Mitochondropathie - Biovis

Fachinformation 2 /2011 Mitochondropathie und nitrosativer Stress
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Mitochondropathie
bio vis’
DIAGNOSTIK
Diagnostik der erworbenen Mitochondropathien
und des nitrosativen Stresses
Nitrosativer Stress und/oder der Mangel
an mitochondrialen Cofaktoren

Mitochondropathie
Im Bereich der mitochondrialen Diagnostik werden immer mehr Parameter an-
geboten. Oft handelt es sich um teure, aufwendige Verfahren. Doch sind diese
Parameter wirklich besser als die bereits vorhandenen oder verursachen sie nur
unnötige Kosten. biovis Diagnostik hat sein diagnostisches Spektrum im Bereich
der mitochondrialen Medizin überarbeitet, sinnvolle neue Parameter wurden in
das Leistungsspektrum aufgenommen, alte präanalytisch sehr aufwendige Ver-
fahren eingestellt. In der beiliegenden Infobroschüre wurde versucht, einen klei-
nen Leitfaden zu geben. Was ist sinnvoll und was nicht? Auch präanalytische
Fallstricke werden aufgezeigt, um zu verhindern, dass Fehler in der Probenge-
winnung zu scheinbar pathologischen Ergebnissen führen.
Klassischerweise werden Mitochondropathien als Erbkrankheiten betrachtet
und in der Regel durch eine Muskelbiopsie gesichert. Es gibt eine Vielzahl solcher
angeborenen Mitochondropathien, die praktisch jeden Bereich des Mitochondri-
ums betreffen können; alleine für die Pyruvatdehydrogenase gibt es mehrere Er-
krankungen, von denen die meisten X-chromosomal dominant vererbt werden.
Daneben kommen auch Störungen des Citratzyklus, der Atmungskette oder der
Fettverbrennung (z.B. Carnitin-Transporter Defekt) vor.
Häufiger als genetisch bedingte Mitochondropathien finden sich erworbene
Formen. Patienten mit erworbenen Mitochondropathien fallen nicht durch cha-
rakteristische Befunde auf. Das klinische Erscheinungsbild kann stark variieren.
Patienten klagen häufig über Energielosigkeit, möglich sind aber auch Beschwer-
debilder, die an CFS, MCS oder Fibromyalgie erinnern.
Auslöser der erworbenen Mitochondropathien ist Nitrosativer Stress, der Struk-
turen und Genom von Mitochondrien schädigen kann, auch ein Mangel an mi-
tochondrialen Cofaktoren, wie z.B. Coenzym Q10, Riboflavin oder Niacin.

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Nitrosativer Stress entsteht wenn Stickstoffmonoxid (NO) in erhöhten Mengen
gebildet wird. Als endotheliales NO (eNOS) führt es an Gefäßen zu einer Vasodilatation.
NO wird in Nervenzellen gebildet (nNOS), es entsteht infolge von bakteriellen
oder viralen Infektionen (iNOS) oder in Mitochondrien (mNOS). NO stellt
ein farbloses Gas dar, das aufgrund eines ungepaarten Elektrons Radikalcharakter
besitzt. Hierauf beruhen die ausgeprägten biologischen Effekte. Durch eine Reaktion
mit Superoxidanionen reagiert es bei oxidativem Stress zu Peroxynitrit, einer
toxischen Substanz, die Mitochondrien schädigen kann. Peroxynitrit ist das wesentliche
schädigende Agens in der Kaskade aus nitrosativem Stress, Mitochondropathie,
Immundysfunktion (chronische, oft subklinische Entzündung) und in vielen
Fällen auch Schmerzen.
Häufige Ursachen einer vermehrten NO-Synthese oder Nitrosativem Stress sind im
folgenden zusammengestellt.
Ursachen von Nitrosativem Stress: [Pall et al. 2007; Kuklinski 2006, 2007]
• Schmerzen
• chronische Entzündungen
• chronischer Stress
• Umweltgifte: Lösungsmittel, Pestizide, Schwermetalle
• Medikamente: Langzeitnitrate, Antihypertonika (z.B. Dihydralazin),
Cholesterinsynthesehemmer, Antidiabetika (v.a. Metformin),
mitochondrienschädigende Antibiotika (z.B. Gentamicin,
Cotrimoxazol) u.a.
• HWS-Traumen
Komplex I
H +
NADH + H + NAD +
Nitrosativer Stress
e - e -
Komplex II Komplex III
Succinat Fumarat
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H +
e -
Komplex IV
H +
1/2O s + H + H 2 O
ATP-Synthase
H +
Pi + ADP ATP + H 2 O
Biochemische Auswirkungen einer
erhöhten NO-Synthese.
Hemmung der FeS-haltigen Enzyme
in der mitochondrialen Atmungskette,
und zwar in den Komplexen I und II.
Verminderte Bildung von ATP.
Eine ganze Reihe von Erkrankungen oder Beschwerdebildern wurden in der Ver-
gangenheit mit Nitrosativem Stress in Verbindung gebracht. Inflammatorische
Erkrankungen fördern über eine Freisetzung von Zytokinen die Aktivierung der induzierbaren
NO-Synthase (iNOS). Hierdurch wird vermehrt NO gebildet. Es kommt
zu Nitrosativem Stress.
Eine Auswahl mitochondrialer und chronisch inflammatorischer Erkrankungen:
• rheumatoide Arthritis
• Seronegative Spondylarthropathien (z.B. M. Bechterew, reakt. Arthr.)
• Kollagenosen (z.B. syst. Lupus, Sjögren Syndrom, Sklerodermie)
• Polymyalgia rheumatika
• Fibromyalgie
• chronifizierte Infektionen (z.B. Borreliose, Chlamydien, Hepatits)
• chronische Erschöpfung
• Multiple Sklerose
• Tumorleiden
• Metabolisches Syndrom, Diabetes, KHK und jegliche Arteriosklerose
• sekundäre Depressionen und Angststörungen
• Psoriasis
• Allergien, Neurodermitis, Asthma
• Diverse Lebererkrankungen
• Migräne, chronischer Kopfschmerz
• Chronisch entzündliche Darmerkrankungen und Reizdarm
Diagnostikübersicht
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Diagnostische Ansätze bei Mitochondropathien oder Nitrosativem Stress können
vielfältig sein. Sie können die NO-Bildung, Voraussetzungen der Peroxinitritsynthese
oder Auswirkungen auf die Mitochondrien erfassen. Auch wichtige therapeutische
Faktoren sind zu berücksichtigen.
Nachweis einer vermehrten NO-Bildung
• Citrullin im Urin
• Aminosäuren im Plasma (Arginin und Citrullin)
• NO – Atemgastest

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Nachweis von Oxidativem Stress und Nitrosativem Stress
• Lipidperoxidation, Antioxidative Kapazität, Glutathion
• Nitrotyrosin, Nitrophenylessigsäure
Nachweis einer Mitochondrienstörung
• LDH – Isoenzyme
• Mitochondriales Membranpontential
• Laktat Belastungstest
• (Lactat / Pyruvat – Ratio)
• M2PK (CAVE: auch Tumormarker)
Nachweis von Inflammation und TH-Shiftung
• Humorale Aktivitätsmarker: CRP, Neopterin, sIL2R, ECP
• Zytokine im Serum TNF, IL-1, IL-6, ggf. auch IL-8 und IL-12
• Stimulierte Zytokinstaten
Mikronährstoffdiagnostik
• Vitamine (v.a. B12, B2, B3, Folsäure, Biotin, C, 25-OH-D3)
• Vollblutmineralanalyse (v.a. K, Mg, Zn, Se Aminosäurestatus)
Nachweis von Folgen
• Diff.-BB, gGT, GPT, Kreatinin, Hst., Serumelektrolyte, Blutfette, BZ etc.
• L-Tryptophan (alternativ Serotonin), evtl. komplettes Aminogramm
Nachweis einer Blut-Hirn-Schranken-Störung
• Protein S100
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Endogenes NO wird von dem Enzym
NOS (NO-Synthase) aus L-Arginin
gebildet
Arginin + Sauerstoff
NO + Citrullin
Spezielle Diagnostik des nitrosativen
Stresses und der Mitochondropathie
Citrullin
Material: 1. Morgenurin
Durch Einführung der Dryspot – Technik (Auf einem speziellen Filter
aufgezogener und getrockneter Urin) lässt sich die Transportstabilität
erheblich verbessern.
Norm: < 4 mg/g Kreatinin
Über der Norm liegende Citrullinwerte deuten auf einen vermehrten
NO-Anfall hin. NO kann durch Reaktion mit Superoxidanionen zur
Bildung von Peroxynitrit führen, wodurch Mitochondrien geschädigt
werden können.
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HN
H2N
C
NH
CH2
CH2
CH2
CH
NH2
OH
l-Arginin
C O
L-NMMA
L-NAME
Aminoguanidin
NADP+
FAD
FMN
NADPH
NO-Synthese
O2
H2O
Da die Citrullinbildung stark variiert (belastungsabhängig), schließt ein
negatives Ergebnis einen NO-Stress oder eine Mitochondropathie
nicht aus. Die Menge an Citrullin, die gebildet wird, ist von vielen
Limitanten abhängig, unter anderem von der Menge an zur
Verfügung stehendem Arginin.
O2
Superoxid-
Anionen
NO
Thiole
ONOO
Peroxynitrit
3-Nitrotyrosin
Achtung: Im Dryspot wird nur das freie Citrullin erfasst, im konventionellen
H4B
NADPH
NOS
Test auch das Protein-/ Peptidgebundene Citrullin. Dadurch kommen
die unterschiedlichen Referenzbereiche zu Stande.
O
H2N
L-Citrullin
C
NH
CH2
CH2
CH2
CH
NH2
OH
NO2
Nitrit
C O
pH erniedrigt
S-GSNO
S-Nitrosothiol

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Nitrotyrosin, Nitrophenylessigsäure
Nitrotyrosin:
Material: EDTA-Blut (... muss per Express eingesandt werden.)
Norm: < 3,2 nmol/l
Peroxynitrit ist toxisch und kann Mitochondrien schädigen. Direkt
nachweisbar ist es nicht. Peroxynitrit führt zu einer Nitrosierung von
aromatischen Aminosäuren. So entsteht z.B. aus Tyrosin 3-Nitrotyro-
sin, das im EDTA-Blut nachweisbar ist. Hohe Nitrotyrosinspiegel lassen
auf eine vermehrte Peroxynitritbildung und damit auf eine
Schädigung der Mitochondrien schließen.
Erhöhte Nitrotyrosinwerte belegen das Vorliegen von Nitrosativem
Stress (hohe Spezifität)
Achtung: Wie beim Citrullin schließen auch unauffällige Nitrotyrosinwerte eine
Mitochondrienschädigung durch Nitrosativen Stress nicht aus. Ein
Grund für unauffällige Messwerte kann z.B. ein Mangel an Tyrosin sein.
Nitrophenylessigsäure:
Material: 1. Morgenurin
Norm: < 3,0 µg/g Kreatinin
3-Nitrophenylessigsäure stellt ein Abbauprodukt des 3-Nitrotyrosins
dar. Positive Werte von Nitrophenylessigsäure bestätigen sicher das
Vorliegen von nitrosativem Stress! Die Messung von Nitrophenylessig
säure im Urin hat somit eine analoge Aussage wie die Nitrotyrosinbe-
stimmung im EDTA-Blut, sie ist aber weniger sensitiv.
Mitochondriale Aktivität
Material: 1 EDTA, muss per Express eingesandt werden.
Norm: > 90% aktive Mitochondrien
Optimal > 95% aktive Mitochondrien
Durch Enzyme der Atmungskette werden Protonen aus dem Zell-
inneren in den intermembranären Spalt transportiert. Hierdurch ent-
steht ein elektrochemisches Membranpotential, das über Fluoreszenz-
farbstoffe nachgewiesen werden kann. Intakte Mitochchondrien zei-
gen einen deutlichen Protonengradienten, inaktive Mitochondrien hin-
gegen nicht. Über durchflusszytometrische Verfahren kann das
Membranpotential nachweisbar gemacht werden. Aktive und inaktive
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Zellen mit intaktem
Membranpotenzial
Zellen mit reduziertem
Membranpotenzial
Zunahme der Grün-Fluoreszenz
durch Störung der
Mitochondrienfunktion
Membranpotenzial messbar über
Durchflußzytometrie
Red fluorescence (FL2)
10 0
10 0
10 0
10 0
10 0
Staurosporine
10 0 10 0 10 0 10 0 10 0
Green fluorescence (FL1)
LDH-Isoenzyme
Mitochondrien lassen sich so unterscheiden. Die mitochondriale
Aktivität wird ermittelt, indem Granulozyten mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, der abhängig vom elektrischen
Potential seine Fluoreszenz ändert.
Im Vergleich zu den LDH-Isoenzymen ermöglicht die Messung der
Mitochondrialen Aktivität eine besser quantifizierbare Aussage, die
nicht nur für Patientenuntersuchungen, sondern auch für in vivo oder
in vitro Studien (z.B. nach Gabe von mitotropen Substanzen, wie
Coenzym Q10) genutzt werden kann.
Achtung: Die Messung der Mitochondrialen Aktivität hat sich in
den letzten Jahren vielfach bewährt. Da nur Granulozyten betrachtet
werden, können in seltenen Fällen bei Tumorpatienten „paradoxe“
Ergebnisse auftreten, wenn Tumorpatienten mit eingebrochener
spezifischer Immunabwehr und überwiegender unspezifischer
Abwehr scheinbar gute Werte zeigen, obwohl außerhalb der
Granulozyten die Situation anders aussieht. In diesen Fällen ist eine
ATP-Messung zu bevorzugen.
Material: Serum, ungefroren! (Einfrieren führt zu einer Zerstörung von LDH-5)
Norm: LDH4: < 9,4 %
LDH5: < 10 %
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Die LDH-Isoenzyme stellen einen preiswerten Marker zur Beurteilung
der Mitochondrienfunktion dar. LDH-4 (H3M) und v.a. LDH-5 (4M)
steigen an, wenn Mitochondrien zerstört werden. Ein relativer Anteil
von LDH-4 oder LDH-5 über 10% weist auf eine Mitochondropathie hin
(vor allem bei normalem Gesamt-LDH)
Achtung: Die Gesamt-LDH sollte im oder nur leicht oberhalb des
Normbereich liegen. Bei stark erhöhter Gesamt-LDH können
Fehlinterpretationen entstehen, wenn nicht gleichzeitig
Leberenzyme (γGT, GPT) und (Herz-) Muskelenzyme (z.B. CK, Troponin)
sowie Hämolysewerte (z.B. Haptoglobin) vorliegen, da eine
Vermehrung der LDH-5 auch bei Leberschäden vorkommt
und eine relative Verschiebung zur LDH 1/2 auch bei Herzmuskel-
schäden oder Hämolyse auftritt.

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ATP – Messung
Material: 1 CPDA (... per Express einsenden, da Lebendzelluntersuchung)
Norm: > 500 pmol/ 10 6 Zellen
Die ATP-Messung ist ähnlich zu bewerten, wie die Bestimmung
der Mitochondrialen Aktivität, da ATP im Komplex V der Atmungs-
kette gebildet wird. Zur Messung des zellulären ATP werden leicht
verfügbare Leukozyten des Blutes herangezogen. Scheinbar paradoxe
Ergebnisse bei Tumorpatienten, wie bei der Mitochondrialen Aktivität
bisweilen zu beobachten, treten bei der zellulären ATP-Messung
nicht auf.
Gemessen wird zunächst das Basal ATP (Eingangsmessung).
Anschließend wird den Zellen Natriumazid zugesetzt, das die
Synthesekette im Komplex IV reversibel hemmt. Unter der Hemmung
nimmt die ATP-Konzentration deutlich ab (Belastungs ATP).
Wird der Hemmstoff nun wieder entfernt, beginnt sich die
Elektronentransportkette zu regenerieren und die ATP-Bildung steigt
an (Recovery-ATP). Während Patienten oft noch weitgehend normale
Basal ATP-Werte zeigen, ist die Regenerationsfähigkeit der
Mitochondrien bei vielen deutlich eingeschränkt. Das Recovery-ATP
sollte um mindestens 25 % über dem Belastungs-ATP-Wert liegen,
Steigerungen von 50% und mehr sind bei Gesunden keine Selten-
heit. Werden Steigerungen von 25% nicht erreicht, ist sicher von einer
gestörten Mitochondrien-Regeneration auszugehen.
Die ATP-Messung ermöglicht Hinweise auf Funktion, Kapazität
und Belastbarkeit der Mitochondrien.
Laktat/Pyruvat-Ratio
Material: 1-2 NaF (... per Express einsenden)
Achtung: Da Nahrungsaufnahme und körperliche Belastung zu einem
deutlichen Anstieg der Pyruvat-Werte führen, muss die Probennahme
streng nüchtern und in Ruhe erfolgen. Der Stauvorgang sollte 1 min
nicht übersteigen.
Norm: Ratio < 20:1
Die Bestimmung von Pyruvat ist extrem störanfällig (Nahrung,
Bewegung, Venenstau) und sehr wenig versandstabil.
Auf Grund der schlechten Stabilität ist der Test zur Diagnostik der
Mitochondrienfunktion nur bedingt empfehlenswert. Durch Einführ-
ung der DrySpot-Technik wird sich zukünftig das Problem der Ver-
sandstabilität lösen lassen.
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(ATP)
435
pmol
Patient 1
980
pmol
Patient 2
Mitochondrien-ATP- Eingangsmessung
(ATP)
100 %
1050
pmol
40,4 %
424
pmol
NW: 500 - 1100 Pmol
658
pmol
Patient 3
+ 109 %
84,5 %
887
pmol
Eingangsmessung Belastungsmessung Regenerationsmessung
Mitochondrien-Belastungstest ausreichend
(ATP)
100 %
950
pmol
35,9 %
341
pmol
Eingangsmessung Belastungsmessung Regenerationsmessung
Mitochondrien-Belastungstest defizient
+ 12,8 %
40,5
385
pmol
Protein S 100
Material: 2x Serum
• Blutentnahme in Ruhe
• 10 Minuten Treppengehen oder Kopfkreisen
• Erneute Blutentnahme
• Vollblut abzentrifugieren und Serum einfrieren,
eingefrorener Versand per Express
Norm: > 0,13 (malignes Melanom) / > 0,07 µg/l (Nitrosativer Stress)
Jeder Wert über 0,07µg/l ist ein Hinweis auf eine gestörte Blut-
Hirn-Schranke.
In der Regel kommt es bei mäßigen Beschwerden erst nach Belastung
zu einem Protein S 100 Anstieg
Ursachen unspezifisch erhöhter Protein S 100-Werte
• leichte Erhöhungen bei: Leberzirrhose, Niereninsuffizienz
• Erhöhungen bis 2,0 µg/l bei: schweren bakteriellen Infekten.
Bei dunkler Hautfarbe physiologisch: Protein S100 Test nicht
zu werten!!
• starke Erhöhung (über 2,0 µg/l) bei: vaskulären Schäden,
Herzinfarkt, zerebrale Ischämie
Achtung: Hämolyse führt zu falsch positiven Ergebnissen
Organische Säuren im Urin
Material: Urin
Profil: Organische Säure des Zitronensäurezyklus
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Eine der wesentlichen Folgen von nitrosativem Stress ist die
Zerstörung eisenhaltiger Enzyme. Eines dieser Enzyme ist die Akonitase,
welche im Zitronensäurezyklus die Umwandlung von Zitronensäure
(Citrat) zu Isozitronensäure (Isocitrat) katalysiert. Bei Zerstörung
der Akonitase durch Peroxynitrit kommt es daher zu einem
Stau von Zitronensäure und einer Unterbrechung des Krebs-Zyklus.
Eine erhöhte Zitronensäure bei niedriger Isozitronensäure kann daher
als weiterer Indikator einer Mitochondropathie dienen.

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