Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Universität Bremen
Fachbereich 2: Biologie
Projektbericht
angefertigt in der Abteilung Marine Mikrobiologie
Leitung: Prof. Dr. Ulrich Fischer
Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen
heterotrophen Bakterien unter besonderer Berücksichtigung der
Amylasen
vorgelegt von
Tatjana Votteler
Bremen, Mai 2007

Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUBGSVERZEICHNIS ........................................................................................ IV
1. EINLEITUNG ........................................................................................................... ......... 1
1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen ...........................................................................................1
1.2. Enzyme in der Industrie .................................................................................................................1
1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz ..........................................................2
1.3. Amylasen .......................................................................................................................................3
1.4. Peptidasen ..................................................................................................................................... 3
1.5. Lipasen ...........................................................................................................................................4
1.6. DNasen ...........................................................................................................................................5
1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit .......................................................................5
2. MATERIAL UND METHODEN....................................................................................... 6
2.1. Material .........................................................................................................................................6
2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien ......................................................................6
2.1.2. Bacillus subtilis ………...........................................................................................................6
2.2. Medien, Lösungen und Puffer ......................................................................................................7
2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992) .......................................7
2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979,
modifiziert nach Rethmeier, 1995) ........................................................................................9
2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989) ...........................................................10
2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme ......................................................10
2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhard
et al., 1994) .......................................................................................................................11
2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach
Schreier, 1969) ..................................................................................................................11
2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach
Gerhard et al., 1994) ........................................................................................................11
2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert
nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................11
2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis ......................................................................11
2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis ......................................................11

Inhaltsverzeichnis II
2.2.7. Lugolsche Lösung ..................................................................................................................12
2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976) ......................................................................................12
2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) ...............................................................................12
2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5) ..................................................................12
2.2.11. Stärke-Puffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung ................................................................12
2.2.12. 2x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970) ...................................................12
2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung ...................................................................................13
2.2.13.1. Fixierer A .......................................................................................................................13
2.2.13.2. Fixierer B .......................................................................................................................13
2.2.13.3. Fixierer C .......................................................................................................................13
2.2.13.4. Entwickler ......................................................................................................................13
2.3. Methoden .....................................................................................................................................13
2.3.1. Hälterung der Organismen .....................................................................................................13
2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen ........................................................14
2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhard
et al.,1994) .......................................................................................................................14
2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach
Schreier, 1969) .................................................................................................................14
2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach
Gerhard et al., 1994) .......................................................................................................14
2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin B-Agar (modifiziert
nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................15
2.3.3. Methoden zur Anreichreung und Bestimmung von Proteinen ..............................................15
2.3.3.1. Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium .......................................................................15
2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis- Kultur ..............................................................................15
2.3.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände ...........................................................................15
2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung ..................................................................................................16
2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976) ..............................................................................16
2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen .....................................................17
2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert
nach Laemmli, 1970) ......................................................................................................17
2.3.4.2. Amylase-Aktiviätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert
nach Kim et al., 1995, Lacks & Springhorn, 1980) .........................................................17
2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine .......................................................................................18
2.4. Chemikalien .................................................................................................................................19

Inhaltsverzeichnis III
3. ERGEBNISSE ....................................................................................................................20
3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien ................................................................20
3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar ..............................................................21
3.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................22
3.2.1. Anreicherung der Amylase ....................................................................................................22
3.2.2. Ammoniumsulfatfällung ........................................................................................................23
3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel ........................................................................23
3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine .............................................................................................25
4. DISKUSSION .....................................................................................................................26
4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien .....................................................26
4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................26
5. LITERATURVERZEICHNIS ..........................................................................................29

Abkürzungsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis
A
Aqua dest.
ASN
d
Da
et al.
G
k
M1
m
µ
n.u.
p.a.
PAGE
RT
rpm
SDS
s
V
Ampere
destilliertes Wasser
Artificial Seawater Nutrients
Tage (days)
Dalton
und andere (et alii)
Gramm
Kilo
Medium
Milli
Mikro
noch unbekannt
zur Analyse (pro analysi)
Polyacryamid-Gelelektrophorese
Raumtemperatur
Rotationen pro Minute (rounds per minute)
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
Sekunde
Volt
v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)
W Watt
w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)

Einleitung 1
1. Einleitung
1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen
Jeder Organismus produziert eine große Vielfalt von Enzymen (Madigan et al., 2003), welche
für die Katalyse der zahlreichen biochemischen Reaktionen verantwortlich sind (Voet et al.,
2002). Die meisten Enzyme werden von den Organismen in kleinen Mengen synthetisiert und
sind an zellulären Prozessen beteiligt. Jedoch sind einige Mikroorganismen befähigt, gewisse
Enzyme in viel größeren Mengen zu produzieren und diese nach außen zu sekretieren
(Madigan et al., 2003). Extrazelluläre Enzyme spalten Makromoleküle, welche nicht in die
Zelle aufgenommen werden können, zu transportablen Mono-, Di- oder Oligomeren (Fritsche,
2002). Diese können nach der Aufnahme in die Zelle als Nährstoffe für das Wachstum
verwendet oder in Form von Makromolekülen gespeichert werden (Madigan et al., 2003).
1.2. Enzyme in der Industrie
Mikroorganismen und Enzyme werden schon seit langer Zeit zur Verarbeitung von
pflanzlichen und tierischen Rohstoffen verwendet. Früher standen die Verfahren mit lebenden
Mikroorganismen im Vordergrund. Dazu gehört die Herstellung von alkoholischen
Getränken, Hefe-Fermentation von Teig bei der Brotherstellung, Konservierung von Gemüse
durch Fermentation mit Lactobazillen (z.B. Sauerkraut) oder die Herstellung von Käse (Uhlig,
1991). Gegen Ende des 19. Jahrhunderts wurde erkannt, dass Enzyme unabhängig von
lebenden Zellen wirken (Buchholz & Kasche, 1997). Heutzutage werden sowohl lebende
Zellen als auch isolierte Enzyme in der Industrie verwendet (Schmid et al., 2001).
Enzyme unterscheiden sich von den üblichen chemischen Katalysatoren in einigen wichtigen
Punkten: Sie weisen höhere Reaktionsgeschwindigkeiten auf, funktionieren unter milderen
Reaktionsbedingungen, sie haben größere Reaktionsspezifität und sind regulationsfähig (Voet
et al., 2002). Aufgrund ihrer Reaktionsspezifität entstehen bei enzymatischen Reaktionen
relativ reine Produkte, was die Abfallmenge reduziert (Marrs et al., 1999). Die milden
Reaktionsbedingungen, bei denen Enzyme arbeiten, senken den Energieverbrauch, was die
Produktionskosten und die Treibhausgasemissionen vermindert (Rozzel, 1999).
Enzyme werden in zahlreichen Industriezweigen in biokatalytischen Prozessen angewandt
(siehe Tab. 1.1.). Sie werden in der Lebensmitteltechnologie, bei der Papier-, Textil- und
Lederbehandlung, sowie für analytische und diagnostische Zwecke eingesetzt. Auch in der
pharmazeutischen und chemischen Industrie werden Enzyme verwendet Dabei ist die Stereo-,
Regio- und Substratspezifität der enzymatischen Katalyse in diesen Industriezweigen von

Einleitung 2
besonderer Bedeutung, weil dadurch Verbindungen synthetisiert werden, die mit
konventionellen chemischen Methoden schwer herzustellen sind (Schmid, 2006; Marrs et al.,
1999; Rozzel, 1999; Koeller & Wong, 2001)
Tab. 1.1.: Anwendungsgebiete und einige Beispiele für Herkunftsorganismen von biotechnisch
genutzten Enzymen (Schmid, 2006; Uhlig, 1991)
Enzymtyp Anwendung Organismen
Proteasen Waschmittelzusatz Bacillus licheniformis
Mehl- und Backwaren Aspergillus oryzae
Käsereifung und Aroma
Lederbehandlung
Amylasen Stärke-Abbau Bacillus amyloliquefaciens
Papierherstellung Bacillus subtilis
Textilbehandlung Aspergillus oryzae
Teig- und Backwaren-
verarbeitung
Lipasen Waschmittelzusatz Aspergillus nidulans
Käsereifung und Aroma
Cellulasen Waschmittelzusatz Trichoderma reesei
Früchteverwertung und Wein Aspergillus niger
Futtermittelherstellung
1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz
Ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt, wird durch das Verhältnis des
anwendungstechnischen Nutzens und dem Preis des Enzyms bestimmt (Schmid, 2006). Die
Kosten der Enzymproduktion und Aufarbeitung sinken mit steigendem Enzymgehalt in den
Enzymquellen. Bei der Suche nach neuen Enzymquellen können Mikroorganismen mithilfe
von Enzym-Assays auf die Produktion von gesuchten Enzymen getestet werden. Inwieweit
sich diese Mikroorganismen auch als Enzymproduzenten für enzymtechnische Verfahren
eignen, kann durch Untersuchungen der Enzymproduktion und der Enzymeigenschaften
herausgefunden werden (Buchholz & Kasche, 1997).
Viele Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit, diejenigen Enzyme verstärkt zu
synthetisieren, deren Substrate im Medium vorhanden sind. Bestimmte Bakterien produzieren
nur dann Amylasen, wenn Stärke als Kohlenstoffquelle in der Umgebung vorliegt. Andere
Kohlenstoffquellen, wie Glucose, können hingegen die Synthese der Amylasen reprimieren.
Solche Enzyme werden als induzierbare Enzyme bezeichnet. Enzyme, deren Synthese

Einleitung 3
unabhängig von den äußeren Faktoren ist und kontinuierlich stattfindet, werden als
konstitutive Enzyme bezeichnet (Ruttloff et al., 1978).
Um hohe Ausbeuten bei der Enzymsynthese zu erreichen, muss die Induktion und Repression
der Synthese berücksichtigt werden (Buchholz & Kasche, 1997). Eine maximale Synthese
induzierbarer Enzyme wird erst durch den Einsatz bestimmter Nährsubstrate, welche als
Induktoren wirken, erreicht. Als typische Induktoren sind Stärke (Amylase), Casein, Albumin
(Protease), Pektin (Pektinase), u.a. bekannt (Ruttloff et al., 1978).
1.3. Amylasen
Amylasen spalten Stärke und Glykogen durch Hydrolyse der α-1,4-glycosidischen Bindung
zu Dextrinen und Zuckern (Uhlig, 1991). Stärke ist ein wichtiges Reservepolysaccharid der
höheren Pflanzen (Ruttloff et al., 1978) und ist Hauptbestandteil der meisten Nahrungsmittel
und der wichtigste Energielieferant unserer Ernährung (Uhlig, 1991). Stärke setzt sich aus den
Bestandteilen Amylose und Amylopektin zusammen, die aus Glucoseuntereinheiten bestehen.
Amylose ist ein lineares Polymer, das aus 6.000 oder mehr α-1,4-glycosidisch verbundenen
Glucoseresten besteht. Amylopektin ist hingegen ein verzweigtes Molekül. Es setzt sich aus
etwa 2 Mio. α-1,4- und α-1,6-glycosidisch verbundenen Glucoseresten zusammen, wobei die
α-1,6-glycosidischen Bindungen etwa 5 % der Gesamtbindungen ausmachen (van den Maarel
et al., 2002).
Viele Bakterien können Stärke als Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum nutzen.
Dafür werden die Stärkemoleküle extrazellulär von den Bakterien zu transportablen
Molekülen gespalten, bevor sie in die Zelle aufgenommen und weiterverwertet werden. Eine
ganze Reihe Stärke-abbauender Enzyme, die eine große Vielfalt von Produkten liefern,
werden von diesen Mikroorganismen gebildet. Viele dieser Enzyme finden bei den
stärkeverarbeitenden, industriellen Prozessen Anwendung (van der Veen et al., 2000).
Man unterscheidet α-, β- und Glycoamylasen. α-Amylasen (1,4-α-D-glucan
glucanohydrolase; EC 3.2.1.1) hydrolysieren α-1,4-glycosidische Bindungen innerhalb des
Makromoleküls, wobei Glucose, Maltose und Grenzdextrine freigesetzt werden. β-Amylasen
(1,4-α-D-glucan maltohydrolase; EC 3.2.1.2) spalten Maltose vom nicht reduzierenden Ende
des Polysaccharids ab und Glycoamylasen (1,4-α-D-glucan glucohydrolase; 3.2.1.3) spalten
Glucose ebenfalls vom nicht reduzierenden Ende ab (Ruttloff et al., 1978;
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/).

Einleitung 4
1.4. Peptidasen
Proteolytische Enzyme (EC 3.4) katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen in
Proteinen und Peptiden. Sie werden in zwei Hauptgruppen, die Exo- und Endopeptidasen
unterteilt. Exopeptidasen spalten Peptidbindungen, die nahe dem C- oder N-Terminus liegen
und werden aufgrund ihres Reaktionsortes entweder als Amino- oder als Carboxypeptidasen
bezeichnet. Endopeptidasen spalten ketteninterne Peptidbindungen. Sie werden nach ihrem
katalytischen Mechanismus in Serin-, Aspartat-, Cystein- und Metalloproteasen unterteilt
(Rao et al., 1998).
Peptidasen kommen sowohl in Tieren als auch in Pflanzen und Mikroorganismen vor. Jedoch
haben die mikrobiologisch erzeugten Peptidasen technisch die größte Bedeutung (Uhlig,
1991). Die große Vielfalt der Peptidasen erregte weltweite Beachtung und es wurde versucht
diese Vielfalt physiologisch und biotechnologisch auszunutzen (Rao et al., 1998).
Serinproteasen (Subtilisine) werden als Waschmittelzusatz zur Entfernung von eiweißhaltigen
Verschmutzungen eingesetzt (Schmid, 2006). In der Lederindustrie werden Peptidasen zur
Entfernung von Haaren von den Tierhäuten verwendet und ersetzen somit den Einsatz von
giftigen Chemikalien (Rao et al., 1998). Auch in der Lebensmittelindustrie werden Peptidasen
eingesetzt. Bei der Verarbeitung von Teig bewirken Peptidasen den partiellen Abbau des
Getreide-Klebereiweißes (Gluten). Die Dehnbarkeit des Teiges wird erhöht, wodurch
verbessertes Gasrückhaltevermögen für das CO2 (Gärung) erreicht wird. Außerdem werden
Peptidasen zum Zartmachen von Fleisch (partieller Verdau des Muskelgewebes) (Schmid,
2006), zur Herstellung von Soja-Produkten und zur Synthese von Aspartam (kalorienfreier
Süßstoff) eingesetzt (Rao et al., 1998). Auch in der Grundlagenforschung spielen Peptidasen
eine wichtige Rolle. Ihre Fähigkeit, selektiv bestimmte Peptidbindungen zu spalten, wird bei
der Peptidsynthese und bei der Sequenzierung von Proteinen ausgenutzt (Rao et al., 1998).
1.5. Lipasen
Lipasen (Triacylglycerol acylhydrolase; EC 3.1.1.3) katalysieren sowohl die Hydrolyse als
auch die Synthese von Estern aus Glycerin und langkettigen Fettsäuren. Lipasen durchführen
diese Reaktionen mit hoher Regio- und Enantioselektivität, was sie zu wichtigen
Biokytalysatoren in der organischen Chemie macht. Viele Lipasen werden großtechnisch
produziert, wobei der Großteil von ihnen aus Pilzen und Bakterien stammt. Das kommerziell
wichtigste Anwendungsgebiet von Lipasen ist ihr Zusatz zu Detergenzien (Jaeger & Reetz,
1998).

Einleitung 5
Ein weiteres Anwendungsgebiet von Lipasen ist die Papierindustrie. Dabei werden Lipasen
zur Entfernung von Triglyceriden und Wachs aus Zellstoff bei der Papierherstellung
eingesetzt (Jaeger & Reetz, 1998). Außerdem kann beim Recycling-Prozess von Altpapier die
Drückerschwärze nach Vorbehandlung mit Lipasen, Cellulasen und Xylanasen leichter
entfernt werden (Schmid, 2006). Lipasen werden auch für die Synthese von Biopolymeren,
wie Polyester sowie Feinchemikalien, wie Medikamenten oder Duftstoffen, eingesetzt (Jaeger
& Eggert, 2002).
1.6. DNasen
DNasen gehören zu den Nukleasen. Sie katalysieren die Spaltung von
Desoxyribonukleinsäure (DNA) entweder durch die Hydrolyse von Phosphodiester-
Bindungen oder durch das Entfernen von Phosphat (Zenkova, 2004). Extrazelluläre
Nukleasen sind bei Bakterien selten. Ihre Produktion begrenzt sich auf eine kleine Anzahl von
Bakterien-Arten, die weit über das Reich der Eubakterien verteilt sind (Benedik & Strych,
1998).
DNasen werden in der Analytik eingesetzt. Bei der Isolierung von RNA werden DNasen
zugesetzt, um mögliche DNA-Kontaminationen zu entfernen (Lottspeich & Zobras, 1998).
Restriktionsendonukleasen, die bestimmte Sequenzen erkennen und schneiden, werden z.B.
bei der Erstellung von genetischen Fingerabdrücken (Fingerprinting) oder beim Klonieren
bestimmter DNA-Fragmente in Vektoren verwendet (Voet et al., 2002).
Bestimmte DNasen werden bei der Behandlung von Symptomen der Cystischen Fibrose
eingesetzt. Bei dieser Erbkrankheit kommt es durch Schleimbildung in den Atemwegen zur
dramatischen Behinderung der Atmung. Dabei wird die Viskoelastizität des Schleims durch
extrazelluläre DNA aus den Leukocyten drastisch erhöht. Durch Inhalationssprays, welche
DNasen enthalten, werden die Symptome gelindert (Schmid, 2006).
1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden zwölf heterotrophe Bakterienstämme aus der
Ostsee, welche von Cyanobakterien aus der Stammsammlung der Arbeitsgruppe Marine
Mikrobiologie isoliert wurden, zunächst hinsichtlich der Produktion verschiedener
extrazellulärer Enzyme getestet. Im zweiten Teil wurde dann bei dem Stamm, der die höchste
Amylaseaktivität aufwies, die Expression der Amylase codierender Gene untersucht.
Außerdem sollte anhand der erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob dieser Stamm als
Enzymquelle für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist.

Material und Methoden 6
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden freundlicherweise von
Dipl.-Biologin Annina Hube (Universität Bremen, Abteilung Marine Mikrobiologie) zur
Verfügung gestellt. Die Organismen (siehe Tab. 2.1.) stammen aus der Ostsee bei Boiensdorf
und wurden von den Cyanobakterien Nodularia harveyana (Stammbezeichnung der
Heterotrophen Bo 53) und Oscillatoria brevis (Stammbezeichnung der Heterotrophen Bo 10)
isoliert. Die Stämme wurden von Annina Hube mithilfe der Sequenzierung und
Charakterisierung von Merkmalen einer Gruppe oder einige von ihnen sogar einer Art
zugeordnet (siehe Tab. 2.1).
Tab. 2.1.: Verwendete Bakterienstämme und deren Art bzw. Gruppenzugehörigkeit
Stamm Art Gruppe
Bo 10-09 Muricauda aquimarina Bacteroidetes
Bo 10-10 n.u. Bacteroidetes
Bo 10-13 n.u. Bacteroidetes
Bo 10-15 n.u. Bacteroidetes
Bo 10-19 Rhodobaca sp. Alpha-Proteobacteria
Bo 10-20 Roseobacter sp. Alpha-Proteobacteria
Bo 53-20 n.u. Gamma-Proteobacteria
Bo 53-33 Porphyrobacter sp. Alpha-Proteobacteria
Bo 53-34 n.u. Bacteroidetes
Bo 53-37 n.u. Bacteroidetes
Bo 53-39 n.u. Bacteroidetes
Bo 53-45 n.u. Bacteroidetes
n.u.= noch unbekannt
2.1.2. Bacillus subtilis
Ein Bacillus subtilis-Stamm wurde von Dipl.-Biologe Helge Mühl (Universität Bremen,
Abteilung Marine Mikrobiologie) zur Verfügung gestellt. Aufgrund seiner Fähigkeit zur
Produktion großer Mengen extrazellulärer Amylasen (Helge Mühl, persönliche Mitteilung),

Material und Methoden 7
wurde dieser Stamm als Positivkontrolle im Amylaseaktivitätstest nach der SDS-PAGE
eingesetzt.
2.2. Medien, Lösungen und Puffer
2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992)
Die Komponenten des M1-Mediums sind in den Tabellen 2.2.-2.7. aufgeführt. Die KH2PO4-,
Spurenelement-, Se-W- und NH4Cl-Lösungen wurden als Stammlösungen angesetzt und
getrennt autoklaviert. Die 7-Vitamin-, Vitamin B12-, Riboflavin- und Thiamin-Lösungen
wurden ebenfalls als Stammlösungen angesetzt und sterilfiltriert (Minisart®-Filter,
Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem Medium nach dem
Autoklavieren steril zugesetzt. Als Kohlenstoffquellen dienten Stärke oder Maltose. Stärke
wurde vor dem Autoklavieren dem Medium zugesetzt. Maltose wurde in Aqua dest. gelöst,
sterilfiltriert (Minisart®-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius) und dem Medium nach dem
Autoklavieren hinzugefügt.
Tab. 2.2.: Zusammensetzung des M1-Mediums
Komponenten g/l oder ml/l
NaCl 13,19
MgCl2 x 6 H2O 2,84 g
KCl 0,36 g
MgSO4 x 7 H2O 3,4 g
CaCl2 x 2 H2O 0,74 g
NaHCO3 0,095 g
Aqua dest. ad 1000 ml
KH2PO4-Lösung (50 g/l) 10 ml
NH4Cl-Lösung (50 g/l) 10 ml
Spurenelementlösung 2 ml
Se-W-Lösung 1 ml
7-Vitamin-Lösung 1 ml
Vitamin B12-Lösung (50 mg/l) l 1 ml
Vitamin B2-Lösung 1 ml
Vitamin B1-Lösung 1 ml

Material und Methoden 8
Tab. 2.3.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das M1-Medium
Komponenten mg/l oder ml/l
FeSO4 x 7 H2O 2100 mg
Na2-EDTA 5200 mg
H3BO3
30 mg
MnCl2 x 4 H2O 100 mg
CoCl2 x 6 H2O 190 mg
NiCl2 x 6 H2O 24 mg
CuCl2 x 2 H2O 10 mg
ZnSO4 x 7 H2O 144 mg
Na2MoO4 x 2 H2O 36 mg
Die Spurenelemente wurden in 800 ml demineralisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert
wurde mit 5 M NaOH-Lösung vor dem Autoklavieren auf 6,0 eingestellt.
Tab. 2.4.: Zusammensetzung der Se-W-Lösung für das M1-Medium
Komponenten mg/l oder ml/l
NaOH 200 mg
Na2SeO3 x 5 H2O 18 mg
Na2WO4 x 2 H2O 18 mg
Aqua dest. ad 1000 ml
Tab. 2.5.: Zusammensetzung der 7-Vitamin-Lösung für das M1-Medium
Komponenten mg/l oder ml/l
NaH2PO4 x H2O (3 mM) 414 mg
Na2HPO4 x 2 H2O (7 mM) 1246 mg
Vitamin H1 40 mg
D-(+)-Biotin 20 mg
Niacin 100 mg
Ca-D-(+)-Pantothenat 50 mg
Vitamin B6 150 mg
Folsäure 40 mg
Liponsäure 20 mg
Aqua dest. ad 1000 ml
Tab. 2.6.: Zusammensetzung der Vitamin B2-Lösung für das M1-Medium
Komponenten mg/l oder ml/l
NaH2PO4 x H2O (25 mM) 3450 mg
Vitamin B2 50 mg
Aqua dest. ad 1000 ml

Material und Methoden 9
Tab. 2.7.: Zusammensetzung der Vitamin B1-Lösung für das M1-Medium
Komponenten mg/l oder ml/l
NaH2PO4 x H2O (25 mM) 3450 mg
Vitamin B1 50 mg
Aqua dest. ad 1000 ml
2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979, modifiziert nach
Rethmeier, 1995)
Die Komponenten des ASN-Mediums sind in den Tabellen 2.8 und 2.9 aufgeführt. Na2CO3
wurde in demineralisiertem Wasser gelöst und getrennt autoklaviert. Nach dem Abkühlen
wurde es dem Medium zugegeben.
Die K2HPO4-, Spurenelement- und Eisen-Ammonium-Citrat-Lösungen wurden als
Stammlösungen angesetzt und getrennt autoklaviert. Die Vitamin B12-Lösung wurde hingegen
sterilfiltriert (Minisart®-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem
Medium nach dem Autoklavieren steril zugesetzt.
Tab. 2.8.: Zusammensetzung des ASNIII/2-Mediums
Komponenten g/l oder ml/l
NaCl 12,5 g
MgCl2 x 6 H2O 1 g
KCl 0,25 g
MgSO4 x 7 H2O 1,75 g
CaCl2 x 2 H2O 0,25 g
NaNO3 0,75 g
Agar (nur für feste Medien) 15 g
Aqua dest. ad 900 ml
Na2CO3 (in 100 ml demineralisiertem Wasser lösen) 0,12 g
K2HPO4 x 3 H2O-Lösung (4 g/l) 2,5 ml
Spurenelementlösung 0,5 ml
Fe-NH4-Citrat-Lösung (6 g/l) 0,25 ml
Vitamin B12-Lösung (10 mg/l) 0,5 ml

Material und Methoden 10
Tab. 2.9.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das ASNIII/2-Medium
Komponenten g/l pder ml/l
Na3-Citrat x 2 H2O 3 g
Na3-EDTA x 2 H2O 5,5 g
H3BO3
2,86 g
MnCl2 x 4 H2O 1,81 g
ZnSO4
0,222 g
Na2MoO4 x 2 H2O 0,318 g
CuSO4 x 5 H2O 0,079 g
Co(NO3)2 x 6 H2O 0,0494 g
Aqua dest. 1000 ml
2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989)
Die Zusammensetzung des LB-Mediums ist in Tab. 2.10 aufgeführt. Nach dem Auflösen der
einzelnen Komponenten in Aqua dest. wurde das Medium autoklaviert.
Tab. 2.10.: Zusammensetzung des LB-Mediums
Komponenten g/l oder ml/l
Trypton 10 g
Hefeextrakt 5 g
NaCl 10 g
Aqua dest. ad 1000 ml
2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme
Für den Nachweis der extrazellulären Enzyme wurde das ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.2.)
verwendet. Dafür wurden den Medien 15 g/l Agar vor dem Autoklavieren zugegeben. Nach
dem Autoklavieren wurden die Medien auf ca. 50 °C abgekühlt und die Na2CO3-, K2HPO4-,
Spurenelement-, Eisen-Ammonium-Citrat- und Vitamin B12-Lösungen hinzugefügt. Der pH-
Wert der fertigen Medien wurde mit 1 M NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Anschließend
wurden die Medien in Aliquots von 20-30 ml in Petrischalen gegossen. Die Platten wurden
bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln und gegen Austrocknung geschützt gelagert.
Die weiteren Zusätze zu den Medien bzw. die Abweichungen in der Herstellung sind jeweils
unten aufgeführt. Pepton, Fleisch- oder Hefeextrakt dienten als Energie- und
Kohlenstoffquellen, um gutes Wachstum der verschiedenen Bakterienstämme zu
gewährleisten und erfüllten in dem eigentlichen Enzymtest keine Funktion.

Material und Methoden 11
2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994)
Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 2 g/l lösliche Stärke und 10 g/l Pepton
zugegeben. Das Medium wurde bei 115 °C für 10 min autoklaviert.
2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach Schreier,
1969)
Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 100 mg/l Toluidinblau (AppliChem)
und 10 g/l Fleischextrakt zugegeben. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden 0,5 g/l DNA
aus der DNA-Stammlösung (siehe Kap. 2.2.5.) hinzugegeben.
2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al.,
1994)
Dem ASNIII/2-Medium wurden 10 g/l Hefeextrakt zugegeben und anschließend bei 115°C
autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 20 g/l
Magermilchpulver aus der Magermilchpulver-Lösung (siehe Kap. 2.2.6.) hinzugegeben.
2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert nach Kouker
& Jaeger, 1987)
Dem ASNIII/2-Medium wurde vor dem Autoklavieren 10 g/l Fleischextrakt hinzugefügt. Nach
dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 25 g/l (2,5 % (w/v)) steriles Olivenöl
(Lidl) und 0,01 g/l Rhodamin B aus einer sterilen wässrigen Lösung mit 1 mg/ml Rhodamin B
zugegeben. Das Medium wurde auf einer Rührplatte gut gemischt und in Petrischalen
gegossen.
2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis
Es wurden 0,5 g DNA aus Fischsperma in 10 ml sterilem 10 mM Tris-HCl, pH 8 über Nacht
bei 4°C und mäßigem Rühren gelöst. Für die Sterilisation wurde vor dem Lösen der DNA ein
Tropfen Chloroform hinzugegeben.
2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis
Es wurden 20 g (handelsübliches) Magermilchpulver in 200 ml Aqua dest. gelöst und bei 110
°C für 10 min autoklaviert.

Material und Methoden 12
2.2.7. Lugolsche Lösung
Bei der Lugolschen Lösung handelt es sich um eine 1 %ige Iod-Kaliumjodid-Lösung. Dazu
wurden Iod und Kaliumjodid im Verhältnis 1:2 in Aqua dest. gelöst.
2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976)
Für die Herstellung des Bradford-Reagenz wurden 40 mg des Farbstoffes Serva Blau G-250
in 50 ml Ethanol (absolut) und 100 ml 85 % iger Orthophosphorsäure gelöst und anschließend
mit Aqua dest. auf 1 l aufgefüllt. Das Bradford-Reagenz wurde dreimal durch Papierfilter
(Schleicher & Schuell 595 1 /2 Faltenfilter) filtriert und in einer dunklen Flasche bei 4 °C
gelagert.
2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5)
Lösung A : Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat [0,2 mol/l]: 27,6 g/l
Lösung B: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l
Für die Herstellung von 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) wurden 8 ml Lösung A, 42 ml
Lösung B und 50 ml Aqua dest. miteinander vermischt.
2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5)
Lösung A: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l
Lösung B: Zitronensäure-Monohydrat [0,1 mol/l]: 21 g/l
Für den gewünschten pH-Wert von 7,5 wurden 88,7 ml Lösung A und 11,3 ml Lösung B
miteinander vermischt.
2.2.11. Stärkepuffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung
Für die Herstellung des Stärkepuffers wurde der Zitronensäurephosphat-Puffer (siehe Kap.
2.2.10.) mit 10 g/l löslicher Stärke versetzt und anschließend aufgekocht, um die Stärke zu
lösen.
2.2.12. 2 x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970)
Die Zusammensetzung des 2x SDS-Probenpuffers, sowie die Endkonzentrationen der
verschiedenen Substanzen im Puffer sind in Tab. 2.11. dargestellt.

Material und Methoden 13
Tab. 2.11.: Zusammensetzung des 2 x SDS-Probenpuffers
Substanz Zugabe [µl] Endkonzentration im Puffer
10 % (w/v) SDS 400 4 %
1 % (w/v) Bromphenolblau 200 0,2 %
87 % (w/v) Glycerin 230 20 %
1 M Tris-HCl (pH 6,8) 170 170 mM
2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung
2.2.13.1. Fixierer A
Zur Herstellung dieser Lösung wurden 50 ml Methanol mit 10 ml Eisessig vermischt und auf
100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.
2.2.13.2. Fixierer B
Für die Herstellung von Fixierer B wurden 5 ml Methanol mit 7 ml Eisessig vermischt und
auf 100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.
2.2.13.3. Fixierer C
Fixierer C ist eine 10 %ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung.
2.2.13.4. Entwickler
Entwickler ist eine wässrige Lösung, die zu 3 % aus Na2CO3 und zu 0,0185 % aus
Formaldehyd besteht.
2.3. Methoden
2.3.1. Hälterung der Organismen
Die Reinkulturen der verschiedenen Stämme wurden in Petrischalen auf festem ASN-Medium
(siehe Kap. 2.2.2.) von Dipl.-Biologin Annina Hube für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.
Zur Erhaltung von Stammkulturen wurde zunächst von den einzelnen Reinkulturen etwas
Zellmaterial mit einer Impföse von den Platten entnommen und in jeweils 30 ml flüssiges
ASNIII/2-Medium mit 10 g/l Fleischextrakt in 50 ml Erlenmeyerkolben überführt. Nach zwei
Tagen Inkubation auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300
Incubator Shaker) bei 120 rpm und 21 °C wurden die Stämme durch Begutachten des
mikroskopischen Bildes (Zeiss Jürgens Mikroskop) auf Reinheit überprüft. Anschließend

Material und Methoden 14
wurde von den Reinkulturen jeweils 200 µl in Eppendorfcups überführt und mit sterilem
87 %igen (w/v) Glycerin auf 1 ml aufgefüllt. Die auf diese Weise präparierten Stammkulturen
wurden bei -80 °C gelagert.
Zur Reaktivierung wurde aus den Eppendorfcups das aufgetaute Zellmaterial mit einer
Impföse entnommen und auf feste Nährböden (ASNIII/2 mit 10 g/l Fleischextrakt)
ausgestrichen. Die Platten wurden mit Parafilm gegen Austrocknen geschützt und bis zum
Anwachsen der Kulturen bei 21 °C inkubiert. Danach wurden diese Platten bei 4 °C gelagert
und dienten als Stammplatten zum Animpfen von flüssigen und festen Medien.
2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen
Im ersten Teil dieser Arbeit sollten zunächst die in Tab. 2.1 aufgeführten Stämme hinsichtlich
der Produktion von extrazellulären Enzymen untersucht werden.
2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994)
Bei diesem Test wurden die Stärke-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.1.) mit den zu
untersuchenden Stämmen von den Stammplatten (siehe Kap. 2.3.1.) punktförmig beimpft und
2-9 Tage bei 21 °C inkubiert. Danach wurden die Bakterien vorsichtig von den Agarplatten
entfernt und die Platten für 2 min mit Lugolscher Lösung (siehe Kap. 2.2.7.) überschichtet.
Das in dieser Lösung enthaltene Iod-Kaliumjodid färbt hochmolekulare Stärke dunkelblau an.
Amylase-positive Stämme spalten die Stärkepolymere in ihrer Umgebung. Dies führte dazu,
dass nach dem Abgießen der Lugolschen Lösung an den Stellen, wo sich diese Stämme
befanden, farblose Zonen auftraten.
2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach Schreier, 1969)
DNase-Toluidinblau-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.2.) wurden punktförmig beimpft und bei
21 °C inkubiert. DNase-positive Kolonien konnten durch die Bildung eines rosafarbenen Hofs
auf dem ansonsten blau gefärbten Agar identifiziert werden. Die Platten wurden alle 2-4 Tage
nach Farbveränderungen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.
2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al.,
1994)
Magermilchpulverhaltige Agaplatten (siehe Kap. 2.2.4.3.) wurden punktförmig mit den zu
untersuchenden Stämmen beimpft und bei 21 °C inkubiert. Peptidase produzierende Kolonien
ließen sich durch die Entstehung eines klaren Hofes in dem trüben Agar identifizieren. Die

Material und Methoden 15
Entstehung der klaren Höfe ist auf die Hydrolyse des im Magermilchpulver enthaltenen
Caseins zurückzuführen. Die Platten wurden alle 2-4 Tage auf das Vorhandensein von klaren
Höfen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.
2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin-B-Agar (modifiziert nach Kouker &
Jaeger, 1987)
Bei diesem Test wurden die olivenölhaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.4.) punkförmig
beimpft. Lipase-Aktivität konnte mittels Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 360 nm
anhand der Fluoreszenz des feiwerdenden und sich im Wasser lösenden Rhodamin B
nachgewiesen werden. Die Platten wurden bis zu vier Wochen lang inkubiert und alle 5-7
Tage mittels UV-Bestrahlung auf das Vorhandensein der Lipase-Aktivität untersucht.
2.3.3. Methoden zur Anreicherung und Bestimmung von Proteinen
2.3.3.1 Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium
Für die Produktion der extrazellulären Amylasen wurden sechs 100 ml Erlenmeyerkolben mit
jeweils 50 ml M1-Medium mit 10 g/l Maltose und sechs weitere 100 ml Erlenmeyerkolben
mit jeweils 50 ml M1-Medium mit 5 g/l löslicher Stärke befüllt. Diese Medien wurden mit
Stamm Bo 10-09 (siehe Tab. 2.1.) von einer Stammplatte (siehe Kap. 2.3.1) beimpft und bei
21°C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker)
bei 120 rpm 3 Wochen lang inkubiert. Die Aufteilung der 300 ml der jeweiligen Medien in 50
ml Fraktionen wurde vorgenommen, weil aus Vorversuchen bekannt war, dass Stamm
Bo 10-09 in dem M1-Medium mit Stärke in großem Mediumvolumen nicht anwächst.
2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis-Kultur
Ein 50 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 20 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.3.) gefüllt.
Anschließend wurden dem Medium 2 g/l unsterile lösliche Stärke hinzugegeben und das
Medium beimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (New
Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker) bei 100 rpm herangezogen.
2.2.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände
Die Flüssigkulturen (siehe Kap. 2.3.3.1) wurden in Zentrifugenbecher überführt und für 30
min bei 4 °C und 10.000 x g in einer Zentrifuge (Beckman Avanti TM J-25) zentrifugiert. Die
Überstände wurden in neue Zentrifugenbecher überführt und erneut unter gleichen

Material und Methoden 16
Bedingungen für 30 min zentrifugiert. Zur Entfernung der restlichen Mikroorganismen aus
den Überständen wurden diese mit Hilfe einer Pumpe (Jürgens) über einen Cellulose-Acetat-
Filter (Sartorius) mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Die sterilen Überstände wurden
bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Zur Herstellung eines zellfreien Überstandes der Bacillus subtilis-Übernachtkultur wurden
von dieser jeweils 1 ml in zwei 1,5 ml Eppendorfcups überführt und in einer Zentrifuge
(Heraeus Instruments) bei 12.000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden die Aliquots
vereinigt und sterilfiltriert (Minisart®-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius).
2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung
Das Aussalzen der Proteine durch die Zugabe von Ammoniumsulfat ist die älteste und die am
häufigsten angewendete Methode zur Proteinfällung. Ammoniumsulfat vergrößert
hydrophobe Effekte in der Lösung und fördert Proteinaggregationen über hydrophobe
Wechselwirkungen (Lottspeich & Zobras, 1998). Zur Fällung der Proteine wurde den
Kulturüberständen (siehe Kap. 2.2.3.3.) unter Rühren in einem Eisbad Ammoniumsulfat bis
zu einer Sättigung von 80 % zugegeben. Als Kontrollen wurden 250 ml unbeimpftes M1-
Medium mit 0,5 % Stärke und 250 ml unbeimpftes M1-Medium mit 1 % Maltose eingesetzt
und der gleichen Behandlung unterzogen. Mit diesen Kontrollen wurden zuvor auch die in
den Kap. 2.3.3.1 und 2.3.3.2 beschriebenen Arbeitsschritte durchgeführt.
Nach der vollständigen Zugabe des Ammoniumsulfates zu den Ansätzen wurden diese für
weitere 30 min in einem Eisbad gerührt und anschließend bei 10.000 x g für 40 min und bei
4 °C zentrifugiert (Beckman Avanti TM J-25). Die Überstände wurden entfernt und die Pellets
in jeweils 3 ml 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert. Zur Entsalzung wurden
die Proben in Dialyseschläuche mit einer Porengröße von 12-14 kDa überführt und über
Nacht unter Rühren bei 4 °C gegen 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert.
2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976)
Bei der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) wird der Farbstoff Serva Blau G-250
(Coomassie Brillantblau G-250) eingesetzt. Dieser Farbstoff bindet recht unspezifisch an
kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Komplexbildung
zwischen Farbstoff und Protein bewirkt die Stabilisierung des Farbstoffes in seiner
unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form, wodurch sich das Absorptionsmaximum von
Coomassie Brillantblau G-250 von 465 zu 595 nm verschiebt (Lottspeich & Zobras, 1998).
Somit kann der Farbstoff-Proteinkomplex photometrisch bei 595 nm bestimmt werden.

Material und Methoden 17
Für die Proteinbestimmung wurden 50 µl Probe, 50 µl 2 M NaOH und 1 ml Bradford-
Reagenz (siehe Kap. 2.2.8.) in ein Eppendorfcup gegeben und sofort auf einem Whirl-Mixer
gemischt. Nach 90 s wurde die Absorption bei 595 nm in einem Photometer (Novaspec II
Farmacia) in Kunststoff-Einmalküvetten gegen den Leerwert (entsprechendes Medium oder
0,1 M Natrium-Phosphatpuffer) gemessen. Eine Eichkurve wurde mit Rinderserumalbumin
(Stammlösung 0,1 mg/ml in 1 M NaOH) im Bereich von 0 bis 10 µg erstellt.
2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen
2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach Laemmli,
1970)
Zur Analyse der extrazellulären Amylase wurden die mit Ammoniumsulfat-gefällten Proteine
mittels der SDS-PAGE aufgetrennt. Bei dieser Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese
wird das anionische Detergenz SDS (sodium dodecyl sulfate) benutzt. SDS überdeckt die
Eigenladungen der Proteine, so dass Micellen mit konstanter negativer Ladung pro
Masseneinheit entstehen. Dadurch werden bei dieser Methode die Proteine im Wesentlichen
nach ihrer Größe aufgetrennt (Lottspeich & Zobras, 1998).
Die Ammoniumsulfat-gefällten Proben (siehe Kap. 2.3.3.4.) wurden im Verhältnis 1:2 mit
dem Probenpuffer (siehe Kap. 2.2.12.) versetzt. Auf die Zugabe von Disulfidbrücken-
reduzierenden Substanzen und auf die Hitzedenaturierung der Proben wurde verzichtet, da
dies zum Verlust der Enzymaktivität führen würde.
Die Auftrennung erfolgte in einer vertikalen XCell SureLock TM Novex Mini-Cell
Elektrophoresekammer (Invitrogen). Als Laufpuffer diente der 1:20 verdünnte NuPAGE
MOPS-SDS-Laufpuffer (Invitrogen). Als Proteinmarker wurde ein vorgefärbter PageRuler
Marker (Fermentas) mit Molekulargewichten von 10 bis 170 kDa eingesetzt. Die Geltaschen
des fertigen NuPAGE 12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen) wurden mit 12 µl Probe bzw. 5µl
Proteinmarker beladen. Die Auftrennung wurde bei 4 °C mit 150 V, 70 mA und 10 W für ca.
90 min durchgeführt.
2.3.4.2. Amylase-Aktivitätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert nach Kim
et al., 1995; Lacks & Springhorn, 1980)
Mit der Amylase-Aktivitätsfärbung kann die Amylaseaktivität der Proteinbanden im Gel nach
der SDS-PAGE nachgewiesen werden.

Material und Methoden 18
Nach der Auftrennung der Proteine durch die Elektrophorese wurde das Gel mit Aqua dest.
gespült und anschließend 3 x 15 min bei 21 °C und 70 rpm auf einem Rotationsschüttler (New
Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) mit Zitronensäure-Phosphatpuffer (siehe
Kap. 2.2.10.) gewaschen. Danach wurde dieser durch den Stärkepuffer (siehe Kap. 2.2.11.)
ersetzt und das Gel bei gleichen Bedingungen für 1 h inkubiert. Anschließend wurde der
Puffer abgegossen und das Gel gut mit Aqua dest. gespült, bis die anhaftende Stärke von der
Oberfläche des Gels entfernt war. Die Färbung erfolgte in Lugolscher Lösung (siehe Kap.
2.2.7.) für 2 min.
Die Amylaseaktivitäts-Zonen sollten als helle Bereiche im dunkelblau angefärbten Gel
erscheinen.
2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine
Die durch die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine sollten nach der Amylase-Aktivitätsfärbung
mit 0,1 %igem Silbernitrat nach Wiechmann (1993) angefärbt und detektiert werden. Alle
Einzelschritte der Färbung erfolgten unter Schwenken des Gels auf einem Rotationsschüttler
(New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 80 rpm und RT.
Zur Fixierung der Proteine wurde das Gel nacheinander für 30 min in Fixierer A (siehe Kap.
2.2.13.1.), für 20 min in Fixierer B (siehe Kap. 2.2.13.2.) sowie für 20 min in Fixierer C
(siehe Kap. 2.2.13.3.) inkubiert. Zum Waschen wurde das Gel mit 100 ml Aqua dest. mittels
eines Folienschweißgerätes (Petra Electrinic vacufix electron FS500A) in eine Folie
eingeschweißt und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde eine Ecke der Folie
aufgeschnitten, und es wurden 0,5 mg Dithiothreitol (DTT) in 1 ml Aqua dest.
(Endkonzentration 5µg DTT/ml) zugegeben. Die Folie wurde verschweißt und das Gel für 20
min mit DTT zur Reduktion der Proteine inkubiert. Erneut wurde eine Ecke der Folie
aufgeschnitten und die DTT-Lösung durch 100 ml 0,1 %ige Silbernitat-Lösung ausgetauscht.
Zur Anbindung der Silber-Ionen an die Proteine wurde das Gel für 20 min in der Silbernitrat-
Lösung inkubiert. Danach wurde das Gel aus der Folie entnommen, mit Aqua dest. gespült
und zweimal mit Entwickler (siehe Kap. 2.2.13.4.) überschichtet. Sobald eine gute Anfärbung
der Proteinbanden zu erkennen war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,3 M
Zitronensäure-Lösung gestoppt. Anschließend wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen und
in einer 0,03 %igen Na2CO3-Lösung für 10 min konserviert.

Material und Methoden 19
2.4. Chemikalien
Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle Chemikalien in p.a.-Qualität von den Firmen
Merck, Sigma-Adrich, Serva, Fluka, Riedel de Häen sowie Acros Organics bezogen.

Ergebnisse 20
3. Ergebnisse
3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien
Es wurden 12 Stämme mariner heterotropher Bakterien hinsichtlich der Produktion
extrazellulärer Amylasen, DNasen, Peptidasen und Lipasen untersucht (siehe Kap. 2.3.2.). In
Tab. 3.1. sind die Ergebnisse der Plattentests dargestellt.
Tab. 3.1.: Produktion von Amylase, DNase, Peptidase und Lipase durch verschiedene marine
heterotrophe Stämme
Stamm Amylase DNase Peptidase Lipase
Bo 10-09 + + - -
Bo 10-10 + - - -
Bo 10-13 + - - -
Bo 10-15 - - - -
Bo 10-19 - - - -
Bo 10-20 + - - -
Bo 53-20 - - - +
Bo 53-33 + - - -
Bo 53-34 + - - -
Bo 53-37 - + + +
Bo 53-39 - - - -
Bo 53-45 + + - -
+ = positives Testergebnis
- = negatives Testergebnis
Wie aus Tab. 3.1. ersichtlich, ist Amylase von den vier getesteten Enzymen das am häufigsten
vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Bakterienstämmen. Dabei konnte
bei sieben von insgesamt 12 Stämmen die Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Amylase
festgestellt werden. Bei diesen Stämmen handelt es sich um Vertreter der α-Proteobakterien
und der Bacteroidetes-Gruppe (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Als DNase-positiv erwiesen sich drei
Stämme, die alle der Bacteroidetes-Gruppe angehören (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Peptidase
könnte nur bei Stamm Bo 53-37 nachgewiesen werden. Bei zwei Stämmen konnte die
Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Lipase festgestellt werden. Dabei ist einer dieser
Stämme ein Vertreter der γ-Proteobakterien und der andere Stamm gehört der Bacteroidetes-
Gruppe an.
In Abb. 3.1. sind Beispielplatten für den Nachweis extrazellulärer DNasen, Amylasen und
Proteasen dargestellt.

Ergebnisse 21
Abb. 3.1.: Beispielplatten für den Nachweis der Produktion von extrazellulären Enzymen. A: DNase-
Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar; positive Kolonien konnten anhand der Bildung eines
rosafarbenen Hofes um die Kolonien identifiziert werden. B: Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar;
positive Kolonien waren nach dem Überschichten mit Lugolscher Lösung anhand farbloser Zonen zu
erkennen. C: Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar; positive Kolonien konnten anhand klarer
Hydrolyse-Höfe identifiziert werden. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (hp photosmart 715)
und bei A und B zusätzlich mit Hilfe einer Durchlicht-Einrichtung (Schütt Labortechnik Kolonien-
Zähler). Stämme mit Enzymaktivitäten wurden mit einem Pfeil markiert. Stämme mit der höchsten
Amylaseaktivität sind bei B mit einem grünen Pfeil markiert.
Mit den Plattentests konnte gezeigt werden, dass Amylase von den getesteten Enzymen das
am häufigst vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Stämmen ist. Daher
wurden die Stämme mit Amylaseaktivität für weitere Arbeit ausgewählt und näher untersucht.
3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar
Es sollte untersucht werden, welcher von den sieben ausgewählten Amylase-produzierenden
Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufweist. Dieser Test wurde, wie im Kap. 2.3.2.1.
beschrieben, durchgeführt. Die Amylaseaktivität wurde anhand der Größe der Klarzone auf
Stärke-Agar im Vergleich mit dem Kolonie-Durchmesser nach 2, 3, 5 und 9 Tagen Inkubation
bestimmt.
A
B C
Tab. 3.2.: Amylaseaktivität bei Amylase-positiven Stämmen auf festen Medien nach 2, 3, 5 und 9
Tagen Inkubation
Zeit [d] 2 3 5 9
Stamm
Bo 10-09 +++ +++ +++ +++
Bo 10-10 + ++ ++ +++
Bo 10-13 + + ++ +++
Bo 10-20 - + + +
Bo 53-33 ++ ++ ++ +++
Bo 53-34 + ++ ++ +++
Bo 53-45 +++ +++ +++ +++
- = keine Amylaseaktivität: keine Klarzone; + = geringe Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie <
Kolonie-Durchmesser; ++ = mittlere Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie entspricht dem
Kolonie-Durchmesser; +++ = starke Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie > Kolonie-
Durchmesser

Ergebnisse 22
Die Ergebnisse in Tab. 3.2. zeigen, dass die Stämme Bo 10-09 und Bo 53-45 nach 2, 3 und 5
Tagen Inkubation die höchste Amylaseaktivität aufweisen (siehe Abb. 3.1. B). Vermutlich
handelt es sich bei den beiden Isolaten um ein Duplikat und somit um die gleiche Art (Annina
Hube, persönliche Mitteilung). Daher wurde der Stamm Bo 10-09 für die weiteren
Untersuchungen ausgewählt.
3.2. Untersuchungen zur Expression der Amylase codierender Gene
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde bei Stamm Bo 10-09, welcher die höchste
Amylaseaktivität aufwies (siehe Kap. 3.1.1.), die Expression der Amylase codierenden Gene
untersucht. Dabei sollte festgestellt werden, ob es sich bei der Amylase um ein konstitutives
oder induzierbares Enzym handelt. Dazu wurden Medien, welche Stärke oder Maltose als
einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthalten, mit diesem Stamm beimpft. Nach
ausreichender Inkubation sollten zellfreie Überstände von den Kulturen gewonnen und die
darin enthaltenen Proteine gefällt werden. Anschließend sollten die Proteine der
verschiedenen Ansätze mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf das Vorhandensein von
Amylaseaktivität getestet werden.
3.2.1. Anreicherung der Amylase
In Abb. 3.2. sind die Kulturen des Stammes Bo 10-09 sowie Negativkontrollen (unbeimpfte
Medien) nach dreiwöchiger Inkubation dargestellt.
S SNEG MNEG M
Abb.3.2.: Kulturen des Stammes Bo 10-09 nach dreiwöchiger Inkubation in M1-Medium mit 0,5 %
Stärke oder 1 % Maltose und die entsprechenden Negativkontrollen. Aufgenommen mittels einer
Digitalkamera (hp photosmart 715).
S = Kulturen, die in M1-Medium mit Stärke herangezogen wurden
SNEG = unbeimpftes M1- Medium mit Stärke
MNEG = unbeimpftes M1-Medium mit Maltose
M = Kulturen, die in M1-Medium mit Maltose herangezogen wurden
Die Kulturen, welche auf Stärke gewachsen sind, weisen eine rötliche Färbung auf. Die
Färbung der Kulturen, die auf Maltose gewachsen sind, ist gelblich. Das unbeimpfte Medium

Ergebnisse 23
mit Stärke ist aufgrund der ungelösten Stärkepolymere sehr trüb, wohingegen das Medium
mit Maltose klar ist.
Die Anreicherung der Amylase aus den Kulturüberstanden des Stammes Bo 10-09 (siehe
Kap. 2.3.3.3.) erfolgte mittels der Ammoniumsulfatfällung. Die Proteinkonzentrationen in den
zellfreien Kulturüberstanden waren unter der Detektionsgrenze der Methode nach Bradford
(siehe Kap. 2.3.3.5.).
3.2.2. Ammoniumsulfatfällung
Die Proteine in den Kulturüberständen, welche 1 % Maltose oder 0,5 % Stärke enthielten,
wurden bei einer 80 % igen Sättigung mit Ammoniusulfat gefällt. Die Fällung der Proteine in
dem Ansatz, welches Stärke beinhaltete, erwies sich als problematisch. Es hat sich
herausgestellt, dass Stärke bei Zugabe von Ammoniumsulfat ausfällt. Dadurch wurde nach
der Zentrifugation ein großes Stärke-Protein-Pellet erhalten.
Nach der Dialyse betrug die Proteinkonzentation in dem Ansatz mit Stärke 1,74 µg/ml und in
dem Ansatz mit Maltose 0,6 µg/ml.
3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel
Mit Hilfe der Amylase-Aktivitätsfärbung sollten die Proben auf Anwesenheit von Amylase
getestet werden. Auf diese Weise sollte überprüft werden, ob der Stamm Bo-10-09 die
Fähigkeit besitzt, sowohl bei Anwesenheit von Stärke als auch bei Anwesenheit von Maltose,
extrazelluläre Amylasen zu produzieren.
In Tab. 3.3. ist das Auftragsschema der Proben im Gel für die SDS-PAGE dargestellt.

Ergebnisse 24
Tab. 3.3.: Auftragsschema der Proben im Gel zum Nachweis von Amylase
Tasche Probe
1 PageRuler Proteinstandard
2 -
3 -
4 Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung
(siehe Kap. 2.3.3.3.)
5 -
6 -
7 unbeimpftes Medium mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap.
2.3.3.3.)
8 -
9 -
10 Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung
(siehe Kap. 2.3.3.3.)
11 -
12 unbeimpftes Medium mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap.
2.3.3.3.)
13 -
14 -
15 zellfreier Übertand der Bacillus subtilis-Übernachtkultur (siehe Kap. 2.3.3.3.)
- = Tasche wurde nicht beladen
In Abb. 3.3. ist das SDS-Gel nach der Überschichtung mit Lugolscher Lösung dargestellt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abb. 3.3.: SDS-Gel nach Amylase-Aktivitätsfärbung mit Lugolscher Lösung. Auftragsschema der
Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt. Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines
Scanners (Canon CanoScan 3200 F).

Ergebnisse 25
Wie man in Abb. 3.3. sieht, konnten in dem dunkel angefärbten SDS-Gel keine hellen
Hydrolyse-Zonen festgestellt werden. Somit konnte bei keiner der Proben Amylaseaktivität
nachgewiesen werden. Das gilt auch für den Überstand der Bacillus subtilis-Kultur (Spur 15),
der als Positivkontrolle dienen sollte.
3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine
Nach der Amylase-Aktivitätsfärbung wurden die Proteine im Gel mittels der
Silbernitratfärbung visualisiert. Das Gel ist in Abb. 3.4. dargestellt.
kDa
170
130
100
72
55
40
33
24
17
11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abb.3.4.: SDS-Gel nach Silbernitratfärbung der Proteine. Die Molekulargewichte der Markerproteine
befinden sich links in der Abbildung. Auftragsschema der Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt.
Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines Scanners (Canon CanoScan 3200 F).
Wie aus Abb. 3.4. ersichtlich, sind in den Spuren 4 und 10 zahlreiche Proteinbanden zu
erkennen. Das bedeutet, dass die Bakterien des Stamms Bo 10-09 in Anwesenheit von
Maltose (Spur 4) oder Stärke (Spur 10) Proteine ins Medium abgegeben haben. Aufgrund der
fehlenden Hydrolyse-Zonen bei der Amylase-Aktivitätsfärbung (siehe Kap. 3.2.3.) ist es
jedoch nicht möglich festzustellen, bei welchen Banden es sich um Amylasen handelt. Es ist
jedoch deutlich zu erkennen, dass in Spur 10 mehr Proteinbanden sind als in Spur 4. Im
Überstand der Bacillus subtilis-Kultur konnten keine Proteinbanden nachgewiesen werden
(Spur 15), was die nicht vorhandene Amylaseaktivität (siehe Kap. 3.2.3.) erklärt.

Diskussion 26
4. Diskussion
4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten 12 Stämme sind heterotrophe Begleitbakterien
mariner filamentöser Cyanobakterien. Diese heterotrophen Bakterien beziehen ihre Nährstoffe
wahrscheinlich aus der Biomasse der Cyanobakterien. Daher wurde angenommen, dass diese
Bakterien viele extrazelluläre Enzyme produzieren müssen, um Substrate wie Glykogen,
Membranlipide, Proteine, DNA u.a. spalten zu können.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die meisten der 12 getesteten marinen
heterotrophen Bakterienstämme zur Produktion von extrazellulären Enzymen fähig sind.
Dabei konnte nur bei einem Stamm extrazelluläre Peptidase nachgewiesen werden.
Lipaseaktivität konnte bei zwei Stämmen auf den Olivenöl-Rhodamin-B-Agarplatten
festgestellt werden. Beim Lipase-Nachweis erwies sich die Detektion mit UV-Licht als
problematisch, weil nur geringe Fluoreszenz am Kolonienrand zu sehen war. Zudem konnte
die Fluoreszenz nur in einem begrenzten Zeitraum der Inkubation detektiert werden.
Nach Benedik & Strych (1998) kommen extrazelluläre Nukleasen selten bei Bakterien vor. In
dieser Arbeit wurden bei drei von zwölf getesteten Stämmen extrazelluläre DNasen
nachgewiesen.
Es wurde festgestellt, dass extrazelluläre Amylasen weit verbreitet bei den cyanobakteriellen
Begleitbakterien sind. Cyanobakterien können Glykogen speichern. Vermutlich nutzen viele
Begleitbakterien Glykogen aus der partiell zersetzten cyanobakteriellen Biomasse als Energie-
und Kohlenstoffquelle, was die vermehrte Produktion von Amylasen erklären würde.
4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene
In dieser Arbeit ist es nicht gelungen, die Amylaseaktivität im Gel nach der SDS-PAGE
nachzuweisen. Somit konnte nicht festgestellt werden, ob es sich bei den extrazellulären
Amylasen des Stamms Bo 10-09 (Muricauda aquimarina) um konstitutive oder induzierbare
Enzyme handelt. Vermutlich wurde keine ausreichende Menge an Amylasen ins Medium
abgegeben, denn die Proteinkonzentrationen in den zellfreien Kulturüberständen waren unter
der Detektionsgrenze. Auch nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat waren die
Proteinkonzentrationen mit 1,74 µg/ml im Ansatz mit Stärke und 0,6 µg/ml im Ansatz mit
Maltose sehr niedrig. Dies könnte auf Verdünnungseffekte im Flüssigmedium zurück zu
führen sein, weil auf festen Medien dieser Stamm im Vergleich zu anderen in dieser Arbeit
untersuchten Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufwies. Good und Hartman (1970)

Diskussion 27
haben nämlich beobachtet, dass von festen Medien mit Halobacterium halobium größere
Mengen an Amylasen erhalten werden als aus Flüssigkulturen.
Bei der Anreicherung der Amylasen mit Ammoniumsulfat wurde zusätzlich unerwünscht
Stärke mitgefällt, wodurch mengenmäßig betrachtet ein sehr viel größerer Pellet im Vergleich
zum Ansatz mit Maltose erhalten wurde. Dementsprechend musste das Pellet in einem
größeren Volumen Puffer resuspendiert werden, was wiederum zur Verdünnung der Proteine
in der Probe führte.
Vorversuche haben bereits gezeigt, dass Stärke mit Ammoniumsulfat gefällt wird, daher
wurde bei der Herstellung der Medien die Konzentration von Stärke niedriger gewählt als die
von Maltose. Zudem sollte die relativ lange Inkubationsdauer (drei Wochen) der Kulturen
gewährleisten, dass möglichst viel Stärke hydrolisiert und von den Bakterien verwertet wird
und daher weniger bei der Fällung ausfällt. Jedoch konnte das Ausfallen der Stärke trotz
dieser Maßnahmen nicht verhindert werden. Wahrscheinlich müsste man die Konzentration
der Stärke im Medium noch viel niedriger wählen. Außerdem kann eine zu lange Inkubation
der Kultur zur Abnahme der Amylaseaktivität führen. Nach Kim und Mitarbeitern (1995) tritt
dies bei der Amylase von Bacilluc sp. Stamm GM8901 ein.
In einer Arbeit von Kim und Mitarbeitern (1995) wurde eine Amylase von Bacilluc sp.
Stamm GM8901 aufgereinigt. Dazu wurde dieser Stamm im Medium mit 1 % löslicher Stärke
kultiviert. Nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat (80 %) und einer
anschließenden Dialyse der Enzymlösung wurde diese bei 15.000 x g für 30 min zentrifugiert,
um unlösliche Substanzen zu entfernen. In der vorliegenden Arbeit wurde keine
Zentrifugation nach der Dialyse vorgenommen. Dieser zusätzliche Zentrifugationsschritt
könnte möglicherweise eine Trennung der Stärke von den Proteinen bewirken.
Weitere Optimierungen der Methoden konnten jedoch aus Zeitgründen nicht mehr
vorgenommen werden.
In der vorliegenden Arbeit sollten die heterotrophen Begleitbakterien der Cyanobakterien
hinsichtlich der Produktion extrazellulärer Enzyme gestestet werden. Außerdem sollte anhand
der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob der Stamm mit der
höchsten Amylaseaktivität für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist.
Nach Buchholz und Kasche (1997) sinken die Kosten der Enzymproduktion und
Aufarbeitung mit steigendem Enzymgehalt in den Enzymquellen. Dabei ist das Verhältnis
zwischen dem Preis eines Enzyms und seinen anwendungstechnischen Nutzen entscheidend

Diskussion 28
dafür, ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt (Schmid, 2006) (siehe auch Kap.
1.2.1.).
Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass Muricauda
aquimarina die extrazellulären Amylasen in sehr geringen Mengen produziert. Daher ist
dieser Stamm wahrscheinlich als Amylasequelle für den technischen Einsatz ungeeignet.
Nach Whitehead und Mitarbeiter (2001) kann die Produktion von extrazellulären Enzymen
bei bestimmten Gram-negativen Bakterien durch Quorum sensing reguliert werden. Bei
diesem Regulationsmechanismus werden von den einzelnen Bakterien bestimmte N-Acyl-
Homoserin-Laktone (AHLs) produziert und durch Diffusion in die Umgebung abgegeben. Bei
hoher Zelldichte steigt die Konzentration von AHLs in der Umgebung. Dadurch können die
AHLs in die Nachbarzellen diffundieren und die Expression bestimmter Gene induzieren
(Madigan et al., (2003).
In der vorliegenden Arbeit konnte nicht bestimmt werden, ob die Produktion der Amylasen
bei Muricauda aquimarina durch die Anwesenheit bestimmter Kohlenstoffquellen induziert
oder reprimiert wird. Es gibt jedoch Indizien dafür, dass die Produktion von Amylasen bei
diesem Stamm durch AHLs reguliert wird. Es wurde beobachtet, dass Muricauda aquimarina
in 500 ml Medium mit Stärke als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle nicht anwächst.
Jedoch wachsen diese Bakterien in demselben Volumen des gleichen Mediums, welches
Maltose als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthält. In kleinen Medienvolumen
wächst diese Bakterienart sowohl auf Stärke als auch auf Maltose. Dies kann dadurch erklärt
werden, dass in großen Volumina die AHLs stark verdünnt werden und daher keine Induktion
der Expression Amylase codierender Gene stattfindet. Ohne extrazelluläre Amylasen kann die
Stärke nicht in kleinere Moleküle gespalten werden, was zum „Verhungern“ der
Mikroorganismen führt.
Ein weiterer Grund für diese Beobachtung könnte auch nicht die Verdünnung der AHLs,
sondern die Verdünnung der extrazellulären Amylasen sein. Um festzustellen, ob die
Produktion der Amylasen von den AHLs abhängt, müsste dieser Stamm auf AHL-Produktion
getestet werden. Anschließend müsste überprüft werden, ob durch die Zugabe bestimmter
AHLs zum Medium dieser Stamm eine größere Menge an Amylasen produziert.

Literaturverzeichnis 29
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