewicht der Versuchstiere [61, 85]. Wir verwandten 1µg/kg/h,
um einerseits bei allen Tieren sicher einen Endotoxinschock induzieren zu können und
76

andererseits Endotoxinkonzentrationen zu erzielen, die vergleichbar denen einer gramnegativen
Sepsis beim Menschen sind.
Die Verläufe der hämodynamischen Parameter unserer Versuche entsprachen denen des
septischen Schocks beim Menschen [7]: Einer initialen hyperdynamen Phase mit hohem
Herzzeitvolumen und niedrigem peripheren Gefäßwiderstand, folgte eine Phase mit hohem
peripheren Gefäßwiderstand und niedrigem Herzzeitvolumen (siehe Abb. 3.2.3 und 3.2.6).
Auffallend war, dass diese Phasen in den mit Salmonella abortus equii immunisierten Tiere
wesentlich weniger stark ausgeprägt waren. Ein ähnliches Bild ließ sich im Verlauf des
arteriellen Mitteldrucks beobachten (siehe Abb. 3.2.1): Hier zeigten die Tiere der
Kontrollgruppe einen bereits nach einer Stunde einsetzenden, deutlich steileren Abfall der
Meßwerte gegenüber Tieren der Toleranzgruppe. Dieses Verhalten entsprach den Ergebnissen
von Astiz [2], der an mit Monophosphoryl Lipoid A toleranten Ratten ähnliche Verläufe
zeigte. Eine Reihe weiterer Vitalparameter zeigte signifikante Unterschiede zwischen
Toleranz- und Kontrollgruppe: Zentralvenöser Druck, systemischer Gefäßwiderstand,
gemischt-venöse Sauerstoffsättigung, pH-Wert und Basenüberschuss (siehe Kap. 3.2 und 3.3).
Bei allen diesen Messwerten war der Unterschied zwischen beiden Gruppen zum Zeitpunkt
von 4 Stunden nach Beginn der Endotoxininfusion am größten. Zu diesem Zeitpunkt schienen
also die den Endotoxinschock abmildernden Effekte der Endotoxintoleranz am größten zu
sein.
Dieses unterschiedliche Verhalten bedingte in unserer Versuchsreihe eine signifikante
Verlängerung der Überlebenszeit der toleranten Versuchstiere (siehe Abb. 3.1.1). In unserem
Versuchsaufbau konnte die frühe Endotoxin-Toleranz dabei zwar die Auswirkungen des
Endotoxin-Schocks mildern, durch die über Stunden andauernde LPS-Infusion wurde die
Endotoxin-Toleranz letzten Endes durchbrochen, und die Tiere der Toleranzgruppe verstarben
ebenfalls. Dieses Ergebnis wurde bereits von Greisman [40] unter ähnlichen
Untersuchungsbedingungen am Kaninchen festgestellt.
Bezüglich der mit dem LAL-Test gemessenen Endotoxinkonzentration zeigten Tiermodelle,
bei denen kontinuierlich Endotoxin infundiert wurde ein paradoxes Ergebnis: nach einem
initialem Anstieg, erreichten die Endotoxinkonzentrationen einen Plateau-Wert und fielen
später sogar wieder ab, obwohl zu diesem Zeitpunkt weiterhin Endotoxin infundiert wurde
und damit die Endotoxinkonzentration im Blut der Versuchstiere weiter ansteigen sollte [61,
85]. Dieses Phänomen wurde möglicherweise ausgelöst durch eine zu diesem Zeitpunkt
stärkere Bindung des LPS an Plasmaproteine wie LBP, BPI oder den CD14-Rezeptors, die
Teile der LPS-Menge im Versuchtier für den LAL-Test maskierten und auch durch die
77

Erhitzungs-/Verdünnungsmethode nicht eliminiert werden konnten [49]. Im Gegensatz dazu
zeigten unsere Ergebnisse des internalisierten Endotoxins insbesondere für Monozyten einen
stetigen Anstieg (siehe Abb. 3.9.4.1), da das WN1 222/5 Bindungsepitop in der Kernstruktur
des LPS von möglichen Plasmabindungen unbeeinflusst blieb. Bei Tieren der Toleranzgruppe
fiel dieser Anstieg schwächer aus, hier zeigte sich in Monozyten eine deutlich geringere
Menge LPS, deren Verlauf nach vierstündiger LPS-Infusion nahezu konstant blieb.
Granulozyten und Lymphozyten zeigten ähnliche Verläufe wie bei Tieren der Kontrollgruppe.
Die Effekte der Endotoxintoleranz scheinen also in unserem Versuchsaufbau hauptsächlich
durch Monozyten vermittelt zu sein.
Verschiedene Arbeitsgruppen konnten nachweisen, dass Phagozyten im Zustand der
Endotoxin-Toleranz vermittelt durch Il-1 assoziierte Kinasen weniger Mediatoren (z.B. TNF.
Il-1, Il-6. Il-8, TXB 2 ) ausschütten [28, 66, 75, 128]. Zumindest in unserem Versuchsaufbau
scheinen Endotoxin-tolerante Monozyten jedoch auch deutlich weniger LPS aufzunehmen,
möglicherweise ein Effekt, der durch eine erniedrigte Regulation von TLR4-MD
Rezeptorkomplexen zu erklären ist.
Die zeitlich am schnellsten stattfindende Reaktion auf eine kontinuierliche LPS-Infusion
zeigten in unserem Versuch jedoch die Granulozyten. Bereits nach einer Stunde wiesen diese
Zellen eine nahezu fünffach höhere Menge an LPS auf, Monozyten und Lymphozyten
hingegen nahmen zu diesem Zeitpunkt kaum LPS auf. Dieses Verhalten änderte sich auch
nicht bei den Tieren der Toleranzgruppe, auch hier war ein schneller Anstieg mit
anschließender Plateauphase für die LPS-Aufnahme der Granulozyten charakteristisch.
Ähnlich wie in den in-vitro durchgeführten Inkubationsreihen schienen Granulozyten am
schnellsten (bezüglich Inkubationszeit und Anteil markierter Zellen) und Monozyten am
stärksten (bezüglich Fluoreszenzaktivität) auf Endotoxin zu reagieren. Lymphozyten nahmen
vergleichsweise wenig Endotoxin auf, allerdings in durchaus nicht zu vernachlässigenden
Mengen. Membranständiges Endotoxin ließ sich – ebenso wie in den in-vitro Versuchsreihen
– zu keinem Zeitpunkt nachweisen.
78

4.3 Kritische Erörterung der eigenen Befunde und Schlussfolgerungen
Die zu Beginn des Versuchsvorhabens durchgeführten Verdünnungsreihen zeigen, dass es
mithilfe des murinen monoklonalen Antikörpers WN1 222-5 möglich ist, internalisiertes
Endotoxin im Versuchstierblut in einem Konzentrationsbereich von 50 ng – 1000 ng/ml zu
messen. Hierbei wird deutlich, dass Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten je nach
Endotoxinkonzentration im Verhältnis zueinander unterschiedliche Mengen Endotoxin
aufnehmen. Da die Menge des internalisierten Endotoxins – unabhängig vom
Inkubationsschema – nahezu linear mit der LPS-Konzentration anstieg, kann man
schlussfolgern, dass Einflüsse von Plasmaproteinen, die zu einem großen Teil die
Ungenauigkeit des LAL-Tests bedingen [50, 126], auf unsere Messmethode keinen Einfluss
haben. Der Nachweis von membranständigem Endotoxin gelang im Rahmen dieser
Inkubationen nicht. Wie allerdings die Versuche mit ansteigender Inkubationsdauer zeigen, ist
bereits nach 10-minütiger Inkubation kein membranständiges Endotoxin mehr nachweisbar.
Da im Rahmen der in-vitro Verdünnungsreihen alle Proben 30 Minuten inkubiert wurden,
lässt sich die Abwesenheit von membrangebundenem Endotoxin auf diesem Wege erklären.
Kritisch zu sehen ist die untere Nachweisgrenze in unseren Verdünnungsreihen: Bei einer
Konzentration von 50 ng LPS/ml zeigt sich etwa eine Verdoppelung des internalisierten
Endotoxins im Vergleich zur Nullprobe. Hier sind weitere Versuche mit noch geringeren
LPS-Konzentrationen notwendig, um die untere Nachweisgrenze des Verfahrens zu
bestimmen. Da unter optimalen Bedingungen mit einem chromogenen LAL-Test bereits
Konzentrationen von 5 pg/ml gemessen werden können [19], scheint das von uns
beschriebene Testverfahren zumindest im Moment in diesem Punkt unterlegen.
Der Nachweis des internalisierten Endotoxins der Tiere der Kontrollgruppe lieferte ähnliche
Ergebnisse wie die Inkubationsversuche: Bei niedrigen Endotoxinkonzentrationen nahmen
Granulozyten am meisten Endotoxin auf, nach 5-stündiger Endotoxin-Infusion konnte die
größte Menge Endotoxin in den Monozyten nachgewiesen werden. Monozyten schienen also
in der Lage zu sein größere Mengen Endotoxin aufzunehmen, wohingegen Granulozyten
„sensibler“ also schon auf kleinere Mengen Endotoxin reagierten.
Interessante Erkenntnisse lieferten die Tiere der Endotoxin-toleranten Gruppe: Die signifikant
längere Überlebenszeit und der insgesamt stabilerer Verlauf der meisten hämodynamischen
und metabolischen Parameter deuten daraufhin, dass die vorherige Applikation von geringen
Dosen Salmonella abortus equii bei den Tieren einen den Endotoxinschock abmildernden
79

Effekt erzielt hat. Bei diesen Tieren ließ sich eine geringere Aufnahme von Endotoxin in den
Monozyten nachweisen. Möglicherweise ist hier also nicht nur die Signaltransduktion,
sondern auch die Endotoxinaufnahme in die Zelle herunterreguliert.
Ein zukünftiger interessanter Versuchsansatz wäre der Vergleich von Endotoxin-Werten
unseres Tiermodells gemessen einerseits mit dem LAL-Test und andererseits mit der WN1
222-5 Antikörpermeßmethode.
Die Tatsache, dass sich in den in-vivo Versuchen kein membrangebundenes Endotoxin
nachweisen ließ, deutet daraufhin, dass der Prozess der Internalisierung von Endotoxin sehr
schnell abläuft. Da jedoch die Bindung und Internalisierung von LPS ein in unserem
Tierversuch ständig ablaufender Vorgang ist, muss allerdings auch angenommen werden, dass
Kühlung, Transport und Präparation des Versuchstierbluts möglicherweise nicht schnell
genug erfolgt sind, und so membranständiges Endotoxin auch noch nach Probengewinnung
internalisiert worden ist.
Die Präparation selber stellt wahrscheinlich das größte Problem in Hinblick auf die klinische
Anwendbarkeit unseres Endotoxinnachweises dar. Hierzu ist es notwendig eine genau
definierte Menge mononukleärer Zellen aus den Blutproben zu gewinnen, die Zellwand zu
lysieren, diese dann zunächst mit dem eigentlichen monoklonalen Antikörper zu inkubieren
und diesen daraufhin mit einem sekundären Fluoreszenzantikörper zu markieren. Parallel wird
dieselbe Probe mit einem Isoantikörper präpariert und schließlich werden die
Fluoreszenzaktivitäten der beiden Antikörper für die jeweiligen Zellpopulationen, die mittels
Durchflusszytometrie gemessen werden können von einander subtrahiert. Dieses Verfahren
gestaltete sich in unserem Versuchsaufbau sehr zeitaufwendig. So ist pro Endotoxinnachweis
eine Versuchszeit von etwa drei Stunden anzusetzen. Durch die Verwendung von einem
direkt fluoreszenzmarkierten Anti-Core LPS-Antikörper, einer spektroskopischen
Meßmethode oder eines ELISAs ließe sich die Versuchszeit hier deutlich reduzieren.
Die geringere Sensitivität und aufwändige Präparation lassen unser Meßverfahren derzeit
nicht als Alternative zum LAL-Test erscheinen, trotzdem können auf diesem Wege bislang
nicht erklärbare Phänomene der Endotoxinaufnahme in Leukozyten im Rahmen des
septischen Schock und der Endotoxintoleranz nachgewiesen werden.
Eine systematische Einschränkung der Anwendbarkeit unseres Messverfahrens stellt die
Tatsache dar, dass der von uns verwandte Antikörper nicht an alle LPS-Formen von
gramnegativen Bakterien spezifisch bindet, sondern nur an E.coli, Salmonella-., Citrobacter
spp und einige Enterobacter- und Klebsiellen spp.. Im Hinblick auf die klinische
Bedeutsamkeit der obengenannten Bakterien beispielsweise im Rahmen der Pathogenese der
80

Peritonitis von Patienten auf einer chirurgischen Intensivstation, ließe sich nur mit den von
WN1 222-5 spezifisch bindenden Erregern der größte Teil der Septikämien des
obengenannten Patientenguts nachweisen [42].
Anders als der LAL-Test weist ein Verfahren mit einem hochspezifischen Endotoxin-
Antikörper LPS nicht im Serum nach, sondern an oder in Leukozyten. Die dadurch
möglicherweise früher gewonnenen Informationen, ob und wann und wie stark ein
Zellkompartiment mit LPS belastet ist, können das diagnostische Fenster erweitern und einen
klinisch wichtigen Zeitgewinn bedeuten. Darüberhinaus erschließen sich unter Verwendung
des Antikörpers WN1 222-5 durch die hochspezische Bindung an die klinisch wichtigsten
Bakterienspezies weitreichende therapeutische Möglichkeiten,
Ob die von uns am Schweinetiermodell gemachten Beobachtungen auch auf den Menschen
zutreffen, lässt sich nicht mit Bestimmtheit annehmen. Hier wird es also notwendig sein,
Patientenblut mithilfe unserer Meßmethode auf Endotoxin hin zu untersuchen. Aus dem von
uns verwandten Antikörper WN1 222-5 ist mittlerweile ein chimerisierter menschlicher
IgG1_-Isotyp gewonnen wurden – SDZ 219-800 - der zumindest in-vitro dieselben
Eigenschaft besitzt [4].
81

5. Zusammenfassung
Der frühen Diagnose gram-negativer Septikämien kommt aufgrund immer noch hoher
Infektionsraten - insbesondere auf Intensivstationen - erhebliche Bedeutung zu. Trotz
erheblicher Zweifel an der Validität seiner Ergebnisse, ist der LAL-Test auch heute noch die
einzig verfügbare Meßmethode zum direkten quantitativen Nachweis von Endotoxin.
Hauptnachteile des Verfahrens sind begrenzte Vergleichbarkeit der Ergebnisse, sowie
Wechselwirkungen des Test-Reagenz mit der Probe, welche die Aussagekraft des LAL-Tests
erheblich limitieren.
Ziel des vorliegenden Versuchsvorhabens war die Entwicklung und Evaluierung eines neuen,
quantitativen Endotoxin-Nachweises mithilfe eines monoklonalen Antikörpers (WN1 222-5),
der spezifisch an die Kernstruktur von LPS von E.coli, Salmonella und Shigella bindet.
Durchflußzytometrisch wurde der Nachweisbereich des Antikörpers durch in-vitro
Inkubationen mit Endotoxin in steigender Konzentration bestimmt und während
kontinuierlicher Endotoxin-Infusion bei 5 Versuchsschweinen die Menge des intrazellulär
aufgenommenen Endotoxins gemessen. Bei 5 weiteren Tieren wurden die LPS-
Bestimmungen im Zustand der Endotoxintoleranz durchgeführt. Die Messungen im
Tierversuch wurden zu den Zeitpunkten 0, 1, 4 und 8 Stunden nach Beginn der LPS-Infusion,
bzw. zum Todeszeitpunkt des Tieres durchgeführt.
Die Ergebnisse der in-vitro Inkubationen zeigen einen Anstieg des internalisierten Endotoxins
aller drei Zellpopulationen bei zunehmender LPS-Konzentration im Bereich von 50-1000
ng/ml.
Im Rahmen des beim Versuchstier induzierten Endotoxinschocks ist internalisiertes LPS zu
Beginn am stärksten in Granulozyten nachweisbar, nach über 4-stündiger LPS-Belastung
stellen Monozyten die Zellpopulation mit der höchsten internalisierten LPS-Menge dar.
Lymphozyten internalisieren im Vergleich wesentlich weniger Endotoxin.
Im Zustand der Endotoxin-Toleranz nehmen Monozyten deutlich weniger Endotoxin auf. Für
Granulozyten und Lymphozyten lassen sich keine Unterschiede zur Kontrollgruppe
nachweisen.
Membranständiges Endotoxin lässt sich zu keinem Zeitpunkt des in-vivo Versuches in
größeren Mengen nachweisen.
Mit der beschriebenen Messmethode lassen sich zudem Erkenntnisse der Endotoxin-Bindung
auf der Zellmembran und Aufnahme in die Zellen gewinnen: Endotoxin lässt sich demnach
82

ereits 1 Minute nach Exposition an der Zellmembran nachweisen. Bereits nach 10 Minuten
können große Anteile des Endotoxins im Zellinneren nachgewiesen werden.
Die in der vorliegenden Arbeit erstmalig beschriebene Methode zur quantitativen Messung
von Endotoxin stellt zwar bislang keine Alternative zum LAL-Test dar, kann jedoch dazu
beitragen wichtige Grundlagen der Endotoxinaufnahme in Leukozyten nachzuvollziehen. Die
klinische Anwendung könnte neue Erkenntnisse hinsichtlich der Kinetik der Endotoxin-
Internalisierung bei bestimmten septischen Krankheitsbildern ergeben und bietet in diesem
Zusammenhang darüber hinaus völlig neue therapeutische Möglichkeiten.
83

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100

7. Anhang
101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

8. Danksagung
Für die gute Betreuung und das angenehme Arbeitsklima möchte ich mich bei allen
Mitarbeitern der Klinik für Chirurgie herzlich bedanken, insbesondere bei:
Herrn Prof. Dr. med. H.-P. Bruch,
für die Möglichkeit, an seiner Klinik wissenschaftlich arbeiten zu können,
Herrn Prof. Dr. med. K.-H. Staubach,
für die Überlassung des Dissertationsthemas, die hervorragende Anleitung zur
wissenschaftlichen Auseinandersetzung, sowie die stets kompetente und freundliche
Betreuung meiner experimentellen und schriftlichen Arbeiten,
Herrn Prof. Dr. med. H. Brade,
für die Bereitstellung des Antikörpers und der Endotoxine, sowie seiner ständigen
Bereitschaft zu anregenden und erhellenden Diskussionen,
Herrn Dr. med. M. Ernst,
für wertvolle Hinweise und Anregungen rund um die Durchflusszytometrie,
meinen beiden Mitdoktoranden Herrn Dr. med. K. Block und Herrn A. Karpowsky für die
gute Zusammenarbeit während des experimentellen Teils der Arbeit,
Frau C. Killaitis,
die mir bei der statistischen Aufarbeitung der erhobenen Daten Ihre Unterstützung zu teil
werden ließ.
Herrn PD Dr. med. A.Woltmann
für die detaillierte Vorarbeit bei den Inkubationsschemata
Herrn Dr. med. vet. R. Noël,
und seinen Mitarbeitern für die große Hilfe bei der Betreuung der Versuchstiere,
Meiner Schwester Frau Dipl.Chem. Moana Nolde,
für die schnelle und gründliche Korrektur der Arbeit.
116

9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Nolde
Vorname: Jan Franz Otto
Geburtsdatum: 10. Juni 1973
Geburtsort: Berlin-Lichterfelde
Eltern:
Dipl.-Chem. Klaus Nolde, 1993 verstorben
Barbara Nolde, Lehrerin
Nationalität: deutsch
Konfession: evangelisch
Familienstand: ledig
Schulbildung
1979-1983 Grundschule: Stadtschule Travemünde
1983-1989 Gymnasium: Ernestinenschule zu Lübeck
1989-1992 Gymnasium: Katharineum zu Lübeck
Studium
14.09.1995 Abschluß der Vorklinik in Lübeck
28.08.1997 1. Staatsexamen in Lübeck
17.09.1999 2. Staatsexamen in Lübeck
23.10.2000 3. Staatsexamen in Lübeck
Berufliche Tätigkeit
01.11.2000 Arzt im Praktikum an der Klinik für Chirurgie
der Medizinischen Universität zu Lübeck
(Direktor: Prof. Dr. Bruch)
01.05.2002 Assistenzarzt an der Klinik für Chirurgie
der Medizinischen Universität zu Lübeck
(Direktor: Prof. Dr. Bruch)
117