6. Aufreinigung und Aktivitätsbestimmung einer Phospholipase D ...
6. Aufreinigung und Aktivitätsbestimmung einer Phospholipase D ...
6. Aufreinigung und Aktivitätsbestimmung einer Phospholipase D ...
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
Versuch 6: <strong>Phospholipase</strong> D<strong>6.</strong> <strong>Aufreinigung</strong> <strong>und</strong> Aktivitätsbestimmung <strong>einer</strong> <strong>Phospholipase</strong> D ausWirsing<strong>6.</strong>1 Einführung in die ProblemstellungPhospholipide sind weitverbreitete Membranbestandteile, die wichtige physiologische Funktionenals Speicher- <strong>und</strong> Signalmoleküle erfüllen. In der Membran des endoplasmatischen Reticulums(ER) sind fast alle Lipide vorhanden, die für den Aufbau neuer Zellmembranen gebrauchtwerden. Das wichtigste dort gespeicherte Phospholipid ist das Phosphatidylcholin,auch Lecitin genannt (siehe Schema 1). Phosphatidylcholin kann durch verschiedene Klassenvon Enzymen aufgebaut <strong>und</strong> auch je nach Bedarf wieder in die einzelnen Bausteine gespaltenwerden. Diese Phospholipid-metabolisierenden Enzyme nennt man <strong>Phospholipase</strong>n, sie katalysierenreversibel die hydrolytische Bindungsspaltung von Phospholipiden. Je nach Positiondes Angriffs der <strong>Phospholipase</strong>n unterscheidet man zwischen <strong>Phospholipase</strong>n A1 <strong>und</strong> A2, dieFettsäuren aus Phospholipiden freisetzen, <strong>und</strong> <strong>Phospholipase</strong>n C <strong>und</strong> D, die an der Phosphosäurediester-Bindungangreifen.Die hier untersuchte <strong>Phospholipase</strong> D katalysiert die Hydrolyse der terminalen Phosphodiester-Bindung,wobei als Spaltprodukte Phosphatidinsäure <strong>und</strong> Cholin entstehen (Phosphatidylcholin+ HOH => Phosphatidyl-OH + Cholin). Bei Anwesenheit von geeigneten Substratenkann <strong>Phospholipase</strong> D auch die Phosphatidylgruppe auf diese Substrate anstatt auf Wasserübertragen. Ein Beispiel ist die Transphosphorylierungsreaktion mit Ethanolamin, bei der derEthanolaminester des Phospholipids entsteht (Phosphatidylcholin + ROH => Phosphatidyl-OR + Cholin).<strong>Phospholipase</strong> A 2<strong>Phospholipase</strong> A 1OR 2OH 2 CCHO R 1O<strong>Phospholipase</strong> DH 2 OOPhosphatidylcholinCH 2 O PO-ON(CH 3 ) 3+<strong>Phospholipase</strong> C <strong>Phospholipase</strong> DOH 2 CO R 1R 2OCHO+OHN(CH 3 ) 3+OPhosphatidinsäureCH 2 O PO-OHCholinSpaltung von Phosphatidylcholin durch verschiedene <strong>Phospholipase</strong>n. Die Spaltungsprodukte der <strong>Phospholipase</strong>-D-katalysiertenReaktion sind Phosphatidinsäure <strong>und</strong> Cholin.In Untersuchungen zur Aktivität der <strong>Phospholipase</strong> D konnte festgestellt werden, daß Ca 2+ -Ionen in millimolaren Konzentrationen essentiell für die katalytische Aktivität sind. Die unterschiedlichenEigenschaften von <strong>Phospholipase</strong> D in Gegenwart <strong>und</strong> Abwesenheit von Ca 2+ -
Versuch 6: <strong>Phospholipase</strong> DReaktionen sollen durch Dünnschichtchromatographie getrennt <strong>und</strong> anschließend durch Farbreaktionensichtbar gemacht werden. Dabei färbt Jod unspezifisch alle Substanzen an, währendNinhydrin selektiv primäre Amine nachweist.Durchführung des Tests:In vier verschiedenen Eppendorf-Gefäßen werden 2 Tropfen der aktiven Proteinfraktion miteinem Tropfen der jeweiligen Alkohollösung (Ethanol, Glycerin oder Ethanolamin) vermischt.Dann wird jedes Gemisch mit 15 Tropfen Phosphatidylcholinlösung versetzt <strong>und</strong> 30 min langgeschüttelt. Nach Zugabe von 2 Tropfen 1 M HCl wird kurz zentrifugiert, um die Phasen zutrennen. 20 µl jeder wäßrigen (oberen!) Phase werden auf eine Dünnschichtplatte aufgetragen.Nach Entwickeln in Chloroform/Methanol/Essigsäure (65:25:10 v/v) werden die Platten für 1min in eine Jodkammer gestellt, um die Analyten sichtbar zu machen. Anschließend taucht mandie Platte kurz in Ninhydrin-Reagenz <strong>und</strong> erhitzt sie mit einem Heißluftfön bis zum Eintreten derFarbreaktion.<strong>6.</strong>3 Kontrollfragen1. Welche Bedeutung haben <strong>Phospholipase</strong>n für Lebewesen?2. Erklären Sie die unterschiedliche Affinität von <strong>Phospholipase</strong> D auf Octylsepharose in Gegenwart<strong>und</strong> Abwesenheit von Ca 2+ -Ionen.3. Skizzieren Sie die theoretischen Produkte der Phosphatidyltransferaseaktivität von <strong>Phospholipase</strong>D in Gegenwart von Phosphatidylcholin <strong>und</strong> den Alkoholen Ethanol, Glycerinoder Ethanolamin. Welches Produkt entspricht einem natürlichen Lipid?4. Erklären Sie das Prinzip der Dünnschichtchromatographie. Warum wird Essigsäure imLaufmittel verwendet?<strong>6.</strong>4 LiteraturR. Lambrecht, R. Ulbrich-Hofmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1992, 373, 81-88.S.F. Yang, Methods in Enzymology 1969, 14, 208-211.L. Stryer “Biochemie”, 4. Aufl., Spektrum Akademischer Verlag Berlin – Heidelberg - NewYork, 199<strong>6.</strong>
Change language