Peptidsubstrat pNA - Kerckhoff-Klinik

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Ziel der vorgestellten Untersuchung war es zu überprüfen, ob es als Folge einer DDAVP-Applikation zu einer Aktivierung von Monozyten mit Induktion der TF-Expression kommt. Material und Methoden Zur Untersuchung einer möglichen DDAVP-induzierten Monozytenaktivierung wurde das Format einer klinischen Beobachtungsstudie gewählt. Zehn gesunde Probanden erhielten über einen intravenösen Zugang eine DDAVP-Kurzinfusion in einer Dosierung von 0,3 �g/kg KG. Über einen Gesamtbeobachtungszeitraum von 6 h erfolgten Blutabnahmen unmittelbar vor und nach der DDAVP-Applikation und anschließend in stündlichem Abstand. Bestimmt wurde ein Differenzialblutbild einschließlich einer durchflusszytometrischen Analyse des relativen Monozytenanteils, Basisgerinnungsparameter und die monozytäre TF-Expression. Dazu war in einer Vorphase eine quantitative TF-PCR auf der Basis der real-time TaqMan-Technologie (siehe auch Kapitel 3.2) sowie ein FXa-Generierungsassay zum funktionellen Nachweis von oberflächlich-exprimiertem TF aufgebaut worden. Der funktionelle Nachweis beruht auf dem Prinzip, dass TF die enzmyatische Aktivität von FVIIa um mehrere Zehnerpotenzen steigern kann (siehe Abbildung 3.2.) TF TF TF TF FVIIa FXa Abbildung 3.2.: Schematische Darstellung des Aktivitätstests zur Bestimmung der monozytären TF-Aktivität. Tissue factor (TF) ist der geschwindigkeitsbestimmende Kofaktor in der FVIIa-abhängigen Bildung von Faktor Xa (FXa). Eine Bestimmung der Konzentration von funktionell aktivem TF auf der Oberfläche von Monozyten kann daher über die FXa-Generierungsrate erfolgen. Nachgewiesen wird die Umsetzung des Substrates als Farbumschlag. Werden die Komponenten FVIIa und FX sowie Phospholipide im Überschuss FX <strong>Peptidsubstrat</strong> <strong>pNA</strong> 4
angeboten, spiegeln Unterschiede in der Menge an gebildetem FXa ausschließlich Änderungen in der Konzentration von TF wider. Mit diesem Testverfahren konnte ein unteres Sensitivitätslimit von 5 ng/ml TF bei einer Intraassayvariabilität von maximal 11,3 % erreicht werden. Diese Werte liegen für ein zellgebundenes Testverfahren im allgemein akzeptierten Bereich. Ergebnis und Ausblick Bis auf eine Flush-Symptomatik bei 8 von 10 Probanden wurden in Zusammenhang mit der DDAVP-Gabe keine Nebenwirkungen beobachtet. Die Wirksamkeit des DDAVP wurde durch einen Anstieg der vWF-Plasmakonzentration und der FVIII-Konzentration belegt. Bei allen 10 Probanden kam es nach der DDAVP-Gabe zu einem signifikanten Abfall der Monozytenwerte. Bei einer mittleren Monozytenzahl von 0,6 x 10 3 /µl wurden die niedrigsten Werte 1h nach DDAVP-Gabe im Mittel mit 0,2 x 10 3 /µl gemessen. Mit gleicher Zeitkinetik konnte ein Anstieg der TF mRNA nachgewiesen werden. Bezogen auf den Ausgangswert von im Mittel 7,1 TF Kopien/1000 Monozyten kam es nach einer Stunde zu einem 5,2fachen Anstieg (Mittelwert nach 1 h: 36,6 TF mRNA Kopien/1000 Monozyten). Dieser Anstieg war mit einem p-Wert < 0,001 hochsignifikant. Die Bestimmung der zellgebundenen TF-Aktivität zeigte bei 4 von 10 untersuchten Probanden einen Anstieg über 150%. Bezogen auf die Gesamtzahl der Probanden war dieser Anstieg statistisch jedoch nicht signifikant. Die Ergebnisse zeigen erstmals, dass neben Endothelzellen auch Monozyten eine DDAVP- Zielzelle sind und dass die DDAVP-induzierte TF-Induktion einen zusätzlichen Wirkmechanismus einer Behandlung mit DDAVP darstellt. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass im Blut zirkulierende Monozyten keine V2R exprimieren. Wir gehen deswegen davon aus, dass die DDAVP-induzierte TF- Expression einen indirekten DDAVP-Wirkmechanismus darstellt. Als Folge der vWF- Freisetzung wird P-Selektin, das Membranbestandteil der vWF-Speicherorganellen ist, in die Endothelzellmembran integriert. P-Selektin ist ein wichtiger Adhäsionsrezeptor für Monozyten. Daher kommt es als Folge der DDAVP-induzierten P-Selektinfreisetzung, für die es experimentelle Belege gibt, zu einer Adhäsion von Monozyten, die wiederum durch gleichzeitig freigesetzte inflammatorische Zytokine zur TF-Synthese stimuliert werden. Die nach DDAVP-Gabe beobachtete Abnahme der Monozytenzahlen ist durch Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen zu erklären und damit ein zusätzliches Argument für die vorgestellte Hypothese. Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, dass eine P-Selektin-abhängige 5
Seite 1 und 2: Induktion der monozytären Tissue F
Seite 3: Abstract Zielvorgaben Desmopressin

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