Peptidsubstrat pNA - Kerckhoff-Klinik

Induktion der monozytären Tissue Factor Expression durch Desmopressin
Gebiet/Fachrichtung:
Hämostaseologie/zelluläre Mechanismen
Fertigstellung:
31.12.2003
Autoren:
Dr. Katharina Madlener,
Hämostaseologie und Transfusions-
medizin,
Kerckhoff-Klinik
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Koautoren:
Prof. Dr. Bernd Pötzsch, Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin, Rheinische
Friedrich-Wilhelms-Universität, Bonn
Dr. Jutta Maria Rox, Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin, Rheinische
Friedrich-Wilhelms-Universität, Bonn
Dipl. Ing. Jens Müller, Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin, Rheinische
Friedrich-Wilhelms-Universität, Bonn
Dr. Matthias Heil, Experimentelle Kardiologie, Kerckhoff-Institut, Bad Nauheim
Mitarbeiter:
Birgit Rabenau, Hämostaseologie und Transfusionsmedizin, Kerckhoff-Klinik
Drittmittel:
Willy und Monika Pitzer Stiftung, Bad Nauheim,
Förderhöhe: 17.895,22 � pro Jahr für 2 Jahre
Keywords:
monocytes, tissue factor, DDAVP, quantitative PCR
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Abstract
Zielvorgaben
Desmopressin (DDAVP) ist ein Vasopressinanalogon. Es wird in der Behandlung von
angeborenen und erworbenen Hämostasestörungen eingesetzt. Desmopressin wirkt als
selektiver Agonist des Vasopressinrezeptors vom Typ 2 (V2R). Es aktiviert über einen
cAMP-abhängigen Signaltransduktionsweg V2R-positive Endothelzellen. Derart aktivierte
Endothelzellen sezernieren von Willebrand Faktor (vWF), sodass es nach DDAVP-
Applikation zu einem schnellen Anstieg der vWF-Plasmaspiegel kommt (siehe Abbildung
3.1.). Im vorgestellten Projekt soll untersucht werden, ob neben dieser getriggerten vWF-
Freisetzung noch andere zelluläre Mechanismen durch DDAVP induziert werden, die zu einer
Aktivierung des Hämostasesystems führen. Für diese Annahme spricht die Beobachtung, dass
auch Patienten mit normalen oder sogar erhöhten vWF-Plasmaspiegeln von einer DDAVP-
Therapie profitieren.
EC
DDAVP
Blutgefäß
vWF
vWF
vWF
vWF
Abbildung 3.1.: Wirkungsweise von DDAVP. Schematische Darstellung eines Blutgefäßes,
ausgekleidet mit Endothelzellen (EC). Durch Induktion mit DDAVP kommt es zu einer
Freisetzung des von Willbrand-Faktors (vWF)
Neben Endothelzellen könnten auch Thrombozyten oder Monozyten mögliche
Zielzellen von DDAVP sein, da beide Zelltypen in direktem Kontakt mit dem strömenden
Blut stehen und über induzierbare gerinnungsfördernde (prokoagulatorische Mechanismen)
verfügen. Bei Monozyten ist ein solcher prokoagulatorischer Mechanismus die induzierbare
Expression von Tissue Factor. Tissue Factor (TF) oder Gewebethromboplastin aktiviert das
plasmatische Gerinnungssystem indem er einen Komplex mit im Plasma zirkulierenden FVIIa
bildet.
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Ziel der vorgestellten Untersuchung war es zu überprüfen, ob es als Folge einer
DDAVP-Applikation zu einer Aktivierung von Monozyten mit Induktion der TF-Expression
kommt.
Material und Methoden
Zur Untersuchung einer möglichen DDAVP-induzierten Monozytenaktivierung wurde das
Format einer klinischen Beobachtungsstudie gewählt. Zehn gesunde Probanden erhielten über
einen intravenösen Zugang eine DDAVP-Kurzinfusion in einer Dosierung von 0,3 �g/kg KG.
Über einen Gesamtbeobachtungszeitraum von 6 h erfolgten Blutabnahmen unmittelbar vor
und nach der DDAVP-Applikation und anschließend in stündlichem Abstand. Bestimmt
wurde ein Differenzialblutbild einschließlich einer durchflusszytometrischen Analyse des
relativen Monozytenanteils, Basisgerinnungsparameter und die monozytäre TF-Expression.
Dazu war in einer Vorphase eine quantitative TF-PCR auf der Basis der real-time
TaqMan-Technologie (siehe auch Kapitel 3.2) sowie ein FXa-Generierungsassay zum
funktionellen Nachweis von oberflächlich-exprimiertem TF aufgebaut worden. Der
funktionelle Nachweis beruht auf dem Prinzip, dass TF die enzmyatische Aktivität von FVIIa
um mehrere Zehnerpotenzen steigern kann (siehe Abbildung 3.2.)
TF
TF
TF
TF FVIIa
FXa
Abbildung 3.2.: Schematische Darstellung des Aktivitätstests zur Bestimmung
der monozytären TF-Aktivität. Tissue factor (TF) ist der
geschwindigkeitsbestimmende Kofaktor in der FVIIa-abhängigen Bildung von Faktor
Xa (FXa). Eine Bestimmung der Konzentration von funktionell aktivem TF auf der
Oberfläche von Monozyten kann daher über die FXa-Generierungsrate erfolgen.
Nachgewiesen wird die Umsetzung des Substrates als Farbumschlag.
Werden die Komponenten FVIIa und FX sowie Phospholipide im Überschuss
FX
Peptidsubstrat pNA
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angeboten, spiegeln Unterschiede in der Menge an gebildetem FXa ausschließlich
Änderungen in der Konzentration von TF wider. Mit diesem Testverfahren konnte ein unteres
Sensitivitätslimit von 5 ng/ml TF bei einer Intraassayvariabilität von maximal 11,3 % erreicht
werden. Diese Werte liegen für ein zellgebundenes Testverfahren im allgemein akzeptierten
Bereich.
Ergebnis und Ausblick
Bis auf eine Flush-Symptomatik bei 8 von 10 Probanden wurden in Zusammenhang mit der
DDAVP-Gabe keine Nebenwirkungen beobachtet. Die Wirksamkeit des DDAVP wurde
durch einen Anstieg der vWF-Plasmakonzentration und der FVIII-Konzentration belegt. Bei
allen 10 Probanden kam es nach der DDAVP-Gabe zu einem signifikanten Abfall der
Monozytenwerte. Bei einer mittleren Monozytenzahl von 0,6 x 10 3 /µl wurden die niedrigsten
Werte 1h nach DDAVP-Gabe im Mittel mit 0,2 x 10 3 /µl gemessen. Mit gleicher Zeitkinetik
konnte ein Anstieg der TF mRNA nachgewiesen werden. Bezogen auf den Ausgangswert von
im Mittel 7,1 TF Kopien/1000 Monozyten kam es nach einer Stunde zu einem 5,2fachen
Anstieg (Mittelwert nach 1 h: 36,6 TF mRNA Kopien/1000 Monozyten). Dieser Anstieg war
mit einem p-Wert < 0,001 hochsignifikant. Die Bestimmung der zellgebundenen TF-Aktivität
zeigte bei 4 von 10 untersuchten Probanden einen Anstieg über 150%. Bezogen auf die
Gesamtzahl der Probanden war dieser Anstieg statistisch jedoch nicht signifikant. Die
Ergebnisse zeigen erstmals, dass neben Endothelzellen auch Monozyten eine DDAVP-
Zielzelle sind und dass die DDAVP-induzierte TF-Induktion einen zusätzlichen
Wirkmechanismus einer Behandlung mit DDAVP darstellt.
Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass im Blut zirkulierende Monozyten
keine V2R exprimieren. Wir gehen deswegen davon aus, dass die DDAVP-induzierte TF-
Expression einen indirekten DDAVP-Wirkmechanismus darstellt. Als Folge der vWF-
Freisetzung wird P-Selektin, das Membranbestandteil der vWF-Speicherorganellen ist, in die
Endothelzellmembran integriert. P-Selektin ist ein wichtiger Adhäsionsrezeptor für
Monozyten. Daher kommt es als Folge der DDAVP-induzierten P-Selektinfreisetzung, für die
es experimentelle Belege gibt, zu einer Adhäsion von Monozyten, die wiederum durch
gleichzeitig freigesetzte inflammatorische Zytokine zur TF-Synthese stimuliert werden. Die
nach DDAVP-Gabe beobachtete Abnahme der Monozytenzahlen ist durch Adhäsion von
Monozyten an Endothelzellen zu erklären und damit ein zusätzliches Argument für die
vorgestellte Hypothese.
Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, dass eine P-Selektin-abhängige
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Monozytenaktivierung auch unter in-vivo Bedingungen zu einer messbaren
Gerinnungsaktivierung führt. Während diese Gerinnungsaktivierung im Fall von Patienten mit
einer Blutungsneigung, die mit DDAVP behandelt werden, eine erwünschte Wirkung
darstellt, ist die Endothelzell-getriggerte Monozytenaktivierung bei Patienten mit septischen
oder thromboembolischen Erkrankungen eher unerwünscht. Basierend auf dem DDAVP-
Modell können die beteiligten molekularen Mechanismen genauer untersucht und neue
Ansätze zur Hemmung der Monozytenaktivierung entwickelt bzw. geprüft werden.
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