peqGOLD Blood RNA Kit - Peqlab

a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten:DNase I Digestion Puffer 73.5 µlRNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µlGesamtvolumen 75 µlHinweise:1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase IReaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen.2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. StandardDNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet!b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes mittig auf die Membran der PerfectBind RNAColumn pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn einTeil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der PerfectBind RNA Columnhaftet.c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuteninkubieren.d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer Izugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei10.000 x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tubeim nächsten Schritt (Schritt 4) weiterverwenden.7. Waschen IIPerfectBind RNA Column mit 650 µl des komplettierten RNA Wash Buffer II auf die Säulepipettieren. Bei 10.000 x g* für 1 Minute zentrifugieren, Durchfluss verwerfen.RNA Wash Puffer II Konzentrat muss vor Gebrauch mit absolutem Ethanol verdünnt werden.Hinweis auf dem Flaschenetikett.8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)Die Säule erneut mit 650 µl RNA Wash Buffer II waschen. Hierfür bei 10.000 x g* für1 Minute zentrifugieren und Durchfluss anschließend verwerfen. Collection Tubewiederverwenden und Säule durch zweiminütiges Zentrifugieren bei 10.000 x g* vollständigtrocknen.9. ElutionPerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen und dieRNA mit 30 bis 50 µl RNase-freiem Wasser eluieren. Dazu mittig auf die Matrixpipettieren, Säule für eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Eine zweite Elutionsrunde kann zur Erhöhung desErtrags nötig sein.* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 20peqGOLD Blood RNA Kit Art.-Nr.: 12-6814/12-6614PEQLAB_v0314 7