1. Einleitung - Universität zu Lübeck

Aus der Klinik für Chirurgie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. H.-P. Bruch
Immunhistologischer Nachweis und prognostische Bedeutung
der neuroendokrinen Differenzierung beim primären
Rektumkarzinom nach kurativer Resektion
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät –
vorgelegt von
Marcus Hilbert
aus Marbach am Neckar
Lübeck 2007

1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Oliver Schwandner
2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Ingeborg Bos
Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2007
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 17.12.2007
Gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
-Dekan der Medizinischen Fakultät-

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...........................................................................6
1.1 Das Rektumkarzinom ............................................................... 6
1.1.1 Epidemiologie und Ätiopathogenese ..............................................6
1.1.2 Klinik und Diagnostik.......................................................................8
1.1.3 Chirurgische Therapie des Rektumkarzinoms................................9
1.2 Prognosefaktoren................................................................... 10
1.3 Die neuroendokrinen Zellen................................................... 13
1.3.1 Historischer Überblick ...................................................................13
1.3.2 Herkunft der neuroendokrinen Zellen ...........................................14
1.3.3 Neuroendokrine Marker: CgA, Syn und NSE................................15
1.3.3.1 Chromogranin A (CgA)................................................................. 15
1.3.3.2 Synaptophysin (Syn) .................................................................... 16
1.3.3.3 Neuron-spezifische Enolase (NSE) ............................................. 17
1.4 Ki-67 ........................................................................................ 17
2. Fragestellung...................................................................19
3. Material und Methoden ...................................................21
3.1 Patientenkollektiv................................................................... 21
3.2 Kurative Chirurgie des Rektumkarzinoms............................ 23
3.3 Histopathologie ...................................................................... 25
3.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung.................................................. 26
3.5 Immunhistochemische Färbung............................................ 27
3.5.1 Das EnVision-Zwei-Schritt Detektionssystem...............................27
3.5.2 Verwendete Antikörper .................................................................28
3.5.3 Färbeprotokoll der neuroendokrinen Marker.................................29
3.5.4 Färbeprotokoll für Ki-67 (MIB-1) ...................................................30
3.5.5 Positiv- und Negativkontrollen ......................................................31
3.5.5.1 Positiv- und Negativkontrollen der neuroendokrinen Marker... 31
3.5.5.2 Positiv- und Negativkontrolle für das Ki-67-Antigen ................. 33
3.6 Auswertung............................................................................. 35
3.6.1 Chromogranin A, Synaptophysin und Neuron-spezifische
Enolase .........................................................................................35
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Inhaltsverzeichnis
3.6.2 Bestimmung des pKi-67-Markierungsindex ..................................35
3.7 Statistische Methoden............................................................ 36
3.7.1 Auswahl und Definition der untersuchten Faktoren ......................36
3.7.2 Endpunkte und statistische Auswertung.......................................38
4. Ergebnisse.......................................................................39
4.1 Klinische, histopathologische und immunhistochemische
Parameter................................................................................ 39
4.1.1 Chromogranin A............................................................................40
4.1.2 Synaptophysin ..............................................................................43
4.1.3 Neuron-spezifische Enolase .........................................................45
4.1.4 Stratifizierung der neuroendokrinen Differenzierung ....................47
4.2 Zusammenhang zwischen CgA-Expression und Ki-67-
Proliferationsaktivität............................................................. 49
4.3 Prognostische Daten.............................................................. 51
4.3.1 Tumorprogression.........................................................................51
4.3.2 Metachrone Fernmetastasen ........................................................53
4.3.3 Überlebensanalysen .....................................................................56
4.3.3.1 Rezidivfreies Überleben (disease-free survival) ........................ 56
4.3.3.2 Gesamtüberleben (overall survival)............................................ 59
5. Diskussion .......................................................................64
5.1 Neuroendokrine Zellen........................................................... 64
5.2 Neuroendokrine Differenzierung beim kolorektalen
Karzinom................................................................................. 64
5.3 Bedeutung der neuroendokrinen Differenzierung beim
Rektumkarzinom im Literaturvergleich................................. 68
5.3.1 Korrelation neuroendokriner Marker mit klinischen und
histopathologischen Parametern ...........................................................68
5.3.2 Prognostische Daten.....................................................................69
5.3.2.1 Metastasierung und neuroendokrine Differenzierung............... 69
5.3.2.2 Überlebensraten ........................................................................... 70
5.4 Bewertung der eigenen Ergebnisse und Schlussfolgerung 74
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Inhaltsverzeichnis
6. Zusammenfassung .........................................................77
7. Literatur............................................................................79
8. Anhang.............................................................................90
8.1 Tabellen und Abbildungen..................................................... 90
8.2 Abkürzungsverzeichnis ......................................................... 95
8.3 Verwendete Materialien.......................................................... 96
8.3.1 Primärantikörper............................................................................96
8.3.2 Sekundärantikörper.......................................................................96
8.3.3 Negativkontrollen ..........................................................................96
8.3.4 Chemikalien und Lösungen ..........................................................96
8.3.5 Geräte und sonstige Materialien...................................................98
8.4 Veröffentlichungen................................................................. 99
8.4.1 Vorträge ........................................................................................99
8.4.2 Publikation...................................................................................100
8.4.3 Publizierter Abstract....................................................................100
8.4.4 Posterpräsentation......................................................................101
9. Danksagung...................................................................102
10. Lebenslauf ...................................................................104
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1. Einleitung
1.1 Das Rektumkarzinom
1. Einleitung
1.1.1 Epidemiologie und Ätiopathogenese
Das kolorektale Karzinom ist mittlerweile für beide Geschlechter die zweithäufigste
Krebserkrankung. Als Rektumkarzinome gelten dabei Tumoren, deren aboraler
Rand bei der Messung mit dem starren Rektoskop 16 cm oder weniger von der
Anokutanlinie entfernt ist [39]. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen in
Deutschland wird für Männer und Frauen jeweils auf etwas über 35.000 geschätzt.
Das mittlere Erkrankungsalter ist bei Männern 69 und bei Frauen 75 Jahre. Das
kolorektale Karzinom ist darüber hinaus sowohl für Frauen und Männer die zweit-
häufigste Krebstodesursache [94].
In Westeuropa und in Nordamerika ist die Inzidenz weitaus höher als in Asien oder
einigen afrikanischen Ländern. Die Inzidenzrate variiert weltweit bis zu 60-fach
beim Kolonkarzinom und bis zu 18-fach beim Rektumkarzinom [14]. Bei
Umsiedlung aus einem Gebiet mit geringer Inzidenz in eine Region mit höherer
Inzidenz erfolgt eine Anpassung an das dortige Risiko [76].
Eindeutige Daten zur Ätiologie kolorektaler Karzinome fehlen. Unterschieden wird
zwischen sporadischen und hereditären Karzinomen. Das sporadische kolorektale
Karzinom entsteht nach heutigem Wissensstand durch genetische Veränderungen
im Darmepithel. In engem Zusammenhang damit werden verschiedene Umwelt-
faktoren gesehen. Ernährungsfaktoren wie eine ballaststoffarme Kost, ein hoher
Anteil an tierischen Fetten, der Verzehr von so genanntem „roten Fleisch“ und
regelmäßiger Alkoholkonsum werden ebenso wie Übergewicht, Rauchen und
Bewegungsmangel diskutiert. Risikominimierend scheinen eine obst- und gemüse-
reiche Kost, nichtsteroidale Antiphlogistika (Cox II - Hemmer), ballaststoffreiche
Nahrung, Vitamine (A, C, E), Selen und Kalzium zu sein. Verwandte ersten
Grades von Patienten mit einem sporadischen kolorektalen Karzinom sind selbst
überdurchschnittlich häufig betroffen. Ob Genveränderungen oder der
gemeinsame Lebensstil zugrunde liegen ist bisher nicht abschließend geklärt.
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1. Einleitung
Etwa 5-10% der kolorektalen Karzinome entstehen auf der Basis von erblichen
Faktoren, wie der familiären adenomatösen Polyposis coli (FAP) oder des
hereditären nichtpolypösen Kolonkarzinom-Syndroms (HNPCC). Die familiäre
adenomatöse Polyposis coli, das Gardner-, Turcot- und Oldfield-Syndrom gelten
als obligate Präkanzerosen. Auch eine langjährige Colitis ulcerosa erhöht das
Risiko, an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken [75, 99].
In klinischen und histopathologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden,
dass ca. 90% der kolorektalen Karzinome sporadisch auftreten und sich fast aus-
schließlich aus gutartigen Adenomen entwickeln [108]. Die Adenom-Karzinom-
Sequenz wurde von Fearon und Vogelstein in einem Mehrschrittmodell
beschrieben (Abb. 1) [37]. Diesem Modell folgend kommt es im normalen
Darmepithel initial zu einer Mutation im APC-Gen. In 80% der sporadischen kolo-
rektalen Karzinome kann diese Mutation beobachtet werden. Im Weiteren kommt
es zu Methylierungsabnormalitäten und zur Mutation im Ras-Onkogen. Funktions-
verluste der Tumorsuppressorgene DCC und p53 sind ein weiterer Schritt im
Übergang vom benignen zu malignen Wachstum. Mit dem p53-Verlust ist die
Funktion des „Wächters des Genoms“ ausgeschaltet und die Apoptose kann nicht
mehr eingeleitet werden.
Abb. 1: Genetische Veränderungen entlang der Adenom-Karzinom-Sequenz mit
Angaben zu Genen, Veränderungen und Chromosomenlokalisation.
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1.1.2 Klinik und Diagnostik
1. Einleitung
Kolorektale Karzinome wachsen eher langsam und treten klinisch daher erst spät
in Erscheinung. Die Symptome des Rektumkarzinoms sind mit Befindlichkeits-
störungen, reduziertem Allgemeinzustand, Müdigkeit, Schwäche, Gewichtsverlust
und Atemnot als Anämiefolge sehr unspezifisch. Spezifischere Symptome wie
okkultes Blut im Stuhl, peranale Blutungen, abdominelle, oft kolikartige
Schmerzen, wechselndes Stuhlverhalten mit Obstipation und Diarrhoe,
Tenesmen, Meteorismus oder Flatulenz führen häufig zur Diagnose. Spät-
symptome stellen Schmerzen bei ausgedehntem Primärtumor oder einen Ileus
dar.
Die Metastasierung findet beim Rektumkarzinom, ähnlich wie beim Kolonkarzinom
meist zuerst über den Lymphabfluss statt. Da das Rektum nur relativ wenige
Lymphgefäße besitzt, beginnt die Möglichkeit der Metastasierung erst mit der
Invasion in die Muscularis mucosae und Submukosa. Dabei verlaufen die
Lymphgefäße entlang der Arteria rectalis superior zur Arteria mesenterica inferior
und über die Arteriae rectales inferiores zur seitlichen Beckenwand über die
Iliaca-interna-Gefäße. Bei sehr tiefem Tumorsitz besteht aber auch die
Möglichkeit, dass der Tumor, ähnlich dem Analkarzinom, nach distal und inguinal
metastasiert.
Nach der UICC-Klassifikation von 1997 werden befallene Lymphknoten distal der
Abzweigung der Arteria mesenterica inferior in das N1- oder N2-Stadium
eingeteilt. Darüber hinaus reichende Lymphknoten gelten definitionsgemäß als
Fernmetastasen (M1). Die Leber ist aufgrund des venösen Abflusses über das
Pfortadersystem das häufigste Metastasierungsorgan (73%). Die Lunge ist mit
10% der zweithäufigste Metastasierungsort, vor allem bei tiefsitzenden
Rektumkarzinomen [62]. Knochenmetastasen sind mit 1-4% eher selten und
befinden sich überwiegend in der Lendenwirbelsäule und im Becken [13, 111].
Eine peritoneale Metastasierung kann sich im fortgeschrittenen Stadium finden.
Als Früherkennungsmaßnahme wird eine Untersuchung auf okkultes Blut im Stuhl
und die rektal-digitale Untersuchung ab dem 50. Lebensjahr empfohlen. Eine
Sigmoidoskopie ist ab dem 55. Lebensjahr alle fünf Jahre und eine Koloskopie ab
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1. Einleitung
dem 55. Lebensjahr alle 10 Jahre für die Früherkennung des kolorektalen
Karzinoms sinnvoll [99].
Tumormarker, wie das karzinoembryonale Antigen (CEA), haben weniger für die
Diagnose, als für den Verlauf erhebliche Bedeutung [113] und dienen der
postoperativen Überwachung. Es gibt jedoch auch mehrere Studien, die zeigen,
dass Patienten mit einem deutlich erhöhten präoperativen CEA-Wert eine
schlechtere Prognose haben, als Patienten mit einem niedrigen Wert [22, 52, 57].
Makroskopisch werden schlüsselförmig ulzerierende, polypoide und diffus-
infiltrierende Wachstumsformen bei den kolorektalen Karzinomen unterschieden.
Nach der WHO-Klassifikation von 2000 werden folgende Karzinomtypen
histologisch voneinander differenziert:
- Adenokarzinome mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad (G1-G4)
- muzinöse Adenokarzinome
- Siegelringzell-Karzinome
- adenosquamöse Karzinome
- Plattenepithelkarzinome
- kleinzellige Karzinome
- undifferenzierte Karzinome
Die Adenokarzinome nehmen hierbei mit 90-95% den am häufigsten
ausgeprägten histologischen Typ der kolorektalen Karzinome ein.
1.1.3 Chirurgische Therapie des Rektumkarzinoms
Die differenzierte chirurgische Therapie hat in der letzten Dekade dazu geführt,
dass bei 85% der Patienten eine kurative Resektion möglich geworden ist [16, 20].
Die totale mesorektale Exzision (TME) stellt hierbei die entscheidende
Bereicherung in der chirurgisch-onkologischen Behandlung des Rektumkarzinoms
dar [17, 19, 21, 85]. So belegen die Ergebnisse der Zentren, die die TME als
Dissektionsprinzip bei Karzinomen des mittleren und unteren Rektums anwenden,
dass die Lokalrezidivraten bei kurativ behandelten Patienten unter 10% gesenkt
werden konnten [3, 6, 8, 17, 40, 48, 79, 93]. Da mit diesem Verfahren das
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1. Einleitung
komplette Lymphabflussgebiet des Rektums mitentfernt wird, sollte mit dieser
Technik auch bei Vorliegen eines Lymphknotenbefalls eine niedrige Lokalrezidiv-
rate erzielt werden können [23].
Die verbesserte lokale Tumorkontrolle und die damit verbundene Verbesserung
der 5-Jahres-Überlebensraten sind die entscheidenden Zielkriterien in der
operativen Therapie des Rektumkarzinoms. Unbestritten ist, dass die
onkologischen Ergebnisse der sphinktererhaltenden tiefen Resektion im Vergleich
zur abdominoperinealen Rektumexstirpation hinsichtlich der Lokalrezidivrate - bei
beiden Operationsverfahren ist die TME obligat - gleichwertig sind [16, 87, 92,
115]. Dabei ist die Lebensqualität nach Sphinktererhalt unvergleichlich höher.
Heute können 85-90% der Rektumkarzinome mit einer kurativen sphinkter-
erhaltenden Resektion behandelt werden, ohne onkologische Qualitätsstandards
preiszugeben.
Lange Zeit beruhte die Indikationsstellung zur adjuvanten Radiochemotherapie in
den UICC-Stadien II und III auf der mittlerweile mehr als einer Dekade alten
Empfehlung des National Institute of Health [85]. Mittlerweile gilt die präoperative
Radiochemotherapie (neoadjuvante Therapie) bei fortgeschrittenen Rektum-
karzinomen (uT3/T4 bzw. uN+) als Standard [98].
1.2 Prognosefaktoren
Tumorbezogene Prognosefaktoren gewinnen in der Onkologie zunehmend an
Bedeutung [114]. Ihre klinische Relevanz liegt darin, den individuellen Krankheits-
verlauf eines Patienten vorherzusagen, die optimale Therapiestrategie auszu-
wählen, Unterschiede im Therapieverlauf zu erklären und spezifische
therapeutische Interventionen zu planen [58]. Die Prognose wird hierbei durch drei
Faktoren beeinflusst: den Patienten (z.B. Alter, Geschlecht), die Therapie (z.B.
Residualtumorfreiheit, Chirurg, adjuvante Therapie) und den Tumor selbst (z.B.
Tumorstadium, histologischer Differenzierungsgrad, Tumorbiologie) [100, 101].
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1. Einleitung
Prinzipiell findet man bei malignen Tumoren eine Vielzahl von Variablen, die bei
isolierter Betrachtung einen Einfluss auf die Prognose haben. Da zwischen diesen
Faktoren jedoch vielfach Wechselwirkungen bestehen, müssen jene Faktoren
identifiziert werden, die unabhängig von anderen Parametern eine prognostische
Wertigkeit haben [59, 81].
Die weiteste Verbreitung und Akzeptanz als Prognosefaktor hat die anatomische
Tumorausbreitung in Form der TNM-Klassifikation der UICC (Union Internationale
Contre le Cancer) gefunden, die es erlaubt, jeden Patienten mit einer bestimmten
Tumorentität einem vergleichbaren Tumorstadium mit entsprechender Prognose
zuzuordnen [118]. Die TNM-Kategorien beschreiben die aktuelle Tumor-
ausdehnung in Form der Tumorinvasionstiefe pT, des nodalen Status pN und der
pM-Kategorie (Auftreten von Fernmetastasen) (Tabellen 20-22, 24a-b und Abb.
26; siehe Anhang).
Darüber hinaus ist gerade bei soliden Tumorentitäten die Residualtumor-
klassifikation (R-Klassifikation) einer der stärksten prognostischen Parameter
innerhalb der TNM-Klassifikation. Sie beschreibt die Vollständigkeit der
Tumorresektion (Tabelle 23; siehe Anhang) [118].
Ein weiteres pathologisches Einteilungskriterium, in Bezug auf die Prognose ist
das Tumorgrading. Als niedrigmaligne Tumoren („low risk“) bezeichnet man gut
(G1) und mäßig (G2) differenzierte, als hochmaligne („high risk“) schlecht
differenzierte (G3) und undifferenzierte (G4) Karzinome (Tabelle 25; siehe
Anhang).
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1. Einleitung
Die Vielzahl anatomischer, histopathologischer sowie tumorbiologischer Faktoren
hat das College of American Pathologists veranlasst, eine Einteilung in einerseits
etablierte und andererseits in Evaluation befindliche bzw. nicht anerkannte Marker
zu entwickeln (Tabelle 1):
Kategorie Definition Kolorektales Karzinom
I
IIA
IIB
III
IV
Definitiv bewiesener
prognostischer Parameter mit
Einfluss auf das
Patientenmanagment
Prognostische Bedeutung
wiederholt gezeigt, Erwähnung im
Pathologiebericht gerechtfertigt,
weitere statistisch eindeutige
Studien notwendig
Prognostische Bedeutung in
mehreren Studien gezeigt,
Datenlage für Kategorie I bzw. IIA
nicht ausreichend
Prognostische Bedeutung nicht
ausreichend untersucht
Gut untersuchte Faktoren ohne
prognostische Relevanz
Tabelle 1: Einteilung potentieller prognostischer Parameter beim kolorektalen Karzinom
(modifiziert nach [27, 114]).
a DCC= deleted in colorectal cancer
b MSI: Mikrosatelliteninstabilität
c MSI-H: high degree-MSI
d LOH: loss of heterozygoty
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TNM-Klassifikation,
R-Klassifikation, Blut- bzw.
Lymphgefäßinvasion,
präoperative CEA-Erhöhung
Tumordifferenzierung, TNM- und
R-Klassifikation nach
neoadjuvanter Therapie (ypTNM),
R-Klassifikation nicht
peritonealisierter
Absetzungsränder
Histologischer Tumortyp,
histologische Zeichen einer
Mikrosatelliteninstabilität (MSI b ),
MSI-H c , LOH 18q (DCC a ),
Histologie des Tumorrandes
(infiltrativ vs. expandierend)
Alle molekularen Marker (außer
MSI b , LOH d 18q), perineurale
Invasion, Gefäßdichte, DNA-
Gehalt, Proliferation-,
Differenzierungs- bzw.
Invasionsmarker, peritumorale
Fibrose/Inflammation
Tumorgröße, makroskopischer
Tumortyp

1.3 Die neuroendokrinen Zellen
1. Einleitung
In fast allen Epithelgeweben der menschlichen Organe befinden sich Einzelzellen
mit endokriner Funktion. Diese verstreut liegenden, endokrinen Zellen werden in
ihrer Gesamtheit dem APUD-Zellsystem zugeschrieben. Gemeinsam ist den
APUD-Zellen, dass sie die Fähigkeit besitzen, Amine oder deren Vorstufen aufzu-
nehmen und zu decarboxylieren (»amine precursor uptake and decarboxylation«).
Damit sind sie zur Bildung von Polypeptidhormonen befähigt. Physiologischer-
weise sind die Zellen u.a. im Hypothalamus, in der Hypophyse, der Epiphyse, der
Nebenschilddrüse, im endokrinen Teil der Plazenta, im Pankreasinselsystem, in
der Lunge, als C-Zellen in der Schilddrüse, im Nebennierenmark und als endo-
krine Zellen der Magen-Darm-Schleimhaut vorhanden [13, 60].
Neben diesen physiologisch vorkommenden neuroendokrinen Zellen wird in fast
allen malignen Prozessen vom Vorkommen neuroendokriner Zellen in nahezu
allen menschlichen Organen berichtet. So sind neuroendokrin differenzierte Zellen
in Bronchialkarzinomen, Schilddrüsenkarzinomen, Urogenitaltumoren, Mamma-
karzinomen oder auch in kolorektalen Karzinomen nicht selten [12].
1.3.1 Historischer Überblick
Bereits 1927 beschrieb Hamperl die Existenz von argentaffinen bzw. argyrophilen
Zellen in Adenokarzinomen des Gastrointestinaltraktes [56]. Um 1980 wiesen
Iwashita (1979) sowie Smith und Haggitt (1984) durch Versilberungstechniken
(nach der Grimelius-Methode bzw. mit der Churukian-Schenk-Färbung)
argyrophile und argentaffine Zellen an kolorektalen Karzinomen nach [25, 53, 66,
106]. Diese angefärbten Zellen entsprechen zum größten Teil den, heute dank
spezifischer Antikörper eindeutig identifizierbaren, neuroendokrinen Zellen.
Iwashita fand 44,2% argyrophile Zellen in den von ihm untersuchten Tumoren,
während von Smith und Haggitt mit 16% deutlich weniger positive Tumorzellen
nachgewiesen werden konnten. Aus heutiger Sicht sind diese Ergebnisse kritisch
zu bewerten, da sich die Versilberungstechniken als nicht sehr zuverlässig
erwiesen haben. Ultrastrukturell konnte gezeigt werden, dass die durch
Versilberungstechniken gefärbten Zellen nicht immer neuroendokrine Granula
enthielten. Häufig wurden Zellen angefärbt, die mit der Speicherung von Schleim,
Glukagon oder Lactalbumin in Verbindung gebracht werden, so dass es zu falsch
positiven Ergebnissen kommen konnte [2, 26]. Zum anderen ließ sich mit der
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1. Einleitung
Immunhistochemie und mittels Licht- und Elektronenmikroskopie zeigen, dass die
Ergebnisse schlecht oder nicht reproduzierbar waren und von Labor zu Labor
stark differierten [2, 26, 83]. So haben sich die Versilberungstechniken als wenig
praktikabel erwiesen und wurden durch die spezifischen immunhistochemischen
Antikörper ersetzt. Vor allem der Einsatz des immunhistochemischen Markers
Chromogranin A hat die Erforschung der neuroendokrinen Zellen objektivierbar
und reproduzierbar gemacht.
1.3.2 Herkunft der neuroendokrinen Zellen
Über die Herkunft der neuroendokrin-differenzierten Zellen in epithelialen Tumoren
postulierten Smith und Haggitt im Jahre 1984 vier denkbare Möglichkeiten [106]:
1. Ein maligner Prozess schließt physiologisch vorkommende neuroendokrine
Zellen im gesunden Gewebe ein.
2. Eine gutartige Proliferation der neuroendokrinen Zellen in einem bösartigen
Prozess.
3. Die maligne Entartung zweier unterschiedlicher Stammzelllinien
(neuroendokrin und granulär).
4. Eine maligne Transformation einer Stammzelllinie, die zur neuroendokrinen
und granulären Differenzierung befähigt ist.
Die ersten drei Möglichkeiten sind mit der Vorstellung des „APUD“ Zellkonzeptes
von Pearse vereinbar, welches davon ausgeht, dass sich alle Zellen des „diffusen
neuroendokrinen Systems“ aus Neuroektoderm (Neuralrohr) entwickeln [90, 91].
Le Douarin vermutet das Endoderm als Herkunftsort der neuroendokrinen Zellen
[78]. Viele Autoren sind mittlerweile allerdings der Auffassung, dass die
endokrinen Zellen des Gastrointestinaltraktes, wie auch die übrigen dort
lokalisierten Epithelzellen, aus der identischen Progenitorzelle hervorgehen
könnten [89 ,119].
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1. Einleitung
1.3.3 Neuroendokrine Marker: CgA, Syn und NSE
1.3.3.1 Chromogranin A (CgA)
Neuroendokrine Zellen enthalten typische sekretorische Granula, die nach ihrem
Erscheinen im elektronenmikroskopischen Bild als „dense-core vesicles“
bezeichnet werden. Diese Vesikel beinhalten zur Chromogranin-Familie gehörige
Proteine. Als Mitglieder der Granin-Familie sind neben Chromogranin A, das als
erstes entdeckt wurde, auch Chromogranin B, Sekretogranin II, III, IV und V
bekannt. Die Funktion der Chromogranine ist bis heute nur teilweise geklärt.
Bekannt ist, dass durch enzymatische Spaltung aus Graninen andere
regulatorisch wirksame Peptide entstehen können [104, 117]. Möglicherweise
spielen die Granine in der Speicher- und Sortierfunktion für Sekretgranula eine
entscheidende Rolle [63]. Vermutlich ist Chromogranin A in die Reifung von
sekretorischen Granula verwickelt oder selbst als Hormon wirksam [64].
Das aus 431 Aminosäuren bestehende Chromogranin A ist ein saures,
hydrophiles Protein, das u.a. mit Katecholaminen in den Speichervesikeln (dense-
core vesicles) neuroendokriner Zellen vorliegt. Chromogranin A ist auf dem
Chromosom 14 lokalisiert und besitzt eine Molekülmasse von 48 kDa. Es wurde
bereits 1967 in den chromaffinen Vesikeln des Rindernebennierenmarks entdeckt
[9]. Zunächst wurde angenommen, dass Chromogranin A nur in der Nebenniere
zu finden sei. Doch bald konnte eine weite Verbreitung auch im Magen-Darm-
Trakt, dem Pankreas, der Schilddrüse und Nebenschilddrüse sowie insbesondere
in den neuroendokrinen Zellen des diffusen neuroendokrinen oder so genannten
APUD-Systems von Mamma, Herz (ANF-Zellen), Lunge, Trachea, Harnblase und
nicht zuletzt Urethra und Prostata nachgewiesen werden [77, 86, 105, 117]. Laut
heutigem Stand der Forschung lassen sich alle bekannten neuroendokrinen Zell-
typen des Gastrointestinaltraktes durch den Chromogranin A-Antikörper darstellen
[35]. Deshalb und aufgrund der hohen Chromogranin A-Antikörper-Sensitivität
kann und wird der Chromogranin A-Antikörper heute als immunhistochemischer
„Breitband-Marker“ für die Identifizierung neuroendokriner Zellen oder Tumoren
genutzt.
Mittlerweile kann Chromogranin A nicht nur immunhistologisch an Tumorschnitten
nachgewiesen werden. Radioimmunoassays machen die Bestimmung bei
sezernierenden Tumoren aus Blutserum möglich.
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1.3.3.2 Synaptophysin (Syn)
1. Einleitung
Synaptophysin, früher als Protein p38 bezeichnet, ist ein charakteristisches
Membranprotein der klassischen kleinen synaptischen Vesikel (small synaptic
vesicles, SSV). Es wurde ursprünglich aus den präsynaptischen Vesikeln von
Rindern isoliert und besitzt ein Molekulargewicht von 38 kDa. Synaptophysin wird
in den Nervenendigungen durch Exo- und Endozytose „recycled“. Das Membran-
protein ist in nahezu allen Neuronen vorhanden und gilt als spezifische Organelle
in Nervenzellen, da in Nicht-Neuronenzellen kein Äquivalent vorhanden ist.
Abgesehen von der SSV-Lokalisation in Nervenzellen ist Synaptophysin bei
unterschiedlichen neuroendokrinen Zellen ubiquitär auf kleinen pleomorphen
Vesikeln verteilt, jedoch nicht auf den sekretorischen Granula. Deshalb ist bei der
immunhistochemischen Suche nach neuroendokrinen Zellen die Kombination mit
einem Antikörper gegen Chromogranin A sinnvoll.
Die Funktion von Synaptophysin war lange Zeit unklar, obwohl es in enormer
Quantität exprimiert wird. Da Versuche an Synaptophysin-knock-out Mäusen kein
spezifisches Phänomen auslöste, konnte damit gezeigt werden, dass
Synaptophysin nicht essentiell ist [34, 80]. Aktuelle Forschungen gehen davon
aus, dass Synaptophysin eine komplexe Rolle bei plastischen Veränderungen des
adulten Gehirns zukommt, die eine individuelle Anpassung an erhöhte oder ver-
minderte Transmitterfreisetzungen ermöglicht [69].
Der Synaptophysin-Antikörper markiert präsynaptische Vesikel verschiedener
Arten von Nervenzellen und eignet sich somit zum Nachweis von Synapsen.
Darüber hinaus kann mit dem Antikörper ein breites Spektrum neuroendokriner
Neoplasmen, sowohl vom neuralen Typ als auch vom epithelialen Typ, identifiziert
werden.
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1. Einleitung
1.3.3.3 Neuron-spezifische Enolase (NSE)
Die Neuron-spezifische Enolase gehört zu der Gruppe der
2-Phospho-D-glycerat-Hydrolasen, welche die wechselseitige Umwandlung von
2-Phosphoglycerat zu Phosphoenolpyruvat katalysieren. Bei den Enolasen
handelt es sich um Homodimere, die aus zwei α- (46 kDa), zwei β- (44 kDa) oder
zwei γ-Untereinheiten (46 kDa) bestehen. Je nach Lokalisation kommen sie in drei
Hauptgruppen vor. Die αα-Enolase, auch Nicht-neuronale Enolase (NNE)
genannt, ist bevorzugt in der Leber und in Gliazellen lokalisiert. Die ββ-Enolase als
Muskel-spezifische Enolase (MSE) ist überwiegend in Herz- und Skelettmuskeln
vorhanden. Die Neuron-spezifische Enolase (NSE oder γγ-Enolase) kommt in
Nervenzellen und in reifen Neuronen vor und kann auch in neuroendokrinen
Zellen nachgewiesen werden.
Die zytoplasmatisch vorliegende Neuron-spezifische Enolase ist der als erstes
genutzte, neuroendokrine Marker und dient der Identifizierung von peripheren
Nerven. Durch die Markierung der Neuron-spezifische Enolase können sowohl
gesunde als auch neoplastische Zellen neuronalen oder neuroendokrinen
Ursprungs dargestellt werden [72, 103, 107].
1.4 Ki-67
Das Ki-67-Antigen mit seinen zwei Isoformen (345 und 395 kDa) wird als pKi-67
bezeichnet [30, 46]. Diesen Namen verdankt es der Tatsache, dass in einem
Labor in Kiel („Ki“) der monoklonale Antikörper gegen das spätere „Ki-67“-Antigen
in der 67. Vertiefung der verwendeten Mikrotiterplatte Primärwachstum zeigte.
Das Ki-67-Antigen ist ein im Zellkern lokalisiertes Nicht-Histion-Kern-Protein und
wird durch seine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper des Ki-67-Klons
definiert [43, 46, 47]. Das Protein gehört zur Familie der MPM2-Phosphoproteine,
von denen einige für die Kontrolle der Mitose verantwortlich sind [33]. pKi-67 wird
in allen aktiven Phasen des Zellzyklusses (G1, S, G2 und M) exprimiert. Der
Expressionsort ist vom Zellzyklus abhängig. So ist z.B. während der G1-Phase der
Nukleolus, während der S- und G2-Phase hingegen die Nuklearmatrix, der Ort der
pKi-67-Expression [15]. In ruhenden Zellen (G0-Phase) kann pKi-67 nicht nachge-
wiesen werden. Deshalb ist der immunhistologische Nachweis von pKi-67
beweisend für die Proliferationsaktivität der Zellen [45, 47, 54].
Seite 17 von 104

1. Einleitung
Die Erstbeschreibung des zugehörigen Ki-67-Antikörpers gelang 1983 Gerdes et
al.. Das im Zellkern lokalisierte Protein (pKi-67) konnte aber nur an Gefrier-
schnitten nachgewiesen werden [47]. Die Entwicklung weiterer Antikörper (MIB-1
(= Molekulare Immunologie Borstel) und MIB-3) ermöglichte eine retrospektive
Untersuchung, so dass eine MIB-1- und MIB-3-Färbung auch an formalinfixierten
Paraffinschnitten durchgeführt werden konnte [44, 46, 73]. Durch den Zellzyklus-
arrest, z.B. bei gleichzeitiger Expression vom p53- oder p21-Wildtyp, kann die
Proliferationsrate allerdings zu hoch erscheinen, so dass sich heute der Ki-67
Markierungsindex (= Quotient aus Ki-67 positiv anfärbbaren Tumorzellen zu allen
Tumorzellen) in der Routinediagnostik etabliert hat.
Beim monoklonalen Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen (Clone MIB-1) handelt es
sich um einen Antikörper, der für den Nachweis des Ki-67-Antigens etabliert ist.
Diagnostisch wird er vor allem für den Nachweis des Ki-67-Antigens in gesunden
und neoplastischen Zellen, insbesondere bei Weichteilsarkomen, bei Adeno-
karzinomen der Prostata und bei Mammakarzinomen, eingesetzt.
Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von ungefähr 90 Minuten steht mit dem Ki-67-
Antikörper ein immunhistochemischer Marker zur Verfügung, mit dem die
„aktuelle“ Proliferationsaktivität gesunder und neoplastischer Zellen beurteilt
werden kann.
Der Ki-67-Antikörper markiert Zellen, die sich in der Zellteilung befinden. Ki-67 ist
demzufolge ein geeignetes Mittel, um proliferierende Zellen darzustellen. Der
Einfluss der Ki-67-Expression ist in verschiedenen Geweben schon als
prognostischer Marker bewiesen worden. So ist beispielsweise eine prognostische
Relevanz bei Prostata- und Mammakarzinomen beschrieben worden [1, 67]. Bei
Karzinomen des Dickdarmes werden unterschiedliche Bedeutungen der
Expression von Ki-67 diskutiert [32, 74, 88, 97, 112, 116]. Bislang ist allerdings
völlig ungeklärt wie sich der Proliferationsindex in Adenokarzinomen des Kolons
und des Rektums, die neuroendokrine Zellen exprimieren, darstellt.
Seite 18 von 104

2. Fragestellung
2. Fragestellung
Vor dem Hintergrund der widersprüchlichen Bedeutung von neuroendokrinen
Zellen im Gastrointestinaltrakt war es das Ziel der Studie, die Inzidenz und
potentielle klinisch-histopathologische Korrelationen der „klassischen“ Marker in
der Diagnostik von neuroendokrinen Tumoren mittels Chromogranin A (CgA),
Synaptophysin (Syn) und Neuron-spezifische Enolase (NSE) beim primären
Rektumkarzinom zu evaluieren. Die immunhistologische Untersuchung wurde an
einem homogenen Patientenkollektiv (ausschließlich Adenokarzinome des
Rektums nach kurativer Resektion) durchgeführt.
Zudem stand die Frage im Mittelpunkt, ob beim Nachweis der neuroendokrinen
Differenzierung bei rektalen Adenokarzinomen ein möglicher Zusammenhang mit
der Ki-67-Proliferationsaktivität besteht.
Eine weitere Zielsetzung der Studie war es, eine mögliche prognostische
Bedeutung von Chromogranin A (CgA), Synaptophysin (Syn) und Neuron-
spezifische Enolase (NSE) beim primären Rektumkarzinom zu evaluieren.
Speziell die Beobachtung mehrerer Arbeitsgruppen, dass der immunhistologische
Nachweis von neuroendokrinen Zellen in primären kolorektalen Karzinomen
(Adenokarzinome) mit einer schlechteren Überlebensprognose gegenüber
„normalen“ Adenokarzinomen einhergeht, war letztlich Anlass, diese Hypothese
an einem homogenen Patientenkollektiv zu überprüfen [26, 98].
Um ein homologes Kollektiv zu gewährleisten, wurden nur kurativ resezierte
Rektumkarzinome (standardisierte Operation nach onkologischen Grundsätzen
mit totaler mesorektaler Exzision, R0-Resektion, standardisierte histopatho-
logische Untersuchung, adjuvante Radiochemotherapie in den UICC-Stadien II
und III, komplette Nachsorge durch die Klinik für Chirurgie) in der vorliegenden
Analyse eingeschlossen.
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2. Fragestellung
Im Mittelpunkt standen insbesondere folgende Fragestellungen:
• Korrelieren die immunhistochemisch ermittelten Expressionen der neuro-
endokrinen Differenzierung (CgA, Syn, NSE) mit klinischen Parametern?
• Ist der immunhistochemische Nachweis der neuroendokrinen Marker mit
histopathologischen Parametern, u.a. dem Tumorstadium, der Invasions-
tiefe oder dem Lymphknotenstatus assoziiert?
• Korrelieren neuroendokrine Marker mit dem Serum-CEA?
• Bestehen mögliche Assoziationen der neuroendokrinen Differenzierung mit
der Ki-67-Proliferationsaktivität?
• Besteht eine prognostische Relevanz der immunhistologisch
nachgewiesenen Expressionen im Hinblick auf die Rückfallrate (Lokal-
rezidiv und/oder metachrone Fernmetastasen)?
• Lässt sich eine prognostische Signifikanz der immunhistologisch nach-
gewiesenen neuroendokrinen Marker im Hinblick auf das Überleben
(rezidivfreies Überleben, Gesamtüberleben) darstellen?
• Welche klinischen, operativen oder histopathologischen Parameter sind mit
der Prognose assoziiert?
• Welche klinischen, operativen oder histopathologischen Parameter üben
einen unabhängigen Einfluss auf die Prognose aus?
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3. Material und Methoden
3.1 Patientenkollektiv
3. Material und Methoden
Das Patientenkollektiv dieser retrospektiven Untersuchung entstammt dem Tumor-
nachsorgeregister der Klinik für Chirurgie des Universitätsklinikums Schleswig-
Holstein, Campus Lübeck, in dem alle Patienten mit einem kolorektalen Karzinom
prospektiv erfasst werden. Um ein homogenes Patientenkollektiv zu
gewährleisten, wurden für einen definierten Zeitraum (Januar 1996 bis November
2002) 94 kurativ behandelte Patienten mit einem primären Adenokarzinom des
Rektums identifiziert und für die vorliegende Studie ausgewählt. Die Patienten
erfüllten dabei die in Tabelle 2 dargestellten Einschlusskriterien.
Eingeschlossen Ausgeschlossen
Primäre Rektumkarzinome
Adenokarzinome
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Hereditäre, synchrone und Colitis-
assoziierte Rektumkarzinome
Entdifferenzierte Karzinome,
muzinöse Karzinome
Kurative Resektion mit TME Lokale Exzision, TEM
Adjuvante Radiochemotherapie
(UICC II und III)
Neoadjuvante Therapie
Intrainstitutionelle Tumornachsorge Palliative Resektion, R1/R2-Resektion
Komplette Tumornachsorge Keine komplette Tumornachsorge
Tabelle 2: Ein- und Ausschlusskriterien.

3. Material und Methoden
Alle relevanten klinischen, operativen und histopathologischen Daten wurden
anhand der PC-Datenbank „Rektumkarzinom“ prospektiv dokumentiert und regel-
mäßig mit den Daten der Tumornachsorge (gemäß den Leitlinien der Deutschen
Gesellschaft für Chirurgie, Deutsche Krebsgesellschaft und ihre Arbeitsgemein-
schaften und Deutsche Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechsel-
erkrankungen) aktualisiert.
Die Nachbeobachtung der Patienten mit einem kolorektalen Karzinom erfolgte
während der regelmäßigen Nachsorge in der Klinik für Chirurgie des
Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck (Tabellen 3 und 4).
Zeit postoperativ
3 Mon.
1 Jahr
Anamnese/Untersuchung � � � � � � �
Tumormarker � � � � � �
Sonographie � � � � � �
Röntgen Thorax � � � � � �
Endoskopie � � � � �
Tabelle 3: Nachsorgeschema beim Rektumkarzinom: Tumorstadium T1-2 N0 M0.
Zeit postoperativ
3 Mon.
1 Jahr
1 ½ Jahre
Anamnese/Untersuchung � � � � � � � � �
Tumormarker � � � � � � � �
Sonographie � � � � � � � �
Röntgen Thorax � � � � � �
Endoskopie � � � � � � �
Tabelle 4: Nachsorgeschema beim Rektumkarzinom: Tumorstadium T3-4 N0 M0 oder
T1-4N+M0.
2 Jahre
2 Jahre
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3 Jahre
2 ½ Jahre
3 Jahre
4 Jahre
4 Jahre
5 Jahre
5 Jahre
3-jährlich
2-jährlich

3. Material und Methoden
3.2 Kurative Chirurgie des Rektumkarzinoms
Die kurative Resektion (R0-Resektion) wurde in allen Fällen nach den gültigen
onkologischen Standards durchgeführt [17, 18]. Sie beinhaltet die Absetzung der
Arteria mesenterica inferior aortennah sowie der Vena mesenterica inferior am
Pankreasrand, die komplette Entfernung des Mesorektums (totale mesorektale
Exzision) bei Karzinomen der unteren zwei Rektumdrittel, die Einhaltung eines
onkologisch angemessenen Sicherheitsabstandes, die en-bloc-Resektion von
tumoradhärenten Organen (multiviszerale Resektion) sowie der Erhalt der
autonomen Nervenstränge (Plexus hypogastricus, Plexus pudendus) [79].
Entscheidende Operationsschritte sind in den Abbildungen 2-4 dargestellt:
Abb. 2: Laparoskopisches Absetzen der Arteria mesenterica inferior.
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Abb. 3: Situs nach TME.
Abb. 4: TME-Präparat.
3. Material und Methoden
Bei Karzinomen des oberen Rektumdrittels wurde standardisiert eine anteriore
Resektion mit intrapelviner kolorektaler Anastomose durchgeführt, ein aboraler
Sicherheitsabstand in der Rektumwand von 5 cm in situ und eine ebenso weit
nach aboral reichende Entfernung des Mesorektums waren erforderlich [16, 19,
Seite 24 von 104

3. Material und Methoden
21, 29]. Bei Karzinomen des mittleren und unteren Rektumdrittels erfolgte eine
tiefe oder ultratiefe (intersphinktäre) Resektion mit kompletter Entfernung des
Mesorektums (TME) bis zur Puborektalisschlinge. Hierbei wurde die Anastomose
(kolorektal bzw. koloanal) unterhalb von 6 cm ab der Anokutanlinie angelegt.
Ein aboraler Sicherheitsabstand von 2 cm in situ war erforderlich [16, 19, 21, 29].
Eine abdominoperineale Rektumexstirpation wurde immer dann zwingend not-
wendig, wenn der Tumor in den Analkanal eingewachsen war, d.h. die
Sphinkteren und den Beckenboden infiltrierte [16]. Nach R0-Resektion wurden
Patienten in den UICC-Stadien II oder III nach den Empfehlungen der
Konsensuskonferenz adjuvant nachbehandelt (Radiochemotherapie) [85].
3.3 Histopathologie
Die postoperative histopathologische Klassifikation der Tumoren erfolgte im
Rahmen der routinemäßigen Begutachtung des Resektats durch das Institut für
Pathologie (Direktor: Prof. Dr. med. A.C. Feller). Grundlage der Begutachtung
waren stets die WHO-Klassifikation und das TNM-System, wobei die erhobenen
Daten jeweils gemäß der aktuellen Auflage der UICC aktualisiert wurden [118].
Die Begutachtung des intakten TME-Präparats erfolgte intraoperativ durch den
Operateur. Von jeder Tumorprobe wurden Tumor- und Normalgewebe formalin-
fixiert und in Paraffin eingebettet. Für die weitere immunhistochemische
Bearbeitung wurden von den Paraffinblöcken mehrere Schnitte von ca. 4 µm
Dicke angefertigt und auf Objektträger aufgezogen. Die Objektträger wurden über
Nacht bei 56°C getrocknet.
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3.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
3. Material und Methoden
Aus den routinemäßig in Formalin fixierten und anschließend in Paraffin einge-
betteten Tumorblöcken wurden jeweils 4 µm dicke Gewebeschnitte immunhisto-
chemisch untersucht. Vor jeder immunhistochemischen Analyse wurden
HE-Färbungen (Hämatoxylin/Eosin; „HE“) angefertigt, um repräsentative Schnitte
mit ausreichend Tumorgewebe zu gewährleisten.
Das HE-Färbeprotokoll ist nachfolgend dargestellt:
» Objektträger entparaffinisieren (3 x Xylol je 5 Minuten; absteigende
Alkoholreihe: 100%, 100%, 96%, 96%, 70% jeweils 3 Minuten)
» In Millipore spülen
» In Leitungswasser spülen
» Färbung in Hämatoxylin für 5 Minuten
» Bläuen in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten
» Gegenfärbung mit Eosin G-Lösung 0,5 % für 20 - 40 Sekunden
» In Leitungswasser spülen
» Aufsteigende Alkoholreihe
» 3 x Xylol je 5 Minuten
» Eindecken mit Eukitt ®
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3. Material und Methoden
3.5 Immunhistochemische Färbung
3.5.1 Das EnVision-Zwei-Schritt Detektionssystem
Die EnVision TM -Methode ist eine in den USA und in Europa patentrechtlich ge-
schützte Technologie, in welcher ein sowohl enzym- als auch antikörpermarkiertes
Polymerkonjugat eingesetzt wird. Das Konjugat besteht aus einem inerten
Dextranmolekül (Polysaccharid), an welches durchschnittlich 70 Meerrettich-
peroxidasen und zehn Antikörper gebunden sind. AEC (3-Amino-9-etnylcarbazole)
wurde bei allen Untersuchungen als Substrat-Chromogen verwendet.
Die Methode ist aufgrund ihrer kurzen Färbedauer und ihrer hohen Sensitivität ein
sehr beliebtes Zwei-Schritt-Detektionssystem. Mittlerweile wird dieses System
neben der Immunhistochemie auch bei der in-situ-Hybridisierung und beim
Western Blot eingesetzt [10].
Abb. 5: EnVision TM -Methode.
Dem Primärantikörper (Schritt 1) folgt ein Dextranpolymer
(Schritt 2).
Bei der Färbung wird das Gewebe zunächst mit unkonjugierten Primärantikörpern
inkubiert (Schritt 1). Anschließend folgt die Inkubation mit dem EnVision TM -
Polymer. Die an das Dextranpolymer gekoppelten Peroxidasen gehen bei der
Zugabe eines Elektronendonors (AEC-Chromogen) einen Enzym-Substratkomplex
ein (Abbildung 5). Die anschließende Oxidation des Elektronendonors ergibt ein
farbiges Endprodukt, welches im Mikroskop beobachtet und eingestuft werden
kann.
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3.5.2 Verwendete Antikörper
3. Material und Methoden
Für die vorliegende Untersuchung wurden Antikörper gegen Chromogranin A
(CgA), Synaptophysin (Syn) und Neuron-spezifische Enolase (NSE) sowie pKi-67
verwendet.
Bei den drei erstgenannten Antikörpern handelt es sich um die „klassischen“
Marker zur Erkennung von neuroendokrinen Zellen, die auch in der
routinemäßigen histopathologischen Untersuchung von neuroendokrinen Tumoren
eingesetzt werden. Chromogranin A, das in vielen Studien als alleiniger Antikörper
verwendet wird, markiert die sekretorischen Granula der neuroendokrinen Zellen.
Um auch die kleinen synaptischen Vesikel darzustellen, erfolgte neben der
Chromograninfärbung eine ergänzende Färbung mit dem Synaptophysin-
Antikörper. Die spezielle Eigenschaft der Neuron-spezifischen Enolase-Antikörper,
die im Zytoplasma liegenden Proteine anzufärben, komplettierte die Anwendung
der beiden anderen Antikörper, um alle neuroendokrinen Zellen sichtbar zu
machen.
Die Ki-67-Färbung markiert proliferierende Zellen und ist ebenfalls eine Standard-
methode zur histopathologischen Beurteilung von Tumoren.
Tabelle 5 zeigt die Antikörper in den jeweils verwendeten Verdünnungen:
Primärantikörper Verdünnung Methode
Monoclonal Mouse Anti-Human
Chromogranin A
Klon DAK-A3
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
Polycolonal Rabbit Anti-Human
Synaptophysin
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
Monoclonal Mouse Anti-Human
Neuron-specific Enolase
Clone BBS/NC/VI-H14
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
Monoclonal Mouse Anti-Human
Ki-67 Antigen
Clone MIB-1
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
Tabelle 5: Verwendete Antikörper.
1:75
1:65
1:130
1:60
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DAKOEnVision + System-HRP ®
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
DAKOEnVision + System-HRP ®
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
DAKOEnVision + System-HRP ®
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)
DAKOEnVision + System-HRP ®
(DakoCytomation, Glostrup,
Dänemark)

3. Material und Methoden
3.5.3 Färbeprotokoll der neuroendokrinen Marker
Die Objektträger wurden durch ein 3 x 10-minütiges Xylol-Bad und ein jeweils
2-minütiges Alkoholbad in einer absteigenden Alkoholreihe (100%, 100%, 96%,
96%, 70%) entparaffiniert. Anschließend erfolgte das 15-minütige Antigen
Retrieval in einer Mikrowelle bei 700 W in einer TBS – Lösung bei pH 9.
Diese Retrieval-Vorbehandlung war bei der Chromogranin A- und bei der
Synaptophysin-Färbung notwendig. Die NSE–Färbung konnte ohne vorheriges
Antigen-Retrieval durchgeführt werden.
Die auf diese Weise vorbehandelten Objektträger wurden in einem DAKO-
Färbeautomaten im Labor der Hämatologie (Universitätsklinikum Schleswig-
Holstein, Campus Lübeck; Direktor: Prof. Dr. T. Wagner) eingebracht. Hier erfolgte
die immunhistochemische Färbung mit der EnVision TM -Methode. Die
Färbemaschine führte folgende Schritte durch:
» Spülung mit Pufferlösung
» 30-minütige Inkubation des Antikörpers
» kurze Spülung mit Pufferlösung
» Peroxidaseblockung mittels H2O2 3% für 10 Minuten
» Spülung mit Pufferlösung
» 30-minütige Inkubation mit EnVision
» Spülung mit Pufferlösung
» AEC für 10 Minuten
» Spülung mit Pufferlösung
» AEC für 10 Minuten
Nach Rücktransport der Schnitte in TBS-Lösung pH 9 wurden diese eine Minute
lang mit Hämalaun sauer nach Meyer gegengefärbt. Das anschließende
10-minütige Bläuen schloss den Färbevorgang ab. Nach dem Eindeckeln mithilfe
von Aquatex wurden die Schnitte getrocknet und anschließend ausgewertet.
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3. Material und Methoden
3.5.4 Färbeprotokoll für Ki-67 (MIB-1)
Die Entparaffinierung der Objektträger erfolgte durch ein 3 x 10-minütiges Xylol-
Bad und ein sich anschließendes jeweils 3-minütiges Bad in einer absteigenden
Alkoholreihe (100%, 100%, 96%, 96%, 70%).
Danach erfolgte das Antigen Retrieval durch 45-minütiges high-speed Aufkochen
in der Mikrowelle in einem Citratpuffer (pH 6). Die weitere Färbung wurde in
folgenden Schritten durchgeführt:
Tag 1:
Tag 2:
» 3 x in Millipore spülen
» 30 Minuten H2O2 0,5%
» 3 x mit TBS-Lösung spülen
» 20 Minuten Proteinblock mit DAKO X0909
» Antikörperinkubation Ki-67 1:60 über Nacht im Kühlschrank bei 4°C
» 3 x mit TBS-Lösung spülen
» 5 Minuten auf dem Schüttler durchschwenken
» 30 Minuten Envision Mouse (DakoCytomation K4001)
» 3 x mit TBS-Lösung spülen
» AEC-Färbung (3-Amino-9-etnylcarbazole) ansetzen
• 1 Tbl. AEC in 12 ml N,N-Dimethylformamid auflösen
• dazu 100 ml Barbitalpuffer nach Michaelis pH 7,4
• dazu 100 ml Millipore
• dazu 10 µl H2O2 30%
• AEC-Färbelösung filtrieren
» Filtrat mit Schnitten 5 - 15 Minuten auf den Schüttler, Endpunkt
beachten
» 10 Minuten in fließendes Wasser
» Mit Hämalaun sauer nach Meyer für 1,5 Minuten gegenfärben
» 10 Minuten unter fließendem Wasser Bläuen
» Versiegeln mit Aquatex
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3. Material und Methoden
3.5.5 Positiv- und Negativkontrollen
3.5.5.1 Positiv- und Negativkontrollen der neuroendokrinen Marker
Als Positiv- bzw. Negativkontrolle für die Färbungen mit den neuroendokrinen
Markern diente jeweils Normalgewebe des Kolons. Ein Kolonpräparat wurde in
jedem Färbevorgang mitgeführt. Die physiologisch vorkommenden neuro-
endokrinen Zellen bzw. Nervenplexus ermöglichten so eine Aussage über die
Qualität der Färbung.
Entsprechende Positivkontrollen sind nachfolgend abgebildet (Abb. 6-9).
Die Abbildungen 6 und 7 zeigen normales Kolongewebe, das als Positivkontrolle
bei den Tumorfärbungen mitgeführt wurde. Die gefärbten neurosekretorischen
Granula sind deutlich zu erkennen.
Abb. 6: Positivkontrolle für Chromogranin an normaler Kolonschleimhaut (100x,
Originalvergrößerung).
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3. Material und Methoden
Abb. 7: Chromogranin A positives Zytoplasma einer normalen Kolonschleimhaut in
400facher Vergrößerung. (400x, Originalvergrößerung).
Wie in Abbildung 8 dargestellt werden durch Synaptophysin die in gesunder
Kolonmukosa vorhandenen neuroendokrinen Zellen angefärbt.
Abb. 8: Positivkontrolle für Synaptophysin an einem normalem Kolonschleimhautpräparat
(200x, Originalvergrößerung).
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3. Material und Methoden
Abbildung 9 zeigt die deutliche positive Anfärbung für Neuron-spezifische Enolase
eines Plexus myentericus (Auerbach-Plexus).
Abb. 9: Positivkontrolle der NSE-Färbung. Der Plexus myentericus des Kolonschleimhautpräparates
ist deutlich gefärbt. (200x, Originalvergrößerung).
Bei den routinemäßig durchgeführten Negativkontrollen wurden die Schnitte mit
DakoCytomation Mouse IgG2b (Chromogranin A) und DakoCytomation Mouse
IgG (Syn und NSE) inkubiert.
3.5.5.2 Positiv- und Negativkontrolle für das Ki-67-Antigen
Aufgrund der kurzen Halbwertszeit (ca. 90 Minuten) steht mit dem Ki-67-Anti-
körper ein immunhistochemischer Marker zur Verfügung, mit dem die „aktuelle“
Proliferationsaktivität gesunder und neoplastischer Zellen beurteilt werden kann.
Seite 33 von 104

3. Material und Methoden
Abbildung 10 zeigt eine menschliche Tonsille, die bei den Färbevorgängen als
Positivkontrolle genutzt wurde. Die proliferierenden Zellen des Reaktionszentrums
sind deutlich an den gefärbten Zellkernen zu erkennen.
Abb. 10 : Positivkontrolle der Ki-67 (MIB-1) – Färbung. (200x, Originalvergrößerung).
Als Negativkontrolle wurde ebenfalls eine menschliche Tonsille mit
DakoCytomation Mouse IgG, Code-Nr. X0931 gefärbt.
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3.6 Auswertung
3. Material und Methoden
3.6.1 Chromogranin A, Synaptophysin und Neuron-spezifische
Enolase
Die lichtmikroskopische Auswertung der Expressionen erfolgte bei 200-facher Ver-
größerung. Alle Schnitte wurden von cand. med. Marcus Hilbert und von Frau Dr.
rer. nat. Ute Windhoevel (Chirurgisches Forschungslabor) verblindet und
unabhängig voneinander ausgewertet. Die Tumorschnitte wurden komplett „durch-
gerastert“, wobei nur AEC-markierte Zellen in die Auszählung eingingen, die unter
der Muscularis mucosa lagen. So konnte ausgeschlossen werden, dass die im
gesunden Normalgewebe physiologisch vorkommenden neuroendokrinen Zellen
mit ausgezählt wurden. Jeder Tumor wurde in die Kriterien negativ (0), schwach
positiv (+) und stark positiv (++) eingestuft. Schwach positiv bedeutet, dass
einzelne gefärbte Zellen vorliegen (≤ 2 Zellen pro Blickfeld), während stark positive
Tumoren mehr als 2 positive Zellen pro Blickfeld beinhalteten. In negativen
Tumoren waren keine angefärbten Zellen zu sehen.
Bei unterschiedlichem Ergebnis erfolgte eine ausführliche Diskussion bzw. wurde
der Schnitt einer dritten unabhängigen Person vorgelegt (PD Dr. Oliver
Schwandner, Prof. Dr. R. Broll, Chirurgisches Forschungslabor). Alle Untersucher
hatten zum Zeitpunkt der Auswertung keine Kenntnis von den klinischen bzw.
histopathologischen Parametern.
3.6.2 Bestimmung des pKi-67-Markierungsindex
Die Ermittlung des pKi-67 Markierungsindex (auch als „Proliferationsindex“ (PI),
„staining index“ (SI), „staining score“ (SC), bzw. „labeling index“ (LI) bezeichnet)
erfolgte nach den in der Literatur gängigen Verfahren [31].
Auf den MIB-1 gefärbten Paraffinschnitten wurden in 400-facher Vergrößerung
wenigstens fünf Gesichtsfelder mit jeweils mindestens 200 Zellkernen ausgezählt.
Es wurde darauf geachtet, dass die Felder bei besonders stark positiven
Chromogranin A-Arealen in diesem stark gefärbten Bereich lagen. Lag in der
Chromogranin A-Färbung kein besonders intensiv gefärbtes Areal vor wurden fünf
Felder nach dem Zufallsprinzip ausgezählt. Insgesamt wurden pro Schnitt
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3. Material und Methoden
mindestens 1000 Zellen ausgezählt. Dabei wurde eine elektronische Zählhilfe
verwendet (Countboy ACU, TECNOMARA, Zürich, Schweiz).
Tumorzellen, die durch den monoklonalen Antikörper angefärbt wurden, galten als
„positiv“. Nicht angefärbte Tumorzellen hingegen wurden als negativ gewertet.
Stromazellen, Endothelzellen und inflammatorische Zellen wurden ebenso wie
nekrotische Bereiche nicht ausgewertet.
Die Auszählung erfolgte durch cand. med. Marcus Hilbert und beinhaltete nach
fünf unterschiedlich ausgezählten Gesichtsfeldern insgesamt mindestens 1000
Zellen pro Tumor.
Der Index berechnete sich aus dem Quotienten der Anzahl der pKi-67 positiven
Zellen und der Gesamtzahl der Zellen multipliziert mit 100%.
Anzahl pKi - 67 positiver Zellen
pKi - 67 Markierungsindex
=
⋅100
Anzahl Zellen gesamt
Nach Erstellung der Indices wurde das Ergebnis in der Übersichtsvergrößerung
(100 fach) nachvollzogen und überprüft.
Zum Vergleich der Tumoren wurde diese in drei Gruppen eingeteilt. In negative
Tumoren exprimierten weniger als 10% der Zellkerne Ki-67. Bei den positiven
Tumoren (>10% der Zellkerne positiv) wurden ein Cut-off-Level von 40% zur
Diskriminierung von schwach- und stark-positiven Tumoren angewendet.
3.7 Statistische Methoden
3.7.1 Auswahl und Definition der untersuchten Faktoren
Alle klinischen, operativen, histopathologischen und immunhistochemisch
ermittelten Daten für die Evaluation als Prognosefaktoren wurden – falls möglich –
in dichotome Variablen eingeteilt und entsprechend definiert (Tabelle 12):
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[ % ]

3. Material und Methoden
Parameter Kategorie
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
Chromogranin A
Synaptophysin
Neuron-spezifische Enolase
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bis 70 Jahre
70 Jahre und älter
weiblich
männlich
TAR
APE
ExE
UICC I
UlCC II
UICC III
UICC IV
gut oder moderat differenziert (G1/G2)
gering differenziert (G3)
pT1+2
pT3+4
negativ
positiv
normal
erhöht
negativ
positiv
negativ
positiv
negativ
positiv
Tabelle 6: In der Studie evaluierte klinische, operative, histopathologische und
immunhistochemische Parameter.
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen

3. Material und Methoden
3.7.2 Endpunkte und statistische Auswertung
Um eine definitive Beurteilung der Prognose nach kurativer Resektion zu
gewährleisten, wurden bezüglich des Endpunkts „Überleben“ sowohl das
krankheitsfreie oder rezidivfreie Überleben („disease-free survival“, d.h. Wieder-
auftreten der Tumorerkrankung lokoregionär und/oder Fernmetastasen als
erfasstes ungünstigstes Ereignis bzw. „event“) als auch das Gesamtüberleben
(„overall survival“, d.h. Tod jeder Ursache mit oder ohne Tumorerkrankung als
erfasstes ungünstigstes Ereignis bzw. „event“) dokumentiert.
Im Hinblick auf den Endpunkt „Rückfallrate“ wurde zwischen lokoregionärer Rück-
fallrate (Lokalrezidiv), Fernmetastasierungsrate (metachrone Fernmetastasen) und
Gesamtrückfallrate (Tumorprogression sowohl durch Lokalrezidiv als auch durch
Fernmetastasen) differenziert. „Prognosefaktoren“ wurden als Faktoren mit
unabhängigem Einfluss auf den Krankheitsverlauf ohne Berücksichtigung von
Komplikationen definiert [58].
Statistische Signifikanzberechnungen erfolgten uni- und multivariat. Im Rahmen
der Univarianzanalyse (Chi-Quadrat-Test, Student`s t-Test, Pearson Correlation
Test mit pair-wise deletion) wurden immunhistochemische, klinische, operative
und histopathologische Parameter hinsichtlich ihrer Korrelationen verglichen.
Zusätzlich wurden alle Faktoren bezüglich ihrer prognostischen Relevanz
(Endpunkte: Rückfallrate und Überleben) univariat getestet.
Überlebenskurven wurden zensiert nach Kaplan-Meier berechnet und mit dem
log-rank-Test statistisch verglichen. Die Univarianzanalysen erfolgten durch Frau
C. Killaitis, Dokumentation der Klinik für Chirurgie des Universitätsklinikums
Schleswig-Holstein (SPSS ® , Chicago, Illinois, USA). Im Hinblick auf die Endpunkte
„Rückfallrate“ und „Überleben“ erfolgte zusätzlich eine Multivarianzanalyse
(logistic regression model bzw. proportional hazards model; jeweils NCSS ® ,
Kaysville, Utah, USA).
Alle statistischen Signifikanzberechnungen wurden durch ein unabhängiges
Referenzzentrum überprüft (Dr. H. Paul, Institut für Statistik und mathematische
Wirtschaftsforschung der Universität Augsburg).
Das statistische Signifikanzniveau wurde bei 5% festgelegt (p

4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Klinische, histopathologische und immunhistochemische
Parameter
Das Kollektiv der 94 Patienten, die wegen eines primären Adenokarzinoms des
Rektums kurativ therapiert worden waren, bestand aus 40 Frauen (42,6%) und 54
Männern (57,4%), das mittlere Alter betrug 67,2 Jahre (range 32-92) und der
Median lag bei 68,0 Jahren. Im Hinblick auf das Operationsverfahren erfolgte bei
allen 94 Patienten eine kurative onkologische Resektion mit totaler mesorektaler
Exzision (TME), wobei 88,3% der Resektionen sphinktererhaltend durchgeführt
werden konnten.
Bezüglich des immunhistochemischen Nachweises der neuroendokrinen
Differenzierung zeigten 72% (68/94) der Rektumkarzinome keine Expression der
neuroendokrinen Marker. Hingegen konnte bei 28% (26/94) der rektalen Adeno-
karzinome mindestens ein neuroendokriner Marker nachgewiesen werden. Eine
Expression aller drei neuroendokrinen Marker wurde bei keinem Tumorpräparat
dokumentiert.
Patienten- und Tumorcharakteristika sowie die Ergebnisse der Immunhistochemie
sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Parameter Kategorie n =94
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
bis 70 Jahre 54 57,4%
70 Jahre und älter 40 42,6%
weiblich 40 42,6%
männlich 54 57,4%
Seite 39 von 104
TAR 83 88,3%
APE 10 10,6%
ExE 1 1,1%
UICC I 19 20,2%
UlCC II 39 41,5%
UICC III 33 35,1%
UICC IV 3 3,2%

Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
CgA, Syn, NSE Status
4. Ergebnisse
gut oder moderat differenziert
(G1/G2)
Seite 40 von 104
72 76,6%
gering differenziert (G3) 22 23,4%
pT1+2 29 30,9%
pT3+4 65 69,1%
negativ 58 61,7%
positiv 36 38,3%
normal 62 66,0%
erhöht 16 17,0%
negativ 75 79,8%
positiv 19 20,2%
negativ 87 92,6%
positiv 7 7,4%
negativ 91 96,8%
positiv 3 3,2%
alle 3 negativ 68 72,3%
1 mal positiv 23 24,5%
2 mal positiv 3 3,2%
Tabelle 7: Patienten- und Tumorcharakteristika sowie Daten der Immunhistochemie.
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
4.1.1 Chromogranin A
Die Färbung mit Chromogranin A zeigte in jedem Schnitt mit Normalgewebe
positive Zellen, die zusätzlich zum mitgeführten Kolonpräparat (Positivkontrolle)
als „interne“ Positivkontrolle genutzt wurden. Dabei fiel auf, dass die im Normal-
gewebe angefärbten neuroendokrinen Zellen bevorzugt im Kryptengrund
aufzufinden waren. Neuroendokrine Zellen in einem Adenokarzinom sind in
Abbildung 11 mit dem Chromogranin-Antikörper dargestellt.

4. Ergebnisse
Abb. 11: Chromogranin A-positives Adenokarzinom des Rektums (100x,
Originalvergrößerung).
19 (20,2%) der 94 Tumoren zeigten eine Anfärbung mit Chromogranin A. Die
positive CgA-Expression korrelierte hierbei signifikant mit dem Alter und dem
Differenzierungsgrad (Tabelle 8). So wurde eine Chromogranin-A-Positivität bei
unter 70-jährigen signifikant häufiger (p=0,034) registriert als bei Patienten, die 70
Jahre oder älter waren (28% vs. 10%, p=0,03). Weiterhin exprimierten gering-
gradig differenzierte Tumoren (G3) signifikant häufiger Chromogranin A-positive
Zellen als gut oder mittelgradig differenzierte Karzinome (G1/G2) (36% vs. 15%,
p=0,03).
Seite 41 von 104

4. Ergebnisse
Parameter Kategorie n CgA positiv CgA negativ p-Wert
Gesamt alle 94 19 20,2% 75 79,8% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
Syn Status
NSE Status
Tabelle 8 : Beziehung zwischen Charakteristika des Rektumkarzinoms und dem
immunhistochemischen Merkmal Chromogranin A.
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
Die klinischen Daten der 19 Patienten mit Chromogranin A-positiven Tumoren sind
in Tabelle 26 im Anhang zusammengestellt.
bis 70 Jahre 54 15 27,8% 39 72,2%
70 Jahre und älter 40 4 10,0% 36 90,0%
weiblich 40 9 22,5% 31 77,5%
männlich 54 10 18,5% 44 81,5%
TAR 83 18 21,7% 65 78,3%
APE 10 1 10,0% 9 90,0%
ExE 1 0 0,0% 1 100,0%
UICC I 19 3 15,8% 16 84,2%
UlCC II 39 9 23,1% 30 76,9%
UICC III 33 7 21,2% 26 78,8%
UICC IV 3 0 0,0% 3 100,0%
gut oder moderat
differenziert (G1/G2)
gering differenziert
(G3)
Seite 42 von 104
72 11 15,3% 61 84,7%
22 8 36,4% 14 63,6%
pT1+2 29 3 10,3% 26 89,7%
pT3+4 65 16 24,6% 49 75,4%
negativ 58 12 20,7% 46 79,3%
positiv 36 7 19,4% 29 80,6%
normal 62 9 14,5% 53 85,5%
erhöht 16 4 25,0% 12 75,0%
negativ 87 16 18,4% 71 81,6%
positiv 7 3 42,9% 4 57,1%
negativ 91 19 20,9% 72 79,1%
positiv 3 0 0,0% 3 100,0%
0,034
NS
NS
NS
0,031
NS
NS
NS
NS
NS

4.1.2 Synaptophysin
4. Ergebnisse
Die in Abbildung 12 dargestellte Synaptophysinfärbung zeigt rein morphologisch
eine starke Ähnlichkeit zu den Färbungen mit Chromogranin A, wobei hier nicht
die sekretorische Granula, sondern integrale Membranproteine der präsyn-
aptischen Vesikel angefärbt wurden. Aufgrund des kräftigeren Erscheinungsbildes
der mit Synaptophysin angefärbten Zellen lassen sich die helleren roten Areale
(Erythrozyten) deutlich von den neuroendokrinen Zellen differenzieren.
Abb. 12 : Stark Synaptophysin-positives Adenokarzinom des Rektums (100x, Originalvergrößerung).
Auch bei dieser Färbung waren sowohl das auf den Schnitten vorhandene
Normalgewebe (interne Positivkontrolle) als auch das bei jedem Färbevorgang
mitgeführte Kolonnormalgewebe stets positiv.
Seite 43 von 104

4. Ergebnisse
Von den 94 mit Synaptophysin angefärbten Tumoren zeigten 7 (7,4%) eine
positive Expression, wobei im Gegensatz zu Chromogranin A keine signifikanten
Assoziationen zu klinischen oder histopathologischen Parametern bestanden
(Tabelle 9).
Parameter Kategorie n Syn positiv Syn negativ p-Wert
Gesamt alle 94 7 7,4% 87 92,6% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
NSE Status
Tabelle 27 im Anhang zusammengestellt.
Seite 44 von 104
bis 70 Jahre 54 5 9,3% 49 90,7%
70 Jahre und älter 40 2 5,0% 38 95,0%
weiblich 40 2 5,0% 38 95,0%
männlich 54 5 9,3% 49 90,7%
TAR 83 4 4,8% 79 95,2%
APE 10 3 30,0% 7 70,0%
ExE 1 0 0,0% 1 100,0%
UICC I 19 0 0,0% 19 100,0%
UlCC II 39 5 12,8% 34 87,2%
UICC III 33 2 6,1% 31 93,9%
UICC IV 3 0 0,0% 3 100,0%
gut oder moderat
differenziert (G1/G2)
gering differenziert
(G3)
72 5 6,9% 67 93,1%
22 2 9,1% 20 90,9%
pT1+2 29 0 0,0% 29 100,0%
pT3+4 65 7 10,8% 58 89,2%
negativ 58 5 8,6% 53 91,4%
positiv 36 2 5,6% 34 94,4%
normal 62 4 6,5% 58 93,5%
erhöht 16 3 18,8% 13 81,3%
negativ 75 4 5,3% 71 94,7%
positiv 19 3 15,8% 16 84,2%
negativ 91 7 7,7% 84 92,3%
positiv 3 0 0,0% 3 100,0%
Tabelle 9: Beziehung zwischen Charakteristika des Rektumkarzinoms und dem immunhistochemischen
Merkmal Synaptophysin.
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
Die klinischen Daten der 7 Patienten mit Synaptophysin-positiven Tumoren sind in
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS

4.1.3 Neuron-spezifische Enolase
4. Ergebnisse
Nur 3 (3,2%) der 94 Tumoren zeigten eine positive Färbung für Neuron-
spezifische Enolase, den Antikörper, der vor allem Neurone, aber auch
neuroendokrine Zellen anfärbt (Abb. 13).
Abb. 13: Schwach NSE-positives Adenokarzinom des Rektums (100x,
Originalvergrößerung).
Seite 45 von 104

4. Ergebnisse
Hierbei ließen sich keine Korrelationen mit klinischen oder histopathologischen
Parametern nachweisen (Tabelle 10):
Parameter Kategorie n NSE positiv NSE negativ p-Wert
Gesamt alle 94 3 3,2% 91 96,8% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
bis 70 Jahre 54 2 3,7% 52 96,3%
70 Jahre und älter 40 1 2,5% 39 97,5%
weiblich 40 2 5,0% 38 95,0%
männlich 54 1 1,9% 53 98,1%
TAR 83 2 2,4% 81 97,6%
APE 10 1 10,0% 9 90,0%
ExE 1 0 0,0% 1 100,0%
UICC I 19 0 0,0% 19 100,0%
UlCC II 39 1 2,6% 38 97,4%
UICC III 33 2 6,1% 31 93,9%
UICC IV 3 0 0,0% 3 100,0%
gut oder moderat
differenziert (G1/G2)
gering differenziert
(G3)
Seite 46 von 104
72 1 1,4% 71 98,6%
22 2 9,1% 20 90,9%
pT1+2 29 0 0,0% 29 100,0%
pT3+4 65 3 4,6% 62 95,4%
negativ 58 1 1,7% 57 98,3%
positiv 36 2 5,6% 34 94,4%
normal 62 3 4,8% 59 95,2%
erhöht 16 0 0,0% 16 100,0%
negativ 75 3 4,0% 72 96,0%
positiv 19 0 0,0% 19 100,0%
negativ 87 3 3,4% 84 96,6%
positiv 7 0 0,0% 7 100,0%
Tabelle 10 : Beziehung zwischen Charakteristika des Rektumkarzinoms und dem
immunhistochemischen Merkmal der Neuron-spezifischen Enolase (NSE).
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
Die patientenbezogenen Daten zur NSE-Expression sind im Anhang in der Tabelle
28 zusammengefasst.
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS

4. Ergebnisse
4.1.4 Stratifizierung der neuroendokrinen Differenzierung
Bezüglich des immunhistochemischen Nachweises der neuroendokrinen
Differenzierung zeigten 72% (68/94) der Rektumkarzinome keine Expression der
neuroendokrinen Marker. Hingegen konnte bei 28% (26/94) der rektalen Adeno-
karzinome mindestens ein neuroendokriner Marker nachgewiesen werden. Eine
Expression aller drei neuroendokrinen Marker wurde bei keinem Tumorpräparat
dokumentiert.
Vor dem Hintergrund, dass in verschiedenen Literaturstellen ein Tumor als
„positiv“ angesehen wird, sobald dieser durch einen der drei Antikörper angefärbt
wurde [5, 36, 49, 96, 109, 110], sind folglich Korrelationen der klinischen Daten mit
allen als „positiv“ gewerteten Tumoren sinnvoll. Dies ist unabhängig davon, ob
sich ein Tumor als stark oder schwach positiv darstellte oder in welcher Färbung
der Tumor positiv war (Tabelle 11).
Parameter Kategorie n
Seite 47 von 104
CgA/
Syn/
NSE positiv
CgA/
Syn/
NSE negativ
p-Wert
Gesamt alle 94 26 27,7% 68 72,3% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
bis 70 Jahre 54 20 37,0% 34 63,0%
70 Jahre und älter 40 6 15,0% 34 85,0%
weiblich 40 12 30,0% 28 70,0%
männlich 54 14 25,9% 40 74,1%
TAR 83 22 26,5% 61 73,5%
APE 10 4 40,0% 6 60,0%
ExE 1 1 100,0% 0 0,0%
UICC I 19 3 15,8% 16 84,2%
UlCC II 39 13 33,3% 26 66,7%
UICC III 33 10 30,3% 23 69,7%
UICC IV 3 3 100,0% 0 0,0%
gut oder moderat
differenziert (G1/G2)
gering differenziert
(G3)
72 16 22,2% 56 77,8%
22 10 45,5% 12 54,5%
pT1+2 29 3 10,3% 26 89,7%
pT3+4 65 23 35,4% 42 64,6%
0,018
NS
NS
NS
0,033
0,012

Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
4. Ergebnisse
negativ 58 16 27,6% 42 72,4%
positiv 36 10 27,8% 26 72,2%
normal 62 16 25,8% 46 74,2%
erhöht 16 4 25,0% 12 75,0%
Tabelle 11 : Beziehung zwischen Charakteristika des Rektumkarzinoms und den
immunhistochemischen Merkmalen bei Positivität für entweder CgA, Syn, NSE oder einer
Kombination der neuroendokrinen Marker.
a
TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b
Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
In der univariaten Auswertung zeigte sich hierbei eine statistisch signifikante
Korrelation der neuroendokrinen Differenzierung mit der Infiltrationstiefe (p=0,012).
So zeigten wandüberschreitende Karzinome (pT3+pT4) signifikant häufiger eine
neuroendokrine Differenzierung als auf die Rektumwand begrenzte Karzinome
(p=0,01; Tabelle 11). Darüber hinaus war die neuroendokrine Differenzierung
signifikant mit dem Alter und dem Differenzierungsgrad assoziiert, wobei mit zu-
nehmender Entdifferenzierung eine höhere Inzidenz der neuroendokrinen
Differenzierung zu dokumentieren war (p=0,03; Tabelle 11).
Seite 48 von 104
NS
NS

4. Ergebnisse
4.2 Zusammenhang zwischen CgA-Expression und Ki-67-
Proliferationsaktivität
Alle Chromogranin A-positiven Tumoren wurden mit dem Ki-67-Antigen immun-
histochemisch gefärbt. Dabei ergab sich kein negativer Tumor, da in allen
Tumoren mindestens 10% der Zellkerne Ki-67 positiv waren. Nur zwei der 19
Chromogranin A-positiven Tumoren (10,5%) zeigten eine schwach positive
Reaktion, da die Cut-off-level zwischen 0,1 und 0,4 festgelegt wurden. Die große
Mehrheit der Tumoren (17 von 19; 89,5%) zeigte eine positive Reaktion auf die
Ki-67-Färbung, die über 40% der Zellkerne betraft, so dass diese Tumoren als
„high expressors“ eingestuft werden konnten (Abb. 14).
Abb. 14: Ki-67-Expression (100x, Originalvergrößerung).
Tabelle 12 (Absolutwerte) bzw. Abbildung 15 (grafische Darstellung) zeigen die
entsprechenden Ki-67-exprimierenden Tumoren bzw. Ki-67-Indices in
Abhängigkeit zur Chromogranin-A-Expression:
Seite 49 von 104

Nr.
Alter
UICC 97
4. Ergebnisse
CgA
Zellen
gesamt
Seite 50 von 104
ki-67 pos
Index
Expressionstyp
5 59 2 2 1031 659 0,639 High
11 52 3 2 1014 583 0,575 High
21 62 3 1 1049 272 0,259 Low
30 69 2 1 1023 142 0,139 Low
31 56 1 1 1043 429 0,411 High
33 62 3 1 1036 421 0,406 High
43 58 2 2 1018 408 0,401 High
45 66 3 1 1018 555 0,545 High
52 63 3 2 1019 427 0,419 High
53 49 1 2 1058 490 0,463 High
58 47 2 2 1037 587 0,566 High
62 58 2 2 1041 546 0,524 High
73 75 2 1 1026 418 0,407 High
74 79 1 2 1029 602 0,585 High
86 68 3 1 1021 583 0,571 High
89 63 2 1 1029 733 0,712 High
92 48 3 2 1034 426 0,412 High
93 76 2 2 1033 714 0,691 High
94 78 2 1 1023 398 0,389 High
Tabelle 12: Ermittlung des Ki-67-Index.
Index
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Proliferationsindex
Mittelwert 0,480
Mittelwert
(0,480)
0,639
0,575
0,259
0,139
0,411
0,406
0,401
0,545
0,419
0,463
0,566
0,524
0,407
0,585
0,571
0,712
0,412
0,691
0,389
5 11 21 30 31 33 43 45 52 53 58 62 73 74 86 89 92 93 94
Tumornummer
Abb. 15: Grafische Darstellung des Ki-67-Proliferationsindex bei CgA-positiven
Rektumkarzinomen.

4.3 Prognostische Daten
4.3.1 Tumorprogression
4. Ergebnisse
Drei der 94 Patienten verstarben innerhalb von 30 Tagen nach der Operation (30-
Tage-Letalität 3,2%), so dass eine komplette Tumornachsorge bei 91 Patienten
durchgeführt wurde. Nach einem mittleren Follow-up von 46 (range 2-101)
Monaten (medianer Follow-up: 43,0 Monate) kam es bei 15,4% (14/91 Patienten)
zu einer Tumorprogression: Bei 6 Patienten (6,6%) trat ein Lokalrezidiv (isoliert
n=2 bzw. mit Fernmetastasen n=4) auf und bei 12 Patienten (13,2%) wurden
metachrone Fernmetastasen (davon 8 isoliert bzw. mit Lokalrezidiv n=4)
dokumentiert (Abb. 16).
n=2
ohne
Fernmetastasen
Tumorprogression Keine Tumorprogression
Lokalrezidiv Fernmetastase
n=6
n=4
Kurativ operierte
30 Tage Letalität (n=3)
mit Fernmetastase mit Lokalrezidiv
Abb. 16: Übersicht über die Nachsorgedaten des Kollektivs (n=91).
Mit der Tumorprogression korrelierten das Tumorstadium (UICC-Stadium)
(p=0,05) und der präoperative CEA-Wert (p=0,035). Bei weiblichen Patienten kam
es häufiger zu einer Tumorprogression, dieser prozentuale Unterschied erreichte
aber keine Signifikanz (p=0,078). Die immunhistochemisch ermittelten
Expressionen waren nicht mit der Tumorprogression assoziiert (Tabelle 13).
Seite 51 von 104
n=94
n=91
n=14 n=77
n=4
n=12
n=8
ohne Lokalrezidiv

4. Ergebnisse
Parameter Kategorie n
Seite 52 von 104
Ohne
Tumor-
progression
Mit Tumorprogression
p-Wert
Gesamt alle 91 77 84,6% 14 15,4% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
CgA, Syn, NSE Status
CgA, Syn, NSE Status 2
bis 70 Jahre 54 46 85,2% 8 14,8%
70 Jahre und älter 37 31 83,8% 6 16,2%
weiblich 39 30 76,9% 9 23,1%
männlich 52 47 90,4% 5 9,6%
TAR 80 70 87,5% 10 12,5%
APE 10 7 70,0% 3 30,0%
ExE 1 0 0,0% 1 100,0%
UICC I 19 18 94,7% 1 5,3%
UlCC II 36 31 86,1% 5 13,9%
UICC III 33 27 81,8% 6 18,2%
UICC IV 3 1 33,3% 2 66,7%
gut oder moderat
differenziert(G1/G2)
gering differenziert
(G3)
70 60 85,7% 10 14,3%
21 17 81,0% 4 19,0%
pT1+2 29 27 93,1% 2 6,9%
pT3+4 62 50 80,6% 12 19,4%
negativ 55 49 89,1% 6 10,9%
positiv 36 28 77,8% 8 22,2%
normal 62 55 88,7% 7 11,3%
erhöht 15 10 66,7% 5 33,3%
negativ 73 64 87,7% 9 12,3%
positiv 18 13 72,2% 5 27,8%
negativ 84 71 84,5% 13 15,5%
positiv 7 6 85,7% 1 14,3%
negativ 88 74 84,1% 14 15,9%
positiv 3 3 100,0% 0 0,0%
alle 3 negativ 66 57 86,4% 9 13,6%
1 positiv 22 18 81,8% 4 18,2%
2 positiv 3 2 66,7% 1 33,3%
alle 3 negativ 66 57 86,4% 9 13,6%
mind. 1 positiv 25 20 80,0% 5 20,0%
NS
NS
(0,078)
NS
0,05
NS
NS
NS
0,035
Tabelle 13: Tumorprogression gesamt (Lokalrezidiv und/oder Fernmetastasen)
(n=14 bzw. 15,4%).
a TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation; ExE =
Exenteration
b Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
NS
NS
NS
NS
NS

4. Ergebnisse
Im Speziellen gab es keine signifikanten Korrelationen der neuroendokrinen
Marker mit dem Auftreten eines Lokalrezidivs (weder isoliert noch kombiniert mit
Fernmetastasen) (jeweils p>0,05). Die Lokalrezidivrate war jedoch auch nicht mit
klinischen oder histopathologischen Faktoren assoziiert (p>0,05). Nach kurativer
Resektion wegen eines pT1-Karzinoms trat kein Lokalrezidiv auf. Betrachtet man
die Infiltrationstiefe generell, so wurde nur ein Lokalrezidiv (3,6%) nach pT1+2-
Rektumkarzinom beobachtet.
4.3.2 Metachrone Fernmetastasen
Patienten mit positiver CgA-Expression entwickelten signifikant häufiger
Fernmetastasen (inklusive Lokalrezidiv): So lag die Inzidenz metachroner
Fernmetastasen bei CgA-exprimierenden Rektumkarzinomen mit 27,8%
signifikant höher als bei CgA-negativen Tumoren (p=0,04) (Tabelle 14). Keine
Assoziation wurde für Synaptophysin bzw. Neuron-spezifische Enloase
dokumentiert.
Die präoperativ ermittelten erhöhten CEA-Werte korrelierten mit dem Auftreten
von Fernmetastasen, sowohl bei Patienten mit Fernmetastasen inklusive Lokal-
rezidiv (p=0,020) als auch bei Patienten ohne Lokalrezidiv (p=0,019). Patienten
mit Lymphknotenbefall entwickelten ebenfalls häufiger Fernmetastasen, dieser
Zusammenhang war aber nicht signifikant (p=0,081).
Fernmetastasen (inklusive Lokalrezidiv) traten häufiger bei weiblichen Patienten
auf, aber auch dieser Zusammenhang erreichte keine Signifikanz (p=0,071).
Parameter Kategorie n
Seite 53 von 104
Ohne
Tumor-
progression
Fernmetastasen
mit Lokalrezidiv p-Wert
Gesamt alle 89 77 86,5% 12 13,5% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
bis 70 Jahre 53 46 86,8% 7 13,2%
70 Jahre und älter 36 31 86,1% 5 13,9%
weiblich 38 30 78,9% 8 21,1%
männlich 51 47 92,2% 4 7,8%
TAR 80 70 87,5% 10 12,5%
APE 9 7 77,8% 2 22,2%
NS
NS
(0,071)
NS

Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
4. Ergebnisse
UICC I 19 18 94,7% 1 5,3%
UlCC II 35 31 88,6% 4 11,4%
UICC III 32 27 84,4% 5 15,6%
UICC IV 3 1 33,3% 2 66,7%
gut oder moderat
differenziert(G1/G2)
gering differenziert
(G3)
Seite 54 von 104
69 60 87,0% 9 13,0%
20 17 85,0% 3 15,0%
pT1+2 28 27 96,4% 1 3,6%
pT3+4 61 50 82,0% 11 18,0%
negativ 54 49 90,7% 5 9,3%
positiv 35 28 80,0% 7 20,0%
normal 61 55 90,2% 6 9,8%
erhöht 15 10 66,7% 5 33,3%
negativ 71 64 90,1% 7 9,9%
positiv 18 13 72,2% 5 27,8%
negativ 82 71 86,6% 11 13,4%
positiv 7 6 85,7% 1 14,3%
negativ 86 74 86,0% 12 14,0%
positiv 3 3 100,0% 0 0,0%
Tabelle 14: Metachrone Fernmetastasen (mit und ohne Lokalrezidiv) (n=12 bzw. 13,2%).
a TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation
b Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
NS
NS
NS
NS
0,020
0,047
In der Analyse der isolierten metachronen Fernmetastasen, d.h. ohne Lokalrezidiv,
waren univariat die Invasions- bzw. Infiltrationstiefe (pT-Status) sowie der
präoperative CEA-Serum-Wert signifikant mit der Inzidenz von Fernmetastasen
assoziiert (Tabelle 15). Patienten mit einer positiven CgA-Expression entwickelten
signifikant häufiger Fernmetastasen: So lag die Inzidenz metachroner
Fernmetastasen bei CgA-exprimierenden Rektumkarzinomen mit 23,5%
signifikant höher als bei CgA-negativen Tumoren (p=0,03) (Tabelle 15). Keine
Assoziation wurde für Synaptophysin bzw. Neuron-spezifische Enolase
dokumentiert.
Nach kurativer Resektion wegen eines pT1 und pT2-Rektumkarzinoms wurden
keine metachronen Fernmetastasen boebachtet, die höchste Rate von
Fernmetastasen für das Gesamtkollektiv wurde bei präoperativ erhöhten CEA-
Werten beobachtet (28,6%).
NS
NS

4. Ergebnisse
Parameter Kategorie n
Seite 55 von 104
Ohne
Tumor-
progression
Fernmetastasen
ohne
Lokalrezidiv
p-Wert
Gesamt alle 85 77 90,6% 8 9,4% ---
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium (UICC 97)
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
bis 70 Jahre 51 46 90,2% 5 9,8%
70 Jahre und älter 34 31 91,2% 3 8,8%
weiblich 35 30 85,7% 5 14,3%
männlich 50 47 94,0% 3 6,0%
TAR 76 70 92,1% 6 7,9%
APE 9 7 77,8% 2 22,2%
UICC I 18 18 100,0% 0 0,0%
UlCC II 33 31 93,9% 2 6,1%
UICC III 31 27 87,1% 4 12,9%
UICC IV 3 1 33,3% 2 66,7%
gut oder moderat
differenziert(G1/G2)
gering differenziert
(G3)
65 60 92,3% 5 7,7%
20 17 85,0% 3 15,0%
pT1+2 27 27 100,0% 0 0,0%
pT3+4 58 50 86,2% 8 13,8%
negativ 51 49 96,1% 2 3,9%
positiv 34 28 82,4% 6 17,6%
normal 59 55 93,2% 4 6,8%
erhöht 14 10 71,4% 4 28,6%
negativ 68 64 94,1% 4 5,9%
positiv 17 13 76,5% 4 23,5%
negativ 78 71 91,0% 7 9,0%
positiv 7 6 85,7% 1 14,3%
negativ 82 74 90,2% 8 9,8%
positiv 3 3 100,0% 0 0,0%
Tabelle 15: Metachrone Fernmetastasen (ohne Lokalrezidiv) (n=8 bzw. 8,8%).
a TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation
b Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
NS
NS
NS
NS
NS
0,043
NS
(0,081)
0,019
0,026
Analysiert man das Kollektiv hinsichtlich der Applikation einer adjuvanten
Radiochemotherapie (n=48; 52,7% der Patienten) waren keine statistischen
Signifikanzen zu dokumentieren.
NS
NS

4. Ergebnisse
Die Multivarianzanalyse hinsichtlich der Gesamt-Tumorprogression und der
Inzidenz metachroner Fernmetastasen konnte weder das Tumorstadium, die
Invasionstiefe noch den CEA-Serum-Wert als unabhängige Prognosefaktoren
bestätigen (p>0,05, logistische Regression). Hinsichtlich der neuroendokrinen
Differenzierung konnte Chromogranin A ebenfalls nicht als unabhängiger
Prognosefaktor hinsichtlich der Inzidenz metachroner Fernmetastasen identifiziert
werden.
4.3.3 Überlebensanalysen
Überlebenszeitanalysen wurden mittels der Kaplan-Meier-Methode (Kaplan und
Meier, 1958) durchgeführt.
4.3.3.1 Rezidivfreies Überleben (disease-free survival)
Mit der rezidivfreien 5-Jahres-Überlebens-Rate korrelierten das Tumorstadium
(p=0,007; log rank), die Invasionstiefe (p=0,0238; log rank) und der präoperativ
ermittelte CEA-Wert (Tabelle 16), wobei der CEA-Wert den stärksten
prognostischen Einfluss auf die Überlebensprognose ausübte (rezidivfreie
5-JÜL-Rate 46% bei erhöhtem CEA vs. 70% bei normwertigem CEA, p=0,01;
overall 5-JÜL-Rate 43% vs. 74%, p

Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
CgA, Syn, NSE Status
4. Ergebnisse
negativ 74%
positiv 53%
normal 70%
erhöht 46%
negativ 69%
positiv 47%
negativ 65%
positiv 86%
negativ 66%
positiv ---
1 oder mehr positiv 56%
negativ 68%
Tabelle 16: Rezidivfreies Überleben (disease-free survival).
a TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation
b Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
Seite 57 von 104
NS
(0,079)
0,013
Die ermittelten Expressionen der neuroendokrinen Marker korrelierten nicht
signifikant mit den rezidivfreien 5-Jahres-Überlebensraten. Die Kaplan-Meier-
Überlebenskurven für die neuroendokrinen Marker sind in den Abbildungen 17-19
dargestellt:
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
6
Jahre rezidivfrei
8
10
NS
NS
NS
NS
CgA-Status
positiv
zensiert
negativ
zensiert
Abb. 17 : Kaplan-Meier-Kurve, rezidivfreie 5-Jahresüberlebensrate, Chromogranin A-Status.

Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4. Ergebnisse
4
6
Jahre rezidivfrei
Seite 58 von 104
8
10
Syn-Status
positiv
zensiert
negativ
Abb. 18 : Kaplan-Meier-Kurve, rezidivfreie 5-Jahresüberlebensrate, Synaptophysin-Status.
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
6
Jahre rezidivfrei
Abb. 19 : Kaplan-Meier-Kurve, rezidivfreie 5-Jahresüberlebensrate, NSE-Status.
8
10
zensiert
NSE-Status
positiv
zensiert
negativ
zensiert

4. Ergebnisse
Das Tumorstadium (UICC) war univariat signifikant mit der rezidivfreien 5-Jahres-
Überlebensrate assoziiert (rezidivfreie 5-Jahres-Überlebensrate 89% im
UICC-Stadium I, 64% im UICC-Stadium II, 56% im UICC-Stadium III) (Abb. 20).
In der Multivarianzanalyse konnte das UICC-Stadium jedoch nicht als
unabhängiger Prognosefaktor identifiziert werden (p>0,05; hazard ratio 0,71;
proportional hazards).
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
6
Jahre rezidivfrei
Abb. 20: Kaplan-Meier-Kurven, rezidivfreie 5-Jahresüberlebensrate, UICC-Stadium.
4.3.3.2 Gesamtüberleben (overall survival)
Seite 59 von 104
8
10
UICC-Stadium
III
II
I
zensiert
zensiert
zensiert
Die 5-Jahres-Überlebensraten (overall survival) unterschieden sich nicht
signifikant in Abhängigkeit vom Nachweis einer neuroendokrinen Differenzierung
(Tabelle 17). Mit der overall 5-Jahres-Überlebens-Rate korrelierten die
Invasionstiefe (p=0,037, log rank), der präoperativ gemessene CEA-Wert
(p=0,004, log rank) und das Alter der Patienten (p=0,05, log rank), wobei der prä-
operativ ermittelte CEA-Wert den stärksten prognostischen Einfluss auf die Über-
lebensprognose ausübte (overall 5-JÜL-Rate 43% bei erhöhtem CEA vs. 74% bei
normwertigem CEA, p

4. Ergebnisse
Patienten im UICC-Stadium I hatten eine signifikant günstigere 5-Jahres-
Überlebens-Rate als Patienten im UICC-Stadium III (5-JÜL-Rate 95% im
Stadium I vs. 59% im Stadium III, p=0,025, log rank).
Parameter Kategorie
Alter
Geschlecht
Resektionsverfahren a
Tumorstadium
Differenzierung
Invasionstiefe
Lymphknotenstatus
Präoperatives Serum-CEA b
CgA Status
Syn Status
NSE Status
CgA, Syn, NSE Status
Seite 60 von 104
Overall 5-JÜL-
Rate
Bis 70 Jahre 81%
70 Jahre und älter 57%
weiblich 71%
männlich 73%
TAR 76%
APE 45%
UICC I 95%
UlCC II 73%
UICC III 59%
UICC IV ---
gut oder moderat
differenziert (G1/G2)
Tabelle 17: Gesamtüberleben (overall survival).
74%
gering differenziert (G3) 65%
pT1+2 85%
pT3+4 66%
Negativ 81%
Positiv 58%
Normal 74%
Erhöht 43%
Negativ 72%
Positiv 70%
Negativ 71%
Positiv 83%
Negativ 72%
Positiv ---
1 oder mehr positiv 75%
Negativ 71%
a TAR = Tiefe anteriore Resektion; APE = Abdominoperineale Exstirpation
b Patienten mit nicht bestimmbaren CEA (Kreuzreaktivität) nicht eingeschlossen
P-Wert
(log rank)
0,054
NS
NS
(0,082)
I - III 0,025
gesamt
NS (0,122)
NS
0,037
NS
(0,073)
0,004
Analog zum rezidivfreien Überleben war der Nachweis der neuroendokrinen
Marker nicht mit der Überlebensprognose assoziiert (Abbildungen 21-23):
NS
NS
NS
NS

Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
4. Ergebnisse
Jahre
6
Seite 61 von 104
8
10
CgA-Status
positiv
zensiert
negativ
zensiert
Abb. 21 : Kaplan-Meier-Kurve, Overall-5-Jahresüberlebensrate, Chromogranin A-Status.
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
Jahre
6
8
10
Syn-Status
positiv
zensiert
negativ
Abb. 22: Kaplan-Meier-Kurve, Overall-5-Jahresüberlebensrate, Synaptophysin-Status.
zensiert

Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
4. Ergebnisse
Jahre
Abb. 23 : Kaplan-Meier-Kurve, Overall-5-Jahresüberlebensrate, NSE-Status.
6
Seite 62 von 104
8
10
NSE-Status
positiv
zensiert
negativ
zensiert
Das Tumorstadium (UICC) war univariat signifikant mit der overall 5-Jahres-
Überlebensrate assoziiert (overall 5-Jahres-Überlebensrate 95% im UICC-
Stadium I, 73% im UICC-Stadium II, 59% im UICC-Stadium III) (Abb. 24).
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
%
2
4
Jahre
Abb. 24 : Kaplan-Meier-Kurve, Overall-5-Jahresüberlebensrate, UICC-Stadium.
6
8
10
UICC-Stadium
III
II
I
zensiert
zensiert
zensiert

4. Ergebnisse
In der Multivarianzanalyse konnte das UICC-Stadium jedoch nicht als
unabhängiger Prognosefaktor identifiziert werden (p>0,05, proportional hazards).
Im Zusammenhang mit der qualitativen Auswertung (schwach vs. stark positive
Anfärbung) der immunhistochemischen Färbungen bestanden keine
Assoziationen mit der Überlebensprognose. Lediglich bei der Auswertung der
stark angefärbten Chromogranin A-Tumoren zeigte sich eine 60%-ige
Overall-5-Jahresüberlebensrate, während die schwach positiv angefärbten
Chromogranin A Tumoren, bzw. negativen Tumoren eine
Overall-5-Jahresüberlebensrate von 74% vorzuweisen hatten. Dieses Ergebnis
erreichte allerdings keine statistische Signifikanz (p=0,11).
Wurden alle positiven Ereignisse zusammen ausgewertet bzw. stratifiziert, so
ergab sich eine Overall-5-Jahresüberlebensrate von 75% - im Gegensatz zu 71%
bei allen Chromogranin A, Synaptophysin bzw. Neuron-spezifische Enolase
negativen Tumoren. Die zugehörige Kaplan-Meier Kurve ist in Abbildung 25
dargestellt.
Kum. Überleben
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
Jahre overall
Seite 63 von 104
8
10
CgA, Syn, NSE
alle neg
mind. 1 pos
alle neg-zensiert
mind. 1 pos-zensiert
Abb. 25: Kaplan-Meier-Kurve, Overall-5-Jahresüberlebensrate, Kombination von CgA, Syn
und/oder NSE.

5. Diskussion
5.1 Neuroendokrine Zellen
5. Diskussion
Neuroendokrine Zellen sind in fast allen Organen des menschlichen Körpers weit
verbreitet. Obwohl der Großteil der neuroendokrinen Zellen des menschlichen
Körpers im Gastrointestinaltrakt lokalisiert ist, sind neuroendokrine Karzinome des
Kolons und des Rektums seltene Erkrankungen und haben einen Anteil von
weniger als 1% aller kolorektalen Karzinome [7, 96]. Typischerweise finden sich in
neuroendokrinen Karzinomen neurosekretorische Granula, welche durch die
klassischen neuroendokrinen Marker Chromogranin A, Synaptophysin und
Neuron-spezifische Enolase immunhistochemisch nachweisbar sind. Im Vergleich
zu primären kolorektalen Adenokarzinomen wird bei neuroendokrinen Karzinomen
ein aggressiveres Tumorverhalten mit einer daraus resultierenden ungünstigeren
Prognose vermutet [7, 96].
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Studie, die prognostische Bedeutung
der „klassischen“ neuroendokrinen Marker Chromogranin A (CgA), Synaptophysin
(Syn) und Neuron-spezifische Enolase (NSE) in einem einheitlichen Kollektiv
primärer Adenokarzinome des Rektums zu evaluieren. Darüber hinaus sollte
durch die Ermittlung des Ki-67-Proliferationsindexes eine mögliche Erklärung der
neuroendokrinen Differenzierung gefunden werden. Diese Arbeit ist die erste
Studie, die sich mit der neuroendokrinen Differenzierung und der prognostischen
Relevanz an einem homogenen Kollektiv, ausschließlich beim kurativ resezierten
Rektumkarzinom, beschäftigt.
5.2 Neuroendokrine Differenzierung beim kolorektalen Karzinom
Seitdem neuroendokrine Zellen mit Chromogranin A und anderen Antikörpern
immunhistochemisch dargestellt werden können, sind eine Vielzahl von
Forschungsarbeiten publiziert worden, die sich mit der Thematik der neuro-
endokrinen Differenzierung bei kolorektalen Karzinomen beschäftigt haben. Eine
Auswahl bisher durchgeführter Untersuchungen ist in Tabelle 18 dargestellt:
Seite 64 von 104

Autor
Erscheinungsjahr
Patienten
(n)
5. Diskussion
Färbung
Seite 65 von 104
NEZ
gesamt
Besonderheiten
Iwashita A
[66]
Smith DM und
1979 251 argyrophil 44,2%
Haggitt RC
[106]
1984 94 argyrophil 20,0%
Arends JW et
al. [4]
1986 300 Serotonin 8,0%
Jansson D et
al. [68]
1988 80
CgA, NSE, Serotonin,
SST, Substanz P, VIP
13,8% nur Kolon-Ca
Chen P [24] 1990 130 CgA 41,5%
Hamada Y et
al. [55]
1992 212 CgA 32,5% nur Adeno-Ca
de Bruine AP
et al. [28]
1993 350 CgA 30,0% nur Adeno-Ca
Lapertosa G
et al. [70]
1994 158 panChromogranin 14,0% nur Adeno-Ca
Ferrero S et
al. [38]
1995 208 CgA, Secretogranin II 16,0% nur Adeno-Ca
Mori M et al.
[82]
1995 108 CgA 35,2%
Syversen U et
al. [110]
1995 91 CgA, NSE 40,0%
Secco GB et
al. [102]
1996 100 CgA 17,0% nur Adeno-Ca
Foley EF et
al. [86]
1998 84 CgA 41,7%
nur Stadium III -
Kolon-Adeno-Ca
Lloyd RV et
al. [71]
1998 289 CgA 13,8%
nur Dukes B+C,
nur G2 und G3
Swatek J und
Chibowski D
[109]
2000 57
CgA, Glucagon,
Serotonin, SST
35,1%
hoher Anteil
muzinöser
Karzinome (61,4%)
Famulski W et
al. [36]
2001 48 CgA, Syn, NSE 25,0% nur pT3
Garbowski P
et al. [49]
2001 116 CgA, Syn 36,2%
nur UICC-Stadium
III und IV
Indinnimeo M
et al. [65]
2002 56 CgA 39,3%
nur Kolon-Adeno-
Ca
Romeo R et
al. [95]
2002 60 CgA 8,0%
nur Kolon-Adeno-
Ca
Atasoy P et
al. [5]
2003 50 CgA, Syn, NSE 56,0%
Tabelle 18: Literaturübersicht über die Häufigkeit der neuroendokrinen Zellen in
kolorektalen Karzinomen (NEZ: Neuroendokrine Zellen).
Die seither publizierten Ergebnisse neuroendokriner Differenzierung und die
daraus resultierenden Auswirkungen auf die prognoserelevanten Daten zeigen ein
sehr heterogenes Bild: Einige Autoren beschreiben eine eindeutige Korrelation der
prognostischen Daten mit einer neuroendokrinen Differenzierung [5, 49, 50, 51,
55, 110], während andere einen solchen Einfluss nicht feststellen konnten [38, 82,
102].

5. Diskussion
Als mögliche Ursachen wären hier z.B. die sehr inhomogenen Patientenkollektive,
welche in die Studien eingeschlossen wurden, zu nennen. In diesen Kollektiven
wurden beispielsweise unterschiedliche Tumorlokalisationen (z.B. Kolon und
Rektum), unterschiedliche Tumordifferenzierungsgrade (G1 bis G3) oder unter-
schiedliche Therapieziele (kurativ oder palliativ) zusammengefasst. Weiter ist eine
Unterscheidung in verschiedene Histologietypen (meist große Anzahl an Adeno-
karzinomen, aber sowohl muzinöse Adenokarzinome als auch Siegelring-
zellkarzinome) nicht erfolgt bzw. sind die prognostischen Daten nicht nach der
jeweiligen Histologie ausgewertet worden.
In der eigenen Studie wurden nur primäre Adenokarzinome des Rektums gefärbt,
wobei entdifferenzierte und muzinöse Rektumkarzinome ausgeschlossen wurden.
Als Gegenbeispiel zeigt die Veröffentlichung von Swatek 61,4% muzinöse
Karzinome und lediglich 38,6% „klassische“ Adenokarzinome (neuroendokrine
Differenzierung 45,7% vs. 18,2%; p

5. Diskussion
In den meisten Studien galt allerdings die Regel, dass Tumoren mit weniger als
einer positiven Tumorzelle pro mm 2 als schwach positive „low expressors“ und
Tumoren mit mehr als einer positiven Tumorzelle pro mm 2 als stark positive „high
expressors“ eingestuft wurden. Diese Methode wurde auch in dieser Arbeit ge-
wählt und entspricht dem allgemeingültigen Konsens in der Literatur.
Die Zusammenschau dieser Variabilität in den untersuchten Studienpopulationen
und in der Methodik lässt die große Spannbreite von 8%-56% neuroendokriner
Zellen in kolorektalen Karzinomen plausibel erscheinen [4, 5, 95].
Seite 67 von 104

5. Diskussion
5.3 Bedeutung der neuroendokrinen Differenzierung beim
Rektumkarzinom im Literaturvergleich
5.3.1 Korrelation neuroendokriner Marker mit klinischen und
histopathologischen Parametern
Die in der Literatur beschriebene Geschlechterverteilung von Karzinomen mit
neuroendokrinen Zellen ist, wie auch in der vorliegenden Arbeit, ausgeglichen.
Lediglich Secco beschrieb ein verstärktes Auftreten von Chromogranin A positiven
Tumoren beim weiblichen Geschlecht [102].
In Bezug auf das Alter zeigte sich in der vorliegenden Untersuchung ein statistisch
signifikantes vermehrtes Auftreten von Chromogranin A-positiven Tumoren in
jüngerem Patientenalter (p=0,034). Zu einem vergleichbaren Resultat kommt auch
de Bruine, der ebenfalls eine statistisch signifikante Häufung der neuroendokrinen
Zellen in den Tumoren von unter 70-jährigen Patienten fand [28].
Im Gegensatz dazu ist bei Secco das Vorhandensein von
Chromogranin A-positiven Tumoren mit einem höheren Lebensalter assoziiert
[102].
In der aktuell vorliegenden Arbeit spielt die Einordnung der neuroendokrinen
Differenzierung in Bezug auf das Tumorstadium bzw. die Infiltrationstiefe
(pT-Status) keine Rolle. Im Gegensatz dazu postulierten Chen und Swatek, dass
neuroendokrin differenzierte Tumorzellen in Adenokarzinomen gehäuft mit einem
niedrigen Tumorstadium assoziiert sind [24, 109]. Swatek konnte dies als
statistisch hoch signifikantes Ergebnis nachweisen (p

5. Diskussion
Die eigene Arbeit zeigt eine signifikante Korrelation der neuroendokrinen
Expression mit dem Tumorgrading (Tabellen 8 und 11). Tumoren mit neuro-
endokrinen Zellen sind mit einem höheren Grading assoziiert bzw. schlechter
differenzierte Tumoren exprimieren häufiger neuroendokrine Zellen.
Zu ähnlichen Ergebnissen gelangt auch Scalarides, der in seiner Arbeit zwar in
G1-differenzierten Tumoren keine neuroendokrinen Zellen nachweisen konnte,
dafür aber in G3-differenzierten Tumoren ein gehäuftes Vorkommen beobachtet
hat [96]. Ho konnte ebenfalls mit einer abnehmenden Differenzierung eine
steigende Anzahl Chromogranin A-positiver Zellen nachweisen [61].
Swatek, Chen, Iwashita und Atasoy hingegen kamen in ihren Untersuchungen zu
einem gegensätzlichen Ergebnis. In gut oder moderat differenzierten Geweben
waren mehr neuroendokrine Zellen vorhanden als in schwach differenzierten
Geweben [5, 24, 66, 109]. Swatek begründete dies unter anderem damit, dass ein
höherer Differenzierungsgrad das Tumorgewebe dem Normalgewebe „ähnlicher“
erscheinen lässt, in welchem sich physiologischerweise neuroendokrine Zellen
befinden.
5.3.2 Prognostische Daten
Ein Ziel der Studie war es, einen möglichen Einfluss der neuroendokrinen
Differenzierung auf die Prognose nachzuweisen. Im Literaturvergleich zeigt sich,
dass sich die anfänglich erhobenen Untersuchungen vor allem mit dem Nachweis
der neuroendokrinen Zellen in den kolorektalen Karzinomen und nicht mit der
Überlebensprognose des Patienten beschäftigten. Zudem bedingt die Tatsache,
dass in einigen Studien nur eine geringe Fallzahlgröße vorhanden war, sehr
unterschiedliche Beobachtungen in Bezug auf die prognostischen Daten.
5.3.2.1 Metastasierung und neuroendokrine Differenzierung
Es gibt nur vereinzelte Daten, die sich mit dem Einfluss neuroendokriner Zellen in
Karzinomen auf die lymphogene Metastasierung beschäftigen. Ebenso ist unge-
klärt, inwieweit neuroendokrine Zellen eine Rolle spielen, bzw. ob neuroendokrine
Zellen eine lymphogene Metastasierung wahrscheinlicher machen. In der Arbeit
von Chen wurde eine „frühere Ausbreitung“ bei Chromogranin A-positiven Zellen
postuliert. Gleichzeitig ging diese jedoch mit einer höheren Überlebensrate einher
Seite 69 von 104

5. Diskussion
[24]. Indinnimeo und de Bruine fanden bei Tumoren mit neuroendokrinen Zellen
signifikant mehr Lymphknotenmetastasen [65, 28]. Bei de Bruine fiel das Ergebnis
mit 42% vs. 29% (p=0,004) hoch signifikant aus. Indinnimeo, der nur Kolon-
karzinome untersuchte, wies eine Signifikanz von p

5. Diskussion
zeigte sich in der Arbeit, dass insbesondere Patienten mit dem Primärtumor im
Rektum eine schlechtere Prognose in der verwendeten Studienpopulation vorzu-
weisen hatten. Erst kürzlich konnten Grabowski et al. zeigen, dass eine
Kombination von neuroendokriner Differenzierung und dem p53/BAX-Signalweg
eine beachtliche Möglichkeit bietet, Patienten mit einer schlechten Prognose bei
kolorektalen Karzinomen herauszufiltern [51].
Ebenso konnte Syversen zeigen, dass die Expression des neuroendokrinen
Markers NSE eine schlechtere Überlebensprognose darstellt. 51% der Patienten
mit Neuron-spezifischen Enolase-positiven Tumoren verstarben, während 27% zu
den Überlebenden zählten (p=0,025). Für Chromogranin A konnte eine solche
Beobachtung nicht gemacht werden [110]. Zu vergleichbaren Ergebnissen kommt
Atasoy, der die Chromogranin A-Positivität als einen die Prognose ver-
schlechternden Parameter darstellt. Patienten mit Chromogranin A negativen
Tumoren lebten 2,75-mal länger als Patienten mit nachweisbaren
Chromogranin A-positiven Zellen (p

Studie
(Besonderheiten)
Iwashita A
[66]
Smith DM und
Haggitt RC
[106]
Arends JW et
al.
[4]
Jansson D et
al.
(nur Kolon-Ca)
[68]
Chen P
[24]
Hamada Y et
al.
(nur Adeno-Ca)
[55]
de Bruine AP
et al.
(nur Adeno-Ca)
Folgearbeit von Arends
[28]
Lapertosa G
et al.
(nur Adeno-Ca)
[70]
Ferrero S et
al.
[38]
Mori M et al.
(nur Adeno-Ca)
[82]
Syversen U et
al.
[110]
Pat.
(n) Färbung
251
94
argyrophil
argyro
phil
Ergeb.
gesamt
(stark
positiv)
44,2%
20,0%
300 5-HT 8,0%
80
NSE
CgA
5-HT
SST
SubP
VIP
13,8%
130 CgA 41,5%
212 CgA
350 CgA
158
208
Pan-
Chromogranin
CgA
Secretogranin
II
32,5%
(14%)
30,0%
(9%)
14,0%
(2,5%)
16%
(5%)
108 CgA 35,2%
91
CgA,
NSE
40,0%
5. Diskussion
Ergebnis
nach versch.
Kriterien
Rektum 16%
Colon 52%
Rektum 35,7%
Kolon 28,6%
CgA 15%/
NSE 36%
Seite 72 von 104
Signifikanzen Fazit
- NEC häufiger in gut
als in schlecht differenzierten
Tumoren
- NEC im Kolon
häufiger als im
Rektum
- aggressiveres
klinisches
Erscheinungsbild
- NEC bei höherem
Differenzierungsgrad
- Bei stark pos NEC:
höhere Differenzierung,
frühere
Ausbreitung,
besseres Überleben
- Schlechtere
Prognose: starke
Expression vs.
Negative (p

Secco GB et
al.
(nur Adeno-Ca)
[102]
Lloyd RV et
al.
(nur Stadium III-
Kolon-Adeno-Ca)
[71]
Foley EF et
al.
(nur Dukes B+C,
nur G2 und G3)
[41]
Swatek J und
Chibowski D
(Viele muzinöse
Karzinome
(61,4%))
[109]
Famulski W et
al.
(nur pT3)
[36]
Garbowski P
et al.
(nur stage III und
IV)
[49]
Indinnimeo M
et al.
(nur Kolon-
Adeno-Ca)
[65]
Romeo R et
al.
(nur Kolon-
Adeno-Ca)
[95]
Atasoy P et
al.
[5]
100 CgA
289 CgA
84 CgA
57
48
116
CgA,
Glucagon
5-HT
SST
CgA,
Syn,
NSE
CgA,
Syn
17,0%
(4%)
13,8%
[26% * ]
41,7%
(6,3%)
35,1%
25,0%
36,2%
(17,2%)
56 CgA 39,3%
60 CgA 8,0%
50
CgA,
Syn,
NSE
56%
mind.
ein AK:
5. Diskussion
[Rektum: 23% * ]
[Kolon: 27% * ]
Rektum
29,2%
31,6% nur
CgA
CgA 38%
Syn 6%
NSE 26%
---
26% nur CgA
---
2% alle 3 AK
positiv
Seite 73 von 104
- NEC häufiger bei
Frauen
- NEC häufiger bei
> 70 Jahre
- Nachweis von
aktiven Produkten
(p

5. Diskussion
5.4 Bewertung der eigenen Ergebnisse und Schlussfolgerung
Die chirurgische Therapie bildet die Grundlage in der kurativen Therapie des
Rektumkarzinoms und ist der entscheidende Prognosefaktor. Das Ausmaß der
lokalen Tumorausbreitung und der Lymphknotenbefall sind wesentliche
prognostische Parameter für die lokale Tumorkontrolle und das Überleben.
Entscheidend in der chirurgischen Therapie bleibt die Vermeidung eines Lokal-
rezidivs, da sonst die Überlebensraten signifikant absinken. Hierbei hat die totale
mesorektale Exzision (TME) zu Lokalrezidivraten von unter 10% geführt. Vor
diesem Hintergrund ist es das Ziel, „neue“, d.h. tumorbiologische und molekulare
Prognosefaktoren zu identifizieren, die den individuellen Krankheitsverlauf
charakterisieren.
Betrachtet man die publizierte Literatur zur Bedeutung und prognostischen Rolle
der neuroendokrinen Differenzierung, so zeigt sich deutlich, dass die Expression
der neuroendokrinen Marker beim kolorektalen Karzinom im Vergleich zu normaler
Kolon- und Rektumschleimhaut widersprüchlich ist. Vergleicht man die Ergebnisse
der vorliegenden Arbeit mit der aktuellen Literatur, so offenbart sich, dass die
publizierten Ergebnisse sich fast ausschließlich mit der Entität „Kolorektales
Karzinom“ beschäftigen und die untersuchten Kollektive nicht homogen
hinsichtlich des Therapiezieles sind.
Deshalb war es Ziel der vorliegenden Studie, ein homogenes Patientengut zu
evaluieren. Daraus resultiert die relativ kleine Patientenzahl.
Grabowski und ihre Mitarbeiter konnten eine eindeutige hoch signifikante
Korrelation zwischen immunhistochemisch nachgewiesenen neuroendokrinen
Eigenschaften und einer verschlechterten Überlebensprognose bei 116 konsekutiv
aufgenommenen Patienten mit kolorektalen Karzinomen im UICC Stadium III und
IV zeigen [50, 51]. In einer erst kürzlich publizierten Arbeit konnte die
Arbeitsgruppe zeigen, dass die neuroendokrine Differenzierung in Kombination mit
dem p53/BAX-Signalweg ein wertvolles Werkzeug darstellt, um potentielle
Patienten mit einer schlechteren Prognose im UICC-Stadium III zu identifizieren
[51].
Dementsprechend zeigten auch Syversen et al. eine verminderte Überlebens-
prognose von Patienten mit positiven neuroendokrinen Merkmalen (NSE) [110].
Diese Ergebnisse stimmen auch mit den Daten von Atasoy et al. überein, welche
Seite 74 von 104

5. Diskussion
ebenfalls von einer schlechteren Prognose für Chromogranin A positive Tumoren
berichten [5].
Zudem zeigten die Ergebnisse von Hamada et al., dass der immunhistochemische
CgA-Nachweis beim primären kolorektalen Karzinom ein unabhängiger
prognostischer Faktor ist [55].
Im Vergleich mit der bisher publizierten Literatur konnte diese Arbeit keine
statistisch signifikante Beziehung von neuroendokriner Differenzierung - durch
immunhistochemische Färbungen mit Chromogranin A als Marker für die „large
dense core vesicles“, Synaptophysin, als Bestandteil der „small synaptic vesicles“
und Neuron-spezifische Enolase - und 5-Jahresüberlebensprognose zeigen. Dies
gilt sowohl für das rezidivfreie als auch das Gesamt-Überleben. Von den 94
untersuchten Rektumkarzinomen zeigten 20% (19/94) CgA-positive, 7% (7/94)
Syn-positive, and 3% (3/94) NSE-positive Zellen. Bei der Mehrzahl der Tumoren
(72%, 68/94) konnte keine Expression neuroendokriner Zellen dokumentiert
werden. Keiner der Tumoren ließ sich mit allen drei Markern anfärben. Bei nur 3%
(3/94) der Tumoren konnte eine Kombination von mindestens zwei Markern nach-
gewiesen werden.
Auf den ersten Blick scheinen die Ergebnisse der Expression neuroendokriner
Zellen unter den in der Literatur angegeben Daten, von im Mittel zwischen 30%
und 40% zu liegen [5, 28, 51, 55, 110]. In der Detailanalyse zeigt sich jedoch, dass
die eigenen Ergebnisse durchaus im vergleichbaren Bereich liegen, da un-
differenzierte oder muzinöse Adenokarzinome von vornherein ausgeschlossen
waren.
In Bezug auf Tumorrezidive wiesen die eigenen Daten lediglich eine Assoziation
zum UICC-Stadium und zum präoperativ erhobenen CEA-Serum Wert auf. Es
gelang nicht eine Korrelation zwischen den neuroendokrinen Markern und der
Tumorprogression nachzuweisen. Konzentriert man sich jedoch allein auf die
Fernmetastasen, so zeigen sich signifikante Korrelationen von metachronen
Fernmetastasen und dem UICC-Stadium, der Infiltrationstiefe, dem präoperativen
Serum-CEA und der CgA-Expression (23,5% bei CgA-positiven vs. 5,9% bei CgA-
negativen Tumoren, p=0,02). Zusammenhänge mit Syn und NSE konnten nicht
gefunden werden.
Seite 75 von 104

5. Diskussion
Um eine mögliche Erklärung für das erhöhte Risiko des Auftretens von Fern-
metastasen bei Chromogranin A-positiven Tumoren zu finden, wurden alle
CgA-positiven Tumoren mit Ki-67 nachgefärbt, um eine Aussage über den
Proliferationsstatus dieser Tumoren machen zu können. Hierbei zeigte die Mehr-
heit der CgA-positiven Tumoren (89,5%, 17/19) eine auffällig hohe Ki-67
Expression von mehr als 40% der Tumorzellen (Proliferationsindex >0,4). Der
Proliferationsindex der CgA-positiven Tumoren betrug im Mittel 0,48. Nur zwei
Tumoren (10,5%, 2/19) zeichneten sich als “low expressors” aus (Proliferations-
index < 0,4). Für die Ki-67-Expression war kein Tumor negativ (Proliferationsindex
< 0,1). Deshalb scheint es durchaus plausibel, dass die hohe Zellproliferation in
den CgA-positiven Tumoren zu einem aggressiveren Tumorwachstum in dieser
Untergruppe führen könnte. Es sieht so aus, als spiele die, durch die Ki-67
Färbung nachgewiesene erhöhte Proliferation, eine entscheidende Rolle in einer
homogenen Gruppe von kurativ resezierten rektalen Adenokarzinomen. Allerdings
ist diese Hypothese aufgrund der kleinen Anzahl an Adenokarzinomen des
Rektums, in der vorliegenden Untersuchung nicht ins Allgemeinene übertragbar
und muss somit in größeren Studien weiter untersucht werden.
Seite 76 von 104

6. Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Vor dem Hintergrund der widersprüchlichen Bedeutung von neuroendokrinen
Zellen im Gastrointestinaltrakt war es das Ziel der Studie herauszufinden, ob die
„klassischen“ Marker in der Diagnostik von neuroendokrinen Tumoren
Chromogranin A (CgA), Synaptophysin (Syn) und Neuron-spezifische Enolase
(NSE) Prognosefaktoren beim primären Rektumkarzinom sind.
Paraffinschnitte von 94 aufgrund eines Rektumkarzinoms kurativ resezierten
Patienten (1996-2002) wurden immunhistochemisch auf die Expression von CgA,
Syn und NSE untersucht. Die Proliferationsaktivität wurde durch die Ki-67-
Expression (MIB-1) immunhistologisch quantifiziert (Ki-67-Markierungsindex). Die
Resultate wurden mit klinischen und histopathologischen Parametern sowie den
Daten des prospektiven Tumorregisters korreliert. Nur R0-resezierte Rektum-
karzinome (zentrale Ligatur der Arteria mesenterica inferior, TME, adjuvante
Radiochemotherapie in den UICC-Stadien II+III) wurden eingeschlossen.
Endpunkte der prognostischen Analyse (91 Patienten) waren die
Tumorprogression (Lokalrezidiv und/oder metachrone Fernmetastasen) sowie die
Überlebensraten nach Kaplan-Meier (disease-free, overall).
Signifikanzberechnungen im Hinblick auf die prognostische Relevanz erfolgten
uni- und multivariat (p0,05). Der mittlere Ki-67-Markierungsindex bei
CgA-positiven Tumoren lag bei 0,48. Nach einem mittleren Follow-up von 46
Monaten kam es bei 14 Patienten (15,4%) zu einer Tumorprogression: Lokal-
rezidive (n=6, davon isoliert n=2 bzw. mit Fernmetastasen n=4) bzw. metachrone
Fernmetastasen (n=12, davon n=8 ohne Lokalrezidiv). Hinsichtlich der Inzidenz
eines Lokalrezidivs zeigte die Univarianzanalyse keine signifikanten Zusammen-
hänge mit CgA, Syn oder NSE (p>0,05). Allerdings war die CgA-Expression
signifikant mit dem Auftreten von metachronen Fernmetastasen assoziiert (23,5%
Seite 77 von 104

6. Zusammenfassung
bei CgA-positiv vs. 5,9% bei CgA-negativ, p=0,02). Es bestand jedoch keine
Assoziation mit den 5-Jahres-Überlebensraten (p>0,05). Dies galt in gleicher
Weise für die klinisch erhobenen Parameter Alter, Geschlecht, Resektions-
verfahren und Lymphknotenstatus, wobei die Prognose signifikant mit dem UICC-
Stadium bzw. der Invasionstiefe (pT-Status) korrelierte.
Die eigenen Ergebnisse zeigen univariat eine prognostische Bedeutung des
Chromogranin A, für die Inzidenz von metachronen Fernmetastasen nach
kurativer Resektion beim Rektumkarzinom, wobei die CgA-positiven Tumoren eine
hohe Proliferationsaktivität (Ki-67) aufweisen. Eine Identifikation der neuro-
endokrinen Marker als „Prognosefaktoren“ beim kurativ resezierten Rektum-
karzinom gelang jedoch nicht.
Seite 78 von 104

7. Literatur
7. Literaturverzeichnis
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Seite 89 von 104

8. Anhang
8.1 Tabellen und Abbildungen
8. Anhang
Abb. 26: Bildhafte Darstellung der T-Klassifikation.
T Primärtumor
TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0 Kein Anhalt für Primärtumor
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor infiltriert Submucosa
T2 Tumor infiltriert Muscularis propria
T3
T4
Tumor infiltriert die Muscularis propria hindurch in die Subserosa oder in
nicht peritonealisiertes perikolisches oder perirektales Gewebe
Tumor infiltriert direkt in andere Organe oder Strukturen und/oder
perforiert das viszerale Peritoneum
Tabelle 20: TNM-Klassifikation und Stadieneinteilung des Rektumkarzinoms (UICC 1997).
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N Regionäre Lymphknoten
8. Anhang
NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1 Metastasen in 1 bis 3 regionären Lymphknoten
N2 Metastasen in 4 oder mehr regionären Lymphknoten
Tabelle 21: Regionäre Lymphknoten (UICC 1997).
M Fernmetastasen
MX Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
M0 Keine Fernmetastasen
M1 Fernmetastasen
Tabelle 22: Fernmetastasen (UICC 1997).
R Residualtumor
RX Vorhandensein von Residualtumor kann nicht beurteilt werden
R0 Kein Residualtumor
R1 Mikroskopischer Residualtumor
R2 Makroskopischer Residualtumor
Tabelle 23: Residualtumor-Klassifikation (UICC 1997).
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UICC-Stadium
1997
Tabelle 24a: Stadieneinteilung (UICC, 1997).
UICC-Stadium
2002
8. Anhang
T-Stadium N-Stadium M-Stadium
0 Tis N0 M0
I
IIA
IIB
IIIA
IIIB
IIIC
T-Stadium N-Stadium M-Stadium
Stadium 0 Tis N0 M0
T1
T2
T3
T4
T1, T2
T3, T4
jedes T
IV jedes T jedes N M1
Tabelle 24b: Stadieneinteilung (UICC, 2002).
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N0
N0
N0
N0
N1
N1
N2
Dukes/
Turnbull
Stadium I T1, T2 N0 M0 Dukes A
Stadium II T3, T4 N0 M0 Dukes B
Stadium III jedes T N1, N2 M0 Dukes C
Stadium IV jedes T jedes N M1 Dukes D
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0

G Grading
8. Anhang
GX Differenzierung kann nicht bestimmt werden
G1 Gute Differenzierung
G2 Mäßige Differenzierung
G3 Schlechte Differenzierung
G4 Undifferenziert
Tabelle 25: Grading (UICC, 1997).
Nr.
Alter
Geschlecht
OP-Datum
UICC 97
UICC 02
LK-Befall
Grading
5 59 m Aug. 96 2 2a 0 2 1 2 0 1 Mrz. 00 43 1
11 52 w Apr. 97 3 3c 1 3 2 2 0 1 Okt. 99 31 1
21 62 m Nov. 97 3 3b 1 2 1 1 0 1 Apr. 04 77 0
30 69 w Okt. 98 2 2b 0 2 9 1 0 0 Apr. 04 66 1
31 56 w Nov. 98 1 1 0 2 1 1 0 0 Mrz. 04 63 0
33 62 m Feb. 99 3 3c 1 3 1 1 0 1 Okt. 01 32 0
43 58 m Aug. 99 2 2a 0 2 1 2 0 1 Aug. 04 60 0
45 66 w Sep. 99 3 3b 1 2 1 1 0 1 Mai. 04 55 1
52 63 w Feb. 00 3 3b 1 2 2 2 0 1 Mai. 02 27 1
53 49 w Feb. 00 1 1 0 2 0 2 0 0 Aug. 04 53 0
58 47 m Jun. 00 2 2a 0 3 2 2 0 2 Aug. 04 49 0
62 58 w Jul. 00 2 2a 0 2 0 2 0 0 Mrz. 04 43 0
73 75 m Mai. 01 2 2a 0 2 1 1 0 2 Aug. 04 38 0
74 79 w Mai. 01 1 1 0 2 1 2 0 0 Apr. 04 34 0
86 68 m Feb. 02 3 3b 1 3 0 1 0 0 Aug. 04 30 0
89 63 m Jul. 02 2 2a 0 3 9 1 0 0 Aug. 04 25 0
92 48 w Aug. 02 3 3b 1 3 1 2 0 1 Aug. 04 23 0
93 76 m Okt. 02 2 2a 0 3 9 2 1 0 Okt. 02 0 0
94 78 m Okt. 02 2 2a 0 3 2 1 0 2 Aug. 04 22 0
Tabelle 26 : Einzelauflistung aller Chromogranin A-positiver Tumoren.
präop. CEA-Wert
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Chromogranin A
30-Tage-Letalität
adjuvante Th.
Ende Nachbeob.
Überlebenszeit
Tumorprogression

Nr.
Alter
Geschlecht
OP-Datum
UICC 97
UICC 02
8. Anhang
LK-Befall
Grading
15 55 m Jun. 97 2 2a 0 2 1 2 0 1 Aug. 04 85 0
48 56 m Okt. 99 2 2a 0 2 1 2 0 1 Aug. 04 57 0
52 63 w Feb. 00 3 3b 1 2 2 2 0 1 Mai. 02 27 1
58 47 m Jun. 00 2 2a 0 3 2 2 0 2 Aug. 04 49 0
71 60 m Mrz. 01 2 2a 0 2 1 2 0 1 Aug. 04 40 0
78 70 w Aug. 01 3 3b 1 2 1 2 0 1 Aug. 04 36 0
94 78 m Okt. 02 2 2a 0 3 2 2 0 2 Aug. 04 22 0
Tabelle 27 : Einzelauflistung aller Synaptophysin-positiver Tumoren.
Nr.
Alter
Geschlecht
OP-Datum
UICC 97
UICC 02
LK-Befall
Grading
16 75 w Jun. 97 2 2a 0 2 1 2 0 0 Aug. 97 2 0
51 63 w Feb. 00 3 3b 1 3 1 1 0 1 Aug. 04 54 0
77 64 m Aug. 01 3 3c 1 3 1 2 0 1 Apr. 04 32 0
Tabelle 28 : Einzelauflistung aller NSE-positiver Tumoren.
präop CEA-Wert
präop CEA-Wert
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Synaptophysin
NSE
30-Tage-Letalität
30-Tage-Letalität
adjuvante Th.
adjuvante Th.
Ende Nachbeob.
Ende Nachbeob.
Überlebenszeit
Überlebenszeit
Tumorprogression
Tumorprogression

8.2 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
5-HT Serotonin
AEC 3-Amino-9-etnylcarbazole
8. Anhang
APE Abdominoperineale Exstirpation
CEA karzinoembryonales Antigen
CgA Chromogranin A
cm Zentimeter
EXE Exenteration
g Gramm
G Differenzierungsgrad
HE high expressor
HE Hämatoxylin/Eosin
kDa Kilodalton
LE low expressor
M Metastasierungsgrad
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
N Lymphknotenstatus
NEC neuroendokrine Zelle
NS nicht signifikant
NSE Neuron-spezifische Enolase
p Histopathologischer Befund
R Residualtumorstatus
s Sekunde
SST Somatostatin
SubP Substance P
Syn Synaptophysin
T Tumorausdehnung
TAR Tiefe anteriore Resektion
TEM Transanale endoskopische Mikrochirurgie
TME totale mesorektale Exzision
UICC Union Internationale Contre le Cancer
VIP Vasoaktives Intestinales Polypeptid
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8.3 Verwendete Materialien
8.3.1 Primärantikörper
• Chromogranin A
8. Anhang
Monoclonal Mouse Anti-Human Chromogranin A Klon DAK-A3;
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Ki-67 Antigen
Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen Clone MIB-1;
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Neuron-specific Enolase
Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-specific Enolase Clone BBS/NC/VI-14;
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Synaptophysin
Polycolonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin;
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
8.3.2 Sekundärantikörper
• DAKOEnVision + System-HRP ® Labelled Polymer; Anti-mouse (K4000)
8.3.3 Negativkontrollen
• DakoCytomation Mouse IgG, Code-Nr. X0931/X0936 (Syn, NSE, Ki-67)
• DakoCytomation Mouse IgG2b, Code-Nr. X0944 (CgA)
8.3.4 Chemikalien und Lösungen
• 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) Tabletten;
Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Deutschland
• DAKO ® AEC +; High Sensitivity Substrate Chromogen (K3469);
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Barbital-Puffer nach Michaelis (0,1 molar);
Apotheke Universitätsklinikum S-H, Lübeck, Deutschland
• ChemMate TM Antibody Diluent (S2022);
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Eosin G-Lösung 0,5% wässrig (Microscopy);
Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
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• Eukitt;
8. Anhang
Kindler GmbH & Co., Freiburg, Deutschland
• Ethanol 100% (vergällt);
Apotheke Universitätsklinikum S-H, Lübeck, Deutschland
• Haemalaunlösung sauer nach Meyer;
Dr. K. Hollborn und Söhne, Leipzig, Deutschland
• Microscopy Aquatex;
Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
• N,N-Dimethylformamid;
Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Deutschland
• Natriumchlorid;
Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
• Protein Block Serum-Free (DAKO X0909);
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Trizma ® base;
Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim Deutschland
• Trizma ® hydrochloride;
Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim Deutschland
• Wash Buffer 19x DakoCytomation (S3006);
DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Wasserstoffperoxid (H2O2) 37%;
Apotheke Universitätsklinikum S-H, Lübeck, Deutschland
• Xylol (reinst/Isomerengemisch);
Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
• Zitronensäure monohydrat;
Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
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8. Anhang
8.3.5 Geräte und sonstige Materialien
• Cytoträger ;
Shandon Scientific, Runcorn, Cheshire, England
• DAKO-Färbeautomat;
Serial DC 3400-9455-03, DakoCytomation, Glostrup, Dänemark
• Deckgläser;
Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland
• Elektronische Zählhilfe;
Countboy ACU, TECNOMARA, Zürich, Schweiz
• Faltenfilter;
Faltenfilter 595 1/2; Schleicher & Schuell Microscience, Dassel, Deutschland
• Objektträger;
Menzel-Gläser, Superfrost ® Plus, Braunschweig, Deutschland
• Mikroskop;
Axioskop; Zeiss, Jena, Deutschland
• Mikrowelle;
900W, Siemens, München, Deutschland
• Millipore-RO-System (Wasseraufbereitung);
Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland
• Pipetten;
Eppendorf Research, Hamburg, Deutschland
• Schüttler;
KS 250; IKA Labortechnik, Deutschland
• Zentrifuge;
Biofuge 22R, Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
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8.4 Veröffentlichungen
8.4.1 Vorträge
8. Anhang
Nachweis und prognostische Bedeutung der neuroendokrinen Marker
Chromogranin A, Synaptophysin und Neuronen-spezifische Enolase beim
primären Rektumkarzinom
(Vortrag)
O. Schwandner, M. Hilbert, R. Broll, H.-P. Bruch
175. Kongress der Vereinigung Nordwestdeutscher Chirurgen, Göttingen, 2.-4.
Juni 2005
Incidence and prognostic significance of neuroendocrine markers Chromogranin
A, Synaptophysin and neuron-specific enolase in primary rectal cancer after
curative resection
(Posterpräsentation) (siehe 8.4.4 Poster)
M. Hilbert, R. Broll, H.-P. Bruch, O. Schwandner
9. Chirurgische Forschungstage, Frankfurt am Main, 19.-21. September 2005
Immunhistochemischer Nachweis und prognostische Bedeutung der neuro-
endokrinen Marker Chromogranin A, Synaptophysin und NSE beim primären
Rektumkarzinom und Korrelation mit der Ki-67-Proliferationsaktivität
(Vortrag)
O. Schwandner, M. Hilbert, R. Broll, H.-P. Bruch
83. Kongress der Vereinigung Bayerischer Chirurgen, Regensburg, 19.-21. Juli
2006
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8.4.2 Publikation
8. Anhang
O. Schwandner, M. Hilbert, R. Broll, H.-P. Bruch
Neuroendocrine differentiation in primary rectal cancer: Immunohistology with
prognostic significance?
Chirurgische Gastroenterologie Interdisziplinär 2007; 23: im Druck
8.4.3 Publizierter Abstract
Incidence and prognostic significance of neuroendocrine markers
Chromogranin A, Synaptophysin and neuron-specific enolase in primary rectal
cancer after curative resection
M. Hilbert, R. Broll, H.-P. Bruch, O. Schwandner
Langenbeck's Archives of Surgery 2005; 390: 448
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8.4.4 Posterpräsentation
8. Anhang
Posterpräsentation, 9. Chirurgische Forschungstage in Frankfurt am Main.
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9. Danksagung
9. Danksagung
Ich danke meinem Doktorvater Herrn PD Dr. med. Oliver Schwandner für die
freundliche Überlassung des Themas, für eine stets gute Betreuung, die inhaltliche
und formale Unterstützung und die klar definierten Ziele, die insgesamt einen
reibungslosen Ablauf ermöglicht haben.
Herrn Professor Dr. med H.-P. Bruch danke ich für die Möglichkeit diese
Dissertation in seiner Klinik durchzuführen. Weiter danke ich für die Nutzung des
Chirurgischen Forschungslabors und die Bereitstellung der Patientendaten.
Bei Herrn Professor Dr. med. R. Broll möchte ich mich insbesondere für die
ständige „Rückfragenbereitschaft“ und die Hilfe bei der mikroskopischen
Auswertung bedanken.
Ich danke den Mitarbeitern des Chirurgischen Forschungslabors, Frau Elke
Gheribi, Frau Vera Grobleben-Lembcke, Frau Regina Kaatz, Frau Annemarie
Aumüller und insbesondere Frau Gisela Grosser-Pape, der ich meine
„färberischen Fähigkeiten“ und so manches Stück schweizer Schokolade zu
verdanken habe.
An dieser Stelle möchte ich ganz speziell an PD Dr. rer. nat. Michael Duchrow
erinnern, der mir in statistischen Fragen, histologischer Auswertung und vor allem
bei der Ki-67 Färbung helfend zu Seite stand. Er wird mir nicht nur durch unsere
gemeinsamen Kongressbesuche immer in Erinnerung bleiben.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. rer. nat. Ute Windhoevel für die
Auswertung meiner gefärbten Tumorschnitte und die Einführung in das
experimentelle Arbeiten.
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9. Danksagung
Herrn Professor Dr. med. A.C. Feller danke ich für die Überlassung der Rektum-
karzinompräparate sowie für die Bereitstellung des Mikroskops und somit
Möglichkeit meine Färbungen fotographisch zu dokumentieren. Ganz besonderer
Dank geht an dieser Stelle an Herrn Dr. med. Florian Stellmacher durch den ich
diese Gelegenheit erst erhalten habe.
Für die Benutzung des DAKO-Färbeautomaten im Labor der Hämatologie
(Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck) danke ich dem Direktor
Herrn Professor Dr. med. T. Wagner ebenso wie Frau Monika Vollmer, die mir
nicht nur den Automaten erklärt sondern auch anvertraut hat.
Frau Felicitas Noetzel von der Firma DakoCytomation danke ich für die
Beantwortung meiner Rückfragen vor allem in Bezug auf die NSE-Färbung.
Für die Erfassung und die Zusammenstellung sowie die statistischen
Auswertungen der Patientendaten danke ich Frau Claudia Killaitis.
Herrn Dr. H. Paul aus dem Institut für Statistik und mathematische Wirtschafts-
forschung der Universität Augsburg danke ich für die unabhängige Überprüfung
der erhobenen Daten und deren statistische Auswertung.
Meinen Brüdern Michael und Manuel möchte ich für die ständigen kritischen
Anmerkungen, vor allem aber für die wissenschaftliche Hilfe bei meiner „unechten
(medizinischen) Arbeit zu A.....tumoren“, danken. Lieber Manu: Ich werde wohl
Zweiter werden.
Meiner lieben Anja danke ich für das viele Gegenlesen, die Korrektur zahlreicher
Grammatik- und Rechtschreibfehler und einfach dafür, dass sie immer für mich da
ist.
Abschließend gebührt insbesondere meinen Eltern Monika und Andreas größter
Dank, da sie mir durch ihre Unterstützung das Studium und diese Arbeit
ermöglicht haben.
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10. Lebenslauf
Name Marcus Hilbert
Geburtsdatum 01. Juni 1978
Geburtsort Marbach am Neckar
Konfession römisch-katholisch
Wohnort Hirschgrund 83-85
Familienstand ledig
23627 Groß Grönau
10. Lebenslauf
Eltern Andreas Hilbert * 19.03.1954
Monika Hilbert, geb. Herrmann * 25.01.1954
Geschwister Michael Hilbert * 30.03.1980
Schule
Manuel Hilbert * 02.04.1982
1984 – 1988 Grundschule Erdmannhausen
1988 – 1997 Friedrich-Schiller-Gymnasium Marbach / N.
Wehrdienst
09/1997 – 06/1998 Wehrdienst im 3. SanRgt 6 in Breitenburg/Nordoe
Ausbildung
10/1998 – 09/2001 Ausbildung zum exam. Krankenpfleger im AK St. Georg / HH
Studium
seit 10/2001 Studium der Humanmedizin; Universität zu Lübeck
08/2003 Physikum
08/2006 – 07/2007 Praktisches Jahr:
08/06 – 12/06 Innere Medizin (Asklepios Klinik Bad Oldesloe)
12/2006 – 02/2007 Chirurgie (Klinikum Itzehoe)
02/2007 – 04/2007 Chirurgie (Kantonsspital Frauenfeld / CH)
04/2007 – 07/2007 Urologie (UKSH, Campus Lübeck)
04/2004 – 12/2004 Durchführung des experimentellen Anteils der Doktorarbeit