Quorum Sensing - UFT - Universität Bremen
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Untersuchungen zum „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ (QS)<br />
cyanobakterieller Begleitbakterien und des<br />
Cyanobakteriums Stamm Flo 1<br />
Diplomarbeit<br />
vorgelegt dem<br />
Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)<br />
an der <strong>Universität</strong> <strong>Bremen</strong><br />
von<br />
Peter Orszag<br />
Mai 2008<br />
Betreuender Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer<br />
Zweiter Gutachter: PD Dr. Katarzyna A. Palinska
Danksagung<br />
Danksagung<br />
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die<br />
Bereitstellung meines Arbeitsplatzes sowie die Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei<br />
der Anfertigung meiner Diplomarbeit bedanken.<br />
Bei Frau PD Dr. Katarzyna A. Palinska möchte ich mich für ihr Interesse und für die<br />
Begutachtung meiner Diplomarbeit bedanken.<br />
Ein großes Dankeschön gilt Dr. Birgit Heyduck-Söller, die mich hervorragend betreut<br />
hat und immer Zeit sowie viel Geduld hatte.<br />
Meine ehemaligen und gegenwärtigen Kollegen der Arbeitsgruppe danke ich für die<br />
angenehme Arbeitsatmosphäre, ihre Unterstützung und stete Hilfsbereitschaft sowie<br />
für die „Verpflegung“ durch Kekse und leckere Kuchen.<br />
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich über die gesamte Zeit des Studiums<br />
unterstützt haben.
Inhaltsverzeichnis<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ i<br />
Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle .............................................. iii<br />
1. Einleitung .............................................................................................................. 1<br />
1.1 Zell-Zell-Kommunikation („<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“)............................................................................ 1<br />
1.2 „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer AHL-abhängigen<br />
Genregulation bei Gram-negativen Bakterien............................................................................. 4<br />
1.3 N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien ...................................................... 6<br />
1.4 AHL-Biosensoren............................................................................................................................ 7<br />
1.5 Interspezifische Kommunikation bei Bakterien........................................................................... 7<br />
1.6 „<strong>Quorum</strong> Quenching“ (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation.................................... 9<br />
1.7 Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten ............................................................... 10<br />
1.8 Ziel der Arbeit................................................................................................................................11<br />
2. Material und Methoden....................................................................................... 12<br />
2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft .................................................................. 12<br />
2.2 Verwendete Kulturmedien ........................................................................................................... 13<br />
2.2.1 ASNIII/2-Medium ........................................................................................................................ 13<br />
2.2.2 LB(Luria Bertani)-Medium ........................................................................................................ 14<br />
2.2.2.1 LB(Luria Bertani)-Weichagar........................................................................................... 15<br />
2.2.3 Leuchtbakterien-Medium.......................................................................................................... 15<br />
2.2.4 ABG-Medium............................................................................................................................ 16<br />
2.2.4.1 ABG-Weichagar............................................................................................................... 17<br />
2.3 Pufferlösungen.............................................................................................................................. 17<br />
2.4 Lagerung der Bakterienstämme.................................................................................................. 19<br />
2.5 Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme ............................................................ 19<br />
2.5.1 Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 ............................................ 19<br />
2.5.2 Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo 53............................................ 20<br />
2.6 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09......................................................................................................................................... 20<br />
2.6.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASNIII/2-Medium im Dunkeln .. 21<br />
2.6.2 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten im Dunkeln.... 21<br />
2.6.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR .22<br />
2.6.4 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen ..................................................................... 22<br />
2.7 Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen ............................................................................. 23<br />
2.7.1 Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen................... 23<br />
2.7.1.1 Chromobacterium violaceum CV026............................................................................... 23<br />
2.7.1.2 Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) .................................................................... 24
Inhaltsverzeichnis<br />
2.7.2 Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen zur Untersuchung<br />
von AHL-Signalmolekülen........................................................................................................ 25<br />
2.7.2.1 Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den heterotrophen<br />
Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 .................................................................... 25<br />
2.7.2.2 Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit dem<br />
Cyanobakterium Stamm Flo 1......................................................................................... 26<br />
2.7.3 Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33<br />
und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1........................................................ 27<br />
2.7.3.1 Herstellung zellfreier Kulturüberstände ........................................................................... 27<br />
2.7.3.2 Azidifizierung von Kulturüberständen.............................................................................. 27<br />
2.7.3.3 Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen................................................... 28<br />
2.7.3.4 Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen ....................................................... 28<br />
2.7.4 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signalmolekülen ............................. 29<br />
2.7.5 Visualisierung der DC-Signale ................................................................................................. 30<br />
2.7.5.1 Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme ...................................... 30<br />
2.7.5.2 Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien................................................... 31<br />
2.7.6 Auswertung und Dokumentation der DC-Platten..................................................................... 31<br />
2.7.7 Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien............ 32<br />
2.7.7.1 Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001)...................................................... 33<br />
2.7.7.2 Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) .............................................. 33<br />
2.7.7.3 Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis von AHL-<br />
Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)............................................ 34<br />
2.8 Molekularbiologische Untersuchungen ..................................................................................... 35<br />
2.8.1 Extraktion der chromosomalen DNA........................................................................................ 35<br />
2.8.2 Bestimmung der DNA-Konzentration....................................................................................... 37<br />
2.8.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................................... 37<br />
2.8.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte........................................................... 39<br />
2.8.5 Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten......................................................................... 40<br />
2.8.6 Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens ................................................................. 40<br />
2.8.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen.................................................................... 40<br />
2.9 Herkunft der verwendeten Chemikalien ..................................................................................... 41<br />
3. Ergebnisse .......................................................................................................... 42<br />
3.1 Verwendete Puffersysteme.......................................................................................................... 42<br />
3.2 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei<br />
unterschiedlichen pH-Werten ..................................................................................................... 43<br />
3.2.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände.......................................................................................... 46<br />
3.3 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei einem<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR........................................................................................... 47<br />
3.3.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände.......................................................................................... 49<br />
3.4 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien............................................... 50<br />
3.4.1 Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026 nach MCCLEAN<br />
und Mitarbeitern (1997)............................................................................................................ 50<br />
3.4.2 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern (2001) ..................... 51<br />
3.4.3 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und Mitarbeitern (2002).............. 52
Inhaltsverzeichnis<br />
3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die AHL-<br />
Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie<br />
durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 .................................................................................. 54<br />
3.5.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1................................ 54<br />
3.5.1.1 Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33<br />
und Bo 10-09................................................................................................................... 57<br />
3.5.2 Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09............................................................................... 61<br />
3.5.3 Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion von AHL-Molekülen<br />
durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 ....................................... 63<br />
3.5.4 Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1.............................. 66<br />
3.5.5 Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33<br />
und Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium Stamm Flo 1 ........................................................ 67<br />
3.6 Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen ...................................................... 69<br />
3.6.1 Extraktion der chromosomalen DNA........................................................................................ 69<br />
3.6.2 Amplifikation der 16S-rDNA ..................................................................................................... 69<br />
3.6.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz............ 69<br />
3.6.4 Amplifikation des gyrB-Gens.................................................................................................... 73<br />
3.6.5 Internal Transcribed Spacer (ITS)............................................................................................ 73<br />
4. Diskussion........................................................................................................... 75<br />
4.1 Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter<br />
verschiedenen Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 75<br />
4.1.1 Verwendete Puffersysteme ...................................................................................................... 75<br />
4.1.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten .......................................................... 76<br />
4.1.3 Wachstumsverhalten unter Lichteinfluss ................................................................................. 78<br />
4.2 „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“(QS) bei verschiedenen Gram-negativen Bakterien................................. 79<br />
4.2.1 AHL-Nachweis mit bakteriellen Biosensoren ........................................................................... 80<br />
4.2.2 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien ............................................... 81<br />
4.2.3 Extraktion und Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen ................................................... 82<br />
4.2.4 AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter<br />
verschiedenen Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 84<br />
4.2.4.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Signalmoleküle ..................................................... 84<br />
4.2.4.2 Einfluss der Temperatur auf die AHL-Signalmoleküle .................................................... 87<br />
4.2.4.3 Einfluss von Licht und Nährstoffen auf die Produktion von AHL-Signalmolekülen......... 88<br />
4.2.5 Identifizierung der AHL-Signalmoleküle der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1............................................................... 89<br />
4.3 Molekularbiologie ......................................................................................................................... 96<br />
5. Ausblick............................................................................................................... 98<br />
6. Zusammenfassung ........................................................................................... 100<br />
7. Anhang .............................................................................................................. 103<br />
8. Literatur ............................................................................................................. 105
Abkürzungsverzeichnis<br />
Abkürzungsverzeichnis<br />
Abb. Abbildung<br />
AI Autoinducer<br />
Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser<br />
AHL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e)<br />
ASN Artificial Seawater Nutrient<br />
Bchl a Bakteriochlorophyll a<br />
BLAST basic local alignment search tool<br />
Bp Basenpaare<br />
CFB Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides<br />
DC Dünnschichtchromatographie<br />
DNA Desoxyribonukleinsäure<br />
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat<br />
et al. et alteri<br />
ERG Eppendorfreaktionsgefäß<br />
FE Fleischextrakt<br />
g Gramm<br />
g Erdbeschleunigung<br />
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie<br />
GFP Grün fluoreszierendes Protein<br />
h Stunde(n)<br />
HPLC High Performance Liquid Chromatography<br />
HPLC-MS High Performance Liquid Chromatography-Massen-<br />
spektrometrie<br />
HSL(s) Homoserinlacton(e)<br />
ITS internal transcribed spacer (interne transkribierte Spacer)<br />
Kap. Kapitel<br />
l Liter<br />
LB Luria Bertani<br />
lt. laut<br />
M Molar<br />
mg Milligramm<br />
µg Mikrogramm<br />
µl Mikroliter<br />
µm Mikrometer<br />
i
Abkürzungsverzeichnis<br />
min Minute(n)<br />
ml Milliliter<br />
mM Millimolar<br />
MPI Max Planck-Institut<br />
n Anzahl<br />
N-Acyl-HSL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e)<br />
NCBI National Center for Biotechnology Information<br />
NJ Neighbour-Joining<br />
NK Negativkontrolle<br />
nm Nanometer<br />
O.D. optische Dichte<br />
p.A. per analyse (zur Analyse)<br />
PAR Photosynthetically Active Radiation (photosynthetisch<br />
aktive Strahlung<br />
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion)<br />
Probennr. Probennummer<br />
QQ „<strong>Quorum</strong> Quenching”<br />
QS „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>”<br />
rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure<br />
Rf-Wert retention factor (Retentionsfaktor)<br />
rpm rotation per minute (Rotation pro Minute)<br />
RT Raumtemperatur<br />
sec Sekunde(n)<br />
Tab. Tabelle<br />
TMM Trace-Metal-Mix<br />
Tris Trishydroxymethylaminomethan<br />
U Unit (µmol/min)<br />
<strong>UFT</strong> Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Techno-<br />
logien<br />
ÜK Übernachtkultur<br />
UV Ultraviolett<br />
V Volt<br />
v/v (volume per volume) Volumen pro Volumen<br />
w/v (weight per volume) Gewicht pro Volumen<br />
X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid<br />
2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese<br />
ii
Nomenklatur für AHL-Signalmoleküle<br />
Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle<br />
C4-HSL N-Butanoyl-L-Homoserinlacton (BHL)<br />
C6-HSL N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton (HHL)<br />
C7-HSL N-Heptanoyl-L-Homoserinlacton<br />
C8-HSL N-Octanoyl-L-Homoserinlacton (OHL)<br />
3-oxo-C4-HSL N-(3-oxo-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (OBHL)<br />
3-oxo-C6-HSL N-(3-oxo-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (OHHL)<br />
3-oxo-C8-HSL N-(3-oxo-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (OOHL)<br />
3-oxo-C12-HSL N-(3-oxo-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (OdDHL)<br />
3-hydroxy-C4-HSL N-(3-hydroxy-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (HBHL)<br />
3-hydroxy-C6-HSL N-(3-hydroxy-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (HHHL)<br />
3-hydroxy-C8-HSL N-(3-hydroxy-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (HOHL)<br />
3-hydroxy-C12-HSL N-(3-hydroxy-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (HdDHL)<br />
iii
1. Einleitung<br />
1. Einleitung<br />
Lange Zeit bestand die Auffassung, dass Bakterien unabhängig voneinander in strikt<br />
solitärer Lebensweise existieren. Bereits vor 65 Jahren lieferten jedoch<br />
Untersuchungen an marinen Leuchtbakterien erste Hinweise auf ein multizelluläres<br />
Verhalten von Bakterien (DOUDOROFF, 1942). Die Fähigkeit zur interzellulären<br />
Kommunikation bildet hierbei die Voraussetzung für eine derartige mikrobielle<br />
Organisationsform (BEN JACOB et al., 2004; PARSEK und GREENBERG, 2005).<br />
Die Zell-Zell-Kommunikation wurde erstmals bei dem Gram-positiven Bakterium<br />
Streptococcus pneumoniae (TOMASZ, 1965) und den marinen Gram-negativen<br />
Bakterien Vibrio fischeri und Vibrio harveyi (NEALSON et al., 1970; NEALSON und<br />
HASTINGS, 1979) beschrieben, wobei chemische Signale der Kommunikation und<br />
der Koordination von Gruppenaktivitäten dienen. Das Phänomen einer interzellulären<br />
Kommunikation bei Bakterien wurde erst Jahrzehnte später anerkannt und<br />
Kommunikation zwischen Individuen nicht mehr einzig höheren Organismen oder<br />
spezialisierten Bakterien zugeschrieben. Anfang der 1990er Jahre gewann dieses<br />
Arbeitsgebiet aufgrund von Untersuchungen an pflanzen- und humanpathogenen<br />
Gram-negativen Bakterien (GAMBELLO und IGLEWSKI, 1991; BAINTON et al.,<br />
1992; Fuqua et al., 1994) zunehmend an Bedeutung. Mittlerweile wird die Zell-Zell-<br />
Kommunikation als die wichtigste intrazelluläre Signalreaktion zwischen Bakterien<br />
verstanden (SZENTHE und PAGE, 2003).<br />
1.1 Zell-Zell-Kommunikation („<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“)<br />
In der Literatur werden Kommunikationssysteme, mit Hilfe derer Bakterien die eigene<br />
Populationsdichte wahrnehmen und in Abhängigkeit von dieser physiologische<br />
Aktivitäten regulieren können, als „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“-Systeme zusammengefasst.<br />
Dabei stellt die kleinste Einheit, welche zu Zelldichte-abhängigen Reaktionen<br />
befähigt ist, per Definition das <strong>Quorum</strong> dar (FUQUA et al., 1994; GEISENBERGER,<br />
2000). Zur Ermittlung der Zellpopulationsdichte verwenden Mikroorganismen eine<br />
große Vielfalt an niedermolekularen Substanzen, die unterschiedliche chemische<br />
Strukturen aufweisen (siehe Abb. 1.1) (DONG und ZHANG, 2005; WILLIAMS, 2007).<br />
Diese als „Autoinducer“ bezeichneten Signalmoleküle sind meistens sehr<br />
artspezifisch (SMITH et al., 2004) und werden von den Bakterien zur Koppelung der<br />
Expression bestimmter Gene an die Populationsdichte eingesetzt, welches eine<br />
1
1. Einleitung<br />
synchrone Koordination biologischer Aktivitäten innerhalb einer lokalen Population<br />
ermöglicht (CHA et al., 1998; WILLIAMS, 2007). Das Wahrnehmen der eigenen<br />
Populationsdichte wird dabei durch die Messung der Signalmolekül-Konzentration<br />
ermöglicht, da die Konzentration der produzierten und in die Umwelt freigesetzten<br />
Signalmoleküle mit Zunahme der Bakterienpopulation proportional ansteigt.<br />
Mittlerweile wurden verschiedene QS-Systeme beschrieben, welche sich in der<br />
Verwendung der Signalmoleküle und regulatorischen Proteine unterscheiden. Das<br />
LuxR/LuxI-QS-System mit N-Acyl-L-Homoserinlactonen (AHLs) als Signalmolekülen<br />
wird von den Gram-negativen Bakterien verwendet (FUQUA et al., 2001;<br />
WHITEHEAD et al., 2001). Weitere QS-Systeme vereinigen Komponenten Gram-<br />
negativer und Gram-positiver QS-Systeme, wie für Vibrio harveyi beschrieben<br />
(READING und SPERANDIO, 2006). Dieses marine Bakterium verwendet zwei QS-<br />
Systeme, ein AHL-QS-System zur intraspezifischen Kommunikation (BASSLER et<br />
al., 1994) und ein weiteres System zur interspezifischen Kommunikation (SURETTE<br />
und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003), an dem ein<br />
Furanosylboratdiester (borhaltiges Furanon) als „Autoinducer“ („Autoinducer II“(AI-2),<br />
siehe Abb. 1.1) beteiligt ist (CHEN et al., 2002). Genomanalysen belegten, dass das<br />
für die AI-2-Synthese benötigte LuxS-Enzym unter den Bakterien weitverbreitet ist<br />
(SUN et al., 2004). Für die mittlerweile weiteren nachgewiesenen Gram-positiven<br />
und Gram-negativen Bakterien mit AI-2-Signalmolekülen (LuxS/AI-2-QS-System)<br />
wird ebenfalls angenommen, dass die universellen Signalmoleküle eine<br />
interspezifische Kommunikation ermöglichen (WATERS und BASSLER, 2005).<br />
Die am häufigsten verwendeten Signalmoleküle zur interzellulären Kommunikation<br />
unter den Gram-positiven Bakterien sind lineare, z.T. zyklische Oligopeptide (AIP =<br />
autoinducing peptides) (KLEEREBEZEM et al., 1997; MILLER und BASSLER, 2001;<br />
CAMILLI und BASSLER, 2006), aber es wurden auch γ-Butyrolactone bei<br />
Streptomyceten und AI-2-Signalmoleküle bei z.B. Streptococcus pneumoniae,<br />
S. anginosus und Staphylococcus aureus nachgewiesen (MILLER und BASSLER,<br />
2001; AHMED et al., 2007, WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.1).<br />
2
1. Einleitung<br />
halogeniertes Furanon<br />
Abb. 1.1: Zusammenstellung verschiedener, repräsentativer QS-Signalmoleküle und deren Strukturen.<br />
3-oxo-C6-HSL, N-3-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone; A-Factor, 2-isocapryloyl-3-hydroxymethyl-γbutyrolactone;<br />
Pseudomonas quinolone signal (PQS), 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone; HHQ,<br />
2-heptyl-4(1H)-quinolone; DSF (“diffusible factor“), 11-methyl-2-dodecenoic acid; 3OH-PAME,<br />
hydroxyl-palmitic acid methyl ester; AIP-1, staphylococcal autoinducing peptide 1; DPD (AI-2-<br />
Precursor-Molekül), 4,5 dihydroxy-2,3-pentanedione; AI-2 (Autoinducer-2), furanosyl borate diester;<br />
halogeniertes Furanon aus Delisea pulchra. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von<br />
WILLIAMS (2007) und FROMMBERGER (2005).<br />
In den letzten Jahren wurde in vielen Gram-negativen Bakterienspezies,<br />
überwiegend Proteobakterien, und in einigen Gram-positiven Bakterienspezies QS-<br />
Systeme identifiziert, welche zum Informationsaustausch über den Zustand der<br />
Gesamtpopulation befähigt sind. Damit bestätigte sich, dass „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ ein<br />
weitverbreiteter Mechanismus der Genregulation in Bakterien ist (READING und<br />
SPERANDIO, 2006; CAMILLI und BASSLER, 2006). Die Angaben über QS-Systeme<br />
bei Gram-negativen Bakterien gehen in den Publikationen weit auseinander.<br />
Berichten SHIN und Mitarbeiter (2007) von lediglich über 30 Spezies, konnten alleine<br />
CASE und Mitarbeiter (2008) bei nahezu 50 Spezies (aus etwa 30 Gattungen) QS-<br />
Systeme dokumentieren. Dabei werden für weit mehr Bakterienspezies AHL-QS-<br />
Systeme angenommen.<br />
Bereits 1996 wurde aber am Beispiel der Meeresalge Delisea pulchra aufgezeigt,<br />
dass QS-Komponenten (z.B. halogenierte Furanone, siehe Abb. 1.1) auch in<br />
Eukaryoten vorkommen (GIVSKOV et al., 1996), welche z.B. bakterielle QS-Systeme<br />
durch eine Degradation des LuxR-Rezeptors inhibieren (MANEFIELD et al., 2002).<br />
Die Alge wird folglich kaum von bakteriellen Biofilmen besiedelt.<br />
Al-2<br />
3
1. Einleitung<br />
„<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ stellt ein Regulationssystem mit großem Wirkungsbereich dar,<br />
welches eine Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen ermöglicht bzw. der<br />
Bakterienpopulation einen erheblichen Vorteil verschaffen kann (CASE et al., 2008).<br />
QS kann dabei eine Vielzahl physiologischer Prozesse und phänotypischer<br />
Veränderungen der Bakterienzelle regulieren. Diese Prozesse schließen die<br />
Antibiotika-Produktion, die bakterielle Konjugation, die Produktion von<br />
Virulenzfaktoren, die Sporenbildung, die Lumineszenz, die Biosynthese von<br />
Exopolysacchariden, die Produktion von Sekundärmetaboliten und Exoenzymen, die<br />
Regulation von Zellfunktionen in der stationären Wachstumsphase, die Motilität und<br />
das Schwärmen, die Biofilmbildung und die Zellaggregation ein (WITHERS et al.,<br />
2001; WATERS und BASSLER, 2005; WILLIAMS, 2007; DIGGLE et al., 2007a).<br />
Dementsprechend kommt dem bakteriellen QS z.B. in der Medizin hinsichtlich neuer<br />
Therapieansätze eine entscheidende Bedeutung zu, da die Ausprägung wichtiger<br />
Virulenzfaktoren sowie die Antibiotikaproduktion bei einer Reihe von Organismen,<br />
wie dem humanpathogenen Bakterium Pseudomonas aeruginosa, unter QS-<br />
Kontrolle stehen (BJARNSHOLT und GIVSKOV, 2007).<br />
1.2 „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer<br />
AHL-abhängigen Genregulation bei Gram-negativen Bakterien<br />
Das marine Leuchtbakterium Vibrio (Photobacterium) fischeri lebt in der Natur im<br />
freien Meerwasser oder als Symbiont in Lichtorganen von Fischen und Weichtieren,<br />
in denen das Bakterium zu sehr hohen Zelldichten anwächst (10 10 - 10 11 Zellen/ml)<br />
und die Lumineszenz ausgelöst (BOETTCHER und RUBY, 1995). Der<br />
Wirtsorganismus zieht Nutzen aus der Lichtemission und stellt den Bakterien<br />
innerhalb der Lichtorgane im Gegenzug Nährstoffe zur Verfügung. Im freien<br />
Meerwasser liegen lediglich geringe Zelldichten vor, wodurch eine Lumineszenz nicht<br />
induziert und keine Energie in dieser nährstoffarmen Umgebung für eine unnötige<br />
Lichtproduktion verbraucht wird (NEALSON und HASTINGS, 1979; LEE und RUBY,<br />
1992).<br />
Bei V. fischeri sind niedermolekulare Verbindungen („Autoinducer“) für diese<br />
Zelldichte-abhängige Regulation der Lumineszenz verantwortlich (EBERHARD et al.,<br />
1981). Die acylierten Derivate des Homoserinlactons (bei V. fischeri: 3-oxo-C6-HSL)<br />
werden dabei von dem LuxI-Protein, einer AHL-Synthase, konstitutiv synthetisiert<br />
(EBERHARD et al., 1981; ENGEBRECHT und SILVERMAN, 1984) und diffundieren<br />
4
1. Einleitung<br />
frei durch biologische Membranen und die Zellwand (KAPLAN und GREENBERG,<br />
1985) (siehe Abb. 1.2 A). Aufgrund der freien Diffusion werden die Signalmoleküle<br />
auch außerhalb der Bakterienzelle lokal akkumuliert. Dementsprechend steigt die<br />
intrazelluläre und (lokale) extrazelluläre Konzentration dieser „Autoinducer“ bei<br />
Zunahme der Zellpopulationsdichte proportional. Die AHL-Signalmoleküle binden bei<br />
einer kritischen Schwellenwert-Konzentration (treshold concentration) als Ligand an<br />
das LuxR-Protein (Transkriptionsaktivator) im Cytoplasma mit nachfolgender<br />
Aktivierung der Transkription des luxICDABE-Operons durch Bindung des LuxR-<br />
„Autoinducer“-Komplexes an die Promotorregion (ENGEBRECHT et al., 1983) (siehe<br />
Abb. 1.2 B). Diese als lux-Boxen bezeichneten speziellen Promotorsequenzen sind<br />
20 bp große invertierte, repetitive Sequenzen (ZHANG et al., 2002a). Neben den für<br />
die Lumineszenz benötigten Genen kodiert das lux-Operon das luxI-Gen. Eine<br />
gesteigerte Transkription der Lumineszenz-Gene führt somit durch eine positive<br />
„feedback“-Regulation zu einer Verstärkung der eigenen Signalmolekül-Produktion<br />
(Autoinduktion) (EBERHARD et al., 1981) (siehe Abb. 1.2 B). Studien an V. fischeri<br />
belegen, dass das LuxR/LuxI-QS-System zudem weitere, nicht für die Lumineszenz<br />
erforderliche Gene reguliert (QIN et al., 2007).<br />
Abb. 1.2: Zelldichte-abhängige QS-Regulation der Lumineszenz bei Vibrio fischeri. A: Bei niedrigen<br />
Zelldichten werden die Lumineszenz-Gene luxCDABE aufgrund einer niedrigen Konzentration des<br />
Signalmoleküls (3-oxo-C6-HSL) lediglich schwach transkribiert. B: Bei hohen Zelldichten bindet das<br />
Signalmolekül bei Erreichen einer Schwellenwert-Konzentration als Ligand an das LuxR. Die<br />
gesteigerte Transkription der luxCDABE-Gene führt zur Lichtemission sowe zur Verstärkung der<br />
Signalmolekül-Produktion. Abbildung nach WHITEHEAD (2001), verändert nach FROMMBERGER<br />
(2005)<br />
5
1. Einleitung<br />
1.3 N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien<br />
In vielen Gram-negativen Bakterien (vor allem bei α-, β- und γ-Proteobakterien)<br />
wurden mittlerweile LuxR/LuxI-homologe QS-Systeme nachgewiesen. Diese auf<br />
molekularer Ebene am besten verstandenen QS-Systeme setzen sich aus<br />
regulatorischen LuxI- und LuxR-homologen Proteinen zusammen, wobei die LuxI-<br />
homologen Proteine die N-Acyl-L-Homoserinlactone (AHLs) als „<strong>Quorum</strong><br />
<strong>Sensing</strong>“(QS)-Signalmoleküle synthetisieren (CASE et al., 2008). Die Stoffklasse der<br />
N-Acyl-L-Homoserinlactone zeichnet sich durch einen Homoserinlactonring und einer<br />
N-acylierten Seitenkette aus, verbunden über eine Amid-Bindung. Die N-Acyl-<br />
Seitenketten unterscheiden sich in Länge (zwischen 4 - 18 C-Atomen), Sättigung<br />
sowie durch eine eventuelle Substitution am C3-Atom (3-Oxo- oder 3-Hydroxygruppe)<br />
(WHITEHEAD et al., 2001; WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.3). Dieses bedingt eine<br />
beträchtliche strukturelle Diversität von AHL-Molekülen.<br />
Abb. 1.3: Struktur von AHL-Signalmolekülen. AHL, N-Acyl-L-Homoserinlacton; 3-oxo-AHL, N-3-oxo-<br />
Acyl-L-Homoserinlacton; 3-hydroxy-AHL, N-3-hydroxy-Acyl-L-Homoserinlacton. R = C1 bis C15. . Die<br />
Acyl-Seitenketten können zudem eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen. 3-oxo-C12-HSL,<br />
N-3-oxo-Dodecanoyl-L-Homoserinlacton. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von WILLIAMS<br />
(2007)<br />
S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) und acyliertes acyl carrier protein (acyl-ACP),<br />
letzteres ein Zwischenprodukt der Fettsäurebiosynthese, sind die Substrate der LuxI-<br />
homologen Enzyme (AHL-Synthasen) für die AHL-Synthese. Der<br />
Homoserinlactonring der N-Acyl-HSLs wird dabei aus dem S-Adenosyl-L-Methionin<br />
(SAM) synthetisiert, die N-Acyl-Seitenkette der AHL-Moleküle aus den Acyl-Resten<br />
der acyl-ACP-Moleküle (SCHAEFER et al., 1996).<br />
6
1. Einleitung<br />
1.4 AHL-Biosensoren<br />
Die Identifizierung einer großen Anzahl von AHL-QS-Systemen in Bakterien wurde<br />
durch die Entwicklung und den Einsatz bakterieller AHL-Biosensoren bedeutend<br />
vorangebracht, welche auch heutzutage in AHL-Untersuchungen Anwendung finden.<br />
Diese bakteriellen Biosensoren produzieren selber keine AHL-Signalmoleküle,<br />
zeichnen sich aber durch eine phänotypische Nachweisreaktion in Gegenwart<br />
bestimmter N-Acyl-HSLs aus. Diese Reaktion beruht auf dem Vorhandensein eines<br />
LuxR-homologen Proteins, welches die Aktivierung eines bestimmten Reportergens<br />
induziert (z.B. Lumineszenz, β-Galaktosidase, GFP, Violacein-Pigment) (WAGNER-<br />
DÖBLER et al., 2005; STEINDLER und VENTURI, 2007). Das jeweilige Protein aus<br />
der LuxR-Familie bestimmt für jeden AHL-Biosensor die AHL-Spezifität, kann aber<br />
auch in manchen Fällen (bei höheren Konzentrationen) durch nahverwandte AHLs<br />
angesprochen werden. Dementsprechend gibt es gentechnisch konstruierte<br />
Biosensoren, welche auf AHL-Moleküle mit kurz- und mittellangen Acyl-Seitenketten<br />
(z.B. Chromobacterium violaceum CV026: MCCLEAN et al., 1997), mit langen Acyl-<br />
Seitenketten (z.B. Pseudomonas aeruginosa PAO1 (M71LZ): DONG et al., 2005),<br />
aber auch auf ein breites Spektrum von AHL-Molekülen (z.B. Agrobacterium<br />
tumefaciens NTL4 (pZLR4): FARRAND et al., 2002) reagieren. Andere Biosensoren<br />
reagieren hingegen nur auf bestimmte Modifikationen in der Acyl-Seitenkette, wie der<br />
3-hydroxy-AHL detektierende Biosensor Pseudomonas fluorescens 1855 (pSF105,<br />
pSF107) (KHAN et al., 2005). Neben Modifikation und Länge der Acyl-Seitenkette ist<br />
die AHL-Konzentration für eine Aktivierung der jeweiligen Reportergene von großer<br />
Bedeutung (Sensitivität) (STEINDLER und VENTURI, 2007).<br />
1.5 Interspezifische Kommunikation bei Bakterien<br />
QS-Signalmoleküle sind größtenteils sehr art-spezifisch (SMITH et al., 2004). Die<br />
N-Acyl-L-Homoserinlactone der Gram-negativen Bakterien weisen eine große<br />
strukturelle Ähnlichkeit auf, werden aber dessen ungeachtet mit einer hohen<br />
Spezifität von ihrem jeweiligen LuxR-homologen Protein erkannt (FEDERLE und<br />
BASSLER, 2003; WAGNER-DÖBLER et al., 2005). Aufgrund dieser Spezifität<br />
zwischen LuxR-Homologen und N-Acyl-HSL-Molekülen wurde das bakterielle AHL-<br />
QS-System vor allem als ein intraspezifisches Kommunikationssystem verstanden<br />
(FEDERLE und BASSLER, 2003; READING und SPERANDIO, 2006). Mittlerweile<br />
sind einige LuxR-homologe Proteine bekannt, welche mehr als ein AHL-<br />
7
1. Einleitung<br />
Signalmolekül erkennen und in erster Linie an einer interspezifischen Kommunikation<br />
beteiligt sind (READING und SPERANDIO, 2006). Eine Interspezies-Kommunikation<br />
ist dabei nicht immer zu einem beiderseitigen Vorteil. Mögliche Interaktionen sind<br />
dabei neben einer Aktivierung des LuxR-homologen Regulatorproteins des Weiteren<br />
eine Blockierung der AHL-Bindungsstelle durch Spezies-fremde AHL-Moleküle. In<br />
diesem Zusammenhang wurde für Chromobacterium violaceum eine Inhibierung der<br />
Produktion von Violacein durch langkettige AHL-Moleküle (C10 - C14-Seitenketten)<br />
beschrieben (MCCLEAN et al., 1997).<br />
Ein Beispiel interspezifischer Kommunikation ist die zwischen den opportunistisch<br />
pathogenen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia, welche<br />
die Lungen von Patienten mit Cystischer Fibrose co-infizieren und gemischte<br />
Biofilme ausbilden. In diesem Fall aktivieren die synthetisierten AHL-Moleküle von<br />
P. aeruginosa das Pathogenese regulierende QS-System bei B. cepacia, wodurch<br />
B. cepacia Nutzen aus Spezies-fremden AHLs zieht (RIEDEL et al., 2001). Die LuxR-<br />
homologen Proteine der beiden Spezies weisen eine hohe Verwandtschaft<br />
zueinander auf, welches evolutionär auf einen lateralen Gentransfer schließen lässt,<br />
resultierend in einer erleichterten Interspezies-Kommunikation (CASE et al., 2008).<br />
Das marine Bakterium Vibrio harveyi existiert in natürlichen Habitaten in gemischten<br />
Populationen, bestehend aus verschiedenen Bakterienspezies (MILLER und<br />
BASSLER, 2001). Das interspezifische QS-System mit dem „Autoinducer II“(AI-2)-<br />
Signalmolekül ermöglicht es V. harveyi neben der eigenen Populationsdichte zudem<br />
die der anderen AI-2-synthetisierenden Bakterienspezies in ihrer lokalen Umgebung<br />
wahrzunehmen (SURETTE und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003).<br />
Die Fähigkeit einer Verhaltensänderung in Abhängigkeit von den<br />
Populationsverhältnissen in der Gesamtpopulation beruht bei diversen<br />
Bakterienspezies auf der Erkennung verschiedener AI-2-Signalmoleküle, ausgehend<br />
vom 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD, siehe Abb. 1.1) (CHEN et al., 2002;<br />
MILLER et al., 2004).<br />
Untersuchungen an gemischten Bakterienpopulationen mit verschiedenen<br />
Bakterienspezies zeigten, dass die AI-2-Produktion durch Escherichia coli in anderen<br />
Bakterienspezies QS-gesteuerte Vorgänge bereits bei niedrigen Zelldichten<br />
einleitete. Ein Abbau der AI-2-Signalmoleküle durch E. coli verursachte indes bei<br />
benachbarten Bakterienspezies eine zu geringe Einschätzung der eigenen<br />
8
1. Einleitung<br />
Populationsdichte, wodurch QS-gesteuerte Prozesse nicht eingeleitet oder nicht<br />
beendet wurden (XAVIER und BASSLER, 2005).<br />
Neben der bakteriellen Interspezies-Kommunikation wurden auch Interaktionen<br />
zwischen Bakterien und höheren Organismen beschrieben (inter-kingdom). Dabei<br />
können höhere Organismen bakterielle QS-Systeme über sogenannte AHL-Mimetika<br />
stimulieren, wobei Assoziationen mit Bakterien z.B. beim Menschen zur Erhaltung<br />
seiner Darmflora dienen könnten (CAMILLI und BASSLER, 2006). In Reispflanzen<br />
(Oryza sativa) wurden AHL-Mimetika nachgewiesen (DEGRASSI et al., 2007), deren<br />
biologische Bedeutung bisweilen noch nicht erfasst wurde, aber vermutlich im<br />
Zusammenhang mit Reis-pathogenen Burkholderia-Spezies stehen.<br />
1.6 „<strong>Quorum</strong> Quenching“ (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation<br />
Die Hemmung der interzellulären Kommunikation („<strong>Quorum</strong> Quenching“) stellt<br />
womöglich einen wichtigen Mechanismus in der Regulation des bakteriellen QS, aber<br />
auch bei der Interaktion von verschiedenen Mikroorganismen sowie von<br />
Mikroorganismen und höheren Organismen dar. In diesem Zusammenhang<br />
übernimmt wahrscheinlich der Abbau von Signalmolekülen durch „<strong>Quorum</strong><br />
Quenching“-Enzyme (als eine Möglichkeit des QQ) eine wichtige Funktion (DONG<br />
und ZHANG, 2005). AHL-degradierende Enzyme, AHL-Lactonasen, wurden<br />
beispielsweise bei Bacillus-Spezies (z.B. DONG et al., 2000) und bei Agrobacterium<br />
tumefaciens (ZHANG et al., 2002b), AHL-Acylasen bei Pseudomonas aeruginosa<br />
(HUANG et al., 2003) und einem Anabaena-Stamm (ROMERO et al., 2008)<br />
nachgewiesen. Ein Abbau bzw. eine Inaktivierung von Signalmolekülen ermöglicht<br />
wahrscheinlich, wie für A. tumefaciens beschrieben (ZHANG et al., 2004), das<br />
Abschalten der QS-regulierten Genexpression. Des Weiteren wird für einige<br />
Bakterienspezies eine Inhibierung der interzellulären Kommunikation konkurrierender<br />
und pathogener Bakterienspezies vermutet. In vielen Fällen regulieren die<br />
bakteriellen QS-Systeme die Expression von Virulenz-Genen sowie die Antibiotika-<br />
Produktion. Die in höheren Organismen detektierten AHL-degradierenden Enzyme<br />
besitzen ebenfalls eine inhibierende Funktion gegen pflanzen- bzw.<br />
humanpathogene QS-Systeme (DONG und ZHANG, 2005). Dementsprechend kann<br />
die bakterielle Virulenz deutlich herabgesetzt werden. Neben QS-Inhibitoren wird den<br />
AHL-degradierenden Enzymen eine Rolle bei der medizinischen Bekämpfung von<br />
humanpathogenen Bakterien zugesprochen (HASELTINE und ARNOLD, 2008).<br />
9
1. Einleitung<br />
1.7 Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Auswahl von marinen Gram-negativen<br />
Bakterienstämmen für „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“-Untersuchungen eingesetzt, welche zuvor<br />
auf Grundlage von Voruntersuchungen (SCHOMAKER, 2007) als AHL-Produzenten<br />
beschrieben worden waren.<br />
Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo 53-33 wurde aus der nicht-axenischen<br />
Cyanobakterienkultur Stamm Bo 53 (Nodularia harveyana) isoliert und nach 16S-<br />
rDNA-Sequenzierung der Gattung Porphyrobacter zugeordnet (HUBE, 2008), welche<br />
erstmals von FUERST und Mitarbeitern (1993) beschrieben wurde. Porphyrobacter-<br />
Spezies sind aerobe anoxygen phototrophe Bakterien und gehören zur α-4-<br />
Untergruppe der Proteobakterien (YURKOV und BEATTY, 1998).<br />
Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo 10-09 wurde aus der nicht-axenischen<br />
Cyanobakterienkultur von Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 isoliert und nach<br />
Sequenzierung der 16S-rDNA als Vertreter der Gattung Muricauda (Gruppe:<br />
Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides, Familie: Flavobacteriaceae) identifiziert<br />
(HUBE, 2008). Der Typenstamm Muricauda aquimarina ist ein Gram-negatives,<br />
nicht-sporenbildendes, leicht halophiles Stäbchen (YOON et al., 2005). Das Genus<br />
Muricauda wurde erstmals von BRUNS und Mitarbeitern (2001) beschrieben.<br />
Weiterhin wurde das Cyanobakterium Stamm Flo 1 für QS-Untersuchungen<br />
hinzugezogen. Dieser Cyanobakterienstamm gehört zur Ordnung Oscillatoriales und<br />
wurde ursprünglich aufgrund rein morphologischer Kriterien als Oscillatoria limnetica<br />
bezeichnet. Durch molekularbiologische Untersuchungen konnte SCHRÜBBERS<br />
(2007) aber eindeutig aufzeigen, dass Stamm Flo 1 eine Spezies der Gattung<br />
Geitlerinema ist.<br />
Cyanobakterien leben in engen assoziierten Lebensgemeinschaften mit<br />
heterotrophen Bakterien (STEVENSON und WATERBURY, 2006). Cyanobakterien<br />
stellen den heterotrophen Bakterien im Austausch gegen remineralsierte Nährstoffe<br />
labile Substrate zur Verfügung (TUOMAINEN et al., 2006). Durch Fluoreszenz-Insitu-<br />
Hybridisierung (FISH) wurden Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 und Muricauda<br />
Stamm Bo 10-09 ebenfalls als Teil der heterotrophen Begleitflora des Geitlerinema-<br />
Stammes Flo 1 detektiert (HUBE, 2008, persönliche Mitteilung). In diesem<br />
Zusammenhang stellt sich die Frage, in wieweit die assoziierten<br />
Lebensgemeinschaften interspezifisch über (AHL)-Signalmoleküle miteinander<br />
kommunizieren und über QS-gesteuerte Prozesse beeinflusst werden.<br />
10
1. Einleitung<br />
1.8 Ziel der Arbeit<br />
In der vorliegenden Diplomarbeit sollte eine dünnschichtchromatographische<br />
Methode mit Biosensoren zum Nachweis von AHL-Molekülen etabliert werden. Des<br />
Weiteren sollte die AHL-Produktion in Abhängigkeit vom pH-Wert und der<br />
Wachstumsphase für die heterotrophen Bakterien Porphyrobacter Stamm Bo 53-33<br />
und Muricauda Stamm Bo 10-09 sowie für das Cyanobakterium Stamm Flo 1<br />
untersucht werden. Eine Untersuchung des Lichteinflusses sowie weiterer<br />
Einflussfaktoren wie Temperatur und Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion der<br />
heterotrophen Bakterien sollte zudem durchgeführt werden. Aussagen zum<br />
Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterien sollten mittels physiologischer<br />
Untersuchungen getroffen werden.<br />
Ferner sollte durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden wie 16S-rDNA-<br />
Sequenzierung, gyrB-Gen-Analyse und ITS-Amplifikation überprüft werden, ob es<br />
sich bei den aufgrund morphologischer Kriterien klassifizierten Cyanobakterien<br />
Nodularia harveyana Stamm Bo 53 und Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 tatsächlich<br />
um diese Spezies handelt.<br />
11
2. Material und Methoden<br />
2. Material und Methoden<br />
2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft<br />
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme sowie deren Herkunft<br />
sind in den Tabellen 2.1 - 2.3 zusammengefasst. Hierbei erfolgte eine Unterteilung in<br />
die zu untersuchenden Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1 und Tab. 2.2) sowie in die<br />
für den Nachweis von AHL-Signalmolekülen erforderlichen Stämme und<br />
Referenzstämme (siehe Tab. 2.3).<br />
Die Cyanobakterienstämme (siehe Tab. 2.2) wurden aus der Stammsammlung der<br />
Abteilung Marine Mikrobiologie (<strong>UFT</strong>, <strong>Universität</strong> <strong>Bremen</strong>) entnommen. Die Stämme<br />
Bo 53 und Bo 10 stammen ursprünglich von einem marinen Standort an der Ostsee<br />
(Boiensdorf, Stammbezeichnung Bo), Stamm Flo 1 stammt aus einem<br />
Mangrovenwäldchen in Key Biscayne (Florida (USA), Stammbezeichnung Flo). Die<br />
heterotrophen Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1) wurden von Dipl.-Biologin A. Hube<br />
(Abt. Marine Mikrobiologie, <strong>UFT</strong>, <strong>Universität</strong> <strong>Bremen</strong>) zur Verfügung gestellt<br />
(siehe Kap. 1.7).<br />
Tab. 2.1: Liste der ausgewählten heterotrophen Bakterien und ihre Identifizierung nach HUBE (2008)<br />
Stammbezeichnung Identifizierung nach Sequenzierung<br />
Bo 10-09 Muricauda sp.<br />
Bo 53-33 Porphyrobacter sp.<br />
Tab. 2.2: Übersicht der ausgewählten Cyanobakterienstämme aus der Stammsammlung und deren<br />
Stammbezeichnung sowie ihre taxonomische Einordnung und ihre Abteilungszugehörigkeit nach<br />
RIPPKA und Mitarbeitern (1979)<br />
Stamm und Abteilungszugehörigkeit<br />
(RIPPKA et al., 1979)<br />
Ordnung Oscillatoriales (Unterabteilung III)<br />
Geitlerinema sp. a)<br />
Stammbezeichnung<br />
Flo 1<br />
Oscillatoria brevis Bo 10<br />
Ordnung Nostocales (Unterabteilung IV)<br />
Nodularia harveyana Bo 53<br />
a) reklassifiziert (SCHRÜBBERS, 2007)<br />
12
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.3: Zusammenstellung weiterer Bakterienstämme sowie deren Verwendung und Herkunft<br />
Bakterienstamm<br />
Eigenschaft/<br />
Verwendung<br />
Referenz/Herkunft<br />
Vibrio sp. AHL-Positivkontrolle Max-Planck-Institut, <strong>Bremen</strong><br />
Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)<br />
Agrobacterium tumefaciens NT1<br />
(pTiC58∆accR )<br />
traG::lacZ traR (pZLR4)<br />
AHL-Sensorstamm<br />
FARRAND et al., 2002<br />
AHL-Positivkontrolle FARRAND et al., 2002<br />
Agrobacterium tumefaciens NTL4 AHL-Negativkontrolle FARRAND et al., 2002<br />
Chromobacterium violaceum CV026<br />
Stamm PCC 7105 (Geitlerinema sp. )<br />
2.2 Verwendete Kulturmedien<br />
mini Tn5<br />
AHL-Sensorstamm<br />
cyanobakterieller<br />
Referenzstamm<br />
McCLEAN et al., 1997<br />
Pasteur-Culture-Collection<br />
(PCC, Paris, Frankreich)<br />
Die Lagerung der Flüssigmedien erfolgte bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, die<br />
der Festmedien bei 4 °C im Dunkeln.<br />
2.2.1 ASNIII/2-Medium (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995)<br />
Zur Anzucht von Stamm Flo 1 wurde das „Artificial Seawater Nutrient“-Medium<br />
(ASNIII/2-Medium) mit Nitrat (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER,<br />
1995) verwendet, welchem zur Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 1,0% Fleischextrakt als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurde.<br />
In Tabelle 2.4 sind die Bestandteile des Mediums und in Tabelle 2.5 die<br />
Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung angegeben. Die Lösungen des<br />
Mediums wurden mit Aqua bidest. angesetzt und mit Ausnahme der sterilfiltrierten<br />
Vitamin B12-Lösung autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde zur<br />
Vermeidung von Ausfällungen separat in Aqua bidest. angesetzt und autoklaviert.<br />
Diese Komponente und die Zusätze wurden dem autoklavierten Grundmedium steril<br />
zugegeben. Das ASNIII/2-Medium wies eine Salinität von 15‰ auf. Das Kulturmedium<br />
hatte einen pH-Wert von 9,0, das mit 1% Fleischextrakt versetzte Kulturmedium<br />
einen pH-Wert von 7,1. Zur Herstellung von ASNIII/2-Festmedium wurde dem<br />
Grundmedium zusätzlich 1,5% (w/v) Agar zugesetzt.<br />
13
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.4: Zusammensetzung des ASNIII/2-Mediums (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach<br />
RETHMEIER, 1995)<br />
Komponenten g/l oder ml/l<br />
Grundmedium<br />
NaCl 12,5 g<br />
MgCl 2 x 6 H 2O 1,0 g<br />
KCl 0,25 g<br />
NaNO3 0,75 g<br />
MgSO4 x 7 H2O 1,75 g<br />
CaCl 2 x 2 H 2O 0,25 g<br />
Fleischextrakt a)<br />
10,0 g<br />
Aqua bidest. ad 900 ml<br />
Na2CO3 0,12 g/100 ml<br />
Zusätze<br />
KH2PO4 x 3 H2O-Stammlösung (4 g/l) 2,50 ml<br />
Fe-NH 4-Citrat-Lösung (6 g/l) 0,25 ml<br />
Vitamin B 12-Stammlösung b) (1 mg/100 ml) 0,50 ml<br />
Spurenelement-Lösung (Trace Metal Mix) 0,50 ml<br />
a) Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
b) sterilfiltriert<br />
Tab. 2.5: Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung (Trace Metall Mix) (RIPPKA et al., 1979,<br />
modifiziert nach RETHMEIER, 1995)<br />
Komponenten g/l<br />
Na 3-Citrat x 2 H 2O 3,0<br />
Na 2-EDTA x 2 H 2O 5,5<br />
H3BO3 2,86<br />
MnCl2 x 4 H2O 1,81<br />
ZnSO 4<br />
0,222<br />
Na 2MoO 4 x 2 H 2O 0,318<br />
CuSO 4 x 5 H 2O 0,079<br />
Co(NO 3) 2 x 6 H 2O 0,0494<br />
Aqua bidest. ad 1000 ml<br />
2.2.2 LB(Luria Bertani)-Medium (SAMBROOK et al., 1989)<br />
Die Anzucht von Chromobacterium violaceum CV026 erfolgte im LB-Flüssigmedium<br />
(SAMBROOK et al., 1989). Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.6<br />
dargestellt. Vor dem Autoklavieren wurde der pH-Wert durch Zugabe von 1 M HCl<br />
bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius, PB-11). Durch Zugabe von 1,5% (w/v)<br />
Agar wurde LB-Festmedium hergestellt.<br />
14
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.6: Zusammensetzung des LB-Flüssigmediums (SAMBROOK et al., 1989)<br />
Komponenten g/l<br />
Tryptone 10,0<br />
Hefeextrakt 5,0<br />
NaCl 10,0<br />
Aqua bidest. ad 1000 ml<br />
2.2.2.1 LB(Luria Bertani)-Weichagar (SAMBROOK et al., 1989)<br />
In Tabelle 2.7 sind die Medienkomponenten des LB-Weichagars (SAMBROOK et al.,<br />
1989) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe<br />
Kap. 2.7.5.2) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält.<br />
Tab. 2.7: Zusammensetzung des LB-Weichagars (SAMBROOK et al., 1989)<br />
Komponenten g<br />
Agar 1,12<br />
Tryptone 1,0<br />
Hefeextrakt 0,5<br />
NaCl 1,0<br />
Aqua bidest. ad 100 ml<br />
2.2.3 Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI, <strong>Bremen</strong>)<br />
Die Anzucht von Vibrio sp. erfolgte im Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI,<br />
<strong>Bremen</strong>). Die Medienkomponenten wurden getrennt in Aqua bidest. angesetzt und<br />
anschließend autoklaviert. Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.8<br />
dargestellt.<br />
Tab. 2.8: Zusammensetzung des Leuchtbakterien-Mediums (Angaben lt. MPI, <strong>Bremen</strong>)<br />
Komponenten g/l<br />
CaCl 2 x 2 H 2O 1<br />
Glycerin 3<br />
Hefeextrakt 3<br />
KCI 0,5<br />
MgSO 4 x 7 H 2O 9<br />
NaCl 20<br />
Pepton 5<br />
Aqua bidest. 1000 ml<br />
15
2. Material und Methoden<br />
2.2.4 ABG-Medium (CHILTON et al., 1974)<br />
Die Anzucht der Agrobacterium tumefaciens-Stämme erfolgte im ABG-Medium<br />
(CHILTON et al., 1974). In Tabelle 2.9 ist die Zusammensetzung des ABG-Mediums,<br />
in den Tabellen 2.10 und 2.11 die der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers<br />
dargestellt. Vor dem Autoklavieren der 20x AB-Puffer-Stammlösung wurde der pH-<br />
Wert durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius<br />
PB-11). Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung wurden dem autoklavierten<br />
Aqua bidest. steril zugegeben. ABG-Festmedium wurde durch Zugabe von 1,5 %<br />
(w/v) Agar hergestellt.<br />
Tab. 2.9: Zusammensetzung des ABG-Mediums (CHILTON et al., 1974)<br />
Komponenten ml<br />
20x AB-Salze 50<br />
20x AB-Puffer 50<br />
Glucose (Stammlösung 20%) 10<br />
Aqua bidest. 890<br />
Tab. 2.10: Zusammensetzung der 20x AB-Salze-Stammlösung (CHILTON et al., 1974)<br />
Komponenten g/l<br />
NH 4Cl 20<br />
MgSO4 x 7 H2O 6<br />
KCl 3<br />
CaCl2 0,2<br />
FeSO 4 x 7 H 2O 0,05<br />
Aqua bidest. ad 1000 ml<br />
Tab. 2.11: Zusammensetzung der 20x AB-Puffer-Stammlösung (CHILTON et al., 1974)<br />
Komponenten g/l<br />
K2HPO4 60<br />
NaH2PO4 23<br />
Aqua bidest. ad 1000 ml<br />
16
2. Material und Methoden<br />
2.2.4.1 ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974)<br />
In Tabelle 2.12 sind die Medienkomponenten des ABG-Weichagars (CHILTON et al.,<br />
1974) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe<br />
Kap. 2.7.5.2) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält. Die<br />
Zusammensetzung der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers ist in Kapitel 2.2.4,<br />
Tabelle 2.10 und 2.11 dargestellt. Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung<br />
wurden der autoklavierten Agar-Aqua bidest.-Mischung steril zugegeben.<br />
Tab. 2.12: Zusammensetzung des ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974)<br />
Komponenten g oder ml<br />
Agar 1,12 g<br />
Aqua bidest. 89 ml<br />
20x AB-Salze 5 ml<br />
20x AB-Puffer 5 ml<br />
Glucose (Stammlsg. 20 %) 1 ml<br />
2.3 Pufferlösungen<br />
Für die Pufferung von Kulturmedien wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene<br />
Pufferlösungen (DAWSON et al. 1986) verwendet, deren Zusammensetzungen in<br />
der nachfolgenden Tabelle 2.13 zusammengefasst sind. Dabei wird jeweils die<br />
Pufferzusammensetzung für ein Endvolumen von 100 ml angegeben. Zur<br />
Herstellung der verschiedenen Pufferlösungen wurden die Komponenten abhängig<br />
von dem anzusetzenden pH-Wert in einem bestimmten Verhältnis miteinander<br />
gemischt und nachfolgend gegebenfalls mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt.<br />
17
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.13: Zusammensetzung verschiedener Pufferlösungen im Bereich von pH 2,0 - 11,0 (DAWSON et al., 1986)<br />
Pufferlösungen pH, 25 °C Komponenten (ml)<br />
Aqua bidest. (ml)<br />
Clark and Lubs-Pufferlösung<br />
Citronensäure-Natriumcitrat-<br />
Pufferlösungen<br />
Tris-Maleat-Pufferlösungen<br />
Clark and Lubs-Pufferlösungen<br />
Tris-Pufferlösungen<br />
Clark and Lubs-Pufferlösungen<br />
Glycin-NaOH-Pufferlösungen<br />
Phosphat-Pufferlösung<br />
a) pH-Wert bei 23 °C<br />
0,2 M Kaliumchlorid-Lösung 0,2 M HCI<br />
2,0 25,0 6,5 68,5<br />
0,1 M Citronensäure-Lösung 0,1 M tri-Natriumcitrat-Lösung<br />
3,0 82,0 18,0 --<br />
4,0 59,0 41,0 --<br />
5,0 35,0 65,0 --<br />
0,2 M Tris-Maleat-Lösung 0,2 M NaOH<br />
6,0 a)<br />
25,0 13,0 62,0<br />
7,0 a)<br />
25,0 24,0 51,0<br />
0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung 0,1 M NaOH<br />
6,0 50,0 5,6 44,4<br />
7,0 50,0 29,1 20,9<br />
0,1 M Tris-Lösung 0,1 M HCl<br />
7,1 50,0 45,7 4,3<br />
8,0 50,0 29,2 20,8<br />
8,5 50,0 14,7 35,3<br />
8,9 50,0 7,0 43,0<br />
0,1 M Kaliumchlorid/Borsäure-Lösung 0,1 M NaOH<br />
8,0 50,0 3,9 46,1<br />
8,5 50,0 10,1 39,9<br />
9,0 50,0 20,8 29,2<br />
9,5 50,0 34,6 15,4<br />
10,0 50,0 43,7 6,3<br />
0,2 M Glycin-Lösung 0,2 M NaOH<br />
9,0 25,0 4,4 70,6<br />
10,0 25,0 16,0 59,0<br />
0,05 M di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung 0,1 M NaOH<br />
11,0 50,0 4,1 45,9<br />
18
2. Material und Methoden<br />
2.4 Lagerung der Bakterienstämme<br />
Zur langfristigen Lagerung der heterotrophen Bakterien wurden Glycerinstocks<br />
angelegt. Die Bakterienstämme wurden hierzu im jeweiligen Medium angezogen und<br />
in sterilen Eppendorfreaktionsgefäßen (ERG) in Glycerin (Bakterienkultur und steriles<br />
87%iges Glycerin in 4:1 Volumenanteilen) bei -80 °C eingefroren. Für alle<br />
nachfolgenden Untersuchungen wurde mit einer Impföse oder einer<br />
Eppendorfpipette steril Bakterienmaterial entnommen und in das jeweilige<br />
Flüssigmedium überführt. Die Kontrolle der Reinheit erfolgte über die jeweiligen<br />
Agarplatten für das Bakterium mittels Drei-Ösen-Ausstrich und Inkubation bei 28 °C<br />
im Brutschrank (Heraeus Instruments, kelvitron ® t) unter aeroben Bedingungen für<br />
2 - 4 Tage.<br />
Parallel zu den Glycerinstocks wurden die heterotrophen Bakterienstämme auf den<br />
jeweiligen festen Nährmedien ausgestrichen und bei 28 °C für 4 - 5 Tage inkubiert.<br />
Anschließend wurden die Agarplatten im Kühlraum bei 4 °C gelagert und bildeten ein<br />
zusätzliches Bakterienmateriallager.<br />
2.5 Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme<br />
2.5.1 Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Die Anzucht der Vorkulturen erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 20 ml ASNIII/2-<br />
Medium (siehe Kap. 2.2.1) gefüllten 50 ml Erlenmeyerkolben. Vorkulturen wurden<br />
stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks angeimpft (siehe<br />
Kap. 2.4) und für 16 - 24 h bei 21 °C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei<br />
120 rpm unter aeroben Bedingungen inkubiert (= Übernachtkultur (ÜK)).<br />
Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens (siehe Kap. 2.6) als auch zur<br />
Untersuchung auf AHL-Moleküle (siehe Kap. 2.7.2.1) wurden die Vorkulturen mit<br />
einer O.D.600nm von 0,1 angesetzt, wobei diese aus einer Übernachtkultur (ÜK)<br />
inokuliert wurden. Die Bakterienstämme wurden, wenn nicht anders beschrieben, für<br />
12 - 16 h bei 21 °C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei 120 rpm unter<br />
aeroben Bedingungen im Dunkeln inkubiert.<br />
19
2. Material und Methoden<br />
2.5.2 Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo 53<br />
Die Hälterung der Flo 1-Kulturen erfolgte bei einer konstanten Temperatur von 21 °C<br />
im Brutraum mit einem konstanten Photonenfluss von 1 µE m -2 s -1 PAR<br />
(Photosynthetic Active Radiation). Die Kulturen wurden in einem Abstand von 4 - 5<br />
Wochen in frisches ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.1) überführt. Das Überimpfen<br />
erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 40 ml Kulturmedium gefüllten 100 ml<br />
Erlenmeyerkolben bzw. in mit 100 ml Kulturmedium gefüllten 250 ml<br />
Erlenmeyerkolben.<br />
Vor dem eigentlichen Versuch wurden Vorkulturen angesetzt, die an die jeweiligen<br />
Versuchsbedingungen für 3 - 4 Wochen adaptiert wurden.<br />
Die Voranzucht des Cyanobakteriums Stamm Bo 10 wurde von Dipl.-Biologin<br />
A. Hube, die des Cyanobakteriums Bo 53 von Dr. B. Heyduck-Söller durchgeführt.<br />
2.6 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33<br />
wurden Wachstumskurven mit ungepufferten Kulturmedien sowie bei verschiedenen<br />
pH-Werten generiert und das pH-Minimum, -Maximum und -Optimum der<br />
heterotrophen Bakterien ermittelt. Des Weiteren wurden die Kulturen bei einer<br />
Photonenflussdichte von 5 µE m -2 s -1 PAR (Photosynthetic Active Radiation) inkubiert<br />
und Wachstumskurven aufgenommen. Da die Hälterung der Cyanobakterien in der<br />
Stammsammlung der Abt. Marine Mikrobiologie bei einer konstanten Temperatur von<br />
21 °C erfolgt, wurde diese Temperatur auch zur Anzucht der Bakterienstämme<br />
Bo 10-09 und Bo 53-33 gewählt, um eine AHL-Produktion der ansonsten in<br />
Assoziation lebenden heterotrophen Bakterien bezüglich einer interspezifischen<br />
Kommunikation unter identischen Inkubationstemperaturen zu untersuchen.<br />
Die Wachstumsmessungen wurden in der vorliegenden Arbeit über O.D.-Messungen<br />
bei einer Wellenlänge von 600 nm mittels eines Spektralphotometers (biochrom Libra<br />
S12) durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte in Plastikküvetten gegen<br />
das jeweilige unbeimpfte Kulturmedium als Blindprobe. Für jeden Versuchsansatz<br />
wurde eine Doppelbestimmung (n = 2) durchgeführt mit anschließender Berechnung<br />
der Mittelwerte. Der Abbruch des Versuches erfolgte in der stationären Phase der<br />
Kulturen. Während und nach Beendigung der Wachstumsmessungen wurde der pH-<br />
Wert der Kulturüberstände kontrolliert (siehe Kap. 2.6.4).<br />
20
2. Material und Methoden<br />
2.6.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASNIII/2-<br />
Medium im Dunkeln<br />
Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden, wie in Kapitel<br />
2.5.1 beschrieben, im ASNIII/2-Medium inkubiert. Nach Ermittlung der O.D.600nm der<br />
Vorkultur wurden die ungepufferten Versuchskulturen mit einer Ausgangs-O.D.600nm<br />
von 0,1 inokuliert und bei 21 °C im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW<br />
21) bei 120 rpm im Doppelansatz inkubiert. Die Untersuchungen zum<br />
Wachstumsverhalten wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen<br />
durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im Abstand von 4 h (siehe<br />
Kap. 2.6).<br />
2.6.2 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-<br />
Werten im Dunkeln<br />
Zur Ermittlung des pH-Minimums, -Optimums und -Maximums der heterotrophen<br />
Testorganismen Stamm Bo 53-33 und Stamm Bo 10-09 wurde das Wachstum in<br />
gepuffertem ASNIII/2-Medium in Schritten von einer pH-Einheit im Bereich pH 2,0 -<br />
10,0 getestet. Eine Ausnahme bildete der pH-Wert von 8,5. Die für diese<br />
Versuchsreihe verwendeten Pufferlösungen sind in Tabelle 2.14 zusammengetragen<br />
und wurden in Vorversuchen ausgewählt (siehe Kap. 2.3). Die Komponenten des<br />
Grundmediums (siehe Kap. 2.2.1, Tab. 2.4) wurden dazu direkt dem jeweiligen<br />
Puffer zugesetzt und autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde ungelöst<br />
autoklaviert und dem autoklavierten Grundmedium zugegeben. Der pH-Wert wurde<br />
nach Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums kontrolliert und gegebenenfalls<br />
durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt<br />
(Sartorius PB-11). Mit steigendem pH-Wert der gepufferten Kulturmedien (pH-<br />
Bereich von 8,5 - 10,0) konnte eine zunehmende Trübung des Mediums durch<br />
Ausfall von Salzen (z.B. Mg 2+ - und Ca 2+ -Ionen) festgestellt werden.<br />
21
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.14: Verwendete Pufferlösungen im Bereich von pH 2 - 10 (siehe Kap. 2.3, Tab. 2.13) zur<br />
Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33<br />
Verwendete Pufferlösungen pH-Wert<br />
Clark and Lubs-Pufferlösung pH 2,0<br />
Citronensäure-Natriumcitrat-Pufferlösung pH 3,0 - 5,0<br />
Clark and Lubs-Pufferlösung pH 6,0<br />
Tris-Maleat-Pufferlösung pH 7,0<br />
Tris-HCl-Pufferlösung pH 8,0 und pH 8,5<br />
Glycin-NaOH-Pufferlösung pH 9,0 und pH 10,0<br />
Die gepufferten Versuchsansätze wurden aus einer Vorkultur (siehe Kap. 2.5.1) mit<br />
einer O.D.600nm von 0,1 inokuliert und anschließend, wie in Kapitel 2.6.1 beschrieben,<br />
inkubiert. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml Erlenmeyerkolben<br />
mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im<br />
Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6).<br />
2.6.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von<br />
5 µE m -2 s -1 PAR<br />
Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstum der heterotrophen<br />
Bakterien wurden ungepufferte Versuchsansätze und Versuchsansätze beim<br />
jeweiligen pH-Optimum des heterotrophen Bakteriums bei einem Photonenfluss von<br />
5 µE m -2 s -1 PAR auf einem Inkubationsschüttler (Heidolph UNIMAX 2010) kultiviert<br />
(siehe Kap. 2.6.1). Die Vorkulturen (siehe Kap. 2.5.1) wurden ebenfalls bei einem<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR auf dem gleichen Inkubationsschüttler<br />
angezogen. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml<br />
Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung<br />
erfolgte im Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6).<br />
2.6.4 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen<br />
Der pH-Wert der Versuchskulturen wurde parallel zu den photometrischen<br />
Messungen sowie nach Beendigung der Wachstumsversuche bestimmt. Hierzu<br />
wurden jeweils 200 µl Zellkultur aus den Parallelansätzen für 1 min bei 13.000 rpm<br />
zentrifugiert (Heraeus Instruments, Biofuge pico) und der pH-Wert des Überstandes<br />
mit einem pH-Streifen (Macherey-Nagel; pH 6,0 - 10,0) ermittelt. Die abschließende<br />
22
2. Material und Methoden<br />
pH-Bestimmung in den Kulturüberständen erfolgte nach Zentrifugation (Beckman,<br />
Avanti TM J-25 Centrifuge) der gesamten Zellkultur bei 13.000 rpm für 10 min mittels<br />
einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-Meter (Sartorius PB-11). Es wurde eine<br />
Doppelbestimmung (n = 2) mit anschließender Berechnung der Mittelwerte<br />
durchgeführt.<br />
2.7 Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen<br />
2.7.1 Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL-<br />
Signalmolekülen<br />
Die Detektion von AHL-Signalmolekülen erfolgte mit Hilfe der AHL-Sensorbakterien<br />
Chromobacterium violaceum CV026 bzw. Agrobacterium tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4). Diese Indikatorbakterien synthetisieren durch gentechnische<br />
Veränderungen keine AHL-Signalmoleküle, sind aber in der Lage diese<br />
nachzuweisen (siehe Kap. 2.7.1.1 und 2.7.1.2). Die Sensorbakterien werden<br />
nachfolgend näher beschrieben.<br />
2.7.1.1 Chromobacterium violaceum CV026 (MCCLEAN et al., 1997)<br />
In Abhängigkeit von der Zelldichte wird in C. violaceum die Produktion von Violacein<br />
reguliert. Dieses nicht-wasserlösliche, violette Pigment besitzt antimikrobielle<br />
Eigenschaften. Die Doppelmutante C. violaceum CV026 wurde durch miniTn5<br />
Transposonmutagenese generiert. Infolge der Insertion wurde die AHL-Produktion<br />
unterbrochen, gekoppelt mit einem Verlust der Pigmentierung. Der C. violaceum<br />
Wildtypstamm produziert N-hexanoyl-L-Homoserinlacton (C6-HSL) als einziges AHL-<br />
Signalmolekül, demzufolge der Stamm C. violaceum CV026 besonders sensitiv auf<br />
dieses Signalmolekül mit Violaceinproduktion reagiert. Der Sensorstamm eignet sich<br />
besonders für den Nachweis von kurzkettigen, unsubstituierten AHL-Signalmolekülen<br />
(vor allem C6-HSL) als Biosensor, wird hingegen von längerkettigen N-Acyl-L-<br />
Homoserinlactonen (Acyl-Seitenketten länger als C8) sowie von N-Acyl-HSLs mit<br />
3-Hydroxy-Substitution nicht zur Violaceinproduktion angeregt (STEINDLER und<br />
VENTURI, 2007). AHL-Signalmoleküle mit einer C8-, C10-, C12- und C14-Seitenkette<br />
sind jedoch fähig, bei vorheriger Zugabe von C6-HSL oder 3-oxo-C6-HSL in<br />
angemessener Konzentration, die Pigmentierung der Mutante zu inhibieren.<br />
23
2. Material und Methoden<br />
Hierdurch kann mit diesem AHL-Biosensor ebenfalls ein Nachweis längerkettiger<br />
AHLs erzielt werden.<br />
2.7.1.2 Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) (FARRAND et al., 2002;<br />
SZENTHE und PAGE, 2003)<br />
Der Wildtypstamm von A. tumefaciens ist ein pflanzenpathogenes Bakterium,<br />
welches in seinen Wirtspflanzen Wurzeltumorwachstum induziert. Der Prozess der<br />
Tumorbildung wird durch die Übertragung der T-DNA (oncogenic DNA) und ihrer<br />
Integration in das Pflanzenchromosom verursacht. Die T-DNA ist ein kleiner<br />
Abschnitt des Ti-Plasmids in A. tumefaciens. Auf dem Ti-Plasmid sind weitere Gene,<br />
z.B. für den Transfer der T-DNA in die Wirtspflanze (vir-Gene) und den konjugativen<br />
Transfer des Ti-Plasmids zwischen Stämmen von A. tumefaciens (tra-Gene),<br />
lokalisiert. Die für einen konjugativen Transfer des Ti-Plamids nötigen Gene sind<br />
dabei in einer Regulationseinheit (tra-Regulon) zusammengefasst. Bei<br />
A. tumefaciens wird dieser Transfer über „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ gesteuert, wobei die<br />
LuxI/LuxR-homologen Proteine TraI und TraR des A. tumefaciens-QS-Systems die<br />
Zelldichte-abhängige Expression des tra-Regulons (tra-Operon, trb-Operon, traM)<br />
regulieren. TraI ist eine Autoinducer-Synthase und synthetisiert das AHL-<br />
Signalmolekül 3-oxo-C8-HSL. Das Protein TraR stellt den entsprechenden<br />
Transkriptionsaktivator dar. Bei hoher Zelldichte und ebenfalls hoher intrazellulärer<br />
N-Acyl-HSL-Konzentration bindet TraR das HSL-Molekül und aktiviert sowohl die<br />
Transkription der tra-Gene als auch die Expression des traI-Gens, letzteres<br />
resultierend in einer positiven Feedback-Schleife.<br />
Der AHL-Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) besitzt kein Ti-Plasmid, aber<br />
ein rekombinantes Plasmid (pZLR4). Dieses enthält Inserts von dem Plasmid pTIC58<br />
mit traR und einem tra-Operon, welches eine traG::lacZ-Fusion aufweist. Neben<br />
diesen Genen sind die Gene für Gentamycin- und Carbenicillin-Resistenz auf dem<br />
Vektor kodiert, wobei Gentamycin das bestgeeignete Antibiotikum zur Selektion<br />
darstellt. Der Stamm ist eine AHL-Synthase-Mutante und somit nicht in der Lage,<br />
eigene AHL-Moleküle zu synthetisieren. Folglich reagiert der Stamm aufgrund der<br />
traG::lacZ-Fusion erst bei Anwesenheit geeigneter exogener AHL-Moleküle über die<br />
Aktivierung des TraR-Proteins mit der Expression der lacZ-kodierten<br />
β-Galaktosidase. TraR aktiviert dabei die Transkription des traG-Gens, welches<br />
jedoch durch die Insertion des lacZ-Gens nicht exprimiert wird. Dementsprechend<br />
24
2. Material und Methoden<br />
kann die Anwesenheit entsprechender AHL-Moleküle (bei ausreichender<br />
Konzentration) über die β-Galaktosidase-Aktivität durch Umsetzung des Substrates<br />
X-Gal zu einem hellblauen Farbstoff nachgewiesen werden.<br />
Der A. tumefaciens-Sensorstamm detektiert ein breites Spektrum an AHL-<br />
Signalmolekülen und weist unter den bisweilen konstruierten Biosensoren gegenüber<br />
diesen Komponenten zudem mitunter die höchste Sensitivität auf (STEINDLER und<br />
VENTURI, 2007). Entsprechend des eigenen QS-Systems zeigt der Indikatorstamm<br />
eine höhere Sensitivität gegenüber 3-oxo-substituierten AHL-Signalmolekülen mit<br />
C4- bis C12-Seitenketten, vor allem gegenüber 3-oxo-C8-HSL. Weiter eignet sich der<br />
Sensorstamm, mit Ausnahme von C4-HSL, zum Nachweis unsubstituierter AHL-<br />
Moleküle sowie von 3-hydroxy-Derivaten mit C6-, C8- und C10-Seitenketten<br />
(STEINDLER und VENTURI, 2007).<br />
Weitere A. tumefaciens-Stämme, welche in der vorliegenden Arbeit Verwendung<br />
fanden, waren der A. tumefaciens-Stamm NTL4 und NT1 (pTIC58∆accR). Stamm<br />
NTL4 fehlt ein Ti-Plasmid und ist demzufolge nicht fähig, AHL-Moleküle zu<br />
synthetisieren. Neben dieser AHL-Negativkontrolle wurde der Stamm<br />
NT1 (pTIC58∆accR) als AHL-Positivkontrolle eingesetzt, da dieser aufgrund eines<br />
veränderten Ti-Plasmids (tra c ) konstitutiv die tra-Gene exprimiert und folglich auch<br />
konstitutiv N-Acyl-HSLs synthetisiert.<br />
2.7.2 Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen<br />
zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen<br />
2.7.2.1 Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den<br />
heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Zur Untersuchung der AHL-Produktion in Abhängigkeit von verschiedenen<br />
Parametern variierten die Kultivierungsbedingungen für die Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09. Für die Extraktion von AHL-Molekülen (siehe Kap. 2.7.3) wurden die<br />
Bakterienstämme in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 250 ml Endvolumen angezogen.<br />
Die Inokulation und Anzucht der jeweiligen Versuchsansätze wurden in den<br />
jeweiligen unten genannten Kapiteln zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens<br />
der heterotrophen Bakterienstämme beschrieben.<br />
Zur Ermittlung des pH-Wert-Einflusses auf die AHL-Produktion wurden die AHL-<br />
Gehalte bei dem jeweiligen pH-Minimum, pH-Optimum und pH-Maximum der<br />
25
2. Material und Methoden<br />
heterotrophen Bakterien im Dunkeln bei 21 °C verglichen (siehe Kap. 2.6.2). Des<br />
Weiteren wurden ungepufferte Versuchsansätze im Dunkeln (siehe Kap. 2.6.1) und<br />
bei einer Photonenflussdichte von 5 µE m -2 s -1 PAR (siehe Kap. 2.6.3) bei 21 °C<br />
kultiviert und auf Signalmoleküle untersucht. Die Produktion von AHL-<br />
Signalmolekülen wurde in der stationären Wachstumsphase, für die ungepufferten<br />
und pH-optimalen Ansätze zudem in der logarithmischen Wachstumsphase<br />
untersucht. Die generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2 und 3.3) dienten der<br />
Anzucht als Referenz. Zur Überprüfung einer Korrelation des Zellwachstums<br />
zwischen 250 ml und 25 ml Versuchsansätzen, wurde das Wachstum der Kulturen<br />
stichprobenartig durch photometrische Messungen der O.D.600nm kontrolliert. Ferner<br />
war die AHL-Produktion in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur und von der<br />
Kohlenstoffquelle von Interesse. Hierzu wurden Versuchsansätze mit ungepuffertem<br />
ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.1) bei 28 °C im Dunkeln und zur Untersuchung des<br />
Einflusses der Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion im ASNIII/2-Medium mit 0,1%<br />
Fleischextrakt bei 21 °C im Dunkeln kultiviert. Die Inokulation und Anzucht der<br />
Versuchskulturen erfolgte wie in Kapitel 2.6.1 beschrieben, wobei die Vorkulturen für<br />
die 28 °C Inkubation (Temperaturversuch) bei gleicher Temperatur angezogen<br />
wurden. Die jeweilige Inkubationsdauer der Versuchskulturen ist im Anhang als<br />
Tabelle 7.1 hinterlegt.<br />
2.7.2.2 Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit<br />
dem Cyanobakterium Stamm Flo 1<br />
Zur Untersuchung der AHL-Produktion durch Stamm Flo 1 wurden Versuchsansätze<br />
mit ungepuffertem Kulturmedium (siehe Kap. 2.2.1) sowie gepufferten Kulturmedien<br />
(pH 7,0, 8,0, 8,5 und 9,0) bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einem<br />
konstanten Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR für 14 Tage (logarithmische Phase)<br />
bzw. 21 Tage (stationäre Phase) kultiviert. Die Inkubationsdauer wurde auf<br />
Grundlage der von SCHRÜBBERS (2007) erzielten Ergebnisse gewählt. Die<br />
eingesetzten Vorkulturen wurden 3 - 4 Wochen an die Wachstumsbedingungen<br />
adaptiert (siehe Kap. 2.5.2) und anschließend bei 8.000 rpm für 10 min zentrifugiert<br />
(Beckman, Avanti TM J-25 Centrifuge). Der Kulturüberstand wurde verworfen, die<br />
cyanobakterielle Biomasse vereinigt und homogenisiert. Mit Hilfe einer<br />
Analysenwaage (Sartorius, MC 1 Research RC 210P) wurden jeweils 1000 mg<br />
Homogenat in sterile ERG eingewogen und als Inokulum für die 250 ml AHL-<br />
26
2. Material und Methoden<br />
Versuchsansätze eingesetzt. Die Weiterbehandlung der Ansätze nach Beendigung<br />
der Anzucht ist in Kapitel 2.7.3 beschrieben.<br />
Für die Versuchsreihe wurden für pH 7,0 und 8,0 Tris-HCl-Pufferlösungen, für pH 8,5<br />
und 9,0 Clark and Lubs-Pufferlösungen verwendet (siehe Kap. 2.3). Das Ansetzen<br />
der gepufferten Kulturmedien erfolgte wie in Kapitel 2.6.2 beschrieben. Nach<br />
Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums wurde der pH-Wert kontrolliert und<br />
gegebenenfalls durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen pH-<br />
Wert eingestellt (Sartorius PB-11).<br />
2.7.3 Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums<br />
Stamm Flo 1<br />
2.7.3.1 Herstellung zellfreier Kulturüberstände<br />
Nach erfolgter Inkubation der 250 ml Zellkulturen der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33 (siehe Kap. 2.7.2.1) sowie des<br />
Cyanobakteriums Stamm Flo 1 (siehe Kap. 2.7.2.2) wurden diese bei 10.000 xg für<br />
30 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert (Beckman, Avanti TM J-25 Centrifuge)<br />
und der Zellkulturüberstand anschließend sterilfiltriert (sterilfiltriert; 0,2 µm<br />
Porengröße). Die bakterielle Biomasse wurde entweder bei -20 °C gelagert oder<br />
sofort für intrazelluläre AHL-Untersuchungen weiterverwendet (siehe Kap. 2.7.3.4).<br />
2.7.3.2 Azidifizierung von Kulturüberständen (YATES et al., 2002)<br />
Eine Azidifizierung von ungepufferten Kulturüberständen der heterotrophen Stämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des cyanobakteriellen Stammes Flo 1 wurde nach<br />
YATES und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Nach Gewinnung von zellfreien<br />
Überständen (siehe Kap. 2.7.3.1) wurden diese mit konzentrierter HCl auf einen pH-<br />
Wert < 2 eingestellt und anschließend für 24 h bei 21 °C inkubiert. Die<br />
Weiterbehandlung erfolgte wie in Kapitel 2.7.3.3 beschrieben.<br />
27
2. Material und Methoden<br />
2.7.3.3 Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen<br />
(GEISENBERGER, 2000)<br />
Die Extraktion von AHL-Signalmolekülen der heterotrophen Bakterienstämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 erfolgte aus<br />
250 ml Zellkulturüberstand nach GEISENBERGER (2000). Hierzu wurde zellfreier<br />
Kulturüberstand (siehe Kap. 2.7.3.1) in einen 1000 ml Scheidetrichter vorgelegt,<br />
zweimal mit 100 ml Dichlormethan versetzt und für 10 min durch kräftiges Schütteln<br />
gemischt. Ein ausreichender Druckausgleich wurde durch zwischenzeitliche<br />
Belüftung des Scheidetrichters gewährleistet. Nach deutlicher Phasentrennung<br />
wurde die untere Dichlormethan-Phase in einem 250 ml Erlenmeyerkolben<br />
aufgefangen. Restliches Wasser in den vereinigten Dichlormethanextrakten wurde<br />
vollständig durch Zugabe von wasserfreien Natriumsulfat und anschließendem<br />
Rühren entfernt. Nachfolgend wurden die Extrakte gefiltert (Sartorius 3 hw) und im<br />
Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei einer Wasserbadtemperatur von<br />
40 - 42 °C ohne Anlegen eines Vakuums eingetrocknet. Alternativ wurden die<br />
gefilterten Extrakte unter dem Abzug offen stehen gelassen, wodurch diese<br />
eindampften. Die Aufnahme des Rückstandes erfolgte in 250 µl Ethylacetat (versetzt<br />
mit 0,01% (v/v) Essigsäure). Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20 °C.<br />
Vibrio sp. wurde für einen positiven Extraktionsnachweis bzw. als positive AHL-<br />
Kontrolle im Leuchtbakterien-Medium (siehe Kap. 2.2.3) bei 4 °C im Dunkeln<br />
angezogen, wobei Bakterienmaterial aus einer 24 h-Übernachtkultur (ÜK) als<br />
Inokulum verwendet wurde. Die ÜK wurde mit Bakterienmaterial aus den angelegten<br />
Glycerinstocks angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Kultivierung wurde nach Auftreten<br />
deutlicher Lumineszenz abgebrochen.<br />
2.7.3.4 Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen<br />
Für den Nachweis von intrazellulären AHL-Signalmolekülen wurde die AHL-<br />
Extraktion aus Bakterienzellen nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in abgeänderter<br />
Form durchgeführt. Nach Zentrifugation einer 250 ml Zellkultur (siehe Kap. 2.7.3.1)<br />
wurde das Zellpellet vollständig vom Überstand befreit und die gesamte bakterielle<br />
Biomasse in 40 ml 4 °C kaltem Ethanol resuspendiert und anschließend für 72 h bei<br />
4 °C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde die Zellsuspension für 5 min bei<br />
8.000 rpm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, 30 ml der organischen Phase<br />
ohne Aufnahme von Zellsediment entnommen und diese in einem<br />
28
2. Material und Methoden<br />
Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei RT mit Anlegen eines Vakuums<br />
eingetrocknet. Der Rückstand wurde in 1 - 1,5 ml 10 mM Ammoniumacetat (pH 6,5)<br />
aufgenommen, erneut mit Hilfe des Rotationsevaporators auf ein Endvolumen von<br />
250 µl eingeengt und anschließend bei -20 °C gelagert.<br />
2.7.4 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signal-<br />
molekülen<br />
Die Dünnschichtchromatographie ist eine chromatographisches Trennmethode, bei<br />
der ein Lösungsmittel oder eine Lösung eines Substanzgemisches (mobile Phase)<br />
über ein Sorptionsmittel (stationäre Phase), meistens Silicagel (Kieselgel), geleitet<br />
wird (LOTTSPEICH und ZORBAS, 1998). Bei dieser Adsorptionschromatographie<br />
befindet sich letzteres als dünne Schicht auf einem Träger. Die in der mobilen Phase<br />
gelösten Substanzen haben unterschiedliche Affinität zur mobilen bzw. stationären<br />
Phase, resultierend in unterschiedlichen Laufstrecken der einzelnen gelösten<br />
Substanzen. Bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Umkehrphasen-<br />
Chromatographie (reversed phases chromatography) kommt es durch eine unpolare,<br />
chemisch modifizierte stationäre Phase (Kieselgel lipophilisiert mit unpolaren C18-<br />
Alkylresten) zu einer verbesserten Auftrennung hydrophober Substanzen in einem<br />
stark polaren Laufmittelgemisch (mobile Phase), da unpolare Substanzen stärker<br />
zurückgehalten werden (STADLBAUER, 2006).<br />
Die Auftrennung der N-Acyl-L-Homoserinlacton-Extrakte wurde mit Umkehrphasen-<br />
Dünnschichtchromatographie-Platten (RP-18 W/UV F254s, 20x20 cm, Macherey-<br />
Nagel, Düren, Deutschland) nach Geisenberger (2000) mit geringfügiger Modifikation<br />
durchgeführt. Die Ethylacetat- und Ammoniumacetatlösungen (siehe Kap. 2.7.3.3<br />
und 2.7.3.4) wurden entlang einer Auftragslinie in einem Abstand von 2,0 cm auf die<br />
DC-Platte aufgetragen. Der Abstand vom unteren Rand und von den beiden<br />
Seitenrändern der DC-Platten betrug dabei 2,0 cm. Das Probenvolumen der<br />
Ethylacetat- bzw. Ammoniumacetatlösungen variierte in Abhängigkeit von dem<br />
Testorganismus und dem verwendeten Biosensor zwischen 2,0 µl und 100 µl, wobei<br />
die Proben parallel zur Auftragung mit einem kalten Luftstrom eingetrocknet wurden.<br />
Für die dünnschichtchromatographische Auftrennung der Extrakte wurden 110 ml<br />
Laufmittelmischung aus Methanol und Aqua bidest (60:40 (v/v)) verwendet (ca.<br />
0,7 cm Höhe) und die Seitenwände der DC-Kammer anschließend mit Filterpapier<br />
(Sartorius 3 hw) ausgekleidet. Die DC-Platten wurden bei vollständiger Sättigung der<br />
29
2. Material und Methoden<br />
Kammer (24 h) in diese gestellt. Nach ca. vierstündigem Lauf lag die<br />
Lösungsmittelfront ca. 2 cm unterhalb des oberen DC-Plattenrandes, und die DC-<br />
Platten wurden aus der Kammer genommen. Nach Markierung der exakten Höhe der<br />
Lösungsmittelfront erfolgte die Trocknung der DC-Platten mit kalter Luft eines Föns<br />
für 1 h unter dem Abzug. Die DC-Platten konnten, eingewickelt in Frischhaltefolie,<br />
zur Aufbewahrung bei -20 °C gelagert werden.<br />
2.7.5 Visualisierung der DC-Signale<br />
2.7.5.1 Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme<br />
Vorkulturen wurden stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks<br />
angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Voranzucht erfolgte in 50 ml, die Anzucht der<br />
Versuchskulturen in 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Inkubationsschüttler (New<br />
Brunswick Scientific innova TM 4000 Incubator Shaker).<br />
Eine A. tumefaciens-Vorkultur wurde als Übernachtkultur (ÜK) in 5 ml ABG-Medium<br />
(siehe Kap. 2.2.4) bei 28 °C und 200 rpm angezogen. Als ÜK wurden Kulturen<br />
definiert, welche 16 - 24 h inkubiert wurden. Die Vorkultur wurde anschließend mit<br />
45 ml Kulturmedium versetzt und unter gleichbleibenden Bedingungen bis in die<br />
spät-exponentielle Phase angezogen. Alternativ konnten 50 ml Kulturmedium mit<br />
1 ml Vorkultur inokuliert werden. Die Anzucht erfolgte bei 28 °C und 200 rpm für<br />
24 h. C. violaceum wurde zur Voranzucht als Übernachtkultur (ÜK) bei 30 °C und<br />
120 rpm in 5 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.2) angezogen. Anschließend wurden<br />
50 ml LB-Medium mit 1 ml Vorkultur angeimpft und bei 30 °C und 120 rpm für 24 h<br />
inkubiert.<br />
Die Vorkulturen der verwendeten bakteriellen Biosensoren wurden unter<br />
Selektionsdruck durch Zugabe verschiedener Antibiotika kultiviert. Hierzu wurde das<br />
LB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin, das ABG-Medium mit 30 µg/ml Gentamycin<br />
und 100 µg/ml Carbenicillin versetzt.<br />
Die Anzucht der weiteren A. tumefaciens-Stämme NTL4 und NT1 (pTIC58∆accR)<br />
erfolgte ebenfalls als ÜK in 5 ml ABG-Medium bei 28 °C und 200 rpm.<br />
30
2. Material und Methoden<br />
2.7.5.2 Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien<br />
Zur Detektion der AHL-Signalmoleküle auf der DC-Platte wurde diese mit 150 ml<br />
Indikatorbakterienkultur in Weichagar überschichtet. Hierzu wurden die DC-Platten in<br />
einen Kunststoffrahmen, ausgekleidet mit Klarschichtfolie, eingesetzt. 50 ml<br />
Biosensorkultur A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) bzw. C. violaceum CV026 wurden mit<br />
100 ml ABG-Weichagar (siehe Kap. 2.2.4.1) bzw. LB-Weichagar (siehe Kap. 2.2.2.1)<br />
bei einer Temperatur von ca. 42 °C versetzt und ohne Erzeugung von Luftblasen<br />
gemischt. Vor Zugabe der A. tumefaciens-Kultur wurden dem ABG-Weichagar bei<br />
einer Temperatur < 50 °C 90 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-<br />
Galactopyranosid) zugesetzt, resultierend in einer Endkonzentration von 60 µg/ml.<br />
Das X-Gal wurde als Stammlösung in N,N-Dimethylformamid (20 mg/ml) angesetzt<br />
und bei - 20 °C gelagert. Nach Überschichtung der DC-Platten und Verfestigung des<br />
Agars wurden die DC-Platten in einer luftdichten Kammer, ausgekleidet mit feuchtem<br />
Küchenpapier, bei 28 °C (Heraeus Instruments, kelvitron ® t) für 48 h inkubiert.<br />
Durch Auftragung der AHL-Extrakte auf überschichtete Festagarplatten ohne den<br />
jeweiligen Biosensor, wie in Kapitel 2.7.7.2 beschrieben, wurden Negativkontrollen<br />
durchgeführt. Eine Extraktion des unbeimpften Kulturmediums (siehe Kap. 2.7.3.3)<br />
und anschließender Auftragung auf A. tumefaciens-Indikatorplatten (siehe<br />
Kap. 2.7.7.2) diente als weitere Negativkontrolle.<br />
2.7.6 Auswertung und Dokumentation der DC-Platten<br />
Die Auswertung der überschichteten DC-Platten wurde nach einer Bebrütung bei<br />
28 °C für 48 h durchgeführt. Aufgetrennte AHL-Moleküle konnten je nach<br />
verwendetem Biosensor anhand violetter Spots bei C. violaceum CV026 bzw.<br />
hellblauer Spots durch die β-Galaktosidase-Aktiviät von A. tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4) lokalisiert und identifiziert werden. Die Intensität und Größe der DC-Signale<br />
konnte bei längerer Inkubationszeit leicht zunehmen. Durch einen Größenvergleich<br />
der Flecken konnten halbquantitative Aussagen gemacht werden.<br />
Als Referenz wurden synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL),<br />
gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v) Essigsäure), auf die DC-Platten<br />
aufgetragen. Die DC-Spots wurden mit den synthetischen Referenzmolekülen<br />
(Standards) verglichen und somit eine Eingrenzung an potentiellen AHLs bzw. eine<br />
Identifizierung von AHLs erreicht. Die Referenzmoleküle dienten des Weiteren dazu,<br />
die Nachweisgrenzen des jeweiligen Sensorsystems einzuschätzen. Die Auftragung<br />
31
2. Material und Methoden<br />
der synthetischen AHLs wurde so bemessen, dass in etwa vergleichbare<br />
Signalintensitäten erhalten werden sollten. Die aufgetragenen AHL-Mengen für die<br />
verschiedenen Biosensoren sind in Tabelle 2.15 dargestellt und wurden durch<br />
Agarplattentests (siehe Kap. 2.7.7.3 und 3.4.1) und dünnschichtchromatographische<br />
Voruntersuchungen ermittelt.<br />
Tab. 2.15: Eingesetzte Stoffmengen der synthetischen AHL-Moleküle zum dünnschichtchromatographischen<br />
Nachweis unter Verwendung der Biosensoren A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) und<br />
C. violaceum CV026<br />
AHL-Molekül A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) C. violaceum CV026<br />
eingesetzte Stoffmenge (in mol) eingesetzte Stoffmenge (in mol)<br />
C4-HSL 1,5 x 10 -9 bis 2 x 10 -9<br />
C6-HSL 1,5 x 10 -9<br />
C8-HSL 2,5 x 10 -10<br />
1 x 10 -8<br />
1 x 10 -9<br />
3 x 10 -9<br />
Aufgrund einer begrenzten Anzahl zur Verfügung stehender Referenzmoleküle<br />
wurden zudem die Rf-Werte (retention factor) der DC-Signale bestimmt. Ein Abgleich<br />
der Rf-Werte der DC-Signale mit Literaturwerten zur Identifizierung der AHL-<br />
Signalmoleküle konnte jedoch nicht durchgeführt werden, da die ermittelten Rf-Werte<br />
der Referenzmoleküle nicht mit den bekannten Rf-Werten (SHAW et al., 1997)<br />
übereinstimmten Der Rf-Wert errechnet sich als Quotient aus Laufstrecke der<br />
Substanz zur Laufstrecke des Laufmittels vom Startpunkt aus (LOTTSPEICH und<br />
ZORBAS, 1998).<br />
Für die Dokumentation erfolgten alle Aufnahmen von DC-Platten in der vorliegenden<br />
Arbeit mittels Digitalkamera.<br />
2.7.7 Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHL-<br />
produzierender Bakterien<br />
Zum schnellen Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurden verschiedene<br />
Screeningverfahren in einer Voruntersuchung getestet (siehe Kap. 2.7.7.1 und<br />
2.7.7.2), wobei ein Nachweis über die Biosensoren Agrobacterium tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4) und Chromobacterium violaceum CV026 (siehe Kap. 2.7.1) erfolgen sollte.<br />
Des Weiteren wurde ein Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)<br />
durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.3). Alle Aufnahmen von Agarplatten in der<br />
vorliegenden Arbeit erfolgten mittels Digitalkamera.<br />
32
2. Material und Methoden<br />
2.7.7.1 Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001)<br />
Zur Detektion von AHL-produzierenden Bakterien wurde ein Agarplattentest nach<br />
RAVN und Mitarbeitern (2001) durchgeführt. Anstelle von LB-Agarplatten (siehe Kap.<br />
2.2.2) wurden ASNIII/2-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.1) verwendet, da die zu testenden<br />
Bakterienstämme aufgrund zu geringer Salinität des LB-Mediums nicht auf diesem<br />
Agarmedium wuchsen. Für einen Nachweis mit dem Indikatorstamm A. tumefaciens<br />
NTL4 (pZLR4) wurde das Festmedium zusätzlich nach dem Autoklavieren bei einer<br />
Temperatur < 50 °C mit 50 µg/ml X-Gal versetzt. 50 µl einer 24 h-Übernachtkultur<br />
des auf AHL zu testenden Bakterienstammes (siehe Kap. 2.5.1) wurden auf einer<br />
Agarplatte mit einer Impföse als Bakterienstreifen ausplattiert. In einem geringen<br />
Abstand zum Testorganismus wurden anschließend parallel 50 µl des jeweiligen<br />
Sensorstammes aus einer ÜK (siehe Kap. 2.7.5.1) auf der Agarplatte ausgestrichen.<br />
Das jeweilige Sensorbakterium wurde als Negativkontrolle eingesetzt, wobei bei<br />
Verwendung des Sensorstammes A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) zudem der<br />
Ti-plasmidlose Stamm A. tumefaciens NTL4 als Negativkontrolle verwendet werden<br />
konnte. Zur Untersuchung einer Temperatur-abhängigen Produktion von AHL-<br />
Signalmolekülen erfolgte die Inkubation bei 21 °C (Brutraum), 28 °C und 37 °C<br />
(Heraeus Instruments, kelvitron ® t) für 24 h. Ein AHL-Nachweis wurde durch eine<br />
violette Pigmentierung der Mutante C. violaceum CV026 bzw. einer Blaufärbung des<br />
Indikatorstammes A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) erbracht. Eine Bewertung der AHL-<br />
Produktion wurde über die Intensität der Färbung vorgenommen.<br />
2.7.7.2 Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002)<br />
Zum weiteren Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurde ein Screeningtest<br />
nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Zur Herstellung der<br />
verwendeten A. tumefaciens-Indikatorplatten wurden ABG-Agarplatten (siehe<br />
Kap. 2.2.4) mit jeweils 4 - 5 ml ABG-Weichagar (siehe Kap. 2.2.4.1) überschichtet,<br />
welcher zuvor mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) versetzt worden war. Die Anzucht<br />
des Sensorstammes erfolgte wie in Kapitel 2.7.5.1, das Versetzen der Kultur mit dem<br />
Weichagar wie in Kapitel 2.7.5.2 beschrieben. Die Fest- und Weichagar enthielten<br />
zusätzlich 50 µg/ml X-Gal, welches nach dem Autoklavieren bei einer Temperatur<br />
< 50 °C hinzugesetzt wurde. Nach Verfestigung des Weichagars wurden 30 µl einer<br />
24 h-Übernachtkultur des zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstammes<br />
(siehe Kap. 2.5.1) oder 30 µl Kulturüberstand einer ungepufferten 14 Tage bzw.<br />
33
2. Material und Methoden<br />
21 Tage alten Geitlerinema Flo 1-Kultur (siehe Kap. 2.7.2.2) auf die A. tumefaciens-<br />
Indikatorplatte aufgetragen. Eine ÜK des AHL-produzierenden Stammes<br />
A. tumefaciens NT1 (pTiC58∆accR) (siehe Kap. 2.7.5.1) wurde mit gleichem<br />
Auftragungsvolumen als Positivkontrolle eingesetzt. Überschichtete Agarplatten ohne<br />
Biosensor, auf denen die Proben aufgetragen wurden, dienten als Negativkontrollen.<br />
Zusätzliche Negativkontrollen mit A. tumefaciens-Indikatorplatten und unbeimpftem<br />
Kulturmedium als Probe sollten eine Aktivierung des AHL-Reporters durch im<br />
Medium enthaltene Komponenten ausschließen. Die Bebrütung der Indikatorplatten<br />
und Negativkontrollen erfolgte bei 28 °C (Heraeus Instruments, kelvitron ® t) für 24 h.<br />
Bei der Auswertung der Indikatorplatten wurde eine diffuse blaue Zone im Bereich<br />
der Auftragung als Nachweis einer AHL-Produktion gewertet.<br />
2.7.7.3 Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis<br />
von AHL-Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)<br />
Zum Nachweis von kurzkettigen AHLs mit dem Sensorbakterium C. violaceum<br />
CV026 wurde der Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)<br />
durchgeführt. Als Kontrolle wurden synthetische AHL-Moleküle eingesetzt, wobei die<br />
Sensitivitäten (Nachweisgrenzen) sowie Spezifitäten von Stamm C. violaceum<br />
CV026 gegenüber bestimmten AHL-Molekülen untersucht wurden.<br />
Zur Herstellung von C. violaceum-Indikatorplatten wurden LB-Agarplatten (siehe<br />
Kap. 2.2.2) mit jeweils 4 - 5 ml LB-Weichagar (siehe Kap. 2.2.2.1) überschichtet,<br />
versetzt mit C. violaceum CV026. Die Anzucht des Indikatorbakteriums erfolgte wie<br />
in Kapitel 2.7.5.1, das Versetzen der C. violaceum CV026-Kultur mit dem Weichagar<br />
wie in Kapitel 2.7.5.2 beschrieben. Nach Verfestigung des Weichagars wurden in<br />
einem Abstand von ca. 2 cm steril Löcher (Ø 6 mm) in den Agar gestanzt.<br />
In die Löcher wurden 5 x 10 -9 mol und 5 x 10 -8 mol synthetische AHL-Moleküle<br />
(C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL), gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v)<br />
Essigsäure), bzw. je 10 µl AHL-Extrakt (siehe Kap. 2.7.3.3) pipettiert und mit<br />
LB-Medium (siehe Kap. 2.2.2) auf ein Endvolumen von 50 µl aufgefüllt. Als<br />
Negativkontrolle wurden 10 µl Ethylacetat mit 40 µl LB-Medium versetzt und<br />
eingesetzt. Die Agarplatten wurden 48 h bei 30 °C im Brutschrank (Heraeus<br />
Instruments, kelvitron ® t) inkubiert. Eine violette Pigmentierung des bakteriellen<br />
Teppichs um die Auftragungspunkte wurde als ein Nachweis für intakte AHL-<br />
34
2. Material und Methoden<br />
Moleküle gewertet, wobei sich die AHL-Konzentration in der Spotgröße<br />
widerspiegelte.<br />
2.8 Molekularbiologische Untersuchungen<br />
In der vorliegenden Arbeit wurden des Weiteren die Cyanobakterienstämme Bo 53<br />
und Bo 10 molekularbiologisch untersucht. Bei beiden Mikroorganismen wurden die<br />
16S-rDNA und als weitere Möglichkeit zur Einordnung auf molekularer Ebene das<br />
Gen gyrB mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Zudem erfolgte die<br />
Amplifikation der ITS (internal transcribed spacer) von Stamm Bo 10. Diese nicht-<br />
kodierenden intergenischen Regionen sind zwischen den 16S-rRNA-, 23S-rRNA-<br />
und 5S-rRNA-Genen lokalisiert. Die Anzahl und Größe der amplifizierten ITS-<br />
Regionen stellen einen zusätzlichen taxonomischen Marker zur phylogenetischen<br />
Einordnung von Mikroorganismen dar (ITEMAN et al., 2002).<br />
Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33 (HUBE, 2008) sowie<br />
für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 (SCHRÜBBERS, 2007) wurden in diesem<br />
Zusammenhang von den genannten Autoren bereits 16S-rDNA-Sequenzierungen mit<br />
anschließender phylogenetischer Einordnung durchgeführt. Ergänzend sollte in der<br />
vorliegenden Arbeit eine Amplifikation der ITS von Stamm Flo 1 sowie eine<br />
Amplifikation und Sequenzierung des gyrB-Gens der Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 durchgeführt werden.<br />
Auf Basis der erstellten Sequenzen sollten über die Erstellung von phylogenetischen<br />
Stammbäumen Verwandtschaftsbeziehungen aufgezeigt werden. Stamm Bo 53<br />
wurde freundlicherweise von Dr. B. Heyduck-Söller, Stamm Bo 10 von Dipl.-Biologin<br />
A. Hube zur Verfügung gestellt. Chromosomale DNA vom Stamm Flo 1 und vom<br />
Referenzstamm Geitlerinema PCC 7105 wurde von Dipl.-Biologen J. Schrübbers für<br />
die Untersuchungen überlassen.<br />
2.8.1 Extraktion der chromosomalen DNA nach NEILAN (1995) und SCHENK<br />
(1996)<br />
Für die DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) (modifiziert nach<br />
HEYDUCK-SÖLLER, 2003) wurden 8 - 10 Tage alte Cyanobakterienkulturen von<br />
Stamm Bo 53 und Stamm Bo 10 verwendet, die bei konstanten 21 °C und einer<br />
konstanten Photonenflussdichte von 1 µE m -2 s -1 PAR gehältert wurden. Die Anzucht<br />
der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte als Übernachtkultur bei<br />
35
2. Material und Methoden<br />
einer konstanten Temperatur von 21 °C und 120 rpm im Schüttelwasserbad (Julabo<br />
SW 21) (siehe Kap. 2.5.1).<br />
1 ml der jeweiligen Kultur wurde für 5 min bei 8.000 rpm zentrifugiert (Heraeus<br />
Instruments, Biofuge pico). Der Überstand wurde verworfen, die Kultur anschließend<br />
mit 1 ml STE-Puffer (100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM Na2EDTA, pH<br />
8,0) versetzt und wie oben beschrieben erneut zentrifugiert. Nach Dekantierung des<br />
Überstandes wurde erneut 1 ml STE-Puffer auf den Ansatz pipettiert, wobei<br />
cyanobakterielle Proben zum Ablösen der heterotrophen Begleitflora in einem<br />
Ultraschallbad (Elma, Transsonic Digital) bei 20 °C für 10 min bei maximaler<br />
Stärke beschallt wurden. Die Ultraschallbad-Behandlung wurde bei nicht der DNA-<br />
Extraktion aus den heterotrophen Bakterien durchgeführt. Nach Zentrifugation (5 min<br />
und 8.000 rpm) und Dekantierung des Überstandes wurde nochmals 1 ml STE-Puffer<br />
hinzugesetzt, anschließend zentrifugiert (siehe oben) und der Überstand vollständig<br />
entfernt. Nachfolgend wurde der Ansatz mit 400 µl STE-Puffer überschichtet sowie<br />
mit autoklavierten Glasperlen (Ø 0,1 - 0,2 µm; Fa. BIOmatik GmbH) im gleichen<br />
Volumenanteil (des jeweiligen Pellets) und mit 1 ml 75 °C heißem Phenol versetzt.<br />
Nach Vortexen auf einem Whirl-Mixer für 40 - 60 sec und anschließender Kühlung<br />
auf Eis erfolgte zur Trennung von Phenol- und wässriger Phase eine Zentrifugation<br />
(Beckman GS-15R) für 20 min bei 4 °C und 12.000 rpm. Die DNA-enthaltende obere<br />
wässrige Phase wurde in ein steriles ERG überführt und das Volumen bestimmt.<br />
Anschließend wurden 2 µl Poly A RNA (10 mg/ml) zugegeben. Zur Entfernung von<br />
eventuell noch vorhandenen Proteinen wurde 1 Volumenanteil<br />
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 (v/v)) hinzugesetzt, anschließend gevortext und für<br />
5 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Ein Großteil der oberen wässrigen Phase (350 µl)<br />
wurde in ein steriles ERG überführt und mit 0,1 Volumenanteil 3 M Natriumacetat<br />
(pH 5,2) versetzt. Zur Fällung der DNA erfolgte die Überschichtung mit<br />
0,8 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol, anschließender Lagerung bei -80 °C<br />
für 20 min und Zentrifugation bei 12.000 rpm für 30 min. Nach Dekantierung des<br />
Überstandes wurde das Pellet zur vollständigen Entfernung von eventuell<br />
vorhandenen Salzen mit 1 ml frisch angesetztem 70%igem Ethanol versetzt und<br />
nach Durchmischung für 10 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des<br />
Überstandes erfolgte die Zugabe von 1 ml Ethanol abs. und eine erneute<br />
Zentrifugation (s.o.). Das vom Überstand befreite DNA-Pellet wurde bei<br />
Raumtemperatur (RT) zum Trocknen für 1 h stehengelassen. Abhängig von der<br />
36
2. Material und Methoden<br />
DNA-Menge wurde das Pellet in 20 - 40 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM<br />
Na2EDTA, pH 8,0) über Nacht bei RT resuspendiert. Die DNA wurde im Dunkeln bei<br />
4 °C gelagert.<br />
2.8.2 Bestimmung der DNA-Konzentration<br />
Die Konzentration und die Reinheit der extrahierten DNA wurden mit Hilfe eines<br />
Spektralphotometers (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) photometrisch bei<br />
Wellenlängen von 260 und 280 nm ermittelt. Zur Quantifizierung der DNA wurde die<br />
Absorption der eingesetzten DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm<br />
gemessen. Die Reinheitsbestimmung der DNA erfolgte über das Verhältnis der<br />
Absorptionen bei 260 und 280 nm (A260nm/A280nm).<br />
2.8.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)<br />
Zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS (siehe Kap. 2.8) wurde<br />
eine Standard-PCR durchgeführt. Hierzu wurde standardmäßig jeweils ein PCR-<br />
Ansatz mit 50 µl Endvolumen pipettiert, dessen Zusammensetzung in Tabelle 2.16<br />
dargestellt ist. Für die PCR wurde ein Vielfaches der angegebenen Mengen in Form<br />
eines Mastermix (ohne DNA-Template) angesetzt und auf die PCR-Reaktionsgefäße<br />
verteilt. Die Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifikation und<br />
Sequenzierung der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS sind in Tabelle 2.17<br />
zusammengefasst.<br />
37
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.16: PCR-Ansatz zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS<br />
Reagenz Endkonzentration Menge/Ansatz (µl)<br />
Nukleasefreies Wasser a) 28,1<br />
10 x PCR-Puffer 1x 5,0<br />
MgCl 2 (25 mM) 2 mM 4,0<br />
dNTPs (10 mM) 200 µM 1,0<br />
Forward-Primer (10 µM) 0,8 µM 4,0<br />
Reverse-Primer (10 µM) 0,8 µM 4,0<br />
BSA (20 mg/ml) 1 mg/ml 2,5<br />
DNA-Polymerase (5 U/µl) a) 2 U 0,4<br />
DNA-Template b) 1,0<br />
Summe ∑ 50,0<br />
a) Platinum-Taq-Gold, Invitrogen<br />
b) Zur Amplifikation der ITS wurden 2 µl DNA-Template und dementsprechend 27,1 µl Nukleasefreies<br />
Wasser pro PCR-Ansatz eingesetzt.<br />
Tab. 2.17: Zusammenstellung der verwendeten Primer mit den jeweiligen Sequenzen<br />
Primerbezeichnung 5`→ 3`-Sequenz Verwendung Referenz<br />
8F (GM3F) (Forward-Primer) AGA GTT TGA TCC TGG C 16S-rDNA LANE (1991)<br />
1494R (Reverse-Primer) GTA CGG CTA CCT TGT TAC GAC 16S-rDNA TATON et al. (2003)<br />
380F a) (Forward-Primer) TTT TCC GCA ATG GGC G 16S-rDNA YAN (2005)<br />
GM4F (1507F) (Forward-Primer) GAA GTC GTA ACA AGG TA ITS LANE (1991)<br />
23R23S (Reverse-Primer) GTG CCT AGG TAT CCA CC ITS YAN (2005)<br />
GB/3MF (Forward-Primer) AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG gyrB<br />
GB/CR-2 (Reverse-Primer) CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC gyrB<br />
a) Primer 380F wurde als interner Primer zur Sequenzierung der cyanobakteriellen 16S-rDNA<br />
eingesetzt<br />
SEO und YOKOTA<br />
(2003)<br />
SEO und YOKOTA<br />
(2003)<br />
Die Ansätze wurden nach Zugabe des jeweiligen DNA-Templates mit 30 µl<br />
sterilfiltriertem Paraffinöl als Verdunstungsschutz überschichtet. Die PCR-Reaktionen<br />
wurden in einem Biometra Personal Cycler TM durchgeführt, wobei zur Amplifikation<br />
der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS unterschiedliche Cycler-Programme<br />
verwendet wurden, dargestellt in den Tabellen 2.18 bis 2.20. Eine Negativkontrolle<br />
mit nukleasefreiem Wasser anstelle des jeweiligen DNA-Templates wurde als<br />
Blindprobe mitgeführt.<br />
38
2. Material und Methoden<br />
Tab. 2.18: PCR-Programm zur Amplifikation der 16S-rDNA aus den Cyanobakterienstämmen<br />
Bo 10 und Bo 53<br />
Programmschritte und<br />
Anzahl der Zyklen<br />
Temperatur (°C) Dauer (sec)<br />
1x Startdenaturierung 93,0 120<br />
Denaturierung 93,0 30<br />
35x Annealing 45,0 35<br />
Elongation 72,0 120<br />
1x Finale Elongation 72,0 300<br />
1x Kühlung 20,0 1<br />
Tab. 2.19: PCR-Programm zur Amplifikation der ITS aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10, Flo 1<br />
und PCC 7105<br />
Programmschritte und<br />
Anzahl der Zyklen<br />
Temperatur (°C) Dauer (sec)<br />
1x Startdenaturierung 94,0 120<br />
Denaturierung 94,0 45<br />
35x Annealing 50,0 45<br />
Elongation 72,0 60<br />
1x Finale Elongation 72,0 300<br />
1x Kühlung 20,0 1<br />
Tab. 2.20: PCR-Programm zur Amplifikation des gyrB-Gens aus den Cyanobakterienstämmen<br />
Bo 10 und Bo 53<br />
Programmschritte und<br />
Anzahl der Zyklen<br />
Temperatur (°C) Dauer (sec)<br />
1x Startdenaturierung 94,0 120<br />
Denaturierung 94,0 60<br />
35x Annealing 50,0 60<br />
Elongation 72,0 120<br />
1x Finale Elongation 72,0 600<br />
1x Kühlung 20,0 1<br />
2.8.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte<br />
Zur Kontrolle der Standard-PCR wurden die 16S-rDNA- und gyrB-Amplifikate auf ein<br />
1%iges, die ITS-Amplifikate auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und<br />
Gelelektrophoresen (peqlab-Elektrophoresekammer) durchgeführt. Dazu wurden 5 µl<br />
16S-rDNA- bzw. gyrB-PCR-Produkt mit 1 µl 6x Loading Dye versetzt und in eine<br />
Geltasche pipettiert. Für die Auftrennung der ITS-Amplifikate wurden je 20 µl PCR-<br />
Produkt eingesetzt, versetzt mit 1/5 Volumenanteil 6x Loading-Dye. Als Referenz<br />
wurde ein Molekulargewichtsmarker (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI<br />
Fermentas) mitgeführt, wobei das eingesetzte Volumen dem des jeweiligen PCR-<br />
39
2. Material und Methoden<br />
Produktes entsprach. Bei einer angelegten Spannung von 70 V (Power Pac 300,<br />
Biorad) betrug die Laufzeit der 16S-rDNA-Produkte und der gyrB-Amplifikate ca. 1 h,<br />
die der ITS-Produkte ca. 3 h bei 50 V Spannung. Nach anschließender Gelfärbung<br />
für 15 min in 0,1%iger Ethidiumbromid-Lösung erfolgte die Auswertung am<br />
Transilluminator (Fluco-Link, Biometra) unter UV-Licht bei 254 nm. Die 16S-rDNA-<br />
PCR-Produkte bzw. gyrB-PCR-Produkte sollten bei 1500 bp bzw. 1200 bp eine<br />
deutliche Bande aufweisen, während die Bandenanzahl und die Fragmentgröße der<br />
ITS-Amplifikate variieren konnten.<br />
Die Amplifikate der 16S-rDNA von Stamm Bo 10 wurden durch Extraktion (siehe<br />
Kap. 2.8.5) der 1500 bp-Bande aus dem Gel erhalten, da das PCR-Produkt mehrere<br />
Banden im Gel aufwies. Hierzu erfolgte eine Auftrennung des gesamten PCR-<br />
Produkts in einem 2%igen Agarosegel in mehreren Gelläufen. Die Laufzeit betrug<br />
10 h bei einer angelegten Spannung von 50 V.<br />
2.8.5 Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten<br />
Die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde mittels des „Qiagen QIAquick PCR<br />
Purification“-Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA-Eluierung<br />
erfolgte in 40 µl EB-Puffer.<br />
Die Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarosegelen erfolgte unter<br />
Verwendung des „QIAquick Gel Extraktion“-Kits (Qiagen) nach Angaben des<br />
Herstellers. Die DNA wurde in 40 µl EB-Puffer eluiert.<br />
Die Konzentration an PCR-Produkt wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers<br />
(Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) bestimmt (siehe Kap. 2.8.2).<br />
2.8.6 Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens<br />
Die Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens mittels aufgereinigter PCR-<br />
Produkte wurde von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) unter Verwendung der<br />
in Kapitel 2.8.3, Tabelle 2.17 aufgeführten Primer durchgeführt.<br />
2.8.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen<br />
Das Alignment der Teilsequenzen wurde mit dem Programm ChromasPro<br />
durchgeführt. Die generierten Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 und<br />
Bo 10 wurden unter Anwendung von „nucleotide BLAST” mit den gegenwärtig<br />
hinterlegten Sequenzen der öffentlichen NCBI-Datenbank<br />
40
2. Material und Methoden<br />
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi; Stand: März 2008) verglichen. Basierend auf<br />
den erzielten Ergebnissen erfolgte unter Abgleichung mit Sequenzen von<br />
Referenzstämmen mit den größten Homologien aus der NCBI-Datenbank die<br />
Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes. Das Alignment der ausgewählten<br />
Sequenzen sowie das Zuschneiden der Alignmentsequenzen wurden mit den<br />
Programmen Bioedit und GeneDoc durchgeführt. Die phylogenetischen<br />
Stammbäume wurden mit der “Neighbor-Joining”-Methode (NJ) mit dem Programm<br />
MEGA (Version 4.0) konstruiert. Die Berechnung der evolutionären Distanzen<br />
zwischen den Sequenzen erfolgte nach der Methode von JUKES und CANTOR<br />
(1969). Die evolutionäre Distanz ergbt sich aus dem Verhältnis zwischen<br />
verschiedenen Basen zweier gleichlanger Sequenzen zu allen Basen der Sequenz.<br />
Eine statistische Absicherung der Topologie der phylogenetischen Stammbäume<br />
erfolgte durch 1000 Wiederholungen der Bootstrap-Analysen.<br />
2.9 Herkunft der verwendeten Chemikalien<br />
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wiesen p.A.-Qualität oder<br />
HPLC-Grade auf und wurden von den folgenden Firmen bezogen: Acros Organics<br />
(Geel, Belgien), AppliChem (Darmstadt, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz),<br />
Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland), Jannsen Chimica (Geel, Belgien), MBI<br />
Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Qiagen<br />
(Hilden, Deutschland), Riedel de Haën (Seelze, Deutschland), Roche (Mannheim,<br />
Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland),<br />
Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) und VWR international (Leuven, Belgien).<br />
41
3. Ergebnisse<br />
3. Ergebnisse<br />
3.1 Verwendete Puffersysteme<br />
Für die pH-Untersuchungen der Bakterienstämme Bo 53-33, Bo 10-09 und Flo 1<br />
wurde eine große Bandbreite an Puffersystemen getestet (siehe Kap. 2.3), bevor die<br />
in den generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2) und zur AHL-Untersuchung<br />
(siehe Kap. 3.5.1) eingesetzten Puffer zum Einsatz kamen.<br />
Erhebliche Schwierigkeiten traten vor allem durch den Ausfall von Salzen (z.B. Mg 2+ -<br />
und Ca 2+ -Ionen) in pH-gepufferten ASNIII/2-Medien und durch starke pH-Wert-<br />
Verschiebungen dieser (von dem jeweiligen eingestellten pH-Wert) nach<br />
Autoklavieren auf, die ein Ansetzen von gepufferten Kulturmedien mit höheren pH-<br />
Werten stark erschwerten (pH 8,5 - 10,0) bzw. unmöglich machten (pH 11,0). Die<br />
Trübung des Nährmediums und die pH-Abweichungen nahmen dabei sukzessive mit<br />
steigendem pH-Wert zu, wobei vor allem die mit Fleischextrakt versetzten<br />
Kulturmedien zu Ausfällungen neigten. In diesem Zusammenhang waren<br />
insbesondere die Clark & Lubs-Pufferlösungen im Bereich von pH 8,0 - 10,0<br />
aufgrund oben genannter Probleme zur Kultivierung der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 lediglich bedingt verwendbar (pH 8,0 und<br />
8,5) bzw. völlig ungeeignet gewesen (pH 9,0 und 10,0). Untersuchungen zum<br />
Wachstumsverhalten mit Clark & Lubs-gepufferten Medien (pH 8,0 und 8,5) zeigten<br />
bei Stamm Bo 53-33 kein und bei Stamm Bo 10-09 ein nur schwaches Wachstum<br />
(Daten nicht gezeigt). Neben einem durch Mineralsalz-Ausfällungen bedingten<br />
Nährstoffentzug könnte ebenfalls ein hemmender Einfluss des Puffers ein Grund für<br />
ein nur schwaches Wachstum der heterotrophen Bakterien sein. Die letztlich<br />
verwendeten Tris-HCl- und Glycin-Puffer in diesem pH-Bereich bedingten im<br />
Kulturmedium ebenfalls leichte bis mittlere Ausfällungen und pH-Verschiebungen<br />
nach dem Autoklavieren, welche aber tolerierbar waren. Der geforderte pH-Wert<br />
wurde gegebenenfalls nachträglich durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH<br />
eingestellt. Starke Ausfällungen in den Kulturmedien wurden zudem bei Verwendung<br />
des Tris-HCl-Puffers pH 8,9 und des Clark & Lubs-Puffers pH 7,0 (Phosphat-Puffer)<br />
beobachtet und erwiesen sich somit neben dem Tris-Maleat-Puffer pH 6,0 als<br />
ungeeignet, bei dessen Anwesenheit kein Wachstum der heterotrophen Bakterien<br />
erfolgte.<br />
42
3. Ergebnisse<br />
Weitere Probleme traten mit pH-Wert-Verschiebungen während des Wachstums auf,<br />
die anhand der pH-Endwerte der Versuchskulturen deutlich werden (siehe Kap. 3.2.1<br />
und 3.3.1). Durch die Erhöhung der Molarität und somit der Pufferkapazität (150 mM)<br />
wurde versucht, diesem entgegenzuwirken, welches sich jedoch überwiegend<br />
negativ auf ein Wachstum der Bakterien auswirkte (Daten nicht gezeigt) und zudem<br />
mit stärkeren Ausfällungen im Nährmedium ab pH 8,5 einherging.<br />
Das Ansetzen von getrennt autoklavierten Stammlösungen bestimmter ASNIII/2-<br />
Komponenten (CaCl2 x 2 H2O, MgCl2 x 6 H2O und MgSO4 x 7 H2O), welche nach<br />
Autoklavieren des restlichen gepufferten Grundmediums diesem bei RT hinzugesetzt<br />
wurden, bewirkte sowohl bei schwächer als auch stärker gepufferten Kulturmedien<br />
oberhalb von pH 8,0 hinsichtlich einer Minimierung der Ausfällungen keine Abhilfe.<br />
3.2 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
bei unterschiedlichen pH-Werten<br />
Zur Ermittlung des pH-Toleranzbereiches (pH-Minimum und pH-Maximum) und pH-<br />
Optimums für die heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurde das<br />
Wachstum im pH-Bereich von 2,0 - 10,0 untersucht (siehe Kap. 2.6.2). Als Referenz<br />
wurden ungepufferte Versuchsansätze inkubiert (siehe Kap. 2.6.1). Wachstum wurde<br />
definiert als Zunahme in der O.D.600nm von mindestens 0,1 nach 24 h Inkubation.<br />
Gemäß dieser Definition konnte im Bereich von pH 2,0 - 5,0 sowie bei pH 10,0 kein<br />
Wachstum der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 beobachtet werden (Daten nicht<br />
gezeigt). Die Ergebnisse zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 im Bereich von pH 6,0 - 9,0 sowie in ungepuffertem ASNIII/2-<br />
Medium sind in den Abbildungen 3.1 und 3.3 dargestellt, wobei die Ergebnisse durch<br />
Versuchswiederholungen abgesichert wurden (Daten nicht gezeigt).<br />
43
3. Ergebnisse<br />
OD (600 nm)<br />
6,0<br />
5,5<br />
5,0<br />
4,5<br />
4,0<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
0 24 48 72 96 120 144 168<br />
Zeit (h)<br />
pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 8,5 pH 9,0 ungepuffert<br />
Abb. 3.1: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 53-33 bei unterschiedlichen<br />
pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien und in ungepuffertem ASNIII/2-Medium, determiniert über<br />
Messungen der O.D.600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.<br />
Abbildung 3.1 ist zu entnehmen, dass ein Wachstum von Stamm Bo 53-33 im<br />
Bereich von pH 6,0 - 9,0 vorliegt. Dabei fiel das Zellwachstum beim pH-Minimum<br />
(pH 6,0) mit einer O.D.600nm von 0,65 (nach 120 h) leicht stärker aus als das beim pH-<br />
Maximum (pH 9,0) mit einer O.D.600nm von 0,50 (nach 80 h). Bei pH 6,0 bzw. pH 9,0<br />
lag das Wachstum dabei auf einem nahezu konstant niedrigen Niveau und gelangte<br />
nach 72 h bzw. 48 h in die stationäre Wachstumsphase, wobei über den gesamten<br />
weiteren Messzeitraum eine leichte Zunahme in der Zelldichte zu verzeichnen war.<br />
Morphologisch unterschieden sich die pH 6- und pH 9-gepufferten Kulturen von den<br />
sonstigen Versuchskulturen durch Ausbildung von Zellagglomeraten, während das<br />
Kulturmedium verhältnismäßig ungetrübt blieb (siehe Abb. 3.2 a - b).<br />
Abb. 3.2 a - b: Wachstum der Kulturen von Stamm Bo 53-33 in ASNIII/2-Medium bei pH 6 (a) und in<br />
ungepuffertem ASNIII/2-Medium (b) bei 21 °C und 120 rpm nach 72 h Inkubation. Die Aufnahmen<br />
erfolgten mittels Digitalkamera.<br />
44
3. Ergebnisse<br />
Maximales Wachstum für Stamm Bo 53-33 wurde in gepufferten Versuchsansätzen<br />
bei einem pH von 7,0 (maximale O.D.600nm: 4,24) detektiert, das damit deutlich über<br />
dem der pH 8,0-gepufferten bzw. pH 8,5-gepufferten Versuchskulturen mit<br />
maximalen O.D.600nm-Werten von 2,88 bzw. 2,23 lag. Das pH-Optimum des<br />
Bakterienstammes liegt damit bei pH 7,0. Die gepufferten Versuchsansätze (pH 7,0,<br />
8,0 und 8,5) traten nach 84 - 96 h in die stationäre Wachstumsphase ein, wobei die<br />
O.D.600nm-Werte im weiteren Verlauf noch leicht zunahmen. Die ungepufferten<br />
Referenzansätze wiesen mit einer maximalen O.D.600nm von 5,34 das deutlich<br />
stärkste Zellwachstum auf.<br />
OD (600 nm)<br />
4,0<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
0 24 48 72 96 120 144<br />
Zeit (h)<br />
pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 8,5 pH 9,0 ungepuffert<br />
Abb. 3.3: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 10-09 bei unterschiedlichen<br />
pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien und in ungepuffertem ASNIII/2-Medium, determiniert über<br />
Messungen der O.D.600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.<br />
Aus Abbildung 3.3 geht hervor, dass der Bakterienstamm Bo 10-09 im pH-Bereich<br />
von 6,0 - 9,0 wächst. Beim pH-Minimum des Toleranzbereiches wies Stamm<br />
Bo 10-09 ein wesentlich stärkeres Wachstum auf (maximale O.D.600nm: 0,89) als bei<br />
seinem pH-Maximum (maximale O.D.600nm: 0,37). Bei letzterem gingen die Kulturen<br />
nach Erreichen der stationären Wachstumsphase umgehend in die Absterbephase<br />
über. Maximales Wachstum für Stamm Bo 10-09 wurde in gepufferten<br />
Versuchsansätzen bei pH 8,0 ermittelt (maximale O.D.600nm: 3,08) und ist damit<br />
geringfügig höher als bei pH 7,0 (maximale O.D.600nm: 2,86) und pH 8,5 (maximale<br />
45
3. Ergebnisse<br />
O.D.600nm: 2,75). Die gepufferten Kulturen (pH 7,0, 8,0 und 8,5) erreichten nach etwa<br />
64 h die stationäre Wachstumsphase, gefolgt von einer weiteren leichten Zunahme<br />
der Zelldichten. Die ungepufferten Referenzkulturen wiesen mit einer maximalen<br />
O.D.600nm von 3,39 ein leicht stärkeres Wachstum als die gepufferten Kulturen auf.<br />
Die Referenzansätze traten nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase ein.<br />
3.2.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände<br />
Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten erfolgte parallel eine<br />
pH-Messung der Kulturüberstände mittels pH-Indikatorpapier (Macherey-Nagel;<br />
pH 6,0 - 10,0) (siehe Kap. 2.6.4) (Daten nicht gezeigt).<br />
Nach Abschluss der Untersuchung zum Wachstumsverhalten der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden die pH-Endwerte der<br />
Kulturüberstände mittels einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-Meter,<br />
bestimmt. Die ermittelten pH-Endwerte sind in Tabelle 3.1 zusammengefasst.<br />
Tab. 3.1: pH-Werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 nach Inkubation. Ungepuffertes ASNIII/2-Medium und gepuffertes ASNIII/2-Medium mit<br />
unterschiedlichen pH-Werten diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase (siehe Kap. 3.2) in einem Schüttelwasserbad (120 rpm) bei 21 °C im Dunkeln. n = 2<br />
pH-Wert des Kulturmediums<br />
vor Inkubation<br />
pH-Wert des Kulturüberstandes<br />
von Bo 53-33 nach Inkubation<br />
pH-Wert des Kulturüberstandes<br />
von Bo 10-09 nach Inkubation<br />
pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,36 pH 8,37<br />
pH 6,0 pH 6,32 pH 6,27<br />
pH 7,0 pH 8,18 pH 8,31<br />
pH 8,0 pH 8,25 pH 8,40<br />
pH 8,5 pH 8,50 pH 8,55<br />
pH 9,0 pH 8,65 pH 8,80<br />
In Tabelle 3.1 sind die pH-Werte vor und nach Inkubation der Versuchsansätze der<br />
Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 dargestellt.<br />
Bei beiden Bakterienstämmen ist, abgesehen von pH 8,5 und 9,0, ein Anstieg des<br />
pH-Wertes sowohl in den ungepufferten als auch in den gepufferten<br />
Versuchskulturen zu verzeichnen. Eine kontinuierliche Alkalisierung der Überstande<br />
konnte dabei für die ungepufferten Versuchsansätze bereits nach 8 h Inkubation, für<br />
die gepufferten Versuchsansätze hingegen erst nach 40 - 48 h Inkubation festgestellt<br />
werden (Daten nicht gezeigt).<br />
46
3. Ergebnisse<br />
Der pH-Wert der pH 6-gepufferten Dunkelansätze verschob sich lediglich geringfügig<br />
auf Werte von 6,35 (Stamm Bo 53-33) und 6,25 (Stamm Bo 10-09), während die<br />
ungepufferten sowie die pH 7- und pH 8-gepufferten Dunkelansätze nach Inkubation<br />
pH-Endwerte zwischen 8,05 und 8,36 (Stamm Bo 53-33) sowie zwischen 8,37 und<br />
8,50 (Stamm Bo 10-09) aufwiesen. Eine Ausnahme bei beiden heterotrophen<br />
Stämmen bildeten die pH 8,5-gepufferten Dunkelansätze mit gleich bleibenden und<br />
die pH 9,0-gepufferten Dunkelansätze mit leicht abnehmenden pH-Endwerten in den<br />
Kulturüberständen.<br />
3.3 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR<br />
Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstumsverhalten der<br />
heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte eine Inkubation bei einem<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR (siehe Kap. 2.6.3). Hierzu wurden die<br />
heterotrophen Bakterien bei ihrem ermittelten pH-Optimum und in ungepuffertem<br />
Kulturmedium inkubiert. Als Kontrolle wurden ungepufferte Dunkelansätze<br />
angezogen (siehe Kap. 2.6.1). Die Ergebnisse der Wachstumsmessungen sind in<br />
den Abbildungen 3.4 und 3.5 dargestellt.<br />
OD (600 nm)<br />
5,5<br />
5,0<br />
4,5<br />
4,0<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
0 24 48 72 96 120<br />
Zeit (h)<br />
pH 7,0; 5 µE PAR ungepuffert; 5 µE PAR ungepuffert; Dunkel<br />
Abb. 3.4: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 53-33 in gepuffertem (pH-<br />
Optimum) und ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR,<br />
determiniert über Messungen der O.D.600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle<br />
mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es<br />
wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.<br />
47
3. Ergebnisse<br />
Aus Abbildung 3.4 geht hervor, dass eine Photonenflussdichte von 5 µE m -2 s -1 PAR<br />
keinen ersichtlichen Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Stamm Bo 53-33<br />
hatte. Das Wachstum ungepufferter Licht- und dunkel-inkubierter Kulturen wies einen<br />
ähnlichen Verlauf auf, wobei die Kulturen der Dunkelansätze (maximale O.D.600nm:<br />
5,04) ein leicht besseres Wachstum aufwiesen als die Licht-inkubierten Ansätze<br />
(maximale O.D.600nm: 4,46). Nach einem zunächst logarithmischen Wachstumsverlauf<br />
gingen die Kulturen nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase über. Der<br />
Eintritt in die Absterbephase erfolgte nach 96 - 112 h. Bei ihrem ermittelten pH-<br />
Optimum wiesen die Licht-inkubierten Kulturen ebenfalls ein ähnliches<br />
Wachstumsverhalten auf, jedoch auf einem niedrigeren Wachstumsniveau<br />
(maximale O.D.600nm: 3,57).<br />
OD (600 nm)<br />
4,0<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
0 24 48 72 96 120<br />
Zeit (h)<br />
pH 8,0; 5 µE PAR ungepuffert; 5 µE PAR ungepuffert; Dunkel<br />
Abb. 3.5: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 10-09 in gepuffertem (pH-<br />
Optimum) und ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR,<br />
determiniert über Messungen der O.D.600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle<br />
mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es<br />
wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.<br />
Abbildung 3.5 ist zu entnehmen, dass das Wachstum von Stamm Bo 10-09 nicht<br />
erkennbar durch eine Photonenflussdichte von 5 µE m -2 s -1 PAR beeinflusst wurde.<br />
Das Wachstumsverhalten der ungepufferten, belichteten Versuchsansätze entsprach<br />
in etwa dem der ungepufferten, dunkel-inkubierten Kulturen, wobei der<br />
Wachstumsverlauf (maximale O.D.600nm: 3,44) leicht unter dem der Dunkelansätze<br />
48
3. Ergebnisse<br />
(maximale O.D.600nm: 3,63) lag. Die bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR<br />
und pH-Optimum inkubierten Kulturen wiesen den gleichen Wachstumsverlauf auf<br />
wie die ungepufferten Versuchsansätze, lediglich auf leicht geringerem<br />
Wachstumsniveau (maximale O.D.600nm: 3,40).<br />
3.3.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände<br />
Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten wurden parallel die<br />
pH-Werte der Kulturüberstände mittels pH-Indikatorpapier (Macherey-Nagel; pH 6,0 -<br />
10,0) bestimmt (siehe Kap. 2.6.4) (Daten nicht gezeigt).<br />
Nach Abschluss der Wachstumsversuche erfolgte eine Bestimmung der pH-<br />
Endwerte der Kulturüberstände mittels einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-<br />
Meter. Die ermittelten pH-Endwerte sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst.<br />
Tab. 3.2: pH-Werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 nach Inkubation. Ungepuffertes ASNIII/2-Medium und gepuffertes ASNIII/2-Medium mit<br />
optimalem pH-Wert für den jeweiligen Stamm diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in<br />
die stationäre Wachstumsphase (siehe Kap. 3.3) auf einem Rotationsschüttler (120 rpm) bei 21 °C<br />
und einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR oder im Dunkeln. n = 2<br />
pH-Wert des Kulturmediums<br />
vor Inkubation<br />
pH-Wert des Kulturüberstandes<br />
von Bo 53-33 nach Inkubation<br />
pH-Wert des Kulturüberstandes<br />
von Bo 10-09 nach Inkubation<br />
pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,78 pH 8,78<br />
pH 7,0 (gepuffert) pH 8,50 --<br />
pH 8,0 (gepuffert) -- pH 8,78<br />
pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,80 a)<br />
a) nach Inkubation im Dunkeln<br />
pH 8,70 a)<br />
In Tabelle 3.2 sind die pH-Werte von Kulturmedien vor und nach Inkubation der<br />
Versuchsansätze der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 dargestellt.<br />
Bei beiden Bakterienstämmen konnte eine deutliche Alkalisierung der ungepufferten<br />
sowie gepufferten Versuchsansätze nach der Inkubation festgestellt werden. Hierbei<br />
wiesen die ungepufferten Kulturüberstände beider Stämme, unabhängig von einer<br />
Licht- oder Dunkelinkubation, pH-Endwerte zwischen 8,7 - 8,8 auf. Bei ungepufferten<br />
Kulturen konnte bereits nach 8 h, bei gepufferten Kulturen hingegen erst nach<br />
32 - 40 h Inkubation eine pH-Verschiebung von dem Ausgangswert beobachtet<br />
werden (Daten nicht gezeigt).<br />
49
3. Ergebnisse<br />
3.4 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien<br />
3.4.1 Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026<br />
nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)<br />
Für einen AHL-Nachweis kurzkettiger AHL-Moleküle wurde der Agarplattentest nach<br />
MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.3). Es wurden<br />
synthetische AHL-Moleküle und AHL-Extrakte getestet. Letztere wurden aus<br />
Versuchskulturen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen<br />
Kultivierungsbedingungen gewonnen (siehe Kap. 2.7.2.1). Nach entsprechender<br />
Inkubation konnten mit dem Biosensor C. violaceum CV026 für beide Stämme keine<br />
AHL-Signalmoleküle über eine violette Pigmentierung der Indikatorplatten um die<br />
jeweiligen Auftragungspunkte nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht dargestellt).<br />
In Abbildung 3.6 a - b ist exemplarisch eine C. violaceum-Indikatorplatte mit<br />
synthetischen AHL-Molekülen in Abhängigkeit verschiedener Konzentrationen und<br />
der Inkubationszeit dargestellt.<br />
Abb. 3.6 a - b: Nachweis von synthetischen AHL-Molekülen mittels C. violaceum-Indikatorplatte nach<br />
24 h (a) und 48 h (b) Inkubation bei 30 °C über eine violette Pigmentierung des Biosensors um die<br />
Auftragungspunkte. Auftragungsschema: 1: NK (10 µl Ethylacetat, verdünnt auf 50 µl mit LB-<br />
Medium); 2 - 3: C4-HSL; 4 - 5: C6-HSL; 6 - 7: C8-HSL. Die Auftragung der jeweiligen AHL-Moleküle<br />
und deren Konzentrationen (5 x 10 -9 mol und 5 x 10 -8 mol) erfolgte im Uhrzeigersinn.<br />
Aus Abbildung 3.6 a - b wird ersichtlich, dass C. violaceum CV026 eine hohe<br />
Sensitivität gegenüber C6-HSL aufweist, wobei 5 x 10 -9 mol (Abb. 3.6 a, Nr. 4) noch<br />
deutlich durch eine Violacein-Produktion nachgewiesen wurde. Für C4-HSL und<br />
C8-HSL liegen die Nachweisgrenzen hingegen wesentlich höher. C8-HSL wurde von<br />
C. violaceum CV026 nach längerer Inkubation (48 h) lediglich schwach<br />
nachgewiesen (Abb. 3.6 b, Nr. 6 und 7), 5 x 10 -9 mol C4-HSL gar nicht (Abb. 3.6 b,<br />
Nr. 2).<br />
50
3. Ergebnisse<br />
3.4.2 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern<br />
(2001)<br />
Die „Screening“-Methode nach RAVN und Mitarbeitern (2001) zur Detektion von<br />
AHL-Produzenten (siehe Kap. 2.7.7.1) wurde mit ASNIII/2-Agarplatten durchgeführt,<br />
da die zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33<br />
auf den verwendeten LB-Agarplatten nicht wuchsen. Der Reporterstamm<br />
C. violaceum CV026 wuchs nur unzureichend auf dem ASNIII/2-Agar, wodurch<br />
Aussagen zu einer AHL-Produktion mit Hilfe dieses Biosensors nicht möglich waren<br />
(Ergebnisse nicht dargestellt). In Abbildung 3.7 a - g sind exemplarisch die<br />
Ergebnisse des Screeningtests mit dem Biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4) dargestellt. Die Inkubation der Agarplatten erfolgte bei 21 °C, 28 °C und<br />
37 °C für 24 h mit anschließender Auswertung der Agarplatten, wobei ein<br />
Blauumschlag des Sensorbakteriums als AHL-Nachweis gewertet wurde.<br />
21 °C<br />
28 °C<br />
Stamm Bo 10-09 Stamm Bo 53-33 NK (ASNIII/2-Medium) NK (AGB-Medium)<br />
Abb. 3.7 a - g: Sreeningtest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) mit dem Sensorstamm<br />
Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die<br />
heterotrophen Stämme Bo 10-09 (a und d: linker Ausstrich) und Bo 53-33 (b und e: linker Ausstrich)<br />
nach 24 h Inkubation bei 21 °C und 28 °C über eine Blaufärbung des eingesetzten Sensorbakteriums<br />
A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) (jeweils rechter Ausstrich). Als Negativkontrolle (NK) wurde der<br />
Sensorstamm eingesetzt und unter gleichen Bedingungen (c und f) sowie bei 28 °C für 24 h auf ABG-<br />
Medium (g) bebrütet.<br />
Aus Abbildung 3.7 a - g geht hervor, dass bei einer Inkubationstemperatur von 21 °C<br />
für Stamm Bo 10-09 keine und für Stamm Bo 53-33 eine geringe AHL-Produktion<br />
über die Mutante A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) nachgewiesen werden konnte. Nach<br />
51
3. Ergebnisse<br />
Inkubation bei 28 °C wies der Indikatorstamm auf den ASNIII/2-Agarplatten mit Stamm<br />
Bo 53-33 und Stamm Bo 10-09, einschließlich der Negativkontrolle (Abb. 3.7 f), eine<br />
Blaufärbung auf. Diese fiel in Gegenwart von Stamm Bo 10-09 wesentlich schwächer<br />
aus als in Gegenwart von Stamm Bo 53-33. Aussagen über eine AHL-Produktion<br />
waren aufgrund der positiven Negativkontrolle nicht bzw. kaum möglich.<br />
Versuchswiederholungen bestätigten die Ergebnisse.<br />
Eine weitere Bebrütung bei der jeweiligen Inkubationstemperatur führte bei allen<br />
ASNIII/2-Agarplatten entweder zu einem Auftreten einer Blaufärbung des Biosensors<br />
oder zu einer weiteren Signalverstärkung (Ergebnisse nicht dargestellt). Bei einer<br />
Inkubationtemperatur von 37 °C wies der Sensorstamm nur ein unzureichendes<br />
Wachstum auf, wodurch eine Auswertung unmöglich wurde (Ergebnisse nicht<br />
dargestellt).<br />
Ein Ausstrich des Biosensors auf ABG-Festagar als NK zeigte nach 24 h (Abb. 3.7 g)<br />
und 48 h Inkubation (Ergebnisse nicht dargestellt) bei 28 °C hingegen keine<br />
Blaufärbung auf.<br />
Weiter konnte in Gegenwart von X-Gal oftmals beobachtet werden, dass der<br />
ansonsten gelb-ockrige Stamm Bo 10-09 eine deutliche Grünblau-Färbung aufzeigte.<br />
3.4.3 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und<br />
Mitarbeitern (2002)<br />
Zur Detektion von AHL-Produzenten wurde eine weitere „Screening“-Methode nach<br />
FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.2), da ein<br />
eindeutiger Nachweis nach RAVN und Mitarbeitern (2001) nicht erbracht wurde. In<br />
diesem Screeningtest wurde die AHL-Produktion der zu testenden heterotrophen<br />
Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 bei 21 °C<br />
untersucht. In Abbildung 3.8 a - c sind die A. tumefaciens-Indikatorplatten nach 24 h<br />
Bebrütung bei 28 °C dargestellt.<br />
52
3. Ergebnisse<br />
Abb. 3.8 a - c: Sreeningtest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) mit dem Sensorstamm<br />
A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die Stämme Bo 53-33<br />
(a), Bo 10-09 (b) und Flo 1 (c). Die Proben der zu untersuchenden Stämme wurden links, die der<br />
Positivkontrolle A. tumefaciens NT1 (pTiC58∆accR) rechts auf den Agarplatten aufgetragen. Nach<br />
einer Bebrütung der A. tumefaciens-Indikatorplatten bei 28 °C für 24 h wurden intakte AHL-Moleküle<br />
als blaue Spots sichtbar.<br />
Wie aus Abbildung 3.8 a - c hervorgeht, konnte für den Stamm Bo 53-33 im<br />
Gegensatz zu den Stämmen Bo 10-09 und Flo 1 ein deutlicher AHL-Nachweis mit<br />
der Mutante A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) erzielt werden, sichtbar durch einen<br />
blauen Farbumschlag im Auftragungsbereich. Ein schwacher Farbumschlag im Agar<br />
deutete auf eine geringe AHL-Produktion durch Stamm Bo 10-09 hin, während für<br />
das Cyanobakterium Stamm Flo 1 über das eingesetzte Sensorbakterium keine AHL-<br />
Signalmoleküle nachgewiesen wurden. Die bebrüteten Agarplatten ohne Biosensor<br />
(NK) waren negativ, wodurch eine Hydrolyse von X-Gal durch produzierte<br />
Substanzen der Testorganismen ausgeschlossen werden konnte (Ergebnisse nicht<br />
dargestellt). Eine unspezifische Aktivierung des Indikatorstammes durch<br />
Medienkomponenten lag ebenfalls nicht vor, da eine Blaufärbung des Weichagars in<br />
den Negativkontrollen mit unbeimpftem Kulturmedium nicht beobachtet wurde<br />
(Ergebnisse nicht dargestellt). Eine Auswertung muss spätestens nach 48 h erfolgen,<br />
da nach 48 - 72 h eine zunehmende Blaufärbung durch spontane Hydrolyse von<br />
X-Gal auftrat. Aussagen über vorliegende AHL-Mengen konnten über diese Methode<br />
nicht getätigt werden, da alle über den Biosensor detektierbaren AHL-Moleküle<br />
nachgewiesen werden und die Sensitivitäten gegenüber diesen Signalmolekülen<br />
unterschiedlich sind.<br />
53
3. Ergebnisse<br />
3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener<br />
Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Produktion durch die<br />
heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das<br />
Cyanobakterium Stamm Flo 1<br />
Die Produktion von AHL-Signalmolekülen wurde unter verschiedenen<br />
Kultivierungsbedingungen untersucht (siehe Kap. 2.7.2).<br />
Zum Nachweis der verschiedenen AHL-Signalmoleküle wurde nach AHL-Extraktion<br />
aus 250 ml Zellkulturüberständen (siehe Kap. 2.7.3.3) bzw. bakterieller Biomasse<br />
(siehe Kap. 2.7.3.4) eine Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (siehe<br />
Kap. 2.7.4) mit anschließender Überschichtung mit dem Agrobacterium- bzw.<br />
Chromobacterium-Sensor (siehe Kap. 2.7.5.2) zur Visualisierung der AHL-Moleküle<br />
durchgeführt. Eine Identifikation der Signalmoleküle erfolgte, soweit möglich, mit Hilfe<br />
von synthetischen AHL-Referenzmolekülen (siehe Kap. 2.7.6, Tab. 2.15). Aufgrund<br />
der eingesetzten Standardmoleküle konnte, wie in Referenzarbeiten ebenso<br />
(GEISENBERGER, 2000; YATES et al., 2002), auf eine Auswertung über die<br />
ermittelten Rf-Werte verzichtet werden.<br />
Für die DC-Untersuchungen mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnte eine<br />
Hydrolyse von X-Gal durch extrahierte Substanzen (z.B. Enzyme) sowie durch eine<br />
unspezifische Aktivierung des Biosensors durch das Ausbleiben einer Blaufärbung in<br />
den Negativkontrollen nicht festgestellt werden (siehe Kap. 2.7.5.2) (Ergebnisse nicht<br />
gezeigt).<br />
3.5.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das<br />
Cyanobakterium Stamm Flo 1<br />
Zur Ermittlung des pH-Wert-Einflusses auf die Signalmolekül-Produktion wurden die<br />
AHL-Gehalte in den Kulturüberständen gepufferter Versuchskulturen miteinander<br />
verglichen. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte<br />
die Untersuchung bei ihrem jeweiligen pH-Minimum, -Optimum und -Maximum (siehe<br />
Kap. 2.7.2.1), ermittelt aus den zuvor generierten Wachstumskurven (siehe<br />
Kap. 3.2). Der pH-Wert 8,5 war das zunächst ermittelte pH-Maximum der<br />
heterotrophen Stämme und fand daher ebenfalls in den AHL-Untersuchungen<br />
Eingang. Eine Kultivierung unter pH-optimalen Bedingungen erfolgte bis in die<br />
logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase. Die weiteren gepufferten<br />
54
3. Ergebnisse<br />
Versuchskulturen wurden bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Des<br />
Weiteren wurden die AHL-Gehalte in ungepufferten dunkel-inkubierten Kulturen in<br />
der logarithmischen und stationären Wachstumsphase ermittelt.<br />
Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-<br />
Sensorstamm sind in Abbildung 3.9 dargestellt. Mit dem Sensorstamm C. violaceum<br />
CV026 wurden keine AHL-Signalmoleküle detektiert, wobei für die DC-Analysen bis<br />
zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen wurden.<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
Probennummer<br />
Abb. 3.9: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes<br />
Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem<br />
ASNIII/2-Medium (Probennr. 3 und 4) und bei unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-<br />
Medien (Probennr. 5 - 9) bei 21 °C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre<br />
Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf<br />
die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens<br />
NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel<br />
2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle;<br />
2: Positivkontrolle (Vibrio sp.); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: pH 6, aus<br />
stationärer Phase; 6: pH 7, aus logarithmischer Phase; 7: pH 7, aus stationärer Phase; 8: pH 8,5, aus<br />
stationärer Phase; 9: pH 9,0, aus stationärer Phase.<br />
Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile belegt, dass in allen Ansätzen von<br />
Stamm Bo 53-33 unabhängig vom pH-Wert die Art der AHL-Moleküle sehr ähnlich<br />
ist. Wie der Abbildung 3.9 zudem deutlich zu entnehmen ist, besteht ein<br />
Zusammenhang zwischen dem pH-Wert des Kulturmediums und der AHL-Menge in<br />
den Kulturüberständen. Die Größen der distinkten DC-Spots belegen, dass der<br />
höchste AHL-Gehalt im Überstand der Kultur vorlag, welche bei einem pH 6,0<br />
inkubiert worden war, und dass der AHL-Gehalt mit steigendem pH-Wert abnahm.<br />
Ein DC-Signal lag unterhalb von C6-HSL, wobei bei pH 6-inkubierten Kulturen zwei<br />
55
3. Ergebnisse<br />
AHL-Moleküle detektiert wurden (Probennr. 5). Das zweite DC-Signal lag auf Höhe<br />
von C4-HSL. Signifikante Unterschiede der AHL-Gehalte in den Kulturüberständen<br />
von Stamm Bo 53-33 in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase<br />
wurden nicht beobachtet, wobei der Gehalt an AHL-Molekülen in der logarithmischen<br />
Wachstumsphase (Probennr. 3) leicht höher war als in der stationären<br />
Wachstumsphase (Probennr. 4). Die AHL-Positivkontrolle Vibrio sp. wies im<br />
Kulturüberstand AHL-Signalmoleküle auf (Probennr. 2).<br />
Für den Bakterienstamm Bo 10-09 wurde mit dem Agrobacterium-Sensorstamm DC-<br />
Signale detektiert (Abb. 3.10). Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde<br />
kein AHL-Nachweis erzielt, wobei bis zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen<br />
wurden (Ergebnisse nicht dargestellt).<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3<br />
Probennummer<br />
Abb. 3.10: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes<br />
Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei pH 6 in<br />
gepuffertem ASNIII/2-Medium bis in die stationäre Wachstumsphase bzw. in ungepuffertem ASNIII/2-<br />
Medium bis in die logarithmische Wachstumsphase bei 21 °C im Dunkeln inkubiert. Es wurden jeweils<br />
30 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der<br />
AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen<br />
wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen<br />
eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle; 2: pH 6, aus stationärer<br />
Wachstumsphase; 3: aus logarithmischer Wachstumsphase.<br />
In Abbildung 3.10 sind die AHL-Nachweise für Stamm Bo 10-09 dargestellt. Im<br />
Überstand einer bei pH 6 kultivierten Kultur (Probennr. 2) wurden mindestens zwei<br />
AHL-Signalmoleküle nachgewiesen. In Überständen aus Bo 10-09-Kulturen, welche<br />
beim pH-Optimum (pH 8,0) bis in die logarithmische bzw. stationäre<br />
56
3. Ergebnisse<br />
Wachstumsphase sowie beim pH-Maximum (pH 9,0) bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase kultiviert wurden, konnten keine AHL-Signalmoleküle detektiert<br />
werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Des Weiteren wurde in Überständen<br />
ungepufferter Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase ein AHL-Nachweis<br />
erzielt (Probennr. 3), jedoch nicht in der stationären Wachstumsphase (Ergebnis<br />
nicht dargestellt).<br />
Bei Stamm Flo 1 erfolgte die Untersuchung auf AHL-Moleküle bei pH-Werten von<br />
7,0, 8,0, 8,5 und 9,0 nach 14 bzw. 21 Tagen Kultivierung bei einem Photonenfluss<br />
von 5 µE m -2 s -1 PAR (siehe Kap. 2.7.2.2). Für die DC-Analysen wurden jeweils 50 µl<br />
der AHL-Extrakte eingesetzt. Ein AHL-Nachweis wurde mit keinem Indikatorstamm<br />
erzielt.<br />
3.5.1.1 Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Im Anschluss an die pH-Untersuchungen wurde eine Azidifizierung von<br />
ungepufferten Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 nach YATES<br />
und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.3.2). Eine Kultivierung der<br />
ungepufferten Dunkelansätze erfolgte bis in die logarithmische bzw. stationäre<br />
Wachstumsphase (siehe Kap. 2.7.2.1). Die Ergebnisse des Azidifizierungsversuches<br />
für den Stamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-Sensorstamm sind in Abbildung<br />
3.11 a dargestellt, wobei ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und<br />
nicht-azidifizierten Kulturüberständen vorgenommen wurde. In der DC-Analyse mit<br />
dem Chromobacterium-Sensor wurden lediglich die azidifizierten Kulturüberstände<br />
untersucht (Abb. 3.11 b).<br />
57
3. Ergebnisse<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3 4 5 6 7 8<br />
1 2 3 4<br />
Probennummer<br />
Probennummer<br />
b<br />
� C4-HSL<br />
� C6-HSL<br />
� C8-HSL<br />
Abb. 3.11: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer<br />
Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C im Dunkeln bis in die<br />
logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert.<br />
a: Es wurden jeweils 2 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) und nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen (Probennr. 3 - 6) bzw. 20 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten<br />
Kulturüberständen (pH < 2) (Probennr. 7 und 8) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der<br />
AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen<br />
wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen<br />
eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-<br />
Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase;<br />
5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase; 7: pH < 2, aus logarithmischer Phase;<br />
8: pH < 2, aus stationärer Phase.<br />
b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (pH < 2) auf<br />
die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 1 und 2). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der<br />
Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen<br />
Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt.<br />
Auftragungsschema: 1: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 2: pH < 2, aus stationärer Phase;<br />
3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL).<br />
Aus Abbildung 3.11 a geht deutlich hervor, dass der nachgewiesene AHL-Gehalt in<br />
azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw.<br />
stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher ist als in nicht-azidifizierten<br />
a<br />
58
3. Ergebnisse<br />
Kulturüberständen. In der logarithmischen Wachstumsphase wurde ein AHL-Molekül<br />
detektiert (DC-Signal unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 3). Im Vergleich zur<br />
stationären Wachstumsphase (Probennr. 4) lagen in beiden Wuchsphasen in etwa<br />
gleiche AHL-Mengen vor. Ein weiteres AHL-Molekül wurde in der stationären<br />
Wachstumsphase, dünnschichtchromatographisch auf der Höhe von C4-HSL,<br />
nachgewiesen. Bei einem Auftragungsvolumen von 20 µl AHL-Extrakt konnte zudem<br />
in der logarithmischen Wachstumsphase von Stamm Bo 53-33 noch ein drittes AHL-<br />
Molekül in sehr geringer Menge (DC-Signal auf Höhe von C8-HSL) detektiert werden<br />
(Probennr. 7).<br />
Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde im azidifizierten Kulturüberstand<br />
der Kultur, welche bis in die logarithmische Wachstumsphase inkubiert worden war,<br />
ein kurzkettiges AHL-Molekül (DC-Spot etwas unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen<br />
(Abb. 3.11 b, Probennr. 1).<br />
Ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen von Stamm Bo 10-09 mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ist in<br />
Abbildung 3.12 a dargestellt. Für die DC-Analysen mit dem Chromobacterium-<br />
Sensor wurden lediglich AHL-Extrakte aufgetragen, welche aus azidifizierten<br />
Kulturüberständen gewonnen wurden (Abb. 3.12 b).<br />
59
3. Ergebnisse<br />
C4-HSL �<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL � C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
Abb. 3.12: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer<br />
Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C im Dunkeln bis in die<br />
logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert.<br />
a: Es wurden jeweils 30 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) (Probennr. 3 und 4) und<br />
nicht-azidifizierten Kulturüberständen (Probennr. 5 und 6) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum<br />
Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als<br />
Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen<br />
Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-<br />
Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase;<br />
5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase.<br />
b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (pH < 2) auf<br />
die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 3 und 4). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der<br />
Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen<br />
Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt.<br />
Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül<br />
(C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase.<br />
Wie aus Abbildung 3.12 a ersichtlich, ist der nachgewiesene AHL-Gehalt in<br />
azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw.<br />
stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher als in nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen. In beiden azidifizierten Kulturüberständen befanden sich<br />
mindestens zwei AHL-Signalmoleküle nach dünnschichtchromatographischer<br />
Auftrennung auf Höhe von C8-HSL und im Bereich von C6-HSL (Probennr. 3 und 4).<br />
Ein drittes AHL-Molekül im Bereich von C4-HSL konnte durch weitere DC-Analysen<br />
nicht eindeutig bestätigt werden. Das Erscheinungsbild der beiden AHL-Profile<br />
belegt, dass die gleichen AHL-Molekültypen in den verschiedenen<br />
Wachstumsphasen vorkamen, die Mengen der produzierten AHL-Moleküle jedoch<br />
variierten. Während das längerkettige AHL-Molekül in der stationären<br />
Wachstumsphase in deutlich höherer Konzentration vorlag, nahm die Menge des<br />
kurzkettigen AHL-Moleküls hingegen ab.<br />
a b<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4<br />
Probennummer Probennummer<br />
60
3. Ergebnisse<br />
Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde in den azidifizierten<br />
Kulturüberständen der Kulturen, welche bis in die logarithmische bzw. stationäre<br />
Wachstumsphase inkubiert worden waren, jeweils ein kurzkettiges AHL-<br />
Signalmolekül (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen<br />
(Abb. 3.12 b, Probennr. 3 und 4).<br />
3.5.2 Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die<br />
heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Zur Ermittlung des Lichteinflusses auf die Signalmolekül-Produktion in den<br />
heterotrophen Bakterienstämmen wurden die AHL-Gehalte in den Kulturüberständen<br />
Licht-inkubierter und dunkel-inkubierter Kulturen, kultiviert bis in die logarithmische<br />
bzw. stationäre Wachstumsphase, miteinander verglichen (siehe Kap. 2.7.2.1).<br />
Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-<br />
Sensorstamm sind in Abbildung 3.13 dargestellt. DC-Vorversuche mit dem<br />
Chromobacterium-Sensorstamm hatten ergeben, dass trotz großer Auftragsvolumina<br />
von bis zu 100 µl nur sehr schwache AHL-Nachweise mit Stamm Bo 53-33 zu<br />
verzeichnen waren. Daher wurde auf eine weitere Untersuchung mit diesem<br />
Sensorstamm verzichtet.<br />
61
3. Ergebnisse<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3 4 5 6<br />
Probennummer<br />
Abb. 3.13: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes<br />
Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei einem<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR (Probennr. 3 und 4) bzw. im Dunkeln (Probennr. 5 und 6) in<br />
ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase<br />
inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte<br />
aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6<br />
(Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle<br />
(C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: 5 µE m -2 s -1 PAR, aus logarithmischer<br />
Phase; 4: 5 µE m -2 s -1 PAR, aus stationärer Phase; 5: dunkel, aus logarithmischer Phase; 6: dunkel,<br />
aus stationärer Phase.<br />
Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile in Abbildung 3.13 bestätigt, dass<br />
die Art der AHL-Moleküle in den Licht-inkubierten und dunkel-inkubierten<br />
Versuchsansätzen sehr ähnlich ist. In allen AHL-Extrakten wurde ein Signalmolekül<br />
detektiert (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C6-HSL). Ein weiteres AHL-<br />
Molekül (DC-Spot lag auf Höhe von C4-HSL) wurde eindeutig in der stationären<br />
Wachstumsphase der Licht-inkubierten Versuchskultur nachgewiesen (Probennr. 4).<br />
Des Weiteren belegen die Spotgrößen, dass in den Überständen der Licht-<br />
inkubierten Versuchsansätze im Vergleich zu den jeweiligen Überständen der<br />
Dunkelansätze aus der logarithmischen bzw. stationären Wachstumsphase keine<br />
signifikanten Unterschiede in den AHL-Konzentrationen vorlagen.<br />
Für den Bakterienstamm Bo 10-09 betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte<br />
jeweils 30 µl. Die Licht-inkubierten Versuchsansätze von Stamm Bo 10-09 wiesen<br />
das gleiche AHL-Profil auf wie die dunkel-inkubierten Ansätze (siehe Kap. 3.5.1,<br />
Abb. 3.10, Probennr. 3). Demnach wurde in der logarithmischen Wachstumsphase<br />
Licht-inkubierter Versuchsansätze in ähnlicher Konzentration ein AHL-Molekül<br />
62
3. Ergebnisse<br />
nachgewiesen. In der stationären Wachstumsphase konnte kein AHL-Nachweis<br />
erzielt werden.<br />
3.5.3 Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion<br />
von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33<br />
und Bo 10-09<br />
Die in Assoziation mit Cyanobakterien lebenden heterotrophen Bakterien existieren<br />
unter Mangelbedingungen. Eine Auswirkung von verschiedenen<br />
Nährstoffbedingungen auf die Produktion von AHL-Molekülen bei den zu<br />
untersuchenden heterotrophen Bakterien ist dementsprechend von Interesse.<br />
Daher wurden die Bakterienstämme im ASNIII/2-Medium mit nur 0,1% Fleischextrakt<br />
bis zur stationären Phase angezogen (siehe Kap. 2.7.2.1). Die unter diesen<br />
Bedingungen produzierten AHL-Moleküle wurden nach Extraktion mit den AHL-<br />
Molekülen verglichen, welche aus Kulturen mit dem standardmäßig verwendeten<br />
ASNIII/2-Medium mit 1% Fleischextrakt extrahiert worden waren. Zur Detektion der<br />
AHL-Moleküle wurde der Agrobacterium-Sensorstamm eingesetzt. Die Ergebnisse<br />
sind in Abbildung 3.14 dargestellt.<br />
63
3. Ergebnisse<br />
C8-HSL �<br />
C6-HSL C4-HSL<br />
�<br />
�<br />
1 2 3 4 5 6<br />
Probennummer<br />
Abb. 3.14: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen der Bakterienstämme<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in<br />
0,1% FE versetztem bzw. standardmäßig verwendetem (1% FE) ASNIII/2-Medium bei 21 °C im<br />
Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl (Stamm Bo 53-33)<br />
bzw. jeweils 40 µl (Stamm Bo 10-09) der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte<br />
aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4<br />
(pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6<br />
(Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: Stamm Bo 53-33, 1% FE;<br />
2: Stamm Bo 53-33, 0,1% FE; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-<br />
Referenzmolekül (C4-HSL); 5: Stamm Bo 10-09, 1% FE; 6: Stamm Bo 10-09, 0,1% FE.<br />
FE = Fleischextrakt.<br />
Aus Abbildung 3.14 wird ersichtlich, dass der mit 0,1% Fleischextrakt kultivierte<br />
Bo 53-33-Ansatz (Probennr. 2) eine leicht stärkere AHL-Produktion aufwies als der<br />
mit 1% Fleischextrakt kultivierte (Probennr. 1), erkennbar durch den größeren DC-<br />
Spotdurchmesser (DC-Spot geringfügig unterhalb von C6-HSL).<br />
Ein schwacher AHL-Nachweis konnte für den Stamm Bo 10-09 in einer<br />
Versuchskultur, kultiviert mit 0,1% Fleischextrakt, erzielt werden<br />
(dünnschichtchromatographisch geringfügig unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 6).<br />
Mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnten indes im Überstand einer Kultur,<br />
kultiviert mit 1% Fleischextrakt, keine AHL-Moleküle detektiert werden (Probennr. 5).<br />
Zur Feststellung eines Temperatureinflusses auf die AHL-Menge in Überständen<br />
bzw. auf die AHL-Produktion an sich wurden in einer weiteren Untersuchung<br />
Versuchsansätze der Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33 bei 28 °C bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase hin inkubiert (siehe Kap. 2.7.2.1). Anschließend wurden die AHL-<br />
Gehalte der Überstände mit denen von Kulturen verglichen, welche bei 21 °C bis in<br />
die stationäre Wachstumsphase inkubiert worden waren. Die Ergebnisse für den<br />
64
3. Ergebnisse<br />
Bakterienstamm Bo 53-33 unter Verwendung des Agrobacterium-Sensorstammes<br />
sind in Abbildung 3.15 dargestellt.<br />
Im Kulturüberstand von Stamm Bo 10-09 konnte auch bei einer<br />
Inkubationstemperatur von 28 °C in der stationären Wachstumsphase kein AHL-<br />
Nachweis erzielt werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Für den Stamm Bo 10-09<br />
betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte jeweils 30 µl.<br />
1 2 3 4<br />
Probennummer<br />
� C4-HSL<br />
� C6-HSL<br />
� C8-HSL<br />
Abb. 3.15: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes<br />
Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem<br />
ASNIII/2-Medium bei 21 °C (Probennr. 1) bzw. 28 °C (Probennr. 2) im Dunkeln bis in die stationäre<br />
Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf<br />
die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens<br />
NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel<br />
2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: 21 °C, aus stationärer<br />
Wachstumsphase; 2: 28 °C, aus stationärer Wachstumsphase; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL<br />
und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL).<br />
Wie aus Abbildung 3.15 hervorgeht, wurden nach einer Kultivierung von Stamm<br />
Bo 53-33 bei 28 °C bis in die stationäre Wachstumsphase zwei Signalmoleküle<br />
detektiert (Probennr. 2). Bei einem Vergleich der Spotdurchmesser (DC-Spot<br />
geringfügig unterhalb von C6-HSL) wird deutlich, dass der bei 28 °C kultivierte<br />
Versuchsansatz eine wesentlich geringere AHL-Menge aufwies als der<br />
Versuchsansatz, welcher bei 21 °C inkubiert wurde (siehe Probennr. 1 und 2).<br />
65
3. Ergebnisse<br />
3.5.4 Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1<br />
Eine Anzucht von Stamm Flo 1 in ungepufferten Kulturmedien für 14 bzw. 21 Tage<br />
bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR (siehe Kap. 2.7.2.2) und<br />
anschließender Untersuchung von azidifizierten und nicht-azidifizierten<br />
Kulturüberständen auf AHL-Moleküle mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ergab<br />
die in Abbildung 3.16 dargestellten Ergebnisse. Des Weiteren wurden AHL-Moleküle<br />
aus 1000 ml Überstand extrahiert, wobei die Versuchskulturen zuvor für 8 Wochen<br />
unter gleichen Kultivierungsbedingungen angezogen worden waren.<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Probennummer<br />
Abb. 3.16: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des cyanobakteriellen<br />
Stammes Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in<br />
ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C für 14 bzw. 21 Tage (Probennr. 3 - 6) bzw. für 8 Wochen<br />
(Probennr. 7) bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR inkubiert. Es wurden jeweils 50 µl der<br />
AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) und nicht-azidifizierten 250 ml Kulturüberständen<br />
(Probennr. 3 - 6) bzw. 50 µl AHL-Extrakt aus einem nicht-azidifizierten 1000 ml Kulturüberstand<br />
(Probennr. 7) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der<br />
Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen<br />
Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt.<br />
Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül<br />
(C4-HSL); 3: pH < 2, nach 14 Tagen; 4: pH < 2, nach 21 Tagen; 5: nach 14 Tagen; 6: nach 21 Tagen;<br />
7: nach 8 Wochen.<br />
Wie aus Abbildung 3.16 hervorgeht, wurden nach 14- bzw. 21-tägiger Kultivierung<br />
der ungepufferten Flo 1-Kulturen in den Überständen AHL-Moleküle nachgewiesen<br />
(Probennr. 5 und 6). Die kleinen Durchmesser der einzelnen DC-Spots weisen auf<br />
einen geringen AHL-Gehalt in den Überständen hin. Es wurden zwei AHL-<br />
Molekültypen (DC-Signale auf Höhe von C8-HSL und C6-HSL) mit ähnlichen<br />
Konzentrationen in beiden Überständen gefunden. Eine Azidifizierung der<br />
66
3. Ergebnisse<br />
Kulturüberstände führte bei der 21 Tage lang inkubierten Flo 1-Kultur zu einem<br />
stärkeren Nachweis des längerkettigen AHL-Moleküls (DC-Spot auf Höhe von C8-<br />
HSL) (Probennr. 4). Aufgrund einer fehlerhaft durchgeführten Azidifizierung des<br />
Überstandes der Flo 1-Kultur, angezogen für 14 Tage, konnten bezüglich einer AHL-<br />
Produktion in dieser Kultur keine gesicherten Aussagen getätigt werden<br />
(Probennr. 3).<br />
In 1000 ml Überstand aus Flo 1-Kulturen, welche für 8 Wochen inkubiert wurden,<br />
konnten drei AHL-Moleküle detektiert werden. Neben einem deutlich stärkeren Signal<br />
für das längerkettige AHL-Molekül auf Höhe von C8-HSL war ein weiterer DC-Spot<br />
auf Höhe von C4-HSL ein Beleg dafür, dass noch ein drittes AHL-Molekül im<br />
Überstand von Flo 1-Kulturen vorkommt (Probennr. 7).<br />
3.5.5 Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen<br />
Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium<br />
Stamm Flo 1<br />
Sowohl die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 als auch der<br />
Cyanobakterienstamm Flo 1 wurden intrazellulär auf AHL-Moleküle hin untersucht.<br />
Der Stamm Flo 1 wurde dazu für 14 bzw. 21 Tage in ungepuffertem Nährmedium bei<br />
einer Photonenflussdichte von 5 µE m -2 s -1 PAR kultiviert (siehe Kap. 2.7.2.2) Die<br />
heterotrophen Stämme wurden, wie bereits in Kapitel 3.5.1 beschrieben, in<br />
gepufferten und ungepufferten Nährmedien bis in die logarithmische bzw. stationäre<br />
Wachstumsphase angezogen. Die Aufarbeitung der bakteriellen Biomasse wurde<br />
nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in veränderter Form durchgeführt (siehe<br />
Kap. 2.7.3.4).<br />
Für den heterotrophen Bakterienstamm Bo 10-09 wurde bei Auftragungsvolumina<br />
zwischen 10 - 60 µl der Ammoniumacetat-Extrakte für keinen Versuchsansatz ein<br />
intrazellulärer AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm erzielt. Die<br />
Ergebnisse der analytischen DC für den Stamm Bo 53-33 und Stamm Flo 1 sind in<br />
Abbildung 3.17 dargestellt, wobei der AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensor<br />
erfolgte.<br />
67
3. Ergebnisse<br />
C4-HSL �<br />
C6-HSL �<br />
C8-HSL �<br />
Abb. 3.17: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus bakterieller Biomasse des Bakterienstammes<br />
Bo 53-33 und des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer<br />
Auftrennung.<br />
a: Die Bo 53-33-Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium (Probennr. 3 und 4) und bei<br />
unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien (Probennr. 5 - 9) bei 21 °C im Dunkeln bis<br />
in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 30 µl der Extrakte<br />
aus den bakteriellen Biomassen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle<br />
wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die<br />
synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt.<br />
Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül<br />
(C4-HSL); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: pH 6, aus stationärer Phase;<br />
6: pH 7, aus logarithmischer Phase; 7: pH 7, aus stationärer Phase; 8: pH 8,5, aus stationärer Phase;<br />
9: pH 9,0, aus stationärer Phase.<br />
b: Die Flo 1-Kultur wurde in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C für 21 Tage bei einem<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR inkubiert. Es wurden 60 µl Extrakt aus der bakteriellen Biomasse<br />
auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm<br />
A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in<br />
den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema:<br />
1: cyanobakterieller Extrakt; 2: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 3: AHL-<br />
Referenzmolekül (C4-HSL).<br />
Abbildung 3.17 a ist zu entnehmen, dass im heterotrophen Stamm Bo 53-33,<br />
abgesehen von einer Kultivierung bei pH 8,5 und pH 9,0, eine geringe AHL-Menge<br />
nachgewiesen wurde (Probennr. 3 - 7). Die detektierten DC-Spots lagen dabei auf<br />
gleicher Höhe (geringfügig unterhalb von C6-HSL) wie die jeweiligen AHL-Moleküle<br />
in extrazellulären Untersuchungen (siehe Kap. 3.5.1, Abb. 3.9). Des Weiteren lassen<br />
die Spotdurchmesser vermuten, dass der AHL-Gehalt in exponentiell wachsenden<br />
Bakterienzellen höher war (Probennr. 3) als in Bakterienzellen in der Stationärphase<br />
(Probennr. 4).<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3<br />
Probennummer Probennummer<br />
Für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 wurde in der 21 Tage lang inkubierten<br />
Versuchskultur ein intrazellulärer AHL-Nachweis erzielt (Abb. 3.17 b). Nach<br />
dünnschichtchromatographischer Auftrennung der AHL-Extrakte wurden mit dem<br />
a<br />
b<br />
� C4-HSL<br />
� C6-HSL<br />
� C8-HSL<br />
68
3. Ergebnisse<br />
Agrobacterium-Sensor zwei DC-Spots erhalten. Ein DC-Signal lag auf Höhe der<br />
Probenauftragung, das andere geringfügig oberhalb von C4-HSL (Abb. 3.17 b,<br />
Probennr. 1).<br />
3.6 Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen<br />
3.6.1 Extraktion der chromosomalen DNA<br />
Aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen<br />
Stämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 wurde deren chromosomale DNA extrahiert (siehe<br />
Kap. 2.8.1) und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. DNA-Menge und Reinheit der DNA<br />
wurden mit einem Spektralphotometer (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000)<br />
ermittelt (siehe Kap. 2.8.2). Die DNA-Ausbeuten sind in Tabelle 3.3<br />
zusammengefasst.<br />
Tab. 3.3: Ermittelte DNA-Ausbeute nach DNA-Extraktion aus den Cyanobakterien-<br />
stämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen Stämmen Bo 53-33 und Bo 10-09<br />
Bakterienstamm DNA-Ausbeute [ng/µl]<br />
Bo 10 (Cyanobakterium) 740<br />
Bo 53 (Cyanobakterium) 1153<br />
Bo 10-09 (heterotrophes Bakterium) 5975<br />
Bo 53-33 (heterotrophes Bakterium) 6014<br />
3.6.2 Amplifikation der 16S-rDNA<br />
Durch die Amplifikation der 16S-rDNA von Cyanobakterium Stamm Bo 53 mittels<br />
einer Standard-PCR (siehe Kap. 2.8.3) wurde ein ca. 1500 bp großes DNA-Fragment<br />
erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Für das Cyanobakterium Stamm Bo 10 wurde neben<br />
einer ca. 1500 bp großen Bande noch weitere 1 - 2 Banden im Agarosegel detektiert.<br />
Eine Separation der 16S-rDNA-Amplifikate aus dem Gel erfolgte durch Extraktion<br />
(siehe Kap. 2.8.5).<br />
3.6.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der<br />
16S-rDNA-Sequenz<br />
Die ermittelten 16S-rDNA-Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 (1333 bp)<br />
und Bo 10 (1336 bp) sind nach Alignment im Anhang dargestellt (siehe Tab. 7.2 und<br />
Tab. 7.3). Die Sequenzen wurden mit Sequenzen aus der öffentlichen Datenbank<br />
69
3. Ergebnisse<br />
NCBI mittels BLAST (nucleotide blast) verglichen. Die kultivierten Stämme mit der<br />
größten Sequenzübereinstimmung sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Der<br />
Stamm Bo 53 wurde bereits von LYRA und Mitarbeitern (2005) sequenziert und als<br />
Nodularia harveyana eingeordnet. Ein Abgleich der ermittelten 16S-rDNA-Sequenz<br />
mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten 16S-rDNA-Sequenz (Accession-Nr.:<br />
AJ781143.1) zeigte eine Übereinstimmung von 99,85% auf. Der Stamm Bo 10 wurde<br />
von RETHMEIER (1995) auf Grundlage von morphologischen Merkmalen als<br />
Oscillatoria brevis klassifiziert. Für einen Vergleich von Stamm Bo 10 mit weiteren<br />
Stämmen der Ordnung Oscillatoriales wurden die 16S-rDNA-Sequenzen der<br />
Geitlerinema-Stämme Flo 1 (1372 bp) und PCC 7105 (Referenzstamm) (1378 bp)<br />
zur Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes herangezogen<br />
(SCHRÜBBERS, 2007).<br />
Tab. 3.4: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Nodularia harveyana-Stammes Bo 53 mit den<br />
gegenwärtig verfügbaren Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die<br />
Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 53 in<br />
Prozent und die jeweilige Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt.<br />
Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr.<br />
Nodularia harveyana<br />
BECID27<br />
Nodularia harveyana<br />
BECID29<br />
Nodularia spumigena<br />
BY1<br />
Nodularia sphaerocarpa<br />
BECID36<br />
Nodularia spumigena<br />
HEM<br />
Nodularia spumigena<br />
Huebel 1987/311<br />
Nodularia baltica<br />
BY1<br />
1435 99,70% AJ781145.1<br />
1450 98,94% AJ781146.1<br />
1500 98,57% AF268004.1<br />
1605 98,50% AJ781147.1<br />
1568 98,11% AJ781134.1<br />
1412 98,33% AJ781133.1<br />
1445 98,42% AJ133177.1<br />
Tabelle 3.4 ist zu entnehmen, dass der cyanobakterielle Stamm Bo 53 die größten<br />
16S-rDNA-Sequenzhomologien mit Bakterienstämmen der Gattung Nodularia<br />
aufweist, insbesondere mit Vertretern der Spezies Nodularia harveyana. Gegenüber<br />
den Stämmen BECID27 bzw. BECID29 zeigt der zu untersuchende Stamm Bo 53<br />
Sequenzübereinstimmungen von 99,70% bzw. 98,94% auf. Die ersten 50 16S-rDNA-<br />
Sequenzen, ermittelt mittels BLAST aus der NCBI-Datenbank, sind ausschließlich<br />
Sequenzen von Nodularia-Spezies mit mindestens 97%iger Sequenzhomologie.<br />
70
3. Ergebnisse<br />
Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 53 und naheverwandten Stämmen<br />
(siehe Tab. 3.4) erfolgte nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von<br />
JUKES und CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen<br />
Stammbaumes (siehe Kap. 2.8.7) (siehe Abb. 3.18).<br />
0.01<br />
86<br />
67<br />
100<br />
71<br />
99<br />
Nodularia spumigena HEM (AJ781134.1)<br />
Nodularia spumigena Huebel 1987/311 (AJ781133.1)<br />
Nodularia spumigena BY1 (AF268004.1)<br />
Nodularia baltica BY1 (AJ133177.1)<br />
Nodularia sphaerocarpa BECID36 (AJ781147.1)<br />
Nodularia harveyana BECID29 (AJ781146.1)<br />
Nodularia harveyana BECID27 (AJ781145.1)<br />
Nodularia harveyana Bo 53<br />
Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1)<br />
Abb. 3.18: Phylogenetischer Stammbaum nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von<br />
JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 53 und<br />
naheverwandten Nodularia-Spezies. Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1) wurde als<br />
Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz-Sequenzen sind in Klammern<br />
angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die Bootstrap-Werte in Prozent<br />
dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid-Position.<br />
Abbildung 3.18 zeigt, dass Stamm Bo 53 insbesondere eine enge<br />
Verwandtschaftsbeziehung mit dem Nodularia harveyana-Stamm BECID27 aufweist.<br />
Zu den weiteren Nodularia-Spezies ergab sich ein abgegrenztes Cluster. Der Stamm<br />
Gloeobacter violaceus PCC 8105 grenzt sich als verwendete Außengruppe deutlich<br />
von den Nodularia-Spezies ab.<br />
Tab. 3.5: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Stammes Bo 10 mit den gegenwärtig verfügbaren<br />
Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die Länge der hinterlegten<br />
Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 10 in Prozent und die jeweilige<br />
Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt.<br />
Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr.<br />
Phormidium pseudopristleyi<br />
ANT.ACEV5.3<br />
Phormidium lumbricale<br />
UTCC 476<br />
Phormidium cf. terebriformis<br />
KR2003/25<br />
1463 99,32% AY493600.1<br />
1353 98,64% AF218375.1<br />
1348 98,42% AY575936.1<br />
Oscillatoria acuminata 1434 98,12% AB039014.1<br />
71
3. Ergebnisse<br />
Tabelle 3.5 ist zu entnehmen, dass Stamm Bo 10 die nahesten<br />
Verwandtschaftsbeziehungen zu Vertretern der Gattung Phormidium und hier die<br />
größte Übereinstimmung in der 16S-rDNA-Sequenz mit Phormidium pseudopristleyi<br />
Stamm ANT.ACEV5.3 (99,32%) aufweist.<br />
Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 10 und naheverwandten Stämmen<br />
(siehe Tab. 3.5) sowie der 16S-rDNA-Sequenz der Stämme Flo 1 und PCC 7105<br />
erfolgte nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von JUKES und<br />
CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaumes (siehe<br />
Kap. 2.8.7) (siehe Abb. 3.19).<br />
0.01<br />
100<br />
78<br />
66<br />
100<br />
Phormidium cf. terebriformis KR2003/25 (AY575936.1)<br />
Oscillatoria acuminata (AB039014.1)<br />
Oscillatoria brevis Bo 10<br />
Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (AY493600.1)<br />
Phormidium lumbricale UTCC 476 (AF218375.1)<br />
100<br />
Geitlerinema sp. PCC 7105<br />
Geitlerinema sp. Flo 1<br />
Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1)<br />
Abb. 3.19: Phylogenetischer Stammbaum nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von<br />
JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 10,<br />
naheverwandten Bakterienspezies sowie der Stämme Flo 1 und PCC 7105. Gloeobacter violaceus<br />
PCC 8105 (AF132791.1) wurde als Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz-<br />
Sequenzen sind in Klammern angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die<br />
Bootstrap-Werte in Prozent dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen<br />
pro Nukleotid-Position.<br />
Aus Abbildung 3.19 geht hervor, dass Stamm Bo 10 zwar<br />
Verwandtschaftsbeziehungen mit verschiedenen Phormidium-Spezies und einer<br />
Oscillatoria-Spezies aufweist, aber ein eigenes Cluster bildet. Die beiden<br />
Geitlerinema-Stämme Flo 1 und PCC 7105 grenzen sich als Cluster, wie auch der<br />
als Außengruppe verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105, deutlich von<br />
den Vertretern der Gattungen Phormidium und Oscillatoria ab.<br />
72
3. Ergebnisse<br />
3.6.4 Amplifikation des gyrB-Gens<br />
Durch die Amplifikation des gyrB-Gens der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10<br />
mittels einer Standard-PCR (siehe Kap. 2.8.3) wurde ein ca. 1200 bp großes DNA-<br />
Fragment erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Die Sequenzen des gyrB-Gens der<br />
Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 konnten für eine Erstellung von<br />
phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der gyrB-Sequenz aber nicht verwandt<br />
werden. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 konnten<br />
nach einer Standard-PCR mit den gyrB-spezifischen Primern keine ca. 1200 bp<br />
großen Banden im Agarosegel detektiert werden.<br />
3.6.5 Internal Transcribed Spacer (ITS)<br />
Nach Amplifikation der ITS der cyanobakteriellen Stämme Bo 10, Flo 1 und PCC<br />
7105 (siehe Kap. 2.8.3) wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgetrennt<br />
(siehe Kap. 2.8.4). Das Gelbild ist in Abbildung 3.20 dargestellt.<br />
Proben bp<br />
− 3000<br />
− 1500<br />
− 1000<br />
− 700<br />
− 500<br />
− 400<br />
− 100<br />
Abb. 3.20: ITS-Bandenmuster der Cyanobakterienstämme Bo 10 (Probe 1 und 2), Flo 1 (Probe 3<br />
und 4) und PCC 7105 (Probe 5 und 6) nach Fragmentauftrennung in einem 2%igen Agarosegel.<br />
M: Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus; NK: Negativkontrolle ohne DNA-Template.<br />
Abbildung 3.20 zeigt das Gelbild der ITS-Amplifikate der cyanobakteriellen Stämme<br />
Flo 1, PCC 7105 und Bo 10. Für die beiden Geitlerinema-Stämme Flo 1 und<br />
PCC 7105 konnte im Bereich von 600 bp - 700 bp eine Bande dokumentiert werden.<br />
Für Stamm Bo 10 wurden im Bereich von 500 bp - 700 bp drei Banden detektiert. Die<br />
73
3. Ergebnisse<br />
DNA-Fragmente wiesen Größen von ~500 bp, ~650 bp und ~700 bp auf. Das<br />
unterschiedliche Bandenmuster bzw. die unterschiedliche Anzahl von amplifizierten<br />
ITS-Regionen bei Stamm Bo 10 gegenüber den Geitlerinema-Stämmen zeigt auf,<br />
dass Stamm Bo 10 nicht der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden kann.<br />
74
4. Diskussion<br />
4. Diskussion<br />
Im Mittelpunkt der vorliegenden Diplomarbeit standen sowohl der Nachweis von<br />
AHL-Signalmolekülen bei den heterotrophen Bakterien Porphyrobacter Stamm<br />
Bo 53-33 und Muricauda Stamm Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium Geitlerinema<br />
Stamm Flo 1 als auch die Abhängigkeit der Signalmolekül-Produktion der oben<br />
genannten Mikroorganismen bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen.<br />
Neben den Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 werden des Weiteren in diesem Kapitel die<br />
Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen zur phylogenetischen<br />
Einordnung der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 diskutiert.<br />
4.1 Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen<br />
4.1.1 Verwendete Puffersysteme<br />
Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der Bakterienstämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 in Kulturmedien mit verschiedenen pH-Werten mussten zur Abdeckung des<br />
pH-Bereiches von pH 2,0 - 10,0 verschiedene Puffersysteme eingesetzt werden<br />
(siehe Kap. 2.6.2, Tab. 2.14). Jedes Puffersystem beeinflusst das Kulturmedium und<br />
die im Nährmedium wachsenden Bakterien unterschiedlich. Folglich zeigten<br />
bestimmte Puffersysteme einen inhibierenden Einfluss auf das Wachstum der<br />
Bakterien und konnten nicht weiter verwendet werden (siehe Kap. 3.1). So hatte die<br />
im Clark and Lubs(C&L)-Puffer enthaltene Borsäure wahrscheinlich einen toxischen<br />
Einfluss auf die Bakterien (MORTIMER, 2007). Des Weiteren können organischen<br />
Puffer-Komponenten (Citronensäure, Maleat und Glycin) als potentielle<br />
Kohlenstoffquelle Einfluss auf das Wachstumverhalten bei einem bestimmten pH-<br />
Wert nehmen. Wesentliche Probleme bei der Pufferung von mineralischen<br />
Kulturmedien zeichnen sich vor allem im alkalischen Bereich ab, indem Kationen<br />
(z.B. Mg 2+ - und Ca 2+ -Ionen) stark polarisierend auf Anionen wirken und kovalente<br />
Bindungen eingehen. Dabei liegen starke Tendenzen zur Bildung von unlöslichen<br />
Komplex-Ionen vor (MORTIMER, 2007). Diese Interaktionen von Puffer und<br />
Kulturmedium sowie von verschiedenen Komponenten des Kulturmediums bei hohen<br />
75
4. Diskussion<br />
pH-Werten resultieren in Ausfällungen und gehen mit einem starken Nährstoffentzug<br />
im Kulturmedium einher.<br />
Die gewählten Puffersysteme stellen dementsprechend einen Kompromiss zwischen<br />
der Pufferkapazität des jeweiligen Puffers sowie dessen Verträglichkeit für die<br />
Testorganismen und den mit steigendem pH-Wert zunehmenden Mineralsalz-<br />
Ausfällungen dar.<br />
4.1.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten<br />
Mikroorganismen können extreme Umgebungen besiedeln. Das mikrobielle<br />
Wachstum kann dabei durch die Azidität und Alkalität eines Lebensraumes stark<br />
beeinflusst werden (MADIGAN et al., 2001). Aufgrund ihres pH-Toleranzbereiches<br />
können Mikroorganismen in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Der Großteil<br />
toleriert dabei als Neutrophile einen pH-Bereich von 5,0 bis 8,5 (zitiert aus RIUS und<br />
LOREN, 1998). Azidophile wachsen in einem sauren pH-Bereich, wobei mikrobielles<br />
Wachstum auch bei sehr niedrigen pH-Werten (pH < 3) vorliegt und oftmals selber<br />
Ursache für die Azidität der Umgebung ist (z.B. bakterielle Oxidation von<br />
Sulfidmineralien) (HALLBERG und JOHNSON, 2001). Alkaliphile können ein<br />
optimales Wachstum bei pH-Werten oberhalb von 9,0, oft zwischen 10,0 - 12,0<br />
aufweisen, wachsen aber nicht oder lediglich langsam bei neutralem pH-Wert<br />
(HORIKOSHI, 1999).<br />
Der heterotrophe Bakterienstamm Porphyrobacter Bo 53-33 wächst in einem pH-<br />
Bereich von 6,0 - 9,0 (siehe Kap. 3.2). Das beste Wachstum konnte bei pH 7,0<br />
festgestellt werden, was nahezu dem standardmäßig eingesetzten ASNIII/2-Medium<br />
(pH 7,1) entspricht. Ein geringes Wachstum wurde bei pH-Werten von 6,0 und 9,0<br />
verzeichnet. Bei diesen pH-Werten bildete der Porphyrobacter-Stamm,<br />
wahrscheinlich zur Schaffung eines eigenen pH-Milieus, deutlich abgegrenzte<br />
Zellagglomerate aus. Aufgrund des relativ großen pH-Toleranzbereiches sowie des<br />
pH-Optimums ist Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 als pH-tolerantes, neutrophiles<br />
Bakterium einzuordnen, was sich mit dem natürlichen Habitat mariner Bakterien<br />
deckt (pH 7,8 - 8,2: HAWLEY, 1981).<br />
Im Genus Porphyrobacter, mit mittlerweile 7 klassifizierten Stämmen auf Spezies-<br />
Ebene, wurden identische pH-Toleranzbereiche (6,0 - 9,0) bei den Vertretern<br />
P. sanguineus (HIRAISHI et al., 2002) und P. tepidarius (HANADA et al., 1997)<br />
ermittelt, mit einem langsamen Wachstum bei pH-Werten von 6,0 und 9,0. Einen<br />
76
4. Diskussion<br />
deutlich größeren pH-Toleranzbereich von 5,5 - 10,0 weist dagegen das vor kurzem<br />
beschriebene Bakterium P. meromictius auf (RATHGEBER et al., 2007), für aerobe<br />
anoxygen phototrophe Bakterien (α-4-Unterklasse der Proteobakterien) der bisweilen<br />
maximal tolerierbare pH-Bereich. Das potentielle Wachstum dieses Bakteriums in<br />
diesem großen pH-Bereich ist wahrscheinlich auf dessen natürliche Umgebung,<br />
einem stark Natriumsulfat-haltigen Gewässer, zurückzuführen. Der optimale pH-Wert<br />
für das Wachstum einiger Porphyrobacter-Spezies wurde im Bereich 7,0 - 8,0<br />
detektiert, wobei zwischen den einzelnen Spezies geringfügige Unterschiede<br />
bestehen (HIRAISHI et al., 2002; RAINEY et al., 2003; YOON et al., 2004, 2006)<br />
Der Bakterienstamm Muricauda Bo 10-09 ist aufgrund des pH-Toleranzbereiches<br />
von 6,0 - 9,0, mit einem schwachen Wachstum bei pH 9,0 und einem ermittelten pH-<br />
Optimum bei 8,0 (siehe Kap. 3.2), ebenfalls als neutrophiles Bakterium einzuordnen.<br />
Weitere Untersuchungen mit einem anderen Puffersystem (Tris-HCl-Puffer, pH 7,1)<br />
zeigten auf, dass das pH-Optimum für Stamm Bo 10-09 wahrscheinlich im Bereich<br />
von pH 7,0 liegt (Daten nicht gezeigt).<br />
Das Genus Muricauda (Flavobacteriaceae) ist der Ordnung Cytophagales zugehörig.<br />
Deren Vertreter sind ubiquitär anzutreffen und bilden in marinen Gewässern und<br />
Umgebungen die größte Bakteriengruppe (BRUNS et al., 2001). GLÖCKNER und<br />
Mitarbeiter (1999) konnten dabei in allen untersuchten marinen Proben sowie<br />
Süßwasser-Proben Bakterien der Ordnung Cytophagales nachweisen.<br />
Für die bisher bekannten Arten der Gattung Muricauda (M. ruestringensis,<br />
M. flavescens und M. aquimarina) wurden pH-Optima im Bereich von 6,5 - 7,5 bzw.<br />
um 7,0 dokumentiert (BRUNS et al., 2001; YOON et al., 2005). Mit einem Wachstum<br />
im Bereich von pH 6,0 - 8,0 wurde für das Bakterium M. ruestringensis ein relativ<br />
kleiner pH-Toleranzbereich festgestellt (BRUNS et al., 2001), während für die beiden<br />
anderen Spezies der Gattung noch ein schwaches Wachstum bei einem pH-Wert<br />
von 5,0 nachgewiesen wurde (YOON et al., 2005).<br />
Die lange Kultivierungszeit der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bis<br />
zum Eintritt in die stationäre Wachstumsphase ist bei einer gewählten<br />
Inkubationstemperatur von 21 °C primär auf die Anzuchtsbedingungen<br />
zurückzuführen. Ein optimales Wachstum wurde für die Vertreter der Gattung<br />
Porphyrobacter im Bereich von 30 - 37 °C (YOON et al., 2004, 2006) bzw. weit<br />
77
4. Diskussion<br />
oberhalb dessen (HANADA et al., 1997; RAINEY et al., 2003) festgestellt. Für die<br />
von YOON und Mitarbeitern (2005) beschriebene Spezies Muricauda aquimarina<br />
wurde ein Temperatur-Optimum von 30 - 37 °C berichtet.<br />
Das Wachstum der heterotrophen Bakterienstämme war überwiegend durch eine<br />
deutliche Alkalisierung der gepufferten und ungepufferten Kulturmedien<br />
gekennzeichnet (siehe Kap. 3.2.1). Diese pH-Verschiebungen sind wahrscheinlich in<br />
erster Linie auf die Freisetzung von Ammonium-Ionen sowie Kohlendioxid aus<br />
Proteinen und Peptiden des im ASNIII/2-Medium enthaltenen Fleischextraktes<br />
zurückzuführen. Eine längerfristige Pufferung von Versuchskulturen ist demnach bei<br />
Verwendung eines Vollmediums nicht möglich, da zu viele Stoffwechselreaktionen<br />
die Pufferkapazität reduzieren. Des Weiteren kann eine aktive pH-Wert-Einstellung<br />
durch die heterotrophen Bakterien vermutet werden, da bei pH 8,5- bzw. pH 9,0-<br />
gepufferten Kulturen der pH-Wert konstant blieb bzw. sich leicht erniedrigte.<br />
4.1.3 Wachstumsverhalten unter Lichteinfluss<br />
Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden aus nicht-<br />
axenischen Cyanobakterienkulturen isoliert (HUBE, 2008) und können in engen<br />
assoziierten Lebensgemeinschaften mit Cyanobakterien auftreten (TUOMAINEN et<br />
al., 2006; STEVENSON und WATERBURY, 2006). Cyanobakterien nutzen als<br />
photosynthetische Bakterien das Licht als primäre Energiequelle zur CO2-Fixierung<br />
(FUCHS, 2007). Die Porphyrobacter-Spezies (α-Proteobakterien) zeichnen sich<br />
durch die Synthese von Photopigmenten (Bakteriochlorophyll a (Bchl a)) und von<br />
großen Mengen an Carotinoiden aus (YURKOV und BEATTY, 1998). Im Gegensatz<br />
zu den anaeroben anoxygenen phototrophen Proteobakterien besitzen diese<br />
Bakterien aber nicht die Fähigkeit, die Photopigmente zur anoxygenen<br />
Photosynthese für ein phototrophes Wachstum unter anaeroben Bedingungen zu<br />
nutzen (YURKOV und BEATTY, 1998; RATHGEBER et al., 2004) und wurden daher<br />
als aerobe anoxygene phototrophe Bakterien beschrieben. Die<br />
membrangebundenen Photopigmente und akzessorischen Proteine dienen dabei<br />
dem Aufbau eines elektrochemischen Membranpotentials, wobei letztlich ATP-<br />
Äquivalente aus der protonenmotorischen Kraft generiert werden (WAGNER-<br />
DÖBLER und BIEBL, 2006). Geringe Lichtintensitäten führen bei aeroben<br />
anoxygenen Phototrophen zu einer vollständigen Inhibierung der Bchl a-Synthese<br />
(WAGNER und BIEBL, 2006). Dabei wirken bereits Lichtintensitäten von<br />
78
4. Diskussion<br />
20 µE m -2 s -1 PAR auf die Photopigment-Synthese stark inhibierend (zitiert aus<br />
YURKOV und BEATTY, 1998).<br />
Der Porphyrobacter-Stamm Bo 53-33 zeigte bei einem Photonenfluss von<br />
5 µE m -2 s -1 PAR kein sichtlich verändertes Wachstum gegenüber einer<br />
Dunkelinkubation auf (siehe Kap. 3.3). Dementsprechend hatte das Licht als<br />
zusätzliche Energiequelle anscheinend keinen stimulierenden Einfluss auf das<br />
heterotrophe Wachstum der Versuchskulturen. Ein hemmender Einfluss konnte<br />
ebenso nicht festgestellt werden, da die Carotinoide wahrscheinlich einen Schutz vor<br />
photooxidativen Schaden vermitteln und toxische Sauerstoffderivate quenchen<br />
(MADIGAN et al., 2001; WAGNER und BIEBL, 2006). Für den Stamm Bo 10-09<br />
wurde ebenfalls kein verändertes Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von<br />
5 µE m -2 s -1 PAR festgestellt (siehe Kap. 3.3). Ein Vorkommen von Carotinoiden<br />
wurde in Studien mit verschiedenen Muricauda-Spezies nicht dokumentiert, sind<br />
aber aufgrund eines großen Vorkommens in nicht photosynthetisch aktiven Bakterien<br />
(YURKOV und BEATTY, 1998) auch für den Stamm Bo 10-09 nicht auszuschließen.<br />
4.2 „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“(QS) bei verschiedenen Gram-negativen Bakterien<br />
Interzelluläre Kommunikationsysteme werden in vielen Bakterien zur Regulation der<br />
Expression bestimmter Gene und dementsprechend zur Steuerung physiologischer<br />
Aktivitäten in Abhängigkeit von der eigenen Populationsdichte verwendet. Diese<br />
Anpassung von Aktivitäten können dabei in einer sich verändernden Umgebung<br />
einen deutlichen Vorteil bringen (SZENTHE und PAGE, 2003; CASE et al., 2008)<br />
und z.B. andere Bakterienspezies in einer ökologischen Nische verdrängen. Unter<br />
Gram-negativen Bakterien ist dabei ein AHL-abhängiges „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ ein weit<br />
verbreitetes Kommunikationssystem (FUQUA et al., 2001). In den letzten Jahren<br />
wurde zunehmend in Gram-negativen Bakterien zudem ein weiteres QS-System<br />
nachgewiesen, in dem Furanon-Derivate als QS-Signalmoleküle agieren (z.B.<br />
Yersinia pestis: BOBROV et al., 2007) und wahrscheinlich überwiegend an einer<br />
interspezifischen Kommunikation beteiligt sind (FEDERLE und BASSLER, 2003).<br />
79
4. Diskussion<br />
4.2.1 AHL-Nachweis mit bakteriellen Biosensoren<br />
Eine Möglichkeit zum Nachweis verschiedener AHL-Signalmoleküle ist der Einsatz<br />
von bakteriellen Biosensoren. Die chemischen Strukturunterschiede der N-Acyl-<br />
Seitenkette der AHL-Moleküle führen bei den einzelnen Biosensoren zu<br />
unterschiedlichen Sensitivitäten gegenüber den verschiedenen AHL-Molekülen,<br />
wobei viele Biosensoren lediglich eine kleine Bandbreite an AHL-Molekülen<br />
detektieren (STEINDLER und VENTURI, 2007). Der Nachweis ist dementsprechend<br />
auf die AHL-Moleküle beschränkt, auf welche der jeweilige Biosensor ab einer<br />
bestimmten AHL-Konzentration reagiert (SHAW et al., 1997). Generell nimmt die<br />
Affinität gegenüber einem AHL-Molekül dabei in der Stärke ab, je mehr sich die<br />
Seitenkette des Moleküls von der des ursprünglich eigenen AHL-Signalmoleküls<br />
unterscheidet. Die große AHL-Diversität bedingt dementsprechend zur Abdeckung<br />
eines breiten AHL-Spektrums den Einsatz mehrerer Biosensoren, welche auf<br />
verschiedene AHL-Moleküle reagieren. Eine AHL-Produktion kann von den<br />
Kultivierungsbedingungen und dem Nährmedium abhängen (FARRAND et al., 2002)<br />
bzw. durch bestimmte Umweltbedingungen reguliert werden (MOHAMMED et al.,<br />
2008) und liegt folglich unter bestimmten Laborbedingungen vielleicht gar nicht vor.<br />
Demzufolge schließt kein AHL-Nachweis die Produktion von AHL-Signalmolekülen<br />
bzw. eines bestimmten AHL-Moleküls im jeweiligen untersuchten Bakterienstamm<br />
grundsätzlich nicht aus.<br />
Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten AHL-Biosensoren Agrobacterium<br />
tumefaciens NTL4 (pZLR4) und Chromobacterium violaceum CV026 weisen<br />
aufgrund ihres eigenen natürlichen AHL-QS-Systems unterschiedliche Sensitivitäten<br />
gegenüber AHL-Signalmolekülen auf. In dünnschichtchromatographischen<br />
Voruntersuchungen und Agarplattentests wurden Spezifitäten und Sensitivitäten der<br />
AHL-Sensoren gegenüber zur Verfügung stehenden synthetischen<br />
Referenzmolekülen (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL) ermittelt. Der Biosensor<br />
C. violaceum CV026 zeigte mit Abstand die höchste Sensitivität gegenüber C6-HSL,<br />
gefolgt von C8-HSL und C4-HSL (siehe Kap. 2.7.6 und 3.4.1). Der A. tumefaciens-<br />
Sensorstamm wies eine sehr hohe Affinität für C8-HSL auf (siehe Kap. 2.7.6).<br />
Gegenüber C6-HSL war der Sensorstamm leicht sensitiver als gegenüber C4-HSL.<br />
Ähnliche Ergebnisse erzielten MCCLEAN und Mitarbeiter (1997) für C. violaceum<br />
CV026 sowie FARRAND und Mitarbeiter (2002) für A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). Im<br />
Vergleich mit C. violaceum CV026 wies der Agrobacterium-Sensorstamm wesentlich<br />
80
4. Diskussion<br />
höhere Sensitivitäten gegenüber C8-HSL und C4-HSL und gleiche Affinität<br />
gegenüber C6-HSL auf. Aufgrund der hohen nachgewiesenen Sensitivitäten und des<br />
dokumentierten breiten Nachweisspektrums (STEINDLER und VENTURI, 2007)<br />
erfolgten die weiteren Untersuchungen überwiegend mit dem Agrobacterium-<br />
Sensorstamm.<br />
4.2.2 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien<br />
Zum schnellen Nachweis von AHL-produzierenden Bakterien fanden zwei Methoden<br />
in der vorliegenden Arbeit Anwendung. Im Screeningverfahren nach FARRAND und<br />
Mitarbeitern (2002) wurden Bakterienkulturen oder Kulturüberstände direkt auf AHL-<br />
Signalmoleküle untersucht, während RAVN und Mitarbeiter (2001) ausschließlich<br />
Bakterienkulturen einsetzten. Die Methoden ermöglichen jedoch keine<br />
Unterscheidung zwischen verschiedenen AHL-Molekülen. Des Weiteren können die<br />
AHL-Signalmoleküle in den Bakterienkulturen bzw. Kulturüberständen aufgrund einer<br />
fehlenden Aufkonzentrierung für eine Detektion in nicht ausreichender Menge<br />
vorliegen.<br />
In beiden AHL-Screeningsystemen konnte für Stamm Bo 53-33 ein AHL-Nachweis<br />
unter Verwendung des Agrobacterium-Sensors erzielt werden (siehe Kap. 3.4.2 und<br />
3.4.3). Ein schwacher Nachweis auf AHL-Moleküle konnte für Stamm Bo 10-09<br />
lediglich über die Methode von FARRAND und Mitarbeitern (2002) dokumentiert<br />
werden, während eine AHL-Produktion durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 nicht<br />
nachgewiesen wurde.<br />
Im Screeningtest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) stellte das verwendete<br />
Nährmedium einen limitierenden Faktor für diesen Assay dar, da sowohl das zu<br />
testende Bakterium als auch der Biosensor auf diesem wachsen müssen. Ein<br />
schwaches Wachstum, z.B. aufgrund unterschiedlicher Mineralsalz- bzw.<br />
Salinitätsansprüche der Bakterien, schränkten Aussagen über eine AHL-Produktion<br />
ein. Ein Kompromiss wurde mit dem ASNIII/2-Medium erzielt, wodurch aber auf eine<br />
AHL-Untersuchung mit dem Biosensor C. violaceum CV026 verzichtet werden<br />
musste. Die stärkeren Nachweisreaktionen über den Screeningtest nach FARRAND<br />
und Mitarbeitern (2002) im Vergleich zum zweiten Assay zeigten die wesentlich<br />
höhere Sensitivität dieses Assays gegenüber QS-Signalmolekülen auf. Eine in<br />
mehreren Untersuchungen aufgetretene Blaugrün-Färbung des Bakterienstammes<br />
Bo 10-09 im Screeningverfahren nach RAVN und Mitarbeitern (2001) ließ annehmen,<br />
81
4. Diskussion<br />
dass dieser X-Gal wahrscheinlich enzymatisch spalten kann. Neben dieser durch<br />
Testorganismen enzymatisch bedingten X-Gal-Hydrolyse wurde des Weiteren von<br />
FARRAND und Mitarbeitern (2002) von einer möglichen schwachen Aktivierung des<br />
Agrobacterium-Biosensors durch Medienkomponenten berichtet, welche zu falsch-<br />
positiven Ergebnissen führen kann. Eine unspezifische Aktivierung des Sensors<br />
durch ASNIII/2-Medienkomponenten könnte auch Ursache für die Blaufärbung des<br />
Sensorstammes bei der Nachweismethode von RAVN und Mitarbeitern (2001) in den<br />
Negativkontrollen gewesen sein (siehe Kap. 3.4.2). Unspezifische<br />
Nachweisreaktionen verdeutlichen, dass bei Untersuchungen mit Biosensoren eine<br />
Durchführung von Negativkontrollen essentiell ist. Eine mögliche spontane Hydrolyse<br />
von X-Gal erfordert zudem zur Vermeidung von Fehlinterpretationen eine<br />
Auswertung beider Assays nach 24 h.<br />
4.2.3 Extraktion und Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen<br />
Die Extraktion von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen erfolgte in der<br />
vorliegenden Arbeit mittels einer Dichlormethanextraktion nach GEISENBERGER<br />
(2000) (siehe Kap. 2.7.3.3). Die aufwendige Herstellung von AHL-Extrakten war mit<br />
einer Anzucht großer Mengen bakterieller Biomasse verbunden, da für die Extraktion<br />
große Volumina an Kulturüberständen zur Ausschüttelung der AHL-Moleküle mit<br />
dem organischen Lösungsmittel benötigt werden (WAGNER-DÖBLER et al., 2005).<br />
FROMMBERGER (2005) bestimmte die Extraktionsausbeute mit Dichlormethan mit<br />
etwa 60%. Nachfolgend wurde die organische Phase eingeengt. Problematisch<br />
erwies sich hierbei nach Eintrocknung der organischen Phase die vollständige<br />
Aufnahme der Rückstände in einem relativ geringen Volumen an flüchtigem<br />
Ethylacetat. Aufnahmen in unterschiedlichen Ethylacetatvolumen in Abhängigkeit von<br />
der Menge des Rückstandes würden einen AHL-Vergleich zwischen den jeweiligen<br />
Kulturüberständen nicht mehr zulassen. Andere Studien verwendeten Ethylacetat als<br />
Extraktionsmittel (CHA et al., 1998; RAVN et al., 2001; GRAM et al., 2002), wobei<br />
RAVN und Mitarbeiter (2001) erstmals durch Azidifizierung des Ethylacetats die<br />
Effizienz der AHL-Extraktion (75%) deutlich gegenüber nicht-azidifiziertem<br />
Ethylacetat (35%) steigern konnten. Dabei wurde eine abnehmende Polarität der<br />
AHL-Moleküle durch eine Protonierung in der N-Acyl-Seitenkette vermutet,<br />
resultierend in einer leichteren AHL-Extraktion. Aus diesem Grund wurde in der<br />
vorliegenden Arbeit eine Ansäuerung des Ethylacetats mit 0,01% (v/v) Essigsäure<br />
82
4. Diskussion<br />
durchgeführt, um eine maximale Aufnahme des Rückstandes bzw. der extrahierten<br />
AHL-Moleküle zu erreichen.<br />
Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Methode zum Nachweis verschiedener<br />
AHL-Moleküle geht ursprünglich auf SHAW und Mitarbeiter (1997) zurück. Dabei<br />
erfolgte im Anschluss an eine Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie zur<br />
Auftrennung der AHL-Moleküle die Detektion der Signalmoleküle mit bakteriellen<br />
Reportersystemen.<br />
In DC-Voruntersuchungen konnte festgestellt werden, dass mit Agrobacterium-<br />
Sensorkulturen in der spät-exponentiellen Wachstumsphase, gekoppelt mit einer<br />
guten Belüftung (200 rpm) während der Anzucht, die besten AHL-Nachweise erzielt<br />
wurden. Des Weiteren ist das spezielle ABG-Kulturmedium für einen optimalen<br />
Nachweis essentiell. Mit LB(Luria Bertani)-Medium konnten diese Ergebnisse nicht<br />
auf diesem Niveau reproduziert werden. Eine unspezifische Aktivierung des<br />
Biosensors durch LB-Medienkomponenten wurde zudem nicht sicher<br />
ausgeschlossen. Ein weiterer Vorteil des ABG-Mediums ist eine Detektion blauer<br />
DC-Spots auf einem hellen Hintergrund. Für eine optimale Visualisierung der AHL-<br />
Moleküle wurde hierzu das X-Gal in N,N-Dimethylformamid gelöst.<br />
Im Laufe der Untersuchungen zeichnete sich ab, dass der angewandten DC-Analytik<br />
sowohl für physiologische Untersuchungen als auch für quantitative Aussagen<br />
Grenzen gesetzt sind, da viele Parameter Einfluss auf die<br />
dünnschichtchromatographischen Ergebnisse nehmen können. Hierbei spielen vor<br />
allem die Herstellung der AHL-Extrakte, die Anzucht des Biosensors, die<br />
Überschichtung der DC-Platten und deren Inkubation eine wesentliche Rolle. Des<br />
Weiteren können Biosensoren geringe AHL-Mengenunterschiede in Form von<br />
geringen Intensitätsabnahmen der DC-Spots kaum detektieren, und AHL-Reporter<br />
sind zudem nicht fähig, die strukturelle Diversität von AHL-Molekülen nachzuweisen<br />
(WAGNER-DÖBLER et al., 2005; CASE et al., 2008). Dementsprechend konnten nur<br />
Tendenzen aufgezeigt, absolute Aussagen aber nicht getroffen werden.<br />
83
4. Diskussion<br />
4.2.4 AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen<br />
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss verschiedener<br />
Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Molekül-Produktion bei verschiedenen Gram-<br />
negativen Bakterien mittels dünnschichtchromatographischer Methode untersucht<br />
werden. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen dabei die AHL-Produktion und<br />
das Vorkommen verschiedener AHL-Molekültypen in Abhängigkeit vom pH-Wert der<br />
Kulturmedien.<br />
QS ist ein Zelldichte-abhängiger Prozess. Die Konzentration der produzierten und in<br />
die Umwelt freigesetzten Signalmoleküle steigt mit Zunahme der Bakterienpopulation<br />
proportional an (CHA et al., 1998; WILLIAMS, 2007). In der vorliegenden Arbeit<br />
wurden oftmals Proben miteinander verglichen, die aus Kulturen mit<br />
unterschiedlichen Zelldichten gewonnen wurden. Weitere vergleichende AHL-<br />
Untersuchungen sollten dementsprechend mit Kulturen gleicher Populationsdichte<br />
durchgeführt werden, um den Einfluss von verschiedenen Kultivierungsbedingungen<br />
besser bewerten zu können.<br />
4.2.4.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Signalmoleküle<br />
Die dünnschichtchromatographischen Ergebnisse zeigten, dass ein unmittelbarer<br />
Zusammenhang zwischen dem pH-Wert des Kulturmediums und der AHL-Menge in<br />
den Zellkulturüberständen besteht (siehe Kap. 3.5.1). Dabei nahm die über den<br />
Agrobacterium-Sensorstamm nachgewiesene AHL-Menge in Kulturüberständen von<br />
Stamm Bo 53-33 mit zunehmendem pH-Wert von pH 6,0 - 8,5 kontinuierlich ab und<br />
wies bei pH 8,5 und 9,0 in etwa gleich große AHL-Mengen auf. Für den<br />
heterotrophen Stamm Bo 10-09 konnte der gleiche Zusammenhang festgestellt<br />
werden, wobei für einen Nachweis von AHL-Molekülen wesentlich größere Mengen<br />
an AHL-Extrakt eingesetzt werden mussten und lediglich in den pH 6-gepufferten<br />
Kulturen Signalmoleküle nachgewiesen wurden. Aufgrund der sehr schwachen AHL-<br />
Nachweise bei Stamm Bo 10-09 erwies sich dieser mit der zur Verfügung stehenden<br />
Methode für weitere physiologische Untersuchungen als ungeeignet. Die Ursachen<br />
einer schwachen Nachweisreaktion könnten in einer fehlenden Sensitivität des<br />
Biosensors gegenüber den AHL-Molekülen und in einer für eine AHL-Produktion<br />
nicht gegebenen Kultivierungsbedingung liegen.<br />
84
4. Diskussion<br />
YATES und Mitarbeiter (2002) führten diesen Befund in Studien mit Yersinia<br />
pseudotuberculosis und Pseudomonas aeruginosa auf eine nicht-enzymatische<br />
Hydrolyse der AHL-Moleküle unter basischen Anzuchtsbedingungen zurück. Die<br />
Hydrolyse der Esterbindung des Homoserinlactonrings führt dabei zu einer<br />
Inaktivierung und somit zu einem Funktionsverlust des jeweiligen N-Acyl-L-<br />
Homoserinlactons. Ein weiterer Angriffspunkt ist die Amidbindung zwischen dem<br />
Homoserinlacton und der N-Acyl-Seitenkette. Die degradierten AHL-Moleküle<br />
werden von dem LuxR-homologen Protein des jeweiligen AHL-Biosensors nicht mehr<br />
erkannt, und ein AHL-Nachweis bleibt aus (STEINDLER und VENTURI, 2007).<br />
In Anbetracht einer pH-abhängigen Instabilität der AHL-Moleküle könnte ein<br />
kontinuierlich zunehmender pH-Wert während der Anzucht zudem Grund für die<br />
leicht niedrigeren nachgewiesenen AHL-Mengen in der stationären<br />
Wachstumsphase gegenüber der logarithmischen Wachstumsphase ungepufferter<br />
Kulturen von Stamm Bo 53-33 sein. Damit ließe sich ebenfalls ein AHL-Nachweis in<br />
der logarithmischen Wachstumsphase und das Fehlen von AHL-Molekülen in der<br />
stationären Wachstumsphase in ungepufferten Kulturen von Stamm Bo 10-09<br />
erklären. Eine Abnahme des AHL-Gehaltes in der stationären Wachstumsphase<br />
durch eine nicht-enzymatische, pH-abhängige Spaltung von AHL-Molekülen wurde in<br />
einer Studie von BYERS und Mitarbeitern (2002) bei Erwinia carotovora<br />
dokumentiert.<br />
Nach einer Azidifizierung ungepufferter Kulturüberstände der Stämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09 konnte der nachgewiesene AHL-Gehalt für beide Stämme deutlich<br />
gegenüber nicht-azidifizierten Kulturüberständen erhöht werden (siehe Kap. 3.5.1.1),<br />
da die inaktiven AHL-Signalmoleküle durch einen reversiblen Ringschluss des<br />
Homoserins in ihre aktive Struktur überführt wurden und somit über AHL-<br />
Biosensoren nachgewiesen werden konnten (YATES et al., 2002). Der<br />
Azidifizierungsversuch und die vorangegangene pH-Wert-Untersuchung (siehe Kap.<br />
3.5.1) zeigten insbesondere beim Stamm Bo 53-33 auf, dass, wie von YATES und<br />
Mitarbeitern (2002) dokumentiert, ein Zusammenhang zwischen der Stabilität des<br />
Moleküls und der Länge der N-Acyl-Seitenkette besteht. Dementsprechend wurde<br />
ein weiteres, kurzkettigeres AHL-Molekül lediglich in azidifizierten und pH 6-<br />
gepufferten Kulturüberständen über den Agrobacterium-Sensorstamm deutlich<br />
nachgewiesen, während ein längerkettiges AHL-Molekül auch bei höheren pH-<br />
Werten detektiert wurde.<br />
85
4. Diskussion<br />
Bei der Expression QS-gesteuerter Gene verstärken die QS-Signalmoleküle<br />
gleichzeitig ihre eigene Signalmolekül-Produktion (Autoinduktion) (EBERHARD et al.,<br />
1981). Folglich wären in AHL-stabilen Umgebungen (sauer bis leicht-alkalisch) ein<br />
kontinuierlicher Anstieg der AHL-Konzentration und damit eine fortwährende<br />
Genexpression zu erwarten. Eine AHL-Akkumulation in AHL-stabilen Umgebungen<br />
wurde nicht beobachtet (LEADBETTER und GREENBERG, 2000), was auf einen<br />
enzymatischen AHL-Abbau schließen ließ. In den letzten Jahren wurden verstärkt<br />
AHL-degradierende Enzyme, AHL-Lactonasen und AHL-Acylasen, in verschiedenen<br />
Bakterienspezies nachgewiesen, welche wahrscheinlich in der Regulation von QS-<br />
gesteuerten Prozessen eine wichtige Rolle spielen (DONG und ZHANG, 2005).<br />
ZHANG und Mitarbeiter (2002b, 2004) konnten einen schnellen Abbau von 3-oxo-<br />
C8-HSL in der stationären Wachstumsphase von A. tumefaciens auf eine AHL-<br />
Lactonase (AttM) zurückführen. Die Expression dieses Enzyms wird dabei durch<br />
Hunger- und Stresssignale induziert und führte zu einer Beendigung des QS-<br />
gesteuerten konjugativen Ti-Plasmid-Transfers.<br />
Die hohen pH-Werte der Kulturüberstände nach Inkubation der Stämme Bo 53-33<br />
und Bo 10-09 lassen Rückschlüsse auf eine enzymatische AHL-Degradation nicht<br />
zu. Der Azidifizierungsversuch zeigte aber auf, dass die nach Azidifizierung wieder<br />
intakten AHL-Moleküle zuvor nicht durch AHL-Acylasen gespalten werden konnten,<br />
da diese enzymatische Reaktion an der Amidbindung des Moleküls irreversibel ist<br />
(ROMERO et al., 2008).<br />
Aufgrund einer freien Diffusion der Signalmoleküle durch biologische Membranen<br />
und die Zellwand steigt die Konzentration der AHL-Moleküle proportional mit<br />
Zunahme der Populationsdichte intrazellulär und extrazellulär gleichermaßen an<br />
(KAPLAN und GREENBERG, 1985). Dementsprechend wurde in den<br />
Versuchsansätzen mit Stamm Bo 53-33 intrazellulär aufgrund geringerer extrahierter<br />
Volumina an Biomasse gegenüber den Kulturüberständen eine wesentlich kleinere<br />
AHL-Menge nachgewiesen als extrazellulär (siehe Kap. 3.5.5). Für Stamm Bo 10-09<br />
konnte kein AHL-Nachweis erzielt werden. Der ausgebliebene AHL-Nachweis bei<br />
höheren pH-Werten (pH 8,5 und 9,0) in Versuchsansätzen mit Stamm Bo 53-33 ist<br />
wahrscheinlich auf nicht-enzymatisch degradierte AHL-Moleküle zurückzuführen. Der<br />
höhere nachgewiesene AHL-Gehalt in der logarithmischen Wachstumsphase kann<br />
ebenfalls durch eine nicht-enzymatische, pH-abhängige Hydrolyse in der<br />
Stationärphase erklärt werden. Eine enzymatische Degradation von AHL-Molekülen<br />
86
4. Diskussion<br />
ist in der Stationärphase aber nicht ausgeschlossen. Über eine QS-regulierte<br />
Expression von Genen in verschiedenen Wuchsphasen wurde z.B. für Pseudomonas<br />
aeruginosa berichtet (SCHUSTER et al., 2003).<br />
4.2.4.2 Einfluss der Temperatur auf die AHL-Signalmoleküle<br />
Die Temperatur hat generell einen wesentlichen Einfluss auf die Stabilität der<br />
gebildeten AHL-Moleküle. Bei höheren Temperaturen wie 30 °C (YATES et al., 2002)<br />
bzw. 37 °C (BYERS et al., 2002) konnte bereits bei mild-alkalischen Bedingungen<br />
(oberhalb von pH 7,0 bis pH 8,0) eine deutliche Instabilität der AHL-Moleküle<br />
dokumentiert werden, wobei oberhalb von ~ pH 8,2 keine AHL-Moleküle mehr<br />
nachgewiesen wurden. Folglich wird die Verwendung von Furanon-Derivaten als QS-<br />
Signalmoleküle beim Gram-negativen Bakterium Escherichia coli auf die im Darm<br />
herrschenden Bedingungen (pH 7,6; 37 °C) zurückgeführt (SCHAUDER et al., 2001).<br />
Dem gegenüber wird bei GRAM und Mitarbeitern (2002) für marine Roseobacter-<br />
Stämme bei einer Anzuchtstemperatur von 15 °C erst oberhalb eines pH-Wertes von<br />
8,0 auf eine AHL-Instabilität hingewiesen. Die AHL-Stabilität ist bei niedrigeren<br />
Temperaturen um ein Vielfaches erhöht (BYERS et al., 2002), was für eine<br />
interzelluläre Kommunikation mariner, Gram-negativer Bakterien über AHL-<br />
Signalmoleküle hinsichtlich der pH-Werte mariner Gewässer (Meerwasser, pH 7,8 -<br />
8,2: HAWLEY, 1981) essentiell ist. Eine Kommunikation ist demnach auch noch bei<br />
höheren pH-Werten über AHL-Moleküle möglich.<br />
Bei Stamm Bo 53-33 konnten bei einer Inkubationstemperatur von 21 °C noch bei<br />
pH-Endwerten von ~8,5 AHL-Signalmoleküle nachgewiesen werden (siehe<br />
Kap. 3.5.1). Bei einem Vergleich von Kulturüberständen ungepufferter<br />
Versuchsansätze von Stamm Bo 53-33 wurde ein geringerer AHL-Gehalt nach 28 °C<br />
Inkubation gegenüber einer 21 °C-Inkubation für den Bakterienstamm festgestellt<br />
(siehe Kap. 3.5.3).<br />
Physiologische Experimente sollten zukünftig im pH-neutralen Bereich und bei<br />
niedrigen Inkubationstemperaturen durchgeführt werden bzw., wenn dieses nicht<br />
möglich ist, mit einer anschließenden Azidifizierung der Kulturüberstände gekoppelt<br />
werden.<br />
87
4. Diskussion<br />
4.2.4.3 Einfluss von Licht und Nährstoffen auf die Produktion von AHL-<br />
Signalmolekülen<br />
Die Expression von QS-regulierten Genen bei Bakterien kann neben der<br />
Populationsdichte von einer Vielzahl von Umweltstimuli (Stressinduktoren) abhängen<br />
bzw. beeinflusst werden, z.B. der Verfügbarkeit von Nährstoffen (WITHERS et al.,<br />
2001). Ein in Wechselbeziehung mit äußeren Umwelteinflüssen stehendes QS,<br />
involviert in phänotypischen Veränderungen der Bakterienzelle, erhöht dabei für eine<br />
Bakterienzelle die Wahrscheinlichkeit z.B. unter nährstoffarmen Bedingungen oder<br />
anderen Stressbedingungen zu überleben. DAVIES und Mitarbeiter (1998) konnten<br />
in diesem Zusammenhang aufzeigen, dass die Biofilmbildung sowohl vom QS als<br />
auch von externen Umweltstimuli (z.B. pH-Wert und Nährstoffe) abhängig ist.<br />
Studien an Escherichia coli zeigten eine unterschiedliche AI-2-Signalmolekül-<br />
Produktion in Abhängigkeit von umweltbedingten Stressfaktoren auf, was auf die<br />
Fähigkeit einer stressbedingten Anpassung durch QS an sich ändernde<br />
Umweltbedingungen schließen ließ (DE LISA et al., 2001). AHMED und Mitarbeiter<br />
(2007) konnten bei Streptococcus anginosus ebenfalls einen Zusammenhang<br />
zwischen der AI-2-Signalmolekül-Produktion und antibiotischem Stress aufzeigen.<br />
Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden in den in der<br />
vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen möglichen Stressfaktoren<br />
ausgesetzt.<br />
Bei einer Erhöhung der Photonenflussdichte von 0 auf 5 µE m -2 s -1 PAR wurden<br />
dabei keine signifikanten Unterschiede in der AHL-Menge gegenüber einer<br />
Dunkelinkubation der Kulturen nachgewiesen (siehe Kap. 3.5.2). Folglich hat ein<br />
Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR keinen Einfluss auf die AHL-Produktion bzw. auf<br />
QS-gesteuerte Vorgänge bei den heterotrophen Bakterien. Des Weiteren steht<br />
anscheinend eine Hemmung der Bchl a-Synthese bei Stamm Bo 53-33 bei geringen<br />
Lichtintensitäten ebenfalls in keinem Zusammenhang mit „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“.<br />
Durch eine deutliche Reduzierung der Kohlenstoffquelle im verwendeten<br />
Nährmedium sollten die Kulturen einem Nährstoffmangel ausgesetzt werden. Unter<br />
den nährstofflimitierten Bedingungen (0,1% Fleischextrakt) konnte im Vergleich zu<br />
den standardmäßigen Nährstoffbedingungen (1% Fleischextrakt) ein leicht stärkerer<br />
AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm für Stamm Bo 53-33<br />
dokumentiert werden (siehe Kap. 3.5.3). Mit dem standardmäßig verwendeten<br />
Nährmedium blieb ein AHL-Nachweis bei Stamm Bo 10-09 in den Kulturüberständen<br />
88
4. Diskussion<br />
aus, unter nährstofflimitierten Bedingungen wurde hingegen ein geringer AHL-Gehalt<br />
in den Überständen nachgewiesen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass das<br />
Nährmedium einen Einfluss auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Stämme<br />
hat, also eine Abhängigkeit der AHL-Menge von der Verfügbarkeit der<br />
Kohlenstoffquelle vorliegt.<br />
QS ist an einer Vielzahl von phänotypischen Veränderungen und physiologischen<br />
Anpassungen beteiligt (WILLIAMS, 2007), welche insbesondere bei<br />
nährstofflimitierten Bedingungen und Stressbedingungen eine wesentliche Rolle<br />
spielen (WITHERS et al., 2001). Die leicht erhöhten AHL-Gehalte könnten mit einer<br />
verstärkten Expression QS-regulierter Gene zusammenhängen, welche bei einer<br />
geringen Verfügbarkeit von Nährstoffen eine Adaptation an sich ändernde<br />
Umweltbedingungen ermöglichen. Ein Einfluss von Nährmedien bzw. der<br />
Medienzusammensetzung auf die Expression von QS-regulierten Genen wurde für<br />
Pseudomonas aeruginosa beschrieben (WAGNER et al., 2003). In Vollmedien<br />
konnte dabei eine deutliche Senkung der Expression von QS-regulierenden Genen<br />
beobachtet werden. TEPLITSKI und Mitarbeiter (2003) zeigten ebenfalls eine starke<br />
Abhängigkeit des produzierten AHL-Profils von dem Nährmedium auf. Dennoch<br />
konnten QS-Mutanten in LB(Luria Bertani)-Medium zu höheren Zelldichten<br />
heranwachsen als QS-fähige Wildtypstämme von Pseudomonas aeruginosa, da die<br />
QS-regulierte Produktion von diversen Exoprodukten neben den QS-<br />
Signalmolekülen in diesem Nährmedium lediglich einen unnötigen Energieverbrauch<br />
darstellten (DIGGLE et al., 2007b).<br />
4.2.5 Identifizierung der AHL-Signalmoleküle der heterotrophen<br />
Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums<br />
Stamm Flo 1<br />
Die Identifizierung der AHL-Moleküle erfolgte nach dünnschichtchromatographischer<br />
Auftrennung durch einen Vergleich mit synthetischen Referenzmolekülen. Die<br />
beschränkte Anzahl kommerzieller Standardmoleküle decken bei weitem nicht die<br />
Bandbreite der in der Umwelt vorkommenden AHL-Signalmoleküle ab und ließen<br />
oftmals eine Zuordnung nicht zu. Eine Zuordnung der DC-Signale über einen<br />
Abgleich der Rf-Werte mit Rf-Werten aus der Literatur konnte nicht durchgeführt<br />
werden, da die Referenzmoleküle von der Literatur abweichende Rf-Werte<br />
aufzeigten. Dieses ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf unterschiedlich verwendete<br />
89
4. Diskussion<br />
DC-Platten zurückzuführen. Ein abweichendes Laufverhalten hatte zur Folge, dass<br />
sich die Anzahl der potentiellen AHL-Moleküle für einen detektierten DC-Spot<br />
erhöhte. Des Weiteren weisen 3-oxo- und 3-hydroxy-Derivate mit gleicher<br />
Seitenkettenlänge das gleiche dünnschichtchromatographische Laufverhalten auf, so<br />
dass bei Auftreten beider Derivate eine Überlagerung der Signalmoleküle vorliegt<br />
(SHAW et al., 1997).<br />
Viele terrestrische Gram-negative Bakterien produzieren AHL-Moleküle. Im<br />
Gegensatz dazu ist über das Vorkommen von AHL-Molekülen bei marinen Bakterien,<br />
abgesehen von der Zelldichte-abhängigen Regulation der Lumineszenz bei Vibrio<br />
fischeri und weiteren Vibrio-Spezies, noch relativ wenig bekannt (WAGNER-<br />
DÖBLER et al., 2005; MOHAMMED et al., 2008). Bei marinen heterotrophen<br />
Bakterien aus der Ostsee konnten BRUNS und Mitarbeiter (2002) einen<br />
stimulierenden Effekt von AHL-Signalmolekülen auf die Kultivierung von<br />
Laborkulturen aufzeigen. Es wurde daher eine wesentliche Rolle der AHLs bei der<br />
Anpassung der marinen Bakterien an die Laborbedingungen vermutet. Des Weiteren<br />
wurden AHL-Moleküle (C6-HSL, C8-HSL und 3-oxo-Derivate) bei Untersuchungen<br />
mit einem Agrobacterium-Sensor bei 3 Roseobacter-Isolaten (Roseobacter-<br />
Ruegeria-Untergruppe der α-Proteobakterien) aus “Marine Snow“ nachgewiesen<br />
(GRAM et al., 2002). Eine AHL-Produktion in marinen Schwämmen durch assoziierte<br />
Bakterien wurde ebenfalls auf einen Vertreter der Roseobacter-Ruegeria-<br />
Untergruppe zurückgeführt (TAYLOR et al., 2004). Eine weite Verbreitung von AHL-<br />
QS-Systemen bei marinen α-Proteobakterien, insbesondere aus der Roseobacter-<br />
Gruppe, wurde durch Studien an bakteriellen Isolaten aus verschiedenen marinen<br />
Habitaten (WAGNER-DÖBLER et al., 2005) und an marinen Schwämmen<br />
(MOHAMMED et al., 2008) aufgezeigt, während letztere Arbeitsgruppe zudem für<br />
zwei Isolate der Gattung Erythrobacter eine AHL-Produktion dokumentierte. Durch<br />
Einsatz von verschiedenen bakteriellen Biosensoren konnten MOHAMMED und<br />
Mitarbeiter (2008) für die α-Proteobakterien ein breites AHL-Spektrum, WAGNER-<br />
DÖBLER und Mitarbeiter (2005) bei zusätzlicher Verwendung der GC-MS-Analyse<br />
hingegen überwiegend langkettige AHL-Moleküle (C14, C16 und C18) nachweisen.<br />
C8-HSL wurde zudem von letztgenannter Arbeitsgruppe bei zwei aeroben<br />
anoxygenen phototrophen Bakterien der Gattungen Dinoroseobacter und<br />
Roseobacter detektiert.<br />
90
4. Diskussion<br />
Das weitverbreitete Vorkommen von QS-Systemen in marinen α-Proteobakterien<br />
weist auf eine große Bedeutung dieser Regulationssysteme zur Anpassung der<br />
Organismen in ihren ökologischen Nischen hin. Für einige Proteobakterien wurde<br />
dabei eine QS-regulierte Biofilmbildung vermutet, welche z.B. der Kolonisierung von<br />
pflanzlichen und tierischen Oberflächen oder zur Bildung von “Marine Snow“ dient<br />
(WAGNER-DÖBLER et al., 2005). Des Weiteren wurde z.B. für die aus<br />
Dinoflagellaten isolierten Proteobakterien angenommen, dass QS in einer Regulation<br />
symbiotischer Interaktionen involviert ist. Eine wesentliche Rolle wird den AHL-<br />
Signalmolekülen bei Assoziationen zwischen Proteobakterien und höheren marinen<br />
Organismen zugewiesen, wobei AHL-QS-Systeme wahrscheinlich der Etablierung<br />
und Aufrechterhaltung solcher Assoziationen dienen. Die erhöhte<br />
Nährstoffverfügbarkeit durch das Schwammgewebe ermöglicht dabei im Gegensatz<br />
zum relativ nährstoffarmen Meerwasser das Erreichen hoher Populationsdichten und<br />
somit das Einsetzen QS-regulierter Prozesse (MOHAMMED et al., 2008). Die<br />
Bedeutung des QS in Proteobakterien zeigten CASE und Mitarbeiter (2008) in<br />
Untersuchungen an einer Vielzahl bakterieller Genome auf, die ausschließlich für<br />
eine große Anzahl von Proteobakterien luxI- und luxR-homologe Gene nachwiesen.<br />
Für das heterotrophe marine α-Proteobakterium Porphyrobacter Stamm Bo 53-33,<br />
nahe verwandt mit der Roseobacter-Gruppe, konnten mit dem Agrobacterium-<br />
Sensorstamm zwei AHL-Moleküle nachgewiesen werden (siehe Kap. 3.5.1.1). Nach<br />
Abgleich anhand mitgeführter Referenzmoleküle wurde ein AHL-Molekül mit kurzer<br />
Seitenkette (C4 - C6) und ein weiteres mit kurzer bis mittellanger Seitenkette (C6 -<br />
C8) bestätigt. Damit zeigt der Stamm Bo 53-33 im Vergleich zu anderen AHL-<br />
produzierenden α-Proteobakterien (oftmals 4 - 6 verschiedene AHL-Moleküle)<br />
(MOHAMMED et al., 2008) ein relativ einfaches AHL-Profil auf. Die nachgewiesenen<br />
DC-Spots wiesen eine runde, distinkte Form auf und unterschieden sich damit von<br />
den „tailing spots“, welche von 3-oxo-Derivaten gebildet werden (SHAW et al., 1997).<br />
Da C6-HSL-Moleküle über den Chromobacterium-Sensorstamm nicht nachgewiesen<br />
wurden, kann dieses AHL-Molekül für Stamm Bo 53-33 zudem mit großer<br />
Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Ein zusätzlicher Vergleich mit<br />
Referenzdaten (SHAW et al., 1997; GEISENBERGER, 2000) lässt für das<br />
längerkettige Molekül auf C7-HSL oder 3-hydroxy-C8-HSL und für das kurzkettige<br />
Molekül auf C4-HSL oder 3-hydroxy-C6-HSL schließen. Diese AHL-Moleküle sind mit<br />
91
4. Diskussion<br />
Ausnahme von C4-HSL bei AHL-produzierenden Bakterienspezies selten<br />
vorzufinden. Das 3-hydroxy-C8-HSL wurde bisweilen in Pseudomonas fluorescence<br />
(SHAW et al., 1997) und Photobacterium phosphoreum (FLODGAARD et al., 2005)<br />
detektiert.<br />
Die Azidifizierung der Kulturüberstände zeigte des Weiteren auf, dass das<br />
längerkettigere AHL-Molekül in etwa gleich großen Mengen in der logarithmischen<br />
und stationären Wachstumsphase vorlag. Die geringen Auftragungsvolumina in den<br />
DC-Analysen sprechen für eine hohe Sensitivität des Agrobacterium-Sensorstammes<br />
gegenüber diesem AHL-Molekül. Für das kurzkettige AHL-Molekül konnte ein<br />
deutlicher Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm in der stationären<br />
Wachstumsphase gezeigt werden. In der logarithmischen Wachstumsphase lag das<br />
Signalmolekül hingegen lediglich in geringen Mengen vor. Dieses Molekül konnte<br />
durch den C. violaceum-Sensorstamm weder bestätigt noch ausgeschlossen<br />
werden, da ein Nachweis eines kurzkettigen AHL-Moleküls lediglich in der<br />
logarithmischen Wachstumsphase dokumentiert wurde.<br />
QS könnte bei Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 vielleicht, wie bereits für<br />
verschiedene Roseobacter-Stämme vermutet (GRAM et al., 2002), bei hohen<br />
Zelldichten die Produktion von Exoenzymen, eine Antibiotika-Produktion oder eine<br />
Biofilmbildung regulieren. Da die Aggregation bei verschiedenen Bakterienspezies<br />
ein QS-regulierter Prozess ist (WILLIAMS, 2007), könnte die beobachtete Bildung<br />
von Zellagglomeraten bei einem pH-Wert von 6,0 (siehe Kap. 3.2) vielleicht ebenfalls<br />
auf eine AHL-abhängige Regulation zurückgeführt werden. Bei niedrigen Zelldichten<br />
bzw. für Bakterien in einer freilebenden, planktonischen Form sind diese<br />
phänotypischen Veränderungen hingegen kaum von Vorteil für die Population bzw.<br />
das einzelne Bakterium und mit einem unnötigen Verbrauch an Energie verbunden.<br />
Der heterotrophe Bakterienstamm Bo 10-09 wurde nach 16S-rDNA-Sequenzierung<br />
der Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides-Gruppe (CFB-Gruppe) zugeordnet<br />
(HUBE, 2008). In dieser Gruppe sind bisweilen kaum AHL-Produzenten bekannt.<br />
BRUNS und Mitarbeiter (2003) konnten in Kultivierungsversuchen keinen<br />
stimulierenden Einfluss auf das Wachstum von Isolaten der CFB-Gruppe durch<br />
synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL und 3-oxo-C6-HSL) dokumentieren. In diesem<br />
Zusammenhang konnten GRAM und Mitarbeiter (2002) ebenfalls bei keinem<br />
kultivierten Isolat der CFB-Gruppe einen AHL-Nachweis über einen Agrobacterium-<br />
92
4. Diskussion<br />
Sensor erzielen, obwohl Bakterien der CFB-Gruppe neben den Proteobakterien eine<br />
dominierende Gruppe in marinen Partikeln darstellen (GRAM et al., 2002). Das<br />
Erreichen hoher Zellpopulationsdichten könnte das Einleiten QS-regulierter Prozesse<br />
ermöglichen. Lediglich WAGNER-DÖBLER und Mitarbeiter (2005) dokumentierten<br />
für einen Flavobacterium-Stamm einen positiven AHL-Nachweis mit einem<br />
Biosensor, sensitiv für kurzkettige AHL-Moleküle. DOBRETSOV und Mitarbeiter<br />
(2007) konnten jedoch durch Einsatz sogenannter QS-Blocker (Derivate des<br />
Furanons) aufzeigen, dass die Signalmoleküle bei Vertretern der CFB-Gruppe eine<br />
Erniedrigung der Zelldichten in bakteriellen Biofilmen auslösten bzw. eine Bildung<br />
von Biofilmen inhibierten und dementsprechend Einfluss auf die Zusammensetzung<br />
bakterieller Gemeinschaften nehmen. Dieses lässt schlussfolgern, dass AHL-<br />
Signalmoleküle bzw. QS-gesteuerte Prozesse in der CFB-Gruppe keine Ausnahmen<br />
darstellen.<br />
In der vorliegenden Arbeit konnten mit dem Agrobacterium-Sensorstamm für<br />
Muricauda Stamm Bo 10-09 mehrere AHL-Signalmoleküle detektiert werden. Dieses<br />
erforderte aber eine Azidifizierung der Kulturüberstände und ein Auftragen sehr<br />
hoher Volumina an AHL-Extrakten für die DC-Analysen (siehe Kap. 3.5.1.1). Dieses<br />
lässt sich entweder auf eine geringe AHL-Produktion durch Stamm Bo 10-09 oder<br />
auf eine geringe Sensitivität des Biosensors gegenüber diesen Molekülen<br />
zurückführen. Nach Abgleich anhand der mitgeführten Referenzmoleküle wurde ein<br />
nachgewiesenes AHL-Molekül als C8-HSL identifiziert. Neben diesem Molekül<br />
konnten wahrscheinlich zwei weitere kurzkettigere AHL-Moleküle mit C6 - C8- bzw.<br />
C4-Seitenketten für den Stamm Bo 10-09 dokumentiert werden, wobei das Fehlen<br />
distinkter DC-Spots eine Zuordnung über einen Abgleich mit den Standards nur<br />
bedingt zuließ. Der wesentlich höhere Gehalt an potentiellen C8-HSL in der<br />
Stationärphase ist auf die höheren Zelldichten in dieser Wuchsphase<br />
zurückzuführen, die Abnahme an kurzkettigen AHL-Molekülen in dieser Phase ist<br />
jedoch zu hinterfragen. Eine QS-Regulation in verschiedenen Wuchsphasen kann für<br />
Stamm Bo 10-09 nur vermutet werden. Ein über den Chromobacterium-<br />
Sensorstamm nachgewiesenes kurzkettiges AHL-Molekül scheint nach Abgleich mit<br />
den Referenzmolekülen keines der AHL-Moleküle zu entsprechen, welche mit dem<br />
Agrobacterium-Sensor nachgewiesen wurden.<br />
93
4. Diskussion<br />
Cyanobakterien stehen im Gegensatz zu den heterotrophen Bakterien kaum im<br />
Fokus von AHL-Untersuchungen. Dennoch konnten AHL-Moleküle in natürlichen<br />
mikrobiellen Gemeinschaften nachgewiesen werden, in denen Cyanobakterien<br />
auftreten bzw. diese sogar dominieren (mikrobielle Matten, cyanobakterielle Blüten)<br />
(MCLEAN et al., 1997; BRAUN und BACHOFEN, 2004). Einen Zusammenhang<br />
zwischen einer Microcystin-Synthese bei Cyanobakterien und AHL-Molekülen<br />
konnten BRAUN und BACHOFEN (2004) jedoch nicht eindeutig aufzeigen.<br />
ROMERO und Mitarbeiter (2006) dokumentierten eine AHL-Produktion durch den<br />
axenischen Anabaena sp.-Stamm PCC 7120, wobei ausschließlich in der<br />
cyanobakteriellen Biomasse AHL-Moleküle detektiert wurden. Es wurde basierend<br />
auf einer Studie von YOON und GOLDEN (1998) angenommen, dass die AHL-<br />
Moleküle (überwiegend 3-hydroxy-C12-HSL) an der Heterocystenbildung oder an<br />
Prozessen der Stickstofffixierung beteiligt sind. Ein Ausbleiben von AHL-Molekülen in<br />
der stationären Wuchsphase führten ROMERO und Mitarbeiter (2008)<br />
wahrscheinlich auf eine enzymatische Degradation durch die AHL-Acylase AiiC<br />
(auto-inducer inhibitor from Cyanobacteria) zurück. Des Weiteren wird zur<br />
Vermeidung von Interferenzen eine intrazelluläre Degradation Spezies-fremder AHL-<br />
Moleküle durch AiiC angenommen.<br />
Bei Untersuchungen cyanobakterieller Kulturen von Stamm Flo 1 konnten zwei sehr<br />
schwache AHL-Nachweise in Kulturüberständen nach 14 bzw. 21 Tagen Inkubation<br />
mit dem Agrobacterium-Sensorstamm dokumentiert werden, wobei ähnliche AHL-<br />
Gehalte in beiden Wuchsphasen vorlagen (siehe Kap. 1.1.1). Nach Abgleich mit<br />
Referenzmolekülen wurde ein längerkettiges AHL-Molekül als C8-HSL und ein<br />
substituiertes oder nicht-substituiertes AHL-Molekül mit einer C6- - C8-Seitenkette<br />
identifiziert. Eine Azidifizierung von Stamm Flo 1-Kulturüberständen führte zu einem<br />
stärkeren Nachweis des potentiellen C8-HSL und des kurzkettigeren Moleküls durch<br />
Rückführung in die aktive Form der AHL-Moleküle (YATES et al., 2002). Die<br />
geringen AHL-Gehalte ließen sich teilweise durch den hohen pH-Wert des<br />
standardmäßig verwendeten Kulturmediums und der Flo 1-Kulturen (pH 9,0)<br />
erklären. Ein zu geringer Einsatz cyanobakterieller Biomasse kann zudem nicht<br />
ausgeschlossen werden. Durch eine Aufkonzentrierung von AHL-Molekülen aus<br />
größeren Volumina an Kulturüberständen von Stamm Flo 1 wurde ein deutlich<br />
stärkerer Nachweis für das potentielle C8-HSL erzielt und zudem ein drittes AHL-<br />
Molekül, vermutlich C4-HSL, nachgewiesen. Die Inkubation von Flo 1-Kulturen für<br />
94
4. Diskussion<br />
8 Wochen und die Verwendung von nicht-axenischen Kulturen lassen jedoch<br />
vermuten, dass die AHL-Produktion nicht auf Stamm Flo 1 sondern auf heterotrophe<br />
Begleitorganismen zurückzuführen ist. Der cyanobakterielle Detritus bildet dabei<br />
vielleicht die Grundlage für ein stärkeres heterotrophes Wachstum und das Erreichen<br />
höherer Zelldichten der heterotrophen Bakterien. Gestützt könnte diese Annahme<br />
durch intrazelluläre, aber nicht gesicherte AHL-Nachweise einer<br />
21 Tage lang inkubierten Flo 1-Kultur werden (siehe Kap. 3.5.5). Nach Abgleich mit<br />
den Referenzmolekülen und in Anbetracht des AHL-Nachweisspektrums von<br />
Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) (FARRAND et al., 2002) weisen die DC-<br />
Signale auf ein langkettiges AHL-Molekül (mindestens eine C12-Seitenkette) und ein<br />
kurzkettiges AHL-Molekül, vermutlich 3-oxo-C4-HSL oder 3-hydroxy-C4-HSL, hin.<br />
Das Ausbleiben dieser AHL-Moleküle in den Kulturüberständen von Stamm Flo 1<br />
entspräche den bereits geschilderten Beobachtungen von ROMERO und<br />
Mitarbeitern (2006, 2008) bei einem Anabaena sp.-Stamm.<br />
Aussagen über mögliche Interspezies-Kommunikationen in assozzierten<br />
Lebensgemeinschaften von Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien können<br />
anhand der erzielten Ergebnisse kaum getroffen werden. Zum einen bringt der<br />
Nachweis von AHL-Molekülen in Überständen aus nicht-axenischen<br />
Cyanobakterienkulturen keinen Aufschluss über den eigentlichen AHL-Produzenten<br />
und zum anderen sind die untersuchten heterotrophen Stämme nicht wesentlicher<br />
Bestandteil der heterotrophen Begleitflora von Stamm Flo 1 (HUBE, 2008,<br />
persönliche Mitteilung). Dennoch ist vorstellbar, dass die produzierten<br />
Signalmoleküle heterotropher Bakterien Einfluss auf physiologische Prozesse von<br />
Stamm Flo 1 nehmen können (unidirektionale Interspezies-Kommunikation). CASE<br />
und Mitarbeiter (2008) konnten bei einer Vielzahl proteobakterieller Genome<br />
unvollständige QS-Systeme (Fehlen des luxI-homologen Gens) bzw. eine höhere<br />
Anzahl von luxR-Homologen gegenüber luxI-Homologen dokumentieren. Diese<br />
„zusätzlichen“ LuxR-homologen Proteine ermöglichen Bakterien (z.B. Brucella<br />
melitensis, Salmonella typhimurium und Escherichia coli) Spezies-fremde QS-<br />
Signale wahrzunehmen und in Abhängigkeit dieser Signalmoleküle physiologische<br />
Prozesse zu modulieren. Eine soziale Intelligenz wurde unter Bakterien auf diesem<br />
Niveau bis vor kurzem noch nicht vermutet.<br />
Die hohen pH-Werte in Kulturen von Stamm Flo 1 (SCHRÜBBERS, 2007) sprechen<br />
indes gegen eine interspezifische Kommunikation über AHL-Moleküle aufgrund der<br />
95
4. Diskussion<br />
Instabilität der Moleküle im alkalischen Bereich. Des Weiteren erreichen heterotrophe<br />
Bakterienspezies in (vitalen) nicht-axenischen Cyanobakterienkulturen lediglich<br />
geringe Zelldichten. QS-gesteuerte Prozesse werden dementsprechend aufgrund<br />
einer zu niedrigen „Autoinducer“-Konzentration nicht eingeleitet.<br />
4.3 Molekularbiologie<br />
Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden aus nicht-<br />
axenischen Cyanobakterienkulturen isoliert. Diese Cyanobakterienstämme Bo 53<br />
und Bo 10 wurden in der vorliegenden Arbeit zur phylogenetischen Einordnung<br />
molekularbiologisch untersucht und auf eine bereits vorgenommene taxonomische<br />
Einordnung überprüft.<br />
Basierte die Klassifizierung von Cyanobakterien hauptsächlich auf morphologischen<br />
Kriterien, sind mittlerweile neben phänotypischen, physiologischen sowie<br />
biochemischen Analysen insbesondere molekularbiologische grundlegend für eine<br />
taxonomische Einordnung von Cyanobakterien und dem Aufzeigen evolutionärer<br />
Verbindungen. Zur Identifikation von Bakterien und Erstellung von phylogenetischen<br />
Stammbäumen wird standardmäßig die 16S-rDNA-Sequenz der Mikroorganismen<br />
herangezogen (SEO und YOKOTA, 2003).<br />
Die 16S-rDNA-Analyse des Cyanobakterienstammes Bo 53 belegte eine<br />
Übereinstimmung von 99,85% mit der bereits in der NCBI-Datenbank hinterlegten<br />
16S-rDNA-Sequenz des Stammes Nodularia harveyana Bo 53 (LYRA et al., 2005).<br />
16S-rDNA-Sequenzen mit einer Homologie von mindestens 97% weisen<br />
Organismen gewöhnlich einer Spezies zu (STACKEBRANDT und GÖBEL, 1994).<br />
Eine Einordnung auf Speziesebene sollte über eine DNA-DNA-Hybridisierung<br />
abgesichert werden, da die 16S-rDNA aufgrund zu geringer Sequenz-Variabilität<br />
hierfür unzureichend ist (FOX et al., 1992; STACKEBRANDT und GÖBEL, 1994).<br />
Eine Verwandtschaftsbeziehung auf Speziesebene setzt dabei eine DNA-<br />
Reassoziation von mindestens 70% voraus (WAYNE et al., 1987). In diesem<br />
Zusammenhang empfehlen STACKEBRANDT und EBERS (2006), basierend auf<br />
publizierten Daten von 16S-rDNA-Analysen und DNA-DNA-Hybridisierungen, eine<br />
Revidierung der Spezies-Grenze auf 98,7 - 99% bzw. definieren diesen Bereich als<br />
denjenigen, welcher DNA-DNA-Hybridisierungsversuche zur Einordnung auf<br />
Spezies-Ebene zwingend erforderlich macht. Demzufolge kann Stamm Bo 53 mit<br />
einer Sequenzhomologie von 98,94 bzw. 99,70 % zu Stämmen von Nodularia<br />
96
4. Diskussion<br />
harveyana dieser Spezies zugeordnet werden (siehe Kap. 3.6.3). Die beiden in sehr<br />
enger Verwandtschaftsbeziehung stehenden Stämme Bo 53 und BECID27 bilden<br />
dabei in dem phylogenetischen Stammbaum ein abgegrenztes Cluster. Eine<br />
Zuweisung auf Speziesebene von Stamm Bo 53 sollte dennoch über eine DNA-DNA-<br />
Hybridisierung zwischen Stamm Bo 53 und Nodularia harveyana Stamm BECID27<br />
bestätigt werden.<br />
Generell werden Unterschiede von 5 - 7% (93 - 95% Identität) in den 16S-rDNA-<br />
Sequenzen zur Unterstützung für neue Gattungen herangezogen (MADIGAN et al.,<br />
2001). Der Cyanobakterienstamm Bo 10 wurde ursprünglich ausschließlich auf<br />
Grundlage morphologischer Merkmale als Oscillatoria brevis klassifiziert<br />
(RETHMEIER, 1995). Die aufgezeigten nahen Verwandtschaftsbeziehungen zu<br />
diversen Phormidium-Spezies über 16S-rDNA-Analysen machen jedoch eine<br />
Einordnung in die Gattung Phormidium wahrscheinlich, obwohl auch 98%<br />
Sequenzhomologie mit einer Oscillatoria-Spezies vorlagen (siehe Kap. 3.6.3). Der<br />
phylogenetische Stammbaum zeigte indes keine nahe Verwandtschaftsbeziehung<br />
von Stamm Bo 10 zu den Geitlerinema-Stämmen Flo 1 und PCC 7105 auf.<br />
Unterstützend zur 16S-rDNA-Sequenzanalyse sollten weitere molekulare Marker wie<br />
das Gen gyrB und die ITS (internal transcribed spacer) untersucht werden. Die ITS-<br />
Sequenzen sind zwischen den rRNA-Genen (16S-rRNA-, 23S-rRNA- und 5S-rRNA-<br />
Gen) lokalisiert (ITEMAN et al., 2000), wobei molekularbiologische Untersuchungen<br />
sich überwiegend auf die intergenische 16S-rRNA-23S-rRNA-Region beschränken.<br />
Anzahl und Größe der ITS-Regionen stellen einen zusätzlichen taxonomischen<br />
Marker für die phylogenetische Klassifizierung cyanobakterieller Stämme dar<br />
(ITEMAN et al., 2002). Ein identisches ITS-Bandenmuster bei nicht-verwandten<br />
Organismen ermöglicht jedoch keine Unterscheidung. Die im Vergleich zu den<br />
Geitlerinema-Stämmen unterschiedliche Anzahl von ITS-Amplifikaten bei Stamm<br />
Bo 10 schloss eine Einordnung in die Gattung Geitlerinema aus (siehe Kap. 3.6.5).<br />
Eine ITS-Sequenzanalyse kann des Weiteren eine Unterscheidung von<br />
Cyanobakterienstämmen auf intra- oder interspezifischer Ebene ermöglichen<br />
(TATON et al., 2003). Die ITS-Sequenz weist dabei gegenüber funktionellen Genen<br />
(z.B. das 16S-rRNA-Gen) eine wesentlich höhere molekulare Evolutionsrate auf<br />
(LEBLOND-BOURGET et al., 1996).<br />
97
5. Ausblick<br />
5. Ausblick<br />
In der vorliegenden Arbeit sind einige Fragen bezüglich des „<strong>Quorum</strong> <strong>Sensing</strong>“ bei<br />
Gram-negativen Bakterien offen geblieben, deren Beantwortung teilweise weiterer<br />
Methoden bedarf. Die erzielten Ergebnisse führten zu einer Vielzahl neuer<br />
Fragestellungen und bieten gleichermaßen die Grundlage für weitere QS-<br />
Untersuchungen.<br />
Eine AHL-Produktion in Stamm Flo 1-Kulturen konnte nicht gesichert auf das<br />
Cyanobakterium zurückgeführt werden. Fortführende QS-Untersuchungen an Stamm<br />
Flo 1 sollten mit axenischen Kulturen und ausschließlich intrazellulär durchgeführt<br />
werden. Mit dem Hintergrund der sehr schwachen AHL-Nachweise in Flo 1-Kulturen<br />
ist des Weiteren eine Anzucht im größeren Maßstab erforderlich.<br />
Unter den heterotrophen Bakterien zeichnet sich insbesondere der Porphyrobacter-<br />
Stamm aufgrund der deutlichen AHL-Nachweise für weitere QS-Untersuchungen<br />
aus. Die erzielten Ergebnisse bauen nahezu ausschließlich auf Grundlage eines<br />
Biosensors (Agrobacterium-Sensorstamm) auf. Dementsprechend sollten zusätzlich<br />
spezifischere Biosensoren wie Pseudomonas fluorescens 1855 (pSF105, pSF107)<br />
eingesetzt werden. Dieser Sensorstamm reagiert ausschließlich auf<br />
3-hydroxy-Derivate, welche bei Stamm Bo 53-33 vermutet wurden. Des Weiteren<br />
sollte bezüglich einer Interspezies-Kommunikation in assoziierten<br />
Lebensgemeinschaften von Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien eine<br />
Untersuchung auf AI-2-Signalmoleküle erfolgen.<br />
Die Bandbreite der Verfahren zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen ist relativ<br />
eingeschränkt. In den letzten Jahren fanden aber verstärkt MS-gekoppelte<br />
Kapillartechniken in der AHL-Analytik Anwendung. Zur Identifizierung und<br />
strukturchemischen Charakterisierung von AHL-Signalmolekülen sind analytische<br />
Verfahren wie die hochauflösende GC-MS erforderlich, deren Detektionsgrenzen im<br />
nmolaren bis pmolaren Bereich liegen. Alternativ ist eine Strukturanalyse auch mit<br />
der HPLC-MS möglich, wobei das Trennverfahren, die Sensitivität und die<br />
strukturelle Aufklärung nicht dem Niveau der GC-MS entspricht.<br />
Neben der AHL-Produktion ist eine Hinterfragung der AHL-QS-regulierten<br />
Phänotypen bzw. physiologischen Prozesse von großem Interesse. In diesem<br />
Zusammenhang könnte eine Möglichkeit in der Koppelung von<br />
Kultivierungsversuchen mit molekularbiologischen Analysen liegen. Die<br />
98
5. Ausblick<br />
Heterogenität der AHL-Synthase-Gene ermöglicht aber keine Entwicklung von PCR-<br />
Standardprotokollen zur direkten Bestimmung der AHL-Produktionsfähigkeit bei<br />
Mikroorganismen auf molekularer Ebene. Ein Vergleich der Proteinmuster in<br />
verschiedenen Wuchsphasen der Bakterien mittels 2D-PAGE könnte einen Ansatz<br />
bieten, wobei Rückschlüsse auf QS-regulierte Proteine möglich wären. Auf<br />
Transkriptionsebene wurde des Weiteren eine Expression QS-gesteuerter Gene über<br />
eine unterschiedlich stark exprimierte mRNA aufgezeigt (SHIN et al., 2007).<br />
Für eine gesicherte Einordnung des Cyanobakterienstammes Bo 10 in das Genus<br />
Phormidium sollten unterstützend zu den bisherigen phylogenetischen<br />
Untersuchungen eine Sequenzanalyse der ITS-Regionen, eine nochmalige gyrB-<br />
Gen-Analyse und eine Analyse des Fettsäuremusters erfolgen.<br />
99
6. Zusammenfassung<br />
6. Zusammenfassung<br />
1. Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wachsen in einem<br />
pH-Bereich von 6,0 - 9,0 und können daher als neutrophile Bakterien beschrieben<br />
werden. Der zum Wachstum optimale pH-Wert liegt für Stamm Bo 53-33 bei 7,0 und<br />
für Stamm Bo 10-09 bei 8,0. Bei einem Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR wiesen<br />
die heterotrophen Bakterienstämme kein verändertes Wachstumsverhalten<br />
gegenüber einer Dunkelinkubation auf. Die gepufferten und ungepufferten<br />
Versuchskulturen waren nach Beendigung der Inkubation durch eine Alkalisierung<br />
des Kulturmediums gekennzeichnet.<br />
2. Der Agrobacterium-Sensorstamm erwies sich im Vergleich zum Chromobacterium-<br />
Sensorstamm aufgrund deutlich höherer Sensitivitäten gegenüber den synthetischen<br />
Referenzmolekülen C8-HSL und C4-HSL für den Nachweis von AHL-<br />
Signalmolekülen als wesentlich geeigneter.<br />
3. Die Screeningtests mit dem Agrobacterium-Sensorstamm zum Nachweis AHL-<br />
produzierender Bakterien wiesen Stamm Bo 53-33 als deutlichen AHL-Produzenten<br />
aus. Für den Stamm Bo 10-09 wurde ein schwacher AHL-Nachweis erzielt, für das<br />
Cyanobakterium Stamm Flo 1 wurden hingegen keine AHL-Signalmoleküle<br />
nachgewiesen.<br />
4. Auf Grundlage bereits bestehender Methoden wurde eine dünnschicht-<br />
chromatographische Methode zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen mit den<br />
Biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) etabliert.<br />
5. Mit zunehmendem pH-Wert (von pH 6,0 bis 9,0) oder bei einer<br />
Temperaturerhöhung von 21 °C auf 28 °C nahm die mit dem Agrobacterium-<br />
Sensorstamm nachgewiesene AHL-Menge in Kulturüberständen von Stamm<br />
Bo 53-33 ab. Bei Stamm Bo 10-09 konnte in gepufferten Versuchskulturen lediglich<br />
bei pH 6,0 ein AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm erzielt werden.<br />
Die Azidifizierung (pH < 2) von Kulturüberständen der Gram-negativen Bakterien<br />
führte zu einem deutlich stärkeren Nachweis an AHL-Molekülen. Die Stabilität der<br />
AHL-Signalmoleküle ist demnach abhängig vom pH-Wert des Kulturmediums und<br />
100
6. Zusammenfassung<br />
der Temperatur. Der Azidifizierungsversuch konnte insbesondere für Stamm<br />
Bo 53-33 zeigen, dass sich die AHL-Stabilität wahrscheinlich mit abnehmender Acyl-<br />
Seitenkettenlänge verringert.<br />
6. Ein Photonenfluss von 5 µE m -2 s -1 PAR hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf<br />
die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und<br />
Bo 10-09. Eine Reduzierung der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium führte<br />
wahrscheinlich zu einer veränderten AHL-Produktion durch die heterotrophen<br />
Bakterienstämme.<br />
7. Ein intrazellulärer AHL-Nachweis für die heterotrophen Bakterien wurde bei<br />
Stamm Bo 53-33 erzielt, wobei das detektierte AHL-Molekül<br />
dünnschichtchromatographisch identisch ist mit einem nachgewiesenen AHL-Molekül<br />
in den Kulturüberständen. Bei Stamm Bo 10-09 konnten intrazellulär keine AHL-<br />
Moleküle nachgewiesen werden.<br />
8. Für Stamm Bo 53-33 konnte ein AHL-Signalmolekül mit kurzer Acyl-Seitenkette<br />
(C4 - C6) und ein weiteres mit kurzer bis mittellanger Acyl-Seitenkette (C6 - C8)<br />
dokumentiert werden. Für den schwachen AHL-Produzenten Stamm Bo 10-09<br />
wurden neben C8-HSL vermutlich zwei weitere AHL-Signalmoleküle mit einer<br />
C6 - C8-Seitenkette bzw. C4-Seitenkette nachgewiesen. 3-oxo-Derivate konnten<br />
aufgrund fehlender „tailing spots“ der DC-Signale ausgeschlossen werden.<br />
9. In Kulturüberständen des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 wurden sehr geringe<br />
AHL-Mengen mit dem Agrobacterium-Sensorstamm nachgewiesen, wobei vermutlich<br />
drei verschiedene Signalmoleküle mit kurzer bzw. mittellanger Acyl-Seitenkette<br />
vorlagen. Die Ergebnisse konnten durch zwei intrazellulär erzielte AHL-Nachweise<br />
nicht bestätigt werden. Der Stamm Flo 1 konnte nicht gesichert als AHL-Produzent<br />
beschrieben werden, da eine AHL-Produktion durch heterotrophe Begleitflora (nicht-<br />
axenische Kulturen) nicht ausgeschlossen werden kann.<br />
101
6. Zusammenfassung<br />
10. Die 16S-rDNA-Sequenz des Cyanobakterienstammes Bo 53 zeigte durch<br />
Vergleich mit Referenzsequenzen aus der NCBI-Datenbank eine Sequenzhomologie<br />
von 99,70% mit Nodularia harveyana Stamm BECID27 auf. Die bereits<br />
vorgenommene Einordnung zu Nodularia harveyana konnte damit bestätigt werden.<br />
11. Der Cyanobakterienstamm Bo 10 wurde bisher auf Grundlage von<br />
morphologischen Merkmalen als Oscillatoria brevis klassifiziert (RETHMEIER, 1995).<br />
Nach 16S-rDNA-Analyse wurden die größten Übereinstimmungen mit Vertretern der<br />
Gattung Phormidium und hier mit Phormidium pseudopristleyi Stamm ANT.ACEV5.3<br />
(99,32%) dokumentiert. Folglich kann Stamm Bo 10 der Gattung Phormidium<br />
zugeordnet werden. Nach einer Amplifikation der ITS konnte für Stamm Bo 10<br />
gegenüber den Geitlerinema-Stämmen Flo 1 und PCC 7105 eine höhere Anzahl an<br />
ITS-Regionen dokumentiert werden, welches eine Einordnung in das Genus<br />
Geitlerinema ausschloss.<br />
102
7. Anhang<br />
7. Anhang<br />
Tab. 7.1: Inkubationsdauer der AHL-Versuchsansätze mit den heterotrophen Bakterienstämmen<br />
Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen bis in die logarithmische bzw.<br />
stationäre Wachstumsphase in h.<br />
Wachstumsbedingungen<br />
21 °C, Dunkel<br />
21 °C,<br />
5 µE m² s -1 PAR<br />
ASN III/2 -<br />
Medium<br />
Wachstumsphase<br />
28 °C, Dunkel ungepuffert stationär b)<br />
21 °C, Dunkel,<br />
Minimalmedium<br />
ungepuffert<br />
Inkubationsdauer (h)<br />
von Stamm Bo 53-33<br />
logarithmisch 27 a)<br />
stationär 124 a)<br />
Inkubationsdauer (h)<br />
von Stamm Bo 10-09<br />
pH 6,0 stationär 138 64<br />
pH 7,0<br />
pH 8,0<br />
24 a)<br />
72 a)<br />
logarithmisch 40 --<br />
stationär 108 --<br />
logarithmisch -- 40<br />
stationär -- 108<br />
pH 8,5 stationär 108 108<br />
pH 9,0 stationär 46 46<br />
ungepuffert<br />
ungepuffert stationär b)<br />
logarithmisch 22 18<br />
stationär 66 48<br />
a)<br />
Nach Inkubation der Zellkulturen konnte eine Azidifizierung der Zellkulturüberstände nach YATES<br />
und Mitarbeitern (2002) erfolgen.<br />
b)<br />
Die stationäre Wachstumsphase und Inkubationsdauer wurden nicht über zuvor generierte Wachstumskurven<br />
abgeleitet, sondern über photometrische Messungen der 250 ml Ansätze bei einer<br />
O.D.600nm<br />
96 b)<br />
46 b)<br />
60 b)<br />
46 b)<br />
103
7. Anhang<br />
Tab. 7.2: Sequenzausschnitt der 16S-rDNA des Nodularia harveyana-Stammes Bo 53 (1333 bp)<br />
AGTAACGCGTGAGAATCTAGCTTCAGGTCGGGGACAACCACGGGAAACTGTGGCTAATACCGGATATGCC<br />
GAGAGGTGAAAGGCTTGCTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAGAGCGCA<br />
CCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT<br />
CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGG<br />
AGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTACCTGAGGAATAAGCA<br />
TCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTA<br />
AAGGGTCCGCAGGTGGCCATGTAAGTCTGCTGTTAAAGAATCTAGCTCAACTAGATAAAAGCAGTGGAAA<br />
CTACACGGCTAGAGTGCGTTCGGGGTAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGA<br />
AGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTACTAGGCCGCAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAA<br />
TGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGC<br />
CGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATT<br />
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACT<br />
TGACATGTCGCGAATCTTTCTGAAAGGAGAGAGTGCCTTAGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTG<br />
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCAG<br />
CATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAG<br />
CATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCAATGT<br />
GATGCAAATCTCAGAAACCGTAGCTCAGTTCAGATCGCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGTAGGAATC<br />
GCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC<br />
ATGGAAGCTGATCACGCCCGAAGTCGTTACCCCAACTTTTAGGAGAGGGGGATGCCGAAG<br />
Tab. 7.3: Sequenzausschnitt der 16S-rDNA der Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 (1336 bp)<br />
GGGTGAGTAACACGTGAGAATCTGCCTCCAGGTCGGGGACAACAGCGGGAAACTGCTGCTAATACCCGAT<br />
GTGCCTAAGGGTGAAAGATTAATTGCCTGGAGATGAGCTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTAGAGTAAAA<br />
GCCTACCAAGGCTCCGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC<br />
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAAGACCGCGT<br />
GGGGGATGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCCCTTTTCTCAGGGAAGAATAACTGACGGTACCTGAGGAATA<br />
AGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG<br />
CGTAAAGCGTTCGTAGGTGGCTGTTCAAGTCTGCCGTTAAAGACCGGGGCTTAACTCCGGAAAAACTGTG<br />
GAAACTGAACAGCTAGAGTATGGTAGGGGTAAGGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATC<br />
GGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGCCTTACTGGGCCATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAG<br />
CGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCTGTAAACGATGGATACTAGGTGTTGCCCGTATCGACCC<br />
GGGCAGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG<br />
AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAG<br />
GGCTTGACATGTCCAGAATCTTGGGGAAACTTGAGAGTGCCTTCGGGAGCTGGAACACAGGTGGTGCATG<br />
GCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTTAGTTG<br />
CCATCATTAAGTTGGGCACTTTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG<br />
TCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGGAAGGACAGAGGGTAGCAAGCGCGCG<br />
AGTGCAAGCCAATCCCATAAACCTTTCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGCGG<br />
AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCCCGCCCGTCA<br />
CACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACCCTAACCGCAAGGAGGGGGATGCCGAAGGCAGGCTA<br />
GTACGT<br />
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Erklärung gemäß § 21, Absatz 6 der Diplomprüfungsordnung für den<br />
Studiengang Biologie (vom 7. Dezember 1994)<br />
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und dabei<br />
keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.<br />
<strong>Bremen</strong>, im April 2008 ____________________________<br />
(Peter Orszag)<br />
116