Legler TJ - Abteilung Transfusionsmedizin

Theorie der molekulargenetischen 

RH-Bestimmung 

Tobias J. Legler 

Abteilung Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin Göttingen 

Zertifiziert nach DIN ISO 9001:2000 

Molekulargenetische RH-Bestimmung in der Schwangerschaft 

20. März 2007 in Kiel 

T. Legler 20.03.07

1. Molekulargenetik von RH, weak D, Partial D 

2. RHD-Zygotie 

3. Klinische Bedeutung der molekulargenetischen 

Blutgruppenbestimmung und Indikationsstellung 

4. Keine Besprechung von Bandenmustern 

5. Fetale RHD-Bestimmung aus mütterlichem Blut 


ABO 

Erythrozytäre Blutgruppensysteme 

ABO Kell 

Duffy 

= Oligosaccharide 

MN 

Ss 

T. Legler 20.03.07 

Rh Kidd 

= Peptidketten

Meilensteine in der Molekulargenetik 

1990 Avent ND et al.: cDNA cloning of Rh CcEe 

1992 Le Van Kim C, et al.: cDNA cloning of RhD 

1993 Lo YM, et al. Prenatal determination of fetal RhD status by 

analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers (cells). 

1994 Chérif-Zahar B et al.: Organization of the gene (RHCE) 

1995 Rouillac C, et al.: Transcript analysis of D category 

phenotypes predicts hybrid Rh D-CE-D proteins 

1996 Poulter M et al.: Reliable C/c typing method 

1997 Gassner C et al.: RHD/CE typing by polymerase chain 

reaction using sequence-specific primers 


1998 Faas BH et al. and Lo YM et al.: Detection of fetal RHDspecific 

sequences in maternal plasma. 

1999 Wagner FF et al.: Molecular basis of weak D phenotypes 

2000 Okuda H et al. Complete sequence RHD and RHCE 

2000 Singleton BK et al.: Pseudogene RHDψ 

2000 Wagner FF and Flegel WA: RHD gene deletion occurred 

in the Rhesus box. 

2001 Wagner FF et al.: RHD positive haplotypes in D negative 

Europeans 

2002 Shao CP et al.: Molecular basis of DEL and D-negative in 

Chinese 


Rh-Blutgruppensystem 

– RhD Protein, 

• wenn vorhanden, Individuum Rhpositiv 

(D+), ca. 83% unserer 

Bevölkerung 

• wenn nicht vorhanden, Individuum Rhnegativ 

(dd), ca. 17% unserer 

Bevölkerung 

– RhCcEe Protein, 

• exprimiert die Antigene C oder c sowie 

E oder e 


Evolution der RH Genfamilie 

Wagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box 

Blood 95:3662-8 (2000) 

SMP1 

vor 5-12 Mio Jahren 

RHD 

RHCE 

SMP1 


Chromosom 1p34-p36 

RHCE

Rh-System (CcD.ee bzw. CDe/cde) 

RHD 

D Ce CDe 

d 

RHCE 

ce 

RHCE 


Chromosom 1 

Chromosom 1 

cde


Schwache D-Phänotypen 

D-Varianten 

weak D (früher D u ) Partial-D 

D-Kategorie DFR 

DBT 

DHar ..... 


„Partial 

DEL“ 

DEL 

„weak 

DEL“

Häufigkeit schwacher D-Phänotypen 

Wagner et al. Infusionsther Transfusionsmed 1995;22:285 

Häufigkeit (%) 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

82,7 

0,44 0,016 


17,3 

D+ weak D D VI D- incl. DEL

Weak D (Typ 1-53): Intrazelluläre AS 

Avent und Reid: Blood 2000;95:375-387 

Legler TJ, Maas JH et al., Transfusion 1998;38:434-40 

Wagner FF, et al. Blood 1999;93:385-393, Wagner FF, et al. Blood 2000;95:2699-708 


Punktmutationen bei Partial-D 

Phänotypen: Extrazelluläre AS 

Avent and Reid: The Rh blood group system: a review. Blood 2000;95:375-387 

Körmöczi GF, Legler TJ, et al. Molecular and serological Characterization of DWI, 

a novel "high grade" partial D. Transfusion 2004;44:575-580. 


Genumlagerungen 

im RH System 

Avent and Reid: The Rh 

blood group system: a 

review. Blood 

2000;95:375-387 

Legler TJ, et al. D Va - 

category phenotype and 

genotype in Japanese 

families. Vox Sang 

2000;78:194-197. 


D-negativer Phänotyp 

D-negativ 

RHD-Deletion RHD positiv 

nicht exprimiert 

RHD-RHCE-RHD 

Hybridallele 

Stopp-Codon 

Frame-Shift 

Splice-Site 

Missense 


„Partial 

DEL“ 

DEL 

„weak 

DEL“

RHD Allele bei 

D-negativen Individuen 

Europäer 1 1:1.536 

Schwarze in Afrika 2 82% 

Chinesen 3 24-40% (+DEL) 

6,4% (-DEL) 

1 Wagner FF, et al.: BMC Genetics 2001;2:10 

2 Singleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8. 

3 Shao Vox Sang 2002;83:156-161. 


RHD ψ 

Singleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8. 


Ccde s 

Faas et al. Transfusion 1997; 37:38-44 

D-negativ, VS positiv (schwaches C, schwaches e) 

RHD-Gen codiert C, Hybrid Exon 3 (RHD-CE(4-7)-RHD) 

RHCE Gen codiert ce 

Rh-Formel serologisch: dd (C)c ee 

Molekulargenetisch: C-Reaktion von RHCE negativ 

c-Reaktion von RHCE positiv 

Cde s -Reaktion positiv 


RHD (IVS3+1G>A) 

DEL 

RHD 

(M295I) 

Wagner FF, Frohmajer A, Flegel WA: RHD positive haplotypes in D negative 

Europeans. BMC Genetics 2001;2:10 

Shao CP, Maas JH, Su YQ, Köhler M, Legler TJ. Molecular background of Rh Dpositive, 

D-negative, D el and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang 2002;83:156- 

161. 

Wagner T, Körmöczi GF, Buchta C, Vadon M, Lanzer G, Mayr WR, Legler TJ. Anti-D 

immunization by DEL red blood cells. Transfusion 2005;45:520-526. 

Körmöczi GF, Gassner C, Shao CP, Uchikawa M, Legler TJ. A comprehensive analysis 

of DEL types: Partial D el individuals are prone to anti-D alloimmunization. Transfusion 

2005;45:1561-1567 


RHD (K409K)

Häufige D negative RHD-Allele 

RHD ψ 

RHD-CE(3-7)-RHD 

RHD (K409K) 

RHD-CE(2-9)-D 


Rhesus box 

Wagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box 

Blood 95:3662-8 (2000) 

SMP1 

hybrid Rhesus-box 

RHD 

RHCE 

SMP1 

upstream Rhesus-box downstream Rhesus-box 


RHCE

Homologie und Nachweis der Hybrid 

Rhesus box 

upstream Rhesus box 

downstream Rhesus box 

hybrid Rhesus box 

rez7 

rez7 

rez7 

u1-s 

u1-s 

hyb2-U 

Pst 

hyb2-U 

identity region 1463 bp 

TTTT 

TTTT 


hyb2-L 

hyb2-L 

rnb31 

rnb31 

PCR-RFLP,Wagner und Flegel 

Blood 2000;95:3662-3668 

PCR-SSP, Chiu et al 

Clin. Chem. 2001;47:667-672 

PCR-SSP + IPC, Perco et al. 

Transfusion 2003;43:335-359

Anwendungen der molekulargenetischen 

Rh-Bestimmung in der Schwangerschaft 

� Abklärung serologisch schwacher Reaktionen 

bei Schwangeren (und Neugeborenen) 

�Bestimmung der D-Zygotie bei Partnern von 

Anti-D immunisierten Frauen 

�D-Status des Feten bei Anti-D immunisierten 

Schwangeren 


Serologisch schwache 

oder unklare 

Reaktionen 

Zygotiebestimmung 

Pränataldiagnostik 

bei MHN 

Molekulargenetik zur Entscheidung über 

Rh-Prophylaxe 

Schwangere D-negativ: kann Anti-D bilden 

Fetus/ 

Neugeborenes 


D-positiv: bildet kein Anti-D 

D-negativ: ist nicht immunogen 

D-positiv: ist immunogen 

Rhesus-Immunisierungsregister: http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/RIR/ 

Die Rhesus site http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/ 

W. Flegel and F.F. Wagner


oder unklare 

Reaktionen 



bei MHN 

Molekulargenetik zur Entscheidung über 

Rh-Prophylaxe 

Schwangere mit serologisch schwachem D sollten 

bei weak D Typ 1-3 keine Rh-Prophylaxe erhalten, bei 

anderen D-Varianten ist die Rh-Prophylaxe sinnvoll. 

Bei Neugeborenen sollten serologische Methoden 

verwendet werden, die auch sehr schwache D-Varianten 

erfassen. 

Ein molekulargenetisches RHD-Screening bei 

Neugeborenen müsste einfach und schnell sein, 

um rechtzeitig eine Aussage über die Rh-Prophylaxe 

zu ermöglichen 


p 

1000 

500 

300 

200 

100 

Sequenzierung von RHD 

Legler TJ et al.: RHD sequencing: a new tool for decision making on 

transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis 

Ds1 Ds2 Ds3 Ds4 Ds5 Ds6 Ds7 Ds8 Ds9 Ds10 

M D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- 

M 

bp 


Bestimmung der RHD Zygotie bei 

Partnern von Anti-D Immunisierten 


oder unklare 

Reaktionen 



bei MHN 

Bei Paaren mit Kinderwunsch und Anti-D 

Immunisierung kann heute genauer bestimmt werden, 

ob ein D-positiver Mann hemi- (Dd) oder homozygoter 

(DD) Träger von RHD ist. 

Beim hemizygoten Träger kann im Verlauf der 

Schwangerschaft der D-Status des Kindes 

bestimmt werden. Dieses ist zu 50% D-positiv 

und zu 50% D-negativ. 

Beim homozygoten Träger können Untersuchungen 

zur Bestimmung des kindlichen 

D-Status vermieden werden. 


Vorgehen bei Zygotiebestimmung 

1 D-negatives 

Allel 

1 D-positives 

Allel 

D-positiver 

Partner 

+ - 

Test für hybrid- 

Rhesus Box 

+ 

1 D-negatives 

Allel 

1 D-positives 

Allel 

Test für nicht 

exprimiertes 

RHD 

Perco P, et al. T. Transfusion Legler 20.03.07 2003;43:335-339 

RH-Type 

RHD ψ 

Cde s 

DEL 

- 

2 D-positive 

Allele


oder unklare 

Reaktionen 



bei MHN 

Molekulare Diagnostik bei 

Schwangeren mit Anti-D 

Beim hemizygoten Partner sollte ab der 11. SSW 

der fetale D-status aus mütterlichem Blut untersucht 

werden. 

Nur bei RHD negativem Ergebnis für fetales RhD 

aus mütterlichem Blut und sonographischen Zeichen 

einer Anämie sollte über Amniozentese der fetale 

RHD-Status untersucht werden. 

Bei RHD positivem Ergebnis für fetales RhD 

aus mütterlichem Blut besteht bei invasiven 

Eingriffen grundsätzlich eine hohe Gefahr der 

Boosterung des Immun-Anti-D. 


Zusammenfassung 

�Bei Schwangeren mit unklarem D-Status sollte weak D Typ 1-3 

berücksichtigt werden, um eine falsch positive D-Bestimmung und damit 

eine fehlerhafte Unterlassung der Rh-Prophylaxe zu vermeiden. 

�Die Beratung von Partnern mit Allo-Anti-D erfolgt nach Bestimmung 

der D-Zygotie des Mannes durch Bestimmung der Hybrid Rhesus Box. 

�Die fetale D-Bestimmung bei MHN sollte aus mütterlichem Blut 

erfolgen 

�D-Varianten mit Allo-anti-D Bildung sollten molekulargenetisch 

untersucht und ggfls. sequenziert werden. 

�Bei D-negativen Patientinnen mit Allo-Anti-D und Vortransfusionen 

sollte eine Look-back Untersuchung zeigen, ob unter den Blutspender 

evtl. DEL Spender die Immunisierung hervorgerufen haben. 


The Special Non-Invasive Advances in 

Fetal and Neonatal Evaluation Network 

Chair of steering committee Neil Avent (neil.avent@uwe.ac.uk) 

Scientific Director Sinuhe Hahn (shahn@uhbs.ch) 

Network of excellence sponsored under the EU’s Framework programme 6 

‘Life Sciences, Genomics and Biotechnology for Health’ 

www.safenoe.org 


6. EU-Rahmenprogramm 

50 Partner in 19 Nationen 


Die derzeitige Pränataldiagnostik ist of invasiv 

AMNIOZENTESE 

CVS 

CORDOZENTESE 

Bis 1% Risiko einer Fehlgeburt 

Kaum möglich vor der 11. SSW 


Chromosomenanomalie 

Monogene Erkrankungen 

Hämoglobinopathien

SAFE network: Ziel 

Einführung eines kosteneffizienten, nicht-invasiven Pränatalscreenings 

und Neugeborenenscreenings durch Schaffung von lang anhaltenden 

Partnerschaften innerhalb und außerhalb der Europäischen 

Gemeinschaft 

März 2004 – Februar 2009 

50 Partner aus 19 Staaten 

12 Millionen EUR 


Intakte fetale Zellen im mütterlichen Blut 

Vorteil: 

• Komplettes fetales Genom 

Probleme: 

• Sehr wenige! 12-20/ml mütterl. Blut 

(Mergenthaler et al., JHC 2005, 53 (3): 319-322) 

• Bis jetzt keine perfekten Marker 

• Persistenz über längere Zeit 

(Bianchi et al., Med. Science, 1996; 93 (2), 705-708) 


Quellen fetaler Marker im 

mütterlichen Blut 

Fetale Zellen im mütterlichen tterlichen Blut 

Erythroblasten 

Throphoblasten 

Leukozyten 

Schwierig zu isolieren, möglicherweise viele Jahre persistent 

Zellfreie fetale DNA im mütterlichen tterlichen Kreislauf 

Ab der 5. SSW nachweisbar 

Metabolisierung innerhalb von 30 Minuten nach Entbindung 

3 – 6% der gesamten zirkulierenden freien DNA im Plasma 


Ursprung fetaler DNA im Plasma 

• Apoptose fetaler Zellen? 

• Plazenta! Keine starre Barriere 

Trophoblasten 

(Guibert et al.,Hum.Repr., 

2003;18 (8), 1733-36) 


Abbau fetaler DNA nach Entbindung 

Rasche Clearance (Lo et al. Am J Hum Gen,1999; 64:218-24 ) : 

T1/2 = 16 minutes (range 4-30) 


SAFE - Ergebnisse 

Bestimmung des fetalen RHD status aus 

mütterlichem Blut 

– Wird in mehreren Staaten Europas bei alloimmunisierten 

Schwangeren angewendet. In Deutschland: Universität 

Göttingen, Abt. Transfusionsmedizin und DRK Oldenburg 

– SAFE unterstützt Studien zur routinemäßigen Bestimmung des 

fetalen RhD Status aus mütterlichem Blut vor der antenatalen 

Rh-Prophylaxe (indikationsbezogene Rh-Prophylaxe) 

– Bestimmung von C, c, E, e, Kell, Duffy, HPA aus fetaler DNA in 

mütterlichem Blut. 

– Etablierung von Kontrollmaterialien (Standards) und 

Standardisierung von Bestimmungsmethoden durch 

internationale Ringversuche 


Rate der Anti-D Alloimmunisierung 

Schwangerschaft ohne 

Rh-Prophylaxe 

Schwangerschaft mit 

postnataler Rh- 

Prophylaxe 

Schwangerschaft mit 

prä- und postnataler 

Rh-Prophylaxe 

13.2% pro D+ Schwangersch. 



Bowman J: Transfusion 2003;43:1661-1666 


Neuere Daten 

• Die antinatale Rh-Prophylaxe halbiert das Risiko einer Rh-Immunisierung und 

eines schweren M. haemolyticus neonatorum (Koelewijn et al. DGTI 2006, 3 

Jahre Studie, 600.000 Schwangerschaften in den Niederlanden:Neue Anti-D 

Immunisierungen im 1. Trimester von Schwangeren mit mind. einem D+ Kind) 

Nur 

postnatal 


Ante + 

postnatal 

Allo-Anti-D 58 (0,69%) 39 (0,31%) 

Keine 

Immunisierung 

8687 12537

• Blutprodukt 

Anti-D Immunglobulin 

• Freiwillige, hyperimmunisierte 

Plasmaspender 

• Weltweiter Mangel 

•Kosten 


Studien in Göttingen 

Legler TJ, Lynen, R, Maas JH, Pindur G, Kulenkampff D, Suren A, 

Osmers R, Köhler M. Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe 

phenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain 

reaction. Transfusion Science 2002;27:217-223. 

1. Studie: Vergleich der Genotypisierungsergebnisse 

aus Amnionpunktat und peripherem Blut 7.-21. SSW. 

2. Studie: Vergleich der RHD Genotypisierungsergebnisse 

aus Blut von Rh-negativen Schwangeren in der 22.-34. 

SSW mit anamnestischen Angaben (Mutterpaß etc.) der 

Probandinnen nach Geburt (163 Einsender). 


Kosten-Nutzen Analyse: Niederlande 

• Szenarien: 

(34.000 D-negative Frauen, pränatale Rh-Prophylaxe 1000 IU 

(= 48 EUR) in der 30. SSW 

– Alle D-negativen Frauen erhalten eine generelle pränatale Rh-Prophylaxe 

und eine postnatale Rh-Prophylaxe nach D-Bestimmung aus 

Nabelschnurblut 

• 6.6 Mio Euro 

– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhalten 

entsprechend dem Ergebnis eine Rh-Prophylaxe. Die postnatale Rh- 

Prophlaxe erfolgt nach D-Bestimmung aus dem Nabelschnurblut. 


– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhalten 

entsprechend dem Ergebnis eine prä- und postnatale Rh-Prophylaxe 


C. Ellen van der Schoot, 7. März 2007, SAFE Workshop in Göttingen 


Fazit: Die pränatale Anti-D Prophylaxe 

ist oft nicht indiziert! 

15-18 % aller Schwangerschaften betrifft D-negative Frauen 

In 40% der Schwangerschaften bei D-negativen Frauen ist 

eine Anti-D Prophylaxe nicht indiziert, da der Fet Dnegativ 

ist. 

Im Falle eines D-positiven Feten würde nach Geburt eine 

sofortige Rh-Prophylaxe möglich werden, die 

Blutgruppenbestimmung aus Nabelschnurblut müßte nicht 

abgewartet werden. 

Somit wäre die Rh-Prophylaxe effizienter und möglicherweise 

könnten hierdurch weitere Kosten durch eine verlängerte 

Liegedauer der Patientinnen vermieden werden. 



Bestimmung des fetalen Geschlechts aus 

mütterlichem Blut 

• Indikation bei geschlechtschromosomal vererbten 

Erkrankungen und bei Frauen mit angeborener 

adrenaler Hyperplasie. Durch die Y-Chromosom- 

Testung konnten die invasiven Eingriffe um 50% 

reduziert werden. 

• Standardisierung innerhalb Europas 

• Labore in Tschechien, England, Frankreich, Israel, 

Italien, Niederlanden, Schottland, Spanien. 



Monogene Erkrankungen 

• Etablierung einer Biobank für Familien mit Chromosomenanomalien 

und monogenen Erbkrankheiten für den Fall, dass neue 

Technologien sich im Labor durchsetzen. 

• Umfangreiche Untersuchungen bei Thalassaemie 

– Eine wachsende Zahl von Primer/Sonden für die häufigsten 

Mutationen bei ß-Thalassämie wurden etabliert. 

• Eine Diagnostik der Achrondroplasie aus mütterlichem Blut wurde 

entwickelt. 


In-house verfügbar 

SAFE – Ausblick 

• Screening für fetales RhD zur Einführung der indikationsbezogenen Rh- 

Prophylaxe 

• Bestimmung des fetalen Geschlechts 

• Pränataldiagnostik für Paternale genetische Marker 

Neue Forschungsansätze für andere Erkrankungen 

• Besseres Screening für Down Syndrom oder andere Aneuploidien durch 

Proteomics oder Epigenetics 

• Bessere Diagnositik zur Vorhersage von Schwangerschaftskomplikationen 

(Präeklamsie, IUGR, Frühgeburtlichkeit) 

• Diagnostik für X-chromosomal vererbte und rezessive Erkrankungen 


Molekulargenetik 

Jens-Holger Maas 

Nadja Bustami 

Volker Wiemann 

Chao-Peng Shao 

Serjey Lukin 

Elisabeth Binder 

Paul Perco 

Günther Körmöczi 

Thomas Wagner 

Hitoshi Ohto etc. etc. 

Consensus Empfehlungen 

Franz F. Wagner 

Willy A. Flegel 

Christoph Gassner 

Hartmut Kroll 

Danksagungen 

Mütterliches Blut 

Sina Müller 

Sibylle Damme 

Michael Köhler 

Wolfgang Engel 

Iris Bartels 

Günther Emons 

Endokrinologikum 

Kai Gutensohn 

163 Gynäkologen 

Kit-Entwicklung 

Martina Prager 

Nicolas Sachsenberg 


SAFE Partner 

C Ellen van der Schoot 

Geoff Daniels 

Kirstin Finning

Legler TJ - Abteilung Transfusionsmedizin

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?