application note Homogenisator Precellys® 24 - PEQLAB ...

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08
Homogenisator
Precellys ® 24
Dr. rer. nat. Silke Lohmann, Dr. rer. nat. Christian Lohmann
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany
Effektives Homogenisieren unterschiedlichster Mausgewebe und anschließende
Isolierung qualitativ hochwertiger DNA und RNA unter
Verwendung von peqGOLD Kits bzw. Reagenzien.
Einleitung
Sie bilden nicht nur die Basis so mancher
natürlichen Nahrungskette, nein, auch aus
Wissenschaft und Forschung sind Mäuse
nicht mehr wegzudenken. Ob für onkologische,
toxikologische, pathogenetische,
immunologische oder entwicklungsbiologische
Fragestellungen in Biologie, Biochemie,
Medizin und Pharmazie – zahlreiche
Mäuse stehen weltweit als unentbehrliche
Versuchstiere im Dienste der Menschheit. In
diesem Zusammenhang stellt die Isolierung
von DNA und RNA aus Mausgeweben
beispielsweise die Grundlage für die
Erzeugung von transgenen oder knock-out
Mäusen dar, ist die Voraussetzung für
deren Genotypisierung und für anschließende
Expressionsstudien.
Zielsetzung
Nukleinsäureisolierungen aus Mausgeweben
erfolgen häufig in größeren Probenzahlen.
Insbesondere die Homogenisierung
der Proben stellt dabei einen zeit- und/
oder arbeitsintensiven Schritt dar. Ziel dieser
Arbeit war es deshalb, die Eignung des
Homogenisators Precellys ® 24 für die Herstellung
von Homogenaten zu prüfen, aus
denen anschließend qualitativ hochwertige
DNA und RNA gewonnen werden können.
Dabei sollten DNA-Isolierungen mit dem
Silika-Säulen basierenden peqGOLD Tissue
DNA Mini Kit und RNA-Isolierungen mit
dem Reagenz peqGOLD TriFast erfolgen,
welches u. a. Phenol und das chaotrope
Salz Guanidinisothiocyanat enthält.
Material und Methoden
Probenvorbereitung
Aliquots (je 20 mg für DNA- und je 50 mg
für RNA-Isolierungen) verschiedener Mausgewebe
wurden direkt nach der Entnahme
aus adulten Mäusen in Tubes des Precellys
Keramik-Kit 1.4 mm überführt und bei
-80 °C gelagert.
Homogenisierung & DNA-Isolierung
Die Homogenisierung von je 20 mg
Gewebe fand in Tubes des Precellys Keramik-Kit
1.4 mm in Anwesenheit von je
200 µl TL-Puffer und 25 µl OB Protease
(peqGOLD Tissue DNA Mini Kit) statt.
Mausohren wurden bei 5000 rpm für
2 x 15 s (5 s Pause), alle anderen Gewebe
für 1 x 15 s im Homogenisator Precellys ®
24 homogenisiert. Die entstandenen Homogenate
wurden mit 220 µl BL-Puffer versetzt
und für 10 min bei 70 °C inkubiert, bevor
sie auf die HiBind ® -DNA-Säulen geladen
wurden. Alle weiteren Schritte erfolgten
Abb. 01 Die Maus – ein unentbehrliches Versuchstier im Dienste
der Menschheit.
nach dem Protokoll für das peqGOLD
Tissue DNA Mini Kit.
Homogenisierung & RNA-Isolierung
Die Homogenisierung von je 50 mg
Gewebe fand in Tubes des Precellys Keramik-Kit
1.4 mm in Anwesenheit von je 1 ml
peqGOLD TriFast statt. Mausohren wurden
bei 5000 rpm für 2 x 20 s (5 s Pause),
Creating the future together.

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Precellys ® & Mausgewebe
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Mausschwänze bei 6500 rpm für 3 x 20 s
(15 s Pause) und alle anderen Gewebe bei
5000 rpm für 1 x 20 s im Homogenisator
Precellys ® 24 homogenisiert. Alle weiteren
Schritte erfolgten nach dem Protokoll für
das peqGOLD TriFast .
OptiPure -Behandlung isolierter RNA
Abhängig vom Ausgangsgewebe können
RNA-Isolate hohe Anteile an Proteoglykanen
und Polysacchariden enthalten.
Diese Bestandteile führen zu Fehlern bei
der photometrischen Konzentrationsbestimmung
und können inhibitorische Effekte
auf downstream Applikationen wie z. B.
RT-PCR ausüben. Aus diesem Grund wurden
die RNA-Isolate aus Hirn, Ohr, Lunge,
Niere, Schwanz und Leber entsprechend
der peqGOLD OptiPure -Anleitung gefällt
und in 100 µl OptiPure resuspendiert. Dabei
gehen die Verunreinigungen in Lösung
und werden nach erneuter Zentrifugation
zusammen mit dem Überstand verworfen.
Alle weiteren Schritte erfolgten nach dem
Protokoll für das peqGOLD Optipure .
Analyse von DNA und RNA
Neben der photometrischen Konzentrations-
und Reinheitsbestimmung (A 260/280)
erfolgte eine Agarosegelelektrophorese
(1 % in TAE) unter nicht-denaturierenden
Bedingungen.
Ergebnisse
Aus je 20 bzw. 50 mg unterschiedlichster
Mausgewebe, welche innerhalb
weniger Sekunden mit Hilfe des Homogenisators
Precellys ® 24 homogenisiert
worden waren, konnte hochmolekulare
DNA bzw. intakte RNA isoliert werden
(Abb. 02 & 03). Die Nukleinsäuren zeigten
keine mechanische oder enzymatische
Degradation. Die mit dem peqGOLD Tissue
DNA Mini Kit erzielten DNA-Ausbeuten
lagen durchschnittlich bei 30 µg. A 260/280-
Werte von 1.7 bis 1.9 wiesen auf eine
gute Reinheit der gewonnenen DNA hin.
Die Verwendung von peqGOLD TriFast
ergab RNA-Ausbeuten von durchschnittlich
20 µg. Anhand von RNA aus Leber
konnte gezeigt werden, dass die weitere
Aufreinigung mit dem Reagenz peqGOLD
OptiPure das elektrophoretische Laufverhalten
deutlich verbesserte (Abb. 04). Als
ähnlich lohnend erwies sich die OptiPure -
Behandlung von RNA aus Hirn, Ohr,
Lunge, Niere und Schwanz (Abb. 03).
Fazit
Aus den mit dem Homogenisator
Precellys ® 24 hergestellten Homogenaten
unterschiedlichster Mausgewebe lassen
sich mit dem peqGOLD Tissue DNA Mini
Kit und den Reagenzien peqGOLD TriFast
und OptiPure qualitativ hochwertige
Nukleinsäuren isolieren. Da auf den
sonst üblichen, mindestens dreistündigen
Proteaseverdau (für DNA) oder das
Mörsern unter flüssigem Stickstoff (für RNA)
verzichtet werden kann, führt der Einsatz
des Precellys ® 24 dabei zu einer enormen
Zeit- und Arbeitsersparnis.
kbp
M
Muskel
Hirn
Ohr
Niere
Lunge
Herz
Leber
Milz
23.1
kbp
M - +
6.5
2.0
2.3
Abb. 02 Agarosegelelektrophorese (1 % in 1 x TAE) von DNA aus Mausgeweben. M: peqGOLD DNA-Sizer II.
kbp
2.0
M
Hirn*
Ohr*
Lunge*
Muskel
Niere*
Schwanz*
Leber*
DNA
Herz
0.5
RNA
Abb. 04 Agarosegelelektrophorese (1 % in 1 x TAE) von
Gesamt-RNA aus der Leber vor (-) und nach (+) der Behandlung
mit peqGOLD OptiPure . M: peqGOLD 1 kb DNA-Leiter. Die
Positionen der 28S und 18S rRNA sind mit Pfeilen markiert.
0.5
RNA
Abb. 03 Agarosegelelektrophorese (1 % in 1 x TAE) von Gesamt-RNA aus Mausgeweben. OptiPure -behandelte RNAs sind mit Stern
markiert. M: peqGOLD 1 kb DNA-Leiter. Die Positionen der 28S und 18S rRNA sind mit Pfeilen markiert.
V0307
V0610D
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