peqGOLD Blood RNA Kit - Peqlab

INHALTEINLEITUNG 1FUNKTIONSPRINZIP 2KITBESTANDTEILE 3LAGERUNG 3BINDEKAPAZITÄT 3WICHTIGE HINWEISE 4PEQGOLD BLOOD RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 5DNA-KONTAMINATIONEN 8QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 8RNA-QUALITÄT 9BESTELLINFORMATIONEN 9TROUBLESHOOTING TIPS 10CONTENTINTRODUCTION 11PRINCIPLE 11KIT COMPONENTS 12STORAGE AND STABILITY 12BINDING CAPACITY 12BEFORE STARTING 13PEQGOLD BLOOD RNA ISOLATION PROTOCOL 14DNA CONTAMINATION 17QUANTIFICATION AND STORAGE OF RNA 17RNA QUALITY 17ORDERING INFORMATION 18TROUBLESHOOTING TIPS 19APPENDIX 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 1

EINLEITUNGDer peqGOLD Blood RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um Gesamtzell-RNA aus bis zu 1.5 ml frischem oder mit Antikoagulantien wie Heparin, EDTA oder Citrat-Dextrose behandeltem Blut zu isolieren. In weniger als 60 Minuten können aus 1 mlfrischem Vollblut 1 bis 5 µg RNA isoliert werden. Kontaminationen und Enzyminhibitorenwerden dabei vollständig entfernt, wodurch die RNA-Isolierung schnell, einfach angenehmund verlässlich durchgeführt werden kann. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln,wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden, wie Fällungenmit Isopropanol oder LiCl sowie zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen.RNA, die mit dem peqGOLD Blood RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten vonFolgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, NucleaseProtection Assays und in vitro-Translationen weiterverwendet werden.peqGOLD Blood RNA Kits werden wahlweise mit Safety-Line oder mit Classic-Line Säulengeliefert (Safety-Line, Best.-Nr. 12-6814-xx oder Classic-Line, Best.-Nr. 12-6614-xx).Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und füreinen zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinenDeckel und erleichtern so das Handling.FUNKTIONSPRINZIPDie peqGOLD Blood RNA Kits kombinieren die selektiven und reversiblenBindungseigenschaften von PerfectBind Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichtenDurchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Die im Blut enthaltenen Erythrozytenwerden selektiv lysiert und danach die Leukozyten durch Zentrifugation gesammelt. Nachder Lyse der weißen Blutzellen wird die Gesamtzell-RNA an die Silikamembran gebunden,an der sie problemlos gewaschen werden kann. Ein speziell entwickeltes und optimiertesPuffersystem erlaubt die Reinigung von nicht-degradierter RNA ab Moleküllängen von 200Basen. Zellulärer Debris, Hämoglobin und andere Kontaminationen werden effiziententfernt und die qualitativ sehr hochwertige RNA eluiert.Die peqGOLD Blood RNA Kits wurden speziell für die Extraktion von Gesamtzell-RNAaus bis zu 1.5 ml Vollblut entwickelt. Das System wird nicht durch die Bindekapazität derverwendeten PerfectBind RNA Columns (bis ca. 100 µg RNA/PerfectBind RNA Column),wohl aber durch das maximal einsetzbare Probenvolumen limitiert. Aufgrund der großenMenge der im Blut enthaltenen Erythrozyten und Proteine werden Ertrag und Qualität dererhaltenen RNA bei Verwendung größerer Probenvolumina deutlich reduziert.Das peqGOLD Blood RNA Kit kann auch für die RNA-Extraktion aus gefrorenen Blutprobeneingesetzt werden jedoch ist das Probenvolumen dann auf 150 µl pro PerfectBind RNAColumn begrenzt.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 2

KITBESTANDTEILEpeqGOLD Blood RNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 ReinigungenBestellnummer Safety Line 12-6814-00 12-6814-01 12-6814-02Bestellnummer Classic Line 12-6614-00 12-6614-01 12-6614-02BestandteilePerfectBind RNA Columns 5 50 200DNA Removing Columns 5 50 2002.0 ml Collection Tubes 20 200 4 x 200Lysis Buffer ER 3 ml 30 ml 90 mlRNA Lysis Buffer T 2 x1.5 ml 32 ml 125 mlRNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 mlRNA Wash Buffer II 2 ml 20 ml 3 x 20 mlRNase freies Wasser 1 ml 5 ml 20 mlArbeitsanleitung 1 1 1LAGERUNGDie Aufbewahrung des peqGOLD Blood RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Beieiner Umgebungstemperatur von 22 – 25 °C bleiben die Komponenten des Kits fürmindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oderLagerung im RNA Lysis Buffer T bilden, können durch Erwärmen auf 37 °C wieder gelöstwerden.Es gilt zu beachten, dass der Lysis Buffer ER vor Verwendung auf 4 °C gekühlt werden mussund daher bei dieser Temperatur aufbewahrt werden kann.BINDEKAPAZITÄTPerfectBind RNA Columns haben eine RNA-Bindekapazität von ca. 100 µg RNA pro Säule.Die Verwendung von mehr als 1.5 ml Blut (mehr als 1 x 10 7 kernhaltige Zellen) wird nichtempfohlen.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 3

WICHTIGE HINWEISEBitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständigdurch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialienbereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zuvermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-KontaminationenEinmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffersollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglichdurchgeführt werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T zur Bildung vonSalzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendungdes Puffers durch Erwärmen auf 37 °C rückgängig gemacht werden.! Die verwendeten Blutproben sollten mit einem Antikoagulans, vorzugsweise mit Citrat-Dextrose, versetzt und möglichst schnell aufgearbeitet werden, da die in den Leukozytenenthaltenen Transkripte unterschiedlich lange und zum Teil nur sehr kurzeHalbwertszeiten aufweisen.! Das Einfrieren der Blutproben sollte möglichst vermieden werden, da es eine vorzeitigeLyse der Erythrozyten bewirkt. Die effiziente Entfernung ihrer Abfallprodukte ist dannnicht mehr möglich, weshalb auch nicht mehr als 150 µl gefrorenes Blut proAufarbeitung verwendet werden können. Der RNA-Ertrag wird dadurch zwangsläufigreduziert.! Lysis Buffer ER wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung ineinem geeigneten Gefäß mit sterilem, deionisierten RNase-freiem Wasser verdünntwerden:Kit 12-6814-00Kit 12-6814-01Kit 12-6814-023 ml Lysis Buffer ER mit 97 ml dH 2 O mischen.30 ml Lysis Buffer ER mit 970 ml dH 2 O mischen.90 ml Lysis Buffer ER mit 2910 ml dH 2 O mischen.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner erstenVerwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden:Kit 12-6814-00Kit 12-6814-01Kit 12-6814-022 ml Wash Buffer II mit 8 ml EtOH abs. mischen.20 ml Wash Buffer II mit 80 ml EtOH abs. mischen.3 x 20 ml Wash Buffer II mit 3 x 80 ml EtOH abs. mischen.! Verdünnten RNA Wash Buffer II bei Raumtemperatur lagern.! Wenn nicht anders angegeben, müssen alle Zentrifugationsschritte bei 22 – 25 °Causgeführt werden.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 4

PEQGOLD BLOOD RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLEBenötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol und steriles dH 2 O! 70 % Ethanol (mit sterilem RNase-freiem Wasser verdünnt)! Sterile, RNase-freie Pipettenspitzen und ZentrifugenröhrchenHinweis: Nach Lyse und Entfernen der Erythrozyten müssen die folgenden Schritte beiRaumtemperatur ausgeführt werden. Arbeiten Sie schnell, aber sorgfältig.1. Lyse der Erythrozyten10 ml kalten Lysis Buffer ER (4 °C, falls nötig eine ready-to-use Lösung herstellen!) zu 0.5 mlbis 1.5 ml Blutprobe geben. 15 ml Falcon Tube verwenden.Probe für 15 Minuten auf Eis inkubieren und dabei zweimal durch kurzes Vortexenmischen. Während der Lyse der Erythrozyten wird die Mischung durchscheinend. BeiBlutproben von Personen mit einem erhöhten Hämatokritwert oder ECR, sollte dieInkubationszeit auf 20 Minuten verlängert werden.Leukozyten durch Zentrifugieren für 15 Minuten bei 2.500 x g* und 4 °C pelletieren. DenÜberstand mit den lysierten Erythrozyten komplett entfernen und verwerfen.Falls eine kühlbare Zentrifuge nicht verfügbar ist, bei Raumtemperatur zentrifugieren, aber denSchritt schnell abschließen.Pellet nicht verwerfen und Lysis Buffer ER durch Invertieren des Tubes auf ein Papiertuchvollständig entfernen.2. Waschen der LeukozytenLeukozytenpellet mit 5 ml kaltem Lysis Buffer ER (4 °C) durch Mischen resuspendieren,anschließend für 3 Minuten bei 2.500 x g* und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit denlysierten Erythrozyten vollständig entfernen und verwerfen.Reste des Lysis Buffer ER durch Invertieren des Tubes auf ein Papiertuch entfernen.* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 5

3. Lyse der LeukozytenLeukozytenpellet mit 600 µl Lysis Buffer T versetzen und durch Pipettieren vollständigresuspendieren, danach bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubieren.Pellet muss vollständig resuspendiert werden. Falls Klumpen zurückbleiben, weitere 5 Minuten beiRaumtemperatur inkubieren.Die Probe kann nach Zugabe von RNA Lysis Puffer T bei –70 °C gelagert werden.Eine DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und das Lysat auf dieDNA Removing Column laden und anschließend für 2 Minuten bei 10.000 x g*zentrifugieren.Das filtrierte Lysat benötigen Sie für den nächsten Schritt, die DNA Removing Column bitteverwerfen.Bei der Verwendung von mehr als 1 x 10 7 Zellen kann das Lysat zu viskos sein, um es zupipettieren. In diesem Fall den Ansatz in zwei Aliquots teilen und jedes der Aliquots mit 650 µl RNALysis Buffer T auffüllen. Das Protokoll wird dann mit Schritt 3 mit zwei DNA Removing Columns undzwei PerfectBind RNA Columns fortgeführt.4. Laden und BindenGleiches Volumen 70 % Ethanol (~ 600 µl) zum Lysat geben und durch Pipettieren mischen.Nach der Zugabe von Ethanol kann sich ein Präzipitat bilden, das jedoch keineAuswirkungen auf die RNA-Isolation hat.Eine PerfectBind RNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und denvollständigen Ansatz (inklusive Präzipitat) auf die PerfectBind RNA Column laden und für1 Minute bei 10.000 x g* zentrifugieren. Die maximale Kapazität der Säule ist 700 µl.Säulendurchfluss verwerfen und den Vorgang wiederholen, bis die gesamte Probe auf dieSäule geladen ist.5. Waschen INeues Collection Tube nutzen, 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Columnzugeben und für 1 Minute bei 10.000 x g* durch die Säule zentrifugieren.Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden.6. DNase I Verdau (optional)Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entferntwird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nichterforderlich. Dennoch kann eine DNA-Entfernung bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein. Außerdem kann es bei der RNA-Isolation aus > 1 ml Blutprobeerforderlich sein, restliche DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgendeProtokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column(Bestellnr.: 12-1091).* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 6

a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten:DNase I Digestion Puffer 73.5 µlRNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µlGesamtvolumen 75 µlHinweise:1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase IReaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen.2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. StandardDNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet!b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes mittig auf die Membran der PerfectBind RNAColumn pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn einTeil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der PerfectBind RNA Columnhaftet.c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuteninkubieren.d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer Izugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei10.000 x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tubeim nächsten Schritt (Schritt 4) weiterverwenden.7. Waschen IIPerfectBind RNA Column mit 650 µl des komplettierten RNA Wash Buffer II auf die Säulepipettieren. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren, Durchfluss verwerfen.RNA Wash Puffer II Konzentrat muss vor Gebrauch mit absolutem Ethanol verdünnt werden.Hinweis auf dem Flaschenetikett.8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)Die Säule erneut mit 650 µl RNA Wash Buffer II waschen. Hierfür bei 10.000 x g* für1 Minute zentrifugieren und Durchfluss anschließend verwerfen. Collection Tubewiederverwenden und Säule durch zweiminütiges Zentrifugieren bei 10.000 x g* vollständigtrocknen.9. ElutionPerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen und dieRNA mit 30 bis 50 µl RNase-freiem Wasser eluieren. Dazu mittig auf die Matrixpipettieren, Säule für eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Eine zweite Elutionsrunde kann zur Erhöhung desErtrags nötig sein.* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 7

Hinweis: Keine RNA-Extraktionsmethode kann genomische DNA vollständig entfernen. Für sehrsensitive Anwendungen sollte die eluierte RNA mit RNase-freier DNase behandelt werden. Auch fürRT-PCR sollten Intron-umspannende Primer verwendet werden, die eine einfache Identifikation vonDNA-Kontamination erlauben. Eine Kontroll-PCR-Reaktion mit der RNA als Template erlaubtebenfalls die Detektion von DNA-Kontaminationen.DNA-KONTAMINATIONENMit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomischeDNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT-PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache undzeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column,der in das bestehende Protokoll integriert werden kann (s. Punkt 5: DNase I Verdau).Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNasedurchgeführt werden.Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe vonintronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse aufmögliche Kontaminationen zulässt.QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNAUm die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorptioneines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessenwerden.RNase-freies dH 2 O ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatischherabsetzen. Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in einer gepuffertenLösung wie beispielsweise TE verdünnt werden.Eine A 260 -Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sichdemnach wie folgt:RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x VerdünnungsfaktorDas A 260/280 -Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqGOLD BloodRNA Kit erzielbare A 260/280 -Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht RNA einer Reinheit von90 bis 100 %.Phenol hat ein Absorptionsmaximum bei 275 nm und kann deshalb mit den Absorptionsspektrenvon RNA und DNA interferieren. Da das Protokoll des peqGOLD Blood RNA Kits kein Phenolverwendet, tritt dieses Problem hier nicht auf.RNA, die mit dem peqGOLD Blood RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in sterilem RNasefreiemWasser für mindestens ein Jahr bei –70 °C aufbewahrt werden.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 8

RNA-QUALITÄTVor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierendeAgarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst die Qualität derextrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Bandenerkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rRNAs repräsentieren. Sollten dieseBanden in Richtung nieder-molekularer RNA-Größen schmieren, ist es während derPräparation, Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sichje nach Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann.Obwohl RNA-Moleküle < 200 Basen nur sehr ineffizient an die PerfectBind RNA Column despeqGOLD Blood RNA Kits binden, kann auf dem Gel noch eine dritte distinkte Bande aus tRNAserscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterialbesonders hoch war.BESTELLINFORMATIONENfür die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut:peqGOLD Total RNA Kit 12-6634-00 5 Reinigungen(C-Line) 12-6634-01 50 Reinigungen12-6634-02 200 ReinigungenpeqGOLD Total RNA Kit 12-6834-00 5 Reinigungen(S-Line) 12-6834-01 50 Reinigungen12-6834-02 200 ReinigungenpeqGOLD Blood RNA Kit 12-6614-00 5 Reinigungen(C-Line) 12-6614-01 50 Reinigungen12-6614-02 200 ReinigungenpeqGOLD Blood RNA Kit 12-6814-00 5 Reinigungen(S-Line) 12-6814-01 50 Reinigungen12-6814-02 200 ReinigungenpeqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 9

TROUBLESHOOTING TIPSProblem Ursache AbhilfeWenig oder keineRNA im EluatPerfectBind RNAColumn verstopftRNA-DegradationDNA-KontaminationProbleme beiFolgereaktionenRNA bleibt auf derPerfectBind RNAColumnPerfectBind RNAColumn ist überladenUnvollständige LyseUngeeignetesAusgangsmaterialRNase-KontaminationSalzübertragungwährend der ElutionPCR-Inhibitoren•••Elution wiederholen.RNAse-freies Wasser vor demEluieren auf 70 °C erwärmen.PerfectBind RNA Column vor demEluieren für 5 min inkubieren.• Menge des Ausgangsmaterialsreduzieren.•••••Probe sorgfältiger lysieren und Pelletvollständig reusupendieren..Menge des Ausgangsmaterialsreduzieren.Blutproben vor der Lyse nichteinfrieren.Präparation zügig und exakt nachVorschrift durchführen.• Nur RNase-freies Materialverwenden und Handschuhe tragen.• Puffer auf RNase-Kontaminationenüberprüfen.• Verdau mit RNase-freier DNase(5 min bei 37 °C inkubieren.)• Sicherstellen, dass RNA Wash BufferII mit 4 fachem Volumen 100 %EtOH verdünnt wurde.• Sicherstellen, dass RNA Wash BufferII bei Raumtemperatur gelagert undverwendet wurde.• Waschschritt mit RNA Wash Buffer IIwiederholen.••Probenvolumen reduzieren.Für vollständige ErythrozytenlyseInkubation mit Lysis Buffer ERverlängernpeqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 10

INTRODUCTIONpeqGOLD Blood RNA Kits are designed for isolation of total intracellular RNA from up to1.5 ml of fresh, whole blood treated with any common anticoagulant such as heparin,EDTA, or acid-citrate-dextrose. One ml of blood typically yields 1 – 5 µg of total RNA.The procedure completely removes contaminants and enzyme inhibitors making totalRNA isolation fast, less than 60 min. needed, convenient, and reliable. There is no needfor phenol/chloroform extractions, and time-consuming steps such as CsCl gradientultracentrifugation, and precipitation with isopropanol or LiCl, are eliminated.RNA purified using the peqGOLD Blood RNA method is ready for applications such asRT-PCR, Poly(A) + -RNA extractions, Northern Blots, Nuclease Protection Assays and in vitrotranslations.peqGOLD Blood RNA Kits are available as S- or C-line columns (Safety-Line, Order No.12-6814-xx or Classic Line, Order No. 12-6614-xx). Safety-Line columns can be closedtightly by lids to avoid cross-contamination more effectively. C-line columns possess no lid,allowing higher sample throughput and a more comfortable handling.PRINCIPLEThe peqGOLD Blood RNA Kits use the reversible binding properties of PerfectBind matrix,a new silica-based material. This is combined with the speed of mini-column spintechnology. Red blood cells are selectively lysed and white cells collected bycentrifugation. After lysis of white blood cells under denaturing conditions that inactivateRNases, total RNA is purified in the PerfectBind spin column. A specially formulated highsalt buffer system allows RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix.Cellular debris and other contaminants (such as hemoglobin) are effectively washed awayand high quality RNA is finally eluted in RNase-free water.peqGOLD Blood RNA Kits are specially designed for isolation of total RNA out of 1.5 mlmaximum sample volume. The functionality of the kit is not restricted by the bindingcapacity of the PerfectBind RNA Column, but it is restricted by the maximum samplevolume. Due to the large quantity of erythrocytes and proteins in the blood, yield andquality of the received RNA are reduced clearly on use of larger sample volumes.It is also possible to use this kit for RNA isolation out of frozen blood sample, but thesample volume is then restricted to 150 µl for each column.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 11

KIT COMPONENTSpeqGOLD Blood RNA Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 PurificationsProduct Number Safety Line 12-6814-00 12-6814-01 12-6814-02Product Number Classic Line 12-6614-00 12-6614-01 12-6614-02ComponentsPerfectBind RNA Columns 5 50 200DNA Removing Columns 5 50 2002.0 ml Collection Tubes 20 200 4 x 200Lysis Buffer ER 3 ml 30 ml 90 mlRNA Lysis Buffer T 2 x 1.5 ml 32 ml 125 mlRNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 mlRNA Wash Buffer II 2 ml 20 ml 3 x 20 mlRNase free Water 1 ml 5 ml 20 mlInstruction manual 1 1 1STORAGE AND STABILITYpeqGOLD Blood RNA Kit components should be stored at room temperature (22 °C –25 °C). Nevertheless Lysis Buffer ER needs to be cooled to 4 °C prior use and couldalready be stored at that temperature.All peqGOLD Blood RNA Kit components are stable for at least 12 months from the dateof purchase when stored at 22 – 25 °C. During shipment crystals may form in the RNALysis Buffer T. Warm up to 37 °C to dissolve.BINDING CAPACITYEach PerfectBind-RNA column can bind approximately 100 µg of RNA. Using more than1.5 ml blood (more than 1 x 10 7 nucleated cells) is not recommended.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 12

BEFORE STARTINGBriefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all componentsand have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNasecontamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when usingthe supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! Under cool ambient conditions, crystals may form in RNA Lysis Buffer T. This isnormal and the bottle should be warmed (37 °C) to dissolve the salt before use.! Blood samples should be treated with anticoagulants, like acid-citrate-dextrose, andprocessed as quickly as possible, as some transcripts can degrade very fast.! Storage of Blood samples in a freezer should be avoided prior lysis, as this wouldresult in premature lysis of erythrocytes and their cell debris can hardly washed awayafterwards. That’s why it is recommended not to use more than 150 µl frozen blood,as the yield of RNA would be affected.! Lysis Buffer ER is concentrated and has to be diluted with sterile, deionized, RNase-freewater:Kit 12-6814-00Kit 12-6814-01Kit 12-6814-02Add 97 ml dH 2 O to 3 ml Lysis Buffer ERAdd 970 ml dH 2 O to 30 ml Lysis Buffer ERAdd 2910 ml dH 2 O to 90 ml Lysis Buffer ER! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol asfollows:Kit 12-6814-00Kit 12-6814-01Kit 12-6814-02Add 8 ml 100% EtOH to 2 ml Wash Buffer IIAdd 80 ml 100% EtOH to 20 ml Wash Buffer IIAdd 3 x 80 ml 100% EtOH to 3 x 20 ml Wash Buffer II! Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature.! All steps must be carried out at room temperature (22 – 25 °C), unless otherwisenoted.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 13

PEQGOLD BLOOD RNA ISOLATION PROTOCOLMaterials required, but not supplied:! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol (diluted with RNase-free-dH 2 O)! Sterile RNase-free pipet tips and centrifuge tubesNote: After red blood lysis and removal, all other steps must be carried out at room temperature.Work quickly, but carefully.1. Lysis of erythrocytesAdd 10 ml of cold Lysis Buffer ER (4 °C, prepare ready to use solution if necessary!) to0.5 ml – 1.5 ml blood sample. Use a 15 ml Falcon tube.Incubate for 15 min on ice, mixing by brief vortexing twice. Lysis of red blood cells isindicated when the solution becomes translucent. For blood samples from individuals withan elevated hematocrit or ECR, extend incubation time to 20 min.Pellet leukocytes by centrifuging at 2.500 x g* for 15 min at 4 °C. Completely removeand discard the supernatant containing lysed red blood cells. If a refrigerated centrifugeis not available, centrifuge at room temperature, but quickly complete next step. Don’tdiscard the pellet and completely remove Lysis Buffer ER by inverting the tube on a papertowel.2. Wash White Blood Cell PelletUse 5 ml of cold Lysis Buffer ER (4 °C) to resuspend the pellet by mixing. Centrifuge at2.500 x g* for 3 min at 4 °C to pellet leucozytes. Completely remove and discard thesupernatant containing lysed red blood cells. Remove remaining Lysis Buffer ER byinverting the tube on a paper towel.3. Lysis of LeucocytesAdd 600 µl RNA Lysis Buffer T to the pelleted white blood cells and completely resuspendby pipetting. Incubate at room temperature for 2 min.Samples may be safely stored at –70 °C after addition of RNA Lysis Buffer T.Note: Pellet must be completely resuspended. If clumps still remain, incubate for additional 5 minat room temperature.* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 14

Transfer the cell lysate directly to a DNA Removing Column setting in a 2.0 ml collectiontube (supplied) and centrifuge at 10.000 x g* for 2 minutes. Discard DNA RemovingColumns and save the filtrated lysate.Note: If more than 1 x 10 7 cells had been used, the cell lysate will be too viscous to pipet. In thiscase, divide the sample into two aliquots and adjust the volume of each aliquot to 650 µl withRNA Lysis Buffer T. Continue the protocol from the step 3 with two DNA Removing Columns andtwo PerfectBind RNA Columns.4. Load and bindAdd an equal volume of 70 % ethanol (~ 600 µl) to the lysate and mix by pipetting. Aprecipitate may form on addition of ethanol, but will not interfere with RNA isolation.Apply the entire sample (including any precipitate) to a PerfectBind RNA columnassembled in a 2 ml collection tube (supplied). The maximum capacity of the PerfectBindRNA spin cartridge is 700 µl. Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min. Discard flow-throughand reuse collection tube until the whole sample was loaded to the column.5. Wash ITake a new Collection Tube, add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifugethe PerfectBind RNA Column/Collection Tube for 1 minute at 10.000 x g*. Discard theflow-throw liquid and the re-use Collection Tube.6. DNase I Digestion (optional)Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNAwithout the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for mostdownstream applications. However, certain sensitive RNA applications might requirefurther DNA removal. Moreover it might be necessary for RNA isolation out of > 1 mlblood samples to remove remaining DNA by DNase digestion. Following steps provideon-membrane DNase I digestion (Order No. 12-1091).a. For each PerfectBind RNA column, prepare this DNase I digestion reaction mix:DNase I Digestion Buffer 73.5 µlRNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µlTotal volume 75 µlNote:1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mixgently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before RNAisolation.2. DNase I digestion buffer is supplied with RNase-free DNase set.Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion!* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 15

. Pipette 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface ofPerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipette the DNase I digestionmixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some ofthe mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA column.c. Incubate at room temperature (25 - 30 °C) for 15 minutes.d. Place a PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNAWash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at 10.000 x g*for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step.Continue with step 7.7. Wash IIAdd 650 µl completed Wash Buffer II on column and centrifuge at 10.000 x g* for 1 minDiscard flow-through and reuse collection tube.Note: Wash Buffer II Concentrate must be diluted with absolute ethanol before use. Refer to labelon bottle for directions.8. Dry (Important, do not skip this step!)Wash column with a second 650 µl of RNA Wash Buffer II as described in step 7.Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min and discard flow-through. Reuse the collection tubeagain and centrifuge the spin cartridge for 2 min at 10.000 x g* to completely dry thePerfectBind matrix.9. ElutionTransfer the column to a new 1.5 ml microfuge tube (not supplied with the kit) and elutethe RNA with 30 to 50 µl of RNase free water (supplied with kit). Make sure to add waterdirectly onto column matrix. Incubate at room temperature for 1 min and then centrifugefor 1 min at 6.000 x g* A second elution may be necessary to improve yield.Note: No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For very sensitivework we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. Also for RT-PCR, useintron-spanning primers that allow easy identification of DNA-contamination. A control PCRreaction containing the RNA as template will also allow detection of DNA contamination.* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 16

DNA CONTAMINATIONNo RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work(such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA withRNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion (12-1091-01/02) is a simple andfast method and can be integrated into the standard protocol.Alternatively isolated RNA could be treated with DNase afterwards.Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination.Using RNA as a template in a control PCR reaction will also allow thedetection of DNA contamination.QUANTIFICATION AND STORAGE OF RNADetermine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at260 nm and then at 280 nm.RNase-free Water is slightly acidic and can dramatically lower absorption values. We suggestthat you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometer analysis.One A 260 -unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows:RNA conc. (µg /ml) = Absorption 260 × 40 × Dilution FactorThe ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. Values of 1.8 - 2.0 indicates apurity > 90% nucleic acid.Phenol has an absorption maximum at 275 nm and can interfere with absorption readings ofDNA or RNA. However, the peqGOLD Plant RNA Kit eliminates the use of phenol and avoids thisproblem.Store RNA samples at –70 °C in RNase-free Water. Under such conditions RNAprepared with the peqGOLD system is stable for at least one year.RNA QUALITYIt is highly recommended to determine RNA quality prior to further applications.Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assessthe quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28S and18S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA,then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling, orstorage.Although RNA molecules less than 200 bases in length do not efficiently bind the PerfectBindmatrix, a third RNA band, the tRNA band, may be visible when a large number of cells are used.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 17

ORDERING INFORMATIONFor RNA isolation from cells, tissues and blood:peqGOLD Total RNA Kit 12-6634-00 5 Preparations(C-Line) 12-6634-01 50 Preparations12-6634-02 200 PreparationspeqGOLD Total RNA Kit 12-6834-00 5 Preparations(S-Line) 12-6834-01 50 Preparations12-6834-02 200 PreparationspeqGOLD Blood RNA Kit 12-6614-00 5 Preparations(C-Line) 12-6614-01 50 Preparations12-6614-02 200 PreparationspeqGOLD Blood RNA Kit 12-6814-00 5 Preparations(S-Line) 12-6814-01 50 Preparations12-6814-02 200 PreparationspeqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 18

TROUBLESHOOTING TIPSProblemLittle or no RNAelutedLikely causeRNA remains on thecolumnSuggestion• Repeat elution.• Pre-heat RNase-free water to70 °C prior to elution.• Incubate column for 5 min withwater prior to centrifugation.Column isoverloaded• Reduce quantity of startingmaterial.Clogged column Incomplete lysis • completely resuspend pellet.• Reduce amount of startingmaterialDegraded RNAProblem indown-streamapplicationsSource • Do not store blood sample priorto extraction unless they arelysed first.• Follow protocol closely, andwork quickly.RNase contamination • Ensure not to introduce RNaseduring the procedure.• Check buffers for RNasecontamination.Salt carry-overduring elution• Ensure Wash Buffer IIConcentrate has been dilutedwith 4 volumes of 100% ethanolas indicated on bottle.• 1 x Wash Buffer II must bestored and used at roomtemperature.• Repeat wash with RNA WashBuffer II.PCR inhibitors • Reduce volume of sample• For complete lysis of red bloodcells increase incubation withLysis Buffer ERDNAcontamination• Digest with RNase-free DNaseand incubate at 37 °C for5 min.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 19

APPENDIXAbb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser.Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter.peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 20

D PEQLAB Biotechnologie GmbH, 91052 Erlangen, Freecall (D): 0800 100 20 16, info@peqlab.de, www.peqlab.deAT PEQLAB Biotechnologie GmbH, 6404 Polling, Tel: +43 (0) 5238 84 169, info@peqlab.at, www.peqlab.atUK PEQLAB Ltd., Southampton SO31 7ZN, Freephone (UK): 0808 202 1302, info@peqlab.co.uk, www.peqlab.co.ukUSA PEQLAB LLC, Wilmington, DE 19810, Toll-Free (US): 877 737 5220, info@peqlab.us, www.peqlab.usCreating the future together.