SARS-CoV-2-spezifische T-Zell-Immunität bei COVID-19- und SARS-Fällen sowie bei nicht infizierten Kontrollen

SARS-CoV-2-spezifische T-Zell-Immunität bei COVID-19- und SARS-Fällen sowie bei nicht
infizierten Kontrollen
Nina Le Bert, Anthony T. Tan, Kamini Kunasegaran, Christine Y. L. Tham, Morteza Hafezi, Adeline
Chia, Melissa Hui Yen Chng, Meiyin Lin, Nicole Tan, Martin Linster, Wan Ni Chia, Mark I-Cheng
Chen, Lin-Fa Wang, Eng Eong Ooi, Shirin Kalimuddin, Paul Anantharajah Tambyah, Jenny Guek-
Hong Low, Yee-Joo Tan & Antonio Bertoletti
Zusammenfassung
Gedächtnis-T-Zellen, die durch frühere Krankheitserreger induziert wurden, können die Anfälligkeit
für und den klinischen Schweregrad von nachfolgenden Infektionen beeinflussen 1. Es ist wenig über
das Vorhandensein von bereits existierenden Gedächtnis-T-Zellen beim Menschen bekannt, die das
Potenzial haben, das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu
erkennen. Hier untersuchten wir T-Zellen-Antworten gegen die strukturellen (Nukleokapsid (N)-
Protein) und nicht-strukturellen (NSP7 und NSP13 von ORF1) Regionen von SARS-CoV-2 bei
Personen, die sich von der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) erholten (n = 36). Bei all
diesen Personen fanden wir CD4- und CD8-T-Zellen, die mehrere Regionen des N-Proteins
erkannten. Als nächstes zeigten wir, dass Patienten (n = 23), die sich von SARS (der mit der SARS-
CoV-Infektion assoziierten Krankheit) erholt hatten, 17 Jahre nach dem Ausbruch von SARS im
Jahr 2003 langlebige Gedächtnis-T-Zellen besitzen, die gegenüber dem N-Protein von SARS-CoV
reaktiv sind; diese T-Zellen zeigten robuste Kreuzreaktivität gegenüber dem N-Protein von SARS-
CoV-2. Wir wiesen auch SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei Personen nach, die keine
Vorgeschichte von SARS, COVID-19 oder Kontakt mit Personen hatten, die SARS und/oder
COVID-19 hatten (n = 37). SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei nicht infizierten Spendern
wiesen ein anderes Muster der Immundominanz auf und richteten sich häufig gegen NSP7 und
NSP13 sowie das N-Protein. Die Epitop-Charakterisierung von NSP7-spezifischen T-Zellen zeigte
die Erkennung von Proteinfragmenten, die bei tierischen Betacoronaviren konserviert sind, aber
eine geringe Homologie zu den mit dem "Schnupfen" assoziierten humanen Coronaviren aufweisen.
Somit induziert die Infektion mit Betacoronaviren eine multispezifische und lang anhaltende T-Zell-
Immunität gegen das strukturelle N-Protein. Zu verstehen, wie präexistierende N- und ORF1-
spezifische T-Zellen, die in der allgemeinen Bevölkerung vorhanden sind, die Anfälligkeit für und
die Pathogenese von SARS-CoV-2-Infektionen beeinflussen, ist wichtig für das Management der
aktuellen COVID-19-Pandemie.
Übersicht
SARS-CoV-2 ist die Ursache von COVID-19 2. Diese Krankheit wurde von der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Pandemie erklärt und hat schwerwiegende Auswirkungen
auf das Leben von Menschen und die Wirtschaft auf der ganzen Welt. Die Infektion mit SARS-
CoV-2 ist durch ein breites Spektrum klinischer Syndrome gekennzeichnet, die von
asymptomatischen Erkrankungen oder leichten grippeähnlichen Symptomen bis hin zu schwerer
Lungenentzündung und akutem Atemnotsyndrom reichen 3 .
Es ist üblich, um die Fähigkeit eines einzelnen Virus zu beobachten, sehr unterschiedliche
pathologische Manifestationen beim Menschen zu verursachen. Dies ist oft auf mehrere Faktoren
zurückzuführen, darunter die Größe des viralen Inokulums, der genetische Hintergrund der
Patienten und das Vorhandensein von begleitenden pathologischen Zuständen. Darüber hinaus kann
eine etablierte adaptive Immunität gegenüber eng verwandten Viren 4 oder anderen
Mikroorganismen 5 die Anfälligkeit verringern 6 oder den Schweregrad der Erkrankung erhöhen 7 .

SARS-CoV-2 gehört zu den Coronaviridae, einer Familie von großen RNA-Viren, die viele
Tierarten infizieren. Es sind sechs weitere Coronaviren bekannt, die den Menschen infizieren. Vier
davon werden endemisch übertragen 8 und verursachen die gewöhnliche Erkältung (OC43, HKU1,
229E und NL63), während SARS-CoV und das Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
(MERS-CoV) Epidemien schwerer Lungenentzündungen verursacht haben 9 . Alle diese Coronaviren
lösen bei infizierten Patienten Antikörper- und T-Zell-Reaktionen aus: Allerdings scheinen die
Antikörperspiegel schneller abzunehmen als die T-Zellen. SARS-CoV-spezifische Antikörper fielen
innerhalb von 2 bis 3 Jahren unter die Nachweisgrenze 10 , während SARS-CoV-spezifische
Gedächtnis-T-Zellen sogar noch 11 Jahre nach SARS nachgewiesen werden konnten 11 . Da die
Sequenzen ausgewählter struktureller und nicht-struktureller Proteine zwischen verschiedenen
Coronaviren hoch konserviert sind (z. B. sind NSP7 und NSP13 zwischen SARS-CoV-2, SARS-
CoV und dem Fledermaus-assoziierten Fledermaus-SL-CoVZXC21 12 zu 100 % bzw. 99 %
identisch), untersuchten wir, ob kreuzreaktive SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei Personen
vorhanden sind, die eine SARS-CoV-Infektion überwunden haben, und verglichen die Antworten
mit denen bei Personen, die sich von einer SARS-CoV-2-Infektion erholt haben. Wir untersuchten
diese T-Zellen auch bei Personen, die keine Vorgeschichte von SARS oder COVID-19 oder Kontakt
mit Patienten mit SARS-CoV-2 hatten. Insgesamt werden diese Personen im Folgenden als
Personen bezeichnet, die nicht mit SARS-CoV und SARS-CoV-2 exponiert waren (nicht exponierte
Spender).
SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei Patienten mit COVID-19
SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen wurden gerade erst für Patienten mit COVID-19 13,14
charakterisiert, und ihre potenziell schützende Rolle wurde aus Studien an Patienten abgeleitet, die
sich von SARS 15 und MERS 16 erholt hatten. Um SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen zu untersuchen,
die mit der Virus-Clearance assoziiert sind, haben wir peripheres Blut von 36 Personen nach
Genesung von leichter bis schwerer COVID-19 gesammelt (demografische, klinische und
virologische Informationen sind in Tabelle 1 der erweiterten Daten enthalten) und die T-Zell-
Antwort gegen ausgewählte strukturelle (N) und nicht-strukturelle Proteine (NSP7 und NSP13 von
ORF1) des großen SARS-CoV-2-Proteoms untersucht (Abb. 1a). Wir wählten das N-Protein aus, da
es eines der am häufigsten produzierten Strukturproteine ist 17 und einen hohen Grad an Homologie
zwischen verschiedenen Betacoranaviren aufweist 18 (Erweiterte Daten Abb. 1).
Abb. 1: SARS-CoV-2-spezifische Reaktionen bei Patienten, die von COVID-19 genesen sind.
Aus: SARS-CoV-2-spezifische T-Zell-Immunität bei Fällen von COVID-19 und SARS sowie bei
nicht infizierten Kontrollen
a, SARS-CoV-2-Proteom-Organisation; analysierte Proteine sind mit einem Sternchen markiert. b, Die 15-mer Peptide,
die sich um 10 Aminosäuren überlappten und das N-Protein, NSP7 und NSP13 umfassen, wurden in 6 Pools aufgeteilt,
die das N-Protein (N-1, N-2), NSP7 und NSP13 (NSP13-1, NSP13-2, NSP13-3) abdecken. c, PBMCs von Patienten,
die sich von COVID-19 erholt haben (n = 36), wurden mit den Peptidpools oder mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat
(PMA) und Ionomycin (Iono) als Positivkontrolle stimuliert. Die Häufigkeit der spot-forming units (SFU) der IFNγsezernierenden
Zellen ist dargestellt. d, Die Zusammensetzung der SARS-CoV-2-Antwort in jedem Individuum ist als
Prozentsatz der gesamten detektierten Antwort dargestellt. N-1, hellblau; N-2, dunkelblau; NSP7, orange; NSP13-1,
hellrot; NSP13-2, rot; NSP13-3, dunkelrot. e, PBMCs wurden mit den Peptidpools, die das N-Protein abdecken (N-1,
N-2), für 5 h stimuliert und durch intrazelluläre Zytokinfärbung analysiert. Dot Plots zeigen Beispiele von Patienten (2
von 7), die CD4- und/oder CD8-T-Zellen hatten, die IFNγ und/oder TNF als Reaktion auf die Stimulation mit N-1- und/
oder N-2-Peptiden produzierten. Dargestellt ist der prozentuale Anteil von SARS-CoV-2 N-Peptid-reaktiven CD4- und
CD8-T-Zellen bei n = 7 Personen (nicht stimulierte Kontrollen wurden für jede Reaktion subtrahiert).

NSP7 und NSP13 wurden aufgrund ihrer vollständigen Homologie zwischen SARS-CoV, SARS-
CoV-2 und anderen tierischen Coronaviren ausgewählt, die zur Gattung der Betacoranaviren
gehören 12 (Erweiterte Daten Abb. 2), und weil sie repräsentativ für das ORF1a/b-Polyprotein sind,
das für den Replikase-Transkriptase-Komplex kodiert 19 . Dieses Polyprotein ist das erste, das nach
einer Infektion mit dem Coronavirus translatiert wird und ist essentiell für die anschließende
Transkription der genomischen und subgenomischen RNA-Spezies, die für die Strukturproteine
kodieren 19 . Wir synthetisierten 216 15-mer Peptide, die sich um 10 Aminosäuren überlappten und
die gesamte Länge von NSP7 (83 Aminosäuren), NSP13 (601 Aminosäuren) und N (422
Aminosäuren) abdeckten, und teilten diese Peptide in fünf Pools mit jeweils ca. 40 Peptiden (N-1,
N-2, NSP13-1, NSP13-2 und NSP13-3) und einen einzigen Pool mit 15 Peptiden, der sich über
NSP7 erstreckte (Abb. 1b). Diese unbiased Methode mit überlappenden Peptiden wurde anstelle
einer bioinformatischen Auswahl von Peptiden verwendet, da die Leistung solcher Algorithmen in
asiatischen Populationen oft suboptimal ist 20 .

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von 36 Patienten, die sich von COVID-19 erholt
hatten, wurden 18 h lang mit den verschiedenen Peptidpools stimuliert und die virusspezifischen
Antworten wurden mittels Interferon-γ (IFNγ) ELISpot-Assay analysiert. Bei allen getesteten
Personen (36 von 36) konnten wir IFNγ-Spots nach Stimulation mit den Pools synthetischer
Peptide, die das N-Protein abdeckten, nachweisen (Abb. 1c, d). Bei fast allen Individuen konnten
N-spezifische Reaktionen gegen mehrere Regionen des Proteins identifiziert werden: 34 von 36
Individuen zeigten Reaktivität gegen die Region, die die Aminosäuren 1-215 (N-1) umfasste und 36
von 36 Individuen zeigten Reaktivität gegen die Region, die die Aminosäuren 206-419 (N-2)
umfasste. Im Gegensatz dazu wurden Reaktionen auf NSP7- und NSP13-Peptidpools bei 12 von 36
getesteten COVID-19-konvaleszenten Personen in sehr geringen Mengen nachgewiesen.
Zur Bestätigung und Definition der N-spezifischen IFNγ-ELISpot-Antwort wurde eine direkte ex
vivo intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) durchgeführt. Aufgrund ihrer relativ geringen Häufigkeit
waren N-spezifische T-Zellen mit ICS schwieriger zu visualisieren als mit ELISpot; dennoch war
bei sieben von neun analysierten Individuen eine deutliche Population von CD4- und/oder CD8-T-
Zellen nachweisbar, die IFNγ und/oder TNF produzierten (Abb. 1e und Extended Data Abb. 3, 4).
Darüber hinaus konnten wir trotz der geringen Stichprobengröße die Häufigkeit von SARS-CoV-2-
spezifischen IFNγ-Spots mit dem Vorhandensein von virusneutralisierenden Antikörpern, der
Infektionsdauer und der Krankheitsschwere vergleichen und fanden keine Korrelationen (Erweiterte
Daten Abb. 5). Um die Multispezifität der N-spezifischen Antworten, die bei Patienten, die sich von
COVID-19 erholt haben, ex vivo nachgewiesen wurden, zu bestätigen und weiter abzugrenzen,
kartierten wir die genauen Regionen des N-Proteins, die in der Lage sind, IFNγ-Antworten bei neun
Personen zu aktivieren. Wir organisierten die 82 überlappenden Peptide, die das gesamte N-Protein
abdeckten, in kleinen Peptidpools (von 7-8 Peptiden), die verwendet wurden, um PBMCs entweder
direkt ex vivo oder nach einem in vitro-Expansionsprotokoll zu stimulieren, das zuvor bei Patienten
mit Hepatitis-B-Virus 21 oder SARS 22 verwendet wurde. Eine schematische Darstellung der
Peptidpools ist in Abb. 2a zu sehen. Wir fanden heraus, dass 8 von 9 Patienten, die sich von
COVID-19 erholten, PBMCs hatten, die mehrere Regionen des N-Proteins von SARS-CoV-2
erkannten (Abb. 2a). Bemerkenswert ist, dass wir dann einzelne Peptide definierten, die in der Lage
waren, T-Zellen bei sieben Patienten zu aktivieren. Mit Hilfe einer Peptid-Matrix-Strategie 22
entschlüsselten wir zunächst die einzelnen Peptide, die für die detektierte Antwort mittels IFNγ-
ELISpot verantwortlich waren. Anschließend bestätigten wir die Identität der einzelnen Peptide,
indem wir mit ICS die Fähigkeit der Peptide zur Aktivierung von CD4- oder CD8-T-Zellen testeten
(Tabelle 1 und Abb. 2b). Tabelle 1 fasst die verschiedenen T-Zell-Epitope zusammen, die sowohl
durch ELISpot als auch durch ICS für sieben Personen definiert wurden, die sich von COVID-19
erholt haben. Bemerkenswert ist, dass wir beobachteten, dass COVID-19-erkrankte Personen T-
Zellen entwickelten, die spezifisch für Regionen waren, die auch von T-Zellen von Personen, die
sich von SARS erholt hatten, angegriffen wurden. Zum Beispiel stimulierte die Region der
Aminosäuren 101-120 des N-Proteins, die ein zuvor beschriebenes CD4-T-Zell-Epitop bei SARS-
CoV-exponierten Personen ist 11,22 , auch CD4-T-Zellen bei zwei COVID-19-konvaleszenten
Personen. In ähnlicher Weise enthielt die Region der Aminosäuren 321-340 des N-Proteins Epitope,
die CD4- und CD8-T-Zellen bei Patienten auslösten, die sich entweder von COVID-19 oder von
SARS erholt hatten 22 . Der Befund, dass Patienten, die sich von COVID-19 und SARS erholt haben,
T-Zell-Antworten gegen gemeinsame virale Determinanten auslösen können, legt nahe, dass eine
frühere SARS-CoV-Infektion T-Zellen induzieren kann, die in der Lage sind, gegen SARS-CoV-2
zu reagieren.

Abb. 2: SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen in COVID-19-Rekonvaleszenten richten sich gegen
mehrere Regionen des N-Proteins.
a, PBMCs von 9 Personen, die sich von COVID-19 erholt haben, wurden mit 12 verschiedenen Pools von 7-8 N-
Peptiden stimuliert. Die Tabelle zeigt IFNγ-ELISpot-Antworten gegen die einzelnen N-Peptid-Pools. Das Sternchen
kennzeichnet Antworten, die nach der in vitro-Expansion nachgewiesen wurden. b, Nach der in vitro-Zellexpansion
wurde eine Peptidpool-Matrix-Strategie verwendet. T-Zellen, die auf bestimmte Peptide reagierten, wurden durch IFNγ-
ELISpot identifiziert und durch ICS bestätigt. Repräsentative Punktdiagramme von 3 von 7 Patienten sind dargestellt.

SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei Patienten mit SARS
Für den Umgang mit der aktuellen Pandemie und für die Entwicklung von Impfstoffen gegen
SARS-CoV-2 ist es wichtig zu verstehen, ob die erworbene Immunität von langer Dauer ist. Wir
haben zuvor gezeigt, dass Patienten, die sich von SARS erholt haben, T-Zellen haben, die spezifisch
für Epitope innerhalb verschiedener SARS-CoV-Proteine sind, die 11 Jahre nach der Infektion
persistieren 11 . Hier haben wir PBMCs 17 Jahre nach der SARS-CoV-Infektion gesammelt und
getestet, ob sie immer noch Zellen enthalten, die gegen SARS-CoV reaktiv sind und ob diese ein
kreuzreaktives Potenzial gegen SARS-CoV-2-Peptide haben. PBMCs von Personen, die eine
SARS-CoV-Infektion überwunden hatten (n = 15), wurden direkt ex vivo mit Peptidpools
stimuliert, die das N-Protein von SARS-CoV (N-1 und N-2), NSP7 und NSP13 abdeckten (Abb.
3a). Dabei zeigte sich, dass 17 Jahre nach der Infektion die IFNγ-Antworten auf SARS-CoV-
Peptide immer noch vorhanden waren und sich fast ausschließlich auf das N-Protein und nicht auf
die NSP-Peptidpools konzentrierten (Abb. 3b). Anschließend testeten wir, ob die N-Peptide von
SARS-CoV-2 (Aminosäure-Identität, 94 %) IFNγ-Antworten in PBMCs von Personen induzieren,
die eine SARS-CoV-Infektion hinter sich haben. Tatsächlich reagierten PBMCs von allen 23
getesteten Personen auf N-Peptide von SARS-CoV-2 (Abb. 3c, d). Um zu testen, ob sich diese
niederfrequenten Reaktionen bei Personen, die sich von SARS erholt hatten, nach dem Kontakt mit
dem N-Protein von SARS-CoV-2 ausweiten könnten, wurde die Menge der IFNγ-produzierenden
Zellen, die auf die N-, NSP7- und NSP13-Proteine von SARS-CoV-2 reagierten, nach 10 Tagen
Zellkultur in Gegenwart der entsprechenden Peptide analysiert. Sieben von acht getesteten Personen
zeigten eine deutliche, robuste Expansion von N-reaktiven Zellen (Abb. 3e) und ICS bestätigte, dass
Personen, die sich von SARS erholt hatten, SARS-CoV N-reaktive CD4- und CD8-Gedächtnis-T-
Zellen hatten 11 (Erweiterte Daten Abb. 6). Im Gegensatz zur Reaktion auf die N-Peptide konnten
wir keine Zellen nachweisen, die auf die Peptidpools reagierten, die NSP13 abdeckten, und nur
Zellen von einer von acht Personen reagierten auf NSP7 (Abb. 3e).
Abb. 3: SARS-CoV-2 kreuzreaktive Reaktionen sind bei Patienten vorhanden, die sich von
SARS erholt haben.
a, PBMCs von 15 Personen, die sich vor 17 Jahren von SARS erholt hatten, wurden mit SARS-CoV N-, NSP7- und
NSP13-Peptidpools stimuliert. b, Spot-bildende Einheiten von IFNγ-sezernierenden Zellen nach Stimulation über Nacht
mit den angegebenen Peptidpools. c, PBMCs von 15 Individuen, die sich von SARS erholt haben, wurden parallel mit
Peptidpools stimuliert, die die N-Proteine von SARS-CoV und SARS-CoV-2 abdecken, und die Häufigkeit der IFNγproduzierenden
Zellen ist dargestellt. d, Die Zusammensetzung der SARS-CoV-2-Antwort bei jedem Individuum, das
sich von SARS erholt hat (n = 23), ist als Prozentsatz der gesamten nachgewiesenen Antwort dargestellt. N-1, hellblau;
N-2, dunkelblau; NSP7, orange; NSP13-1, hellrot; NSP13-2, rot; NSP13-3, dunkelrot. e, PBMCs von 8 Personen, die
sich von SARS erholt haben, wurden mit allen Peptiden stimuliert, die N, NSP7 und NSP13 von SARS-CoV-2
abdecken, um kreuzreaktive Reaktionen zu erkennen. Die Anzahl der Zellen, die auf die verschiedenen Peptidpools
direkt ex vivo und nach in vitro-Expansion reaktiv sind, sind dargestellt.

Somit sind SARS-CoV-2 N-spezifische T-Zellen Teil des T-Zell-Repertoires von Personen mit einer
SARS-CoV-Infektion in der Vorgeschichte und diese T-Zellen sind in der Lage, nach dem Kontakt
mit N-Peptiden von SARS-CoV-2 robust zu expandieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass virusspezifische
T-Zellen, die durch eine Infektion mit Betacoronaviren induziert werden, lang anhaltend
sind, was die Vorstellung unterstützt, dass Patienten mit COVID-19 eine langfristige T-Zell-
Immunität entwickeln. Unsere Ergebnisse werfen auch die Möglichkeit auf, dass lang anhaltende T-
Zellen, die nach einer Infektion mit verwandten Viren gebildet werden, in der Lage sein könnten,
vor einer Infektion mit SARS-CoV-2 zu schützen oder die dadurch verursachte Pathologie zu
modifizieren.

SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen bei nicht exponierten Spendern
Um diese Möglichkeit zu untersuchen, testeten wir N-, NSP7- und NSP13-Peptid-reaktive IFNγ-
Antworten bei 37 Spendern, die nicht mit SARS-CoV und SARS-CoV-2 exponiert waren. Die
Spender wurden entweder vor Juli 2019 entnommen (n = 26) oder waren serologisch negativ
sowohl für SARS-CoV-2 neutralisierende Antikörper als auch für SARS-CoV-2 N-Antikörper 23 (n =
11). Verschiedene Coronaviren, von denen bekannt ist, dass sie beim Menschen
Erkältungskrankheiten verursachen, wie OC43, HKU1, NL63 und 229E, weisen einen
unterschiedlichen Grad an Aminosäurehomologie mit SARS-CoV-2 auf (Erweiterte Daten Abb. 1
und 2), und neuere Daten haben das Vorhandensein von SARS-CoV-2 kreuzreaktiven CD4-T-Zellen
(hauptsächlich spezifisch für das Spike-Protein) bei Spendern gezeigt, die nicht mit SARS-CoV-2
exponiert waren14. Bemerkenswert ist, dass wir bei 19 von 37 nicht exponierten Spendern SARS-
CoV-2-spezifische IFNγ-Antworten nachweisen konnten (Abb. 4a, b). Der kumulative Anteil aller
untersuchten Personen, die auf Peptide reagierten, die das N-Protein und die ORF1-kodierten
NSP7- und NSP13-Proteine abdecken, ist in Abb. 4b dargestellt. Nicht exponierte Spender zeigten
ein ausgeprägtes Reaktivitätsmuster; während Personen, die sich von COVID-19 und SARS
erholten, bevorzugt auf N-Peptidpools reagierten (66 % der Personen, die sich von COVID-19
erholten und 91 % der Personen, die sich von SARS erholten, reagierten nur auf die N-Peptidpools),
zeigte die nicht exponierte Gruppe eine gemischte Reaktion auf das N-Protein oder auf NSP7 und
NSP13 (Abb. 4a-c). Während die NSP-Peptide außerdem nur bei 1 von 59 Personen, die COVID-19
oder SARS überwunden hatten, eine dominante Reaktion auslösten, lösten diese Peptide bei 9 von
19 nicht exponierten Spendern mit SARS-CoV-2-reaktiven Zellen eine dominante Reaktivität aus
(Abb. 4c und Extended Data Abb. 7). Diese SARS-CoV-2-reaktiven Zellen von nicht exponierten
Spendern hatten die Fähigkeit, nach Stimulation mit SARS-CoV-2-spezifischen Peptiden zu
expandieren (Abb. 4d). Als nächstes haben wir die SARS-CoV-2-spezifische Antwort, die in nicht
exponierten Spendern nachgewiesen wurde, genauer beschrieben. Die Charakterisierung der N-
spezifischen Antwort in einem Spender (H-2) identifizierte CD4-T-Zellen, die auf ein Epitop
innerhalb der Region der Aminosäuren 101-120 des N-Proteins reagierten. Dieses Epitop wurde
auch bei Patienten nachgewiesen, die sich von COVID-19 und SARS 8,22 erholt hatten (Abb. 2b).
Diese Region weist einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen des N-Proteins von MERS-
CoV, OC43 und HKU1 auf (Abb. 4e). Bei demselben Spender analysierten wir PBMCs, die zu
mehreren Zeitpunkten gesammelt worden waren, und zeigten die Persistenz der Reaktion auf die
101-120 Aminosäuren-Region des N-Proteins über ein Jahr (Erweiterte Daten, Abb. 8a). Bei drei
weiteren Spendern, die weder SARS-CoV noch SARS-CoV-2 ausgesetzt waren, identifizierten wir
CD4 T-Zellen, die spezifisch für die Region der Aminosäuren 26-40 von NSP7 sind
(SKLWAQCVQLHNDIL; Spender H-7) und CD8 T-Zellen, die spezifisch für ein Epitop sind, das
die Region der Aminosäuren 36-50 von NSP7 umfasst (HNDILLAKDTTEAFE; H-3, H-21; Abb.
4e, Erweiterte Daten Abb. 8b).
Abb. 4: Immundominanz der SARS-CoV-2-Reaktionen bei Patienten, die sich von COVID-19
und SARS erholt haben, und bei nicht exponierten Personen.
a, PBMCs von Personen, die nicht mit SARS-CoV und SARS-CoV-2 (n = 37) exponiert waren, sich von SARS (n = 23) oder
COVID-19 (n = 36) erholten, wurden mit Peptidpools, die N (N-1, N-2), NSP7 und NSP13 (NSP13-1, NSP13-2, NSP13-3) von
SARS-CoV-2 abdecken, stimuliert und mittels ELISpot analysiert. Die Häufigkeit der peptidreaktiven Zellen ist für jeden Spender
dargestellt (Punkte oder Quadrate) und die Balken stellen die mediane Häufigkeit dar. Die Quadrate bezeichnen PBMC-Proben, die
vor Juli 2019 gesammelt wurden. b, Der Prozentsatz der Personen mit N-spezifischen, NSP7- und NSP13-spezifischen Antworten
oder N-, NSP7- und NSP13-spezifischen Antworten in der Kohorte. c, Die Zusammensetzung der SARS-CoV-2-Antwort bei jedem
antwortenden, nicht exponierten Spender (n = 19) ist als Prozentsatz der gesamten nachgewiesenen Antwort dargestellt. N-1,
hellblau; N-2, dunkelblau; NSP7, orange; NSP13-1, hellrot; NSP13-2, rot; NSP13-3, dunkelrot. d, Häufigkeit von SARS-CoV-2-
reaktiven Zellen bei 11 nicht exponierten Spendern auf die angegebenen Peptidpools direkt ex vivo und nach einer 10-tägigen
Expansion. e, Eine Peptidpool-Matrixstrategie wurde für drei Personen verwendet, die nicht mit SARS-CoV und SARS-CoV-2
exponiert waren. Die identifizierten T-Zell-Epitope wurden durch ICS bestätigt, und die Sequenzen wurden an die entsprechende
Sequenz aller Coronaviren, von denen bekannt ist, dass sie den Menschen infizieren, angeglichen.

iese beiden letztgenannten T-Zell-Spezifitäten waren von besonderem Interesse, da die Homologie
zwischen den beiden Proteinregionen von SARS-CoV, SARS-CoV-2 und anderen Erkältungs-
Coronaviren (OC43, HKU1 NL63 und 229E) minimal war (Abb. 4e), insbesondere für das CD8-T-
Zell-Epitop. Tatsächlich gelang es den Peptiden mit niedriger Homologie, die die Sequenzen der
Erkältungs-Coronaviren abdeckten, nicht, PBMCs von Personen mit T-Zellen zu stimulieren, die
auf die Aminosäuren 36-50 von NSP7 reagieren (Erweiterte Daten Abb. 8c). Auch wenn wir nicht
ausschließen können, dass einige SARS-CoV-2-reaktive T-Zellen naiv sind oder durch völlig
unverwandte Erreger 5 induziert werden, deutet dieser Befund darauf hin, dass unbekannte
Coronaviren, möglicherweise tierischen Ursprungs, kreuzreaktive SARS-CoV-2-T-Zellen in der
allgemeinen Bevölkerung induzieren könnten.
Wir charakterisierten weiter die NSP7-spezifischen CD4- und CD8-T-Zellen, die bei den drei nicht
exponierten Personen vorhanden waren. Die reaktiven T-Zellen expandierten effizient in vitro und
produzierten hauptsächlich entweder sowohl IFNγ als auch TNF (CD8 T-Zellen) oder nur IFNγ
(CD4 T-Zellen) (Extended Data Abb. 9a). Wir stellten außerdem fest, dass die CD8-T-Zellen, die
spezifisch für die Aminosäuren 36-50 von NSP7 waren, HLA-B35-restringiert waren und einen
Effektor-Gedächtnis/terminal differenzierten Phänotyp (CCR7-CD45RA+/-) hatten (Erweiterte
Daten Abb. 9b, c).

Schlussfolgerungen
Es ist unklar, warum NSP7- und NSP13-spezifische T-Zellen bei nicht exponierten Spendern
nachgewiesen werden und oft dominieren, während sie bei Personen, die sich von SARS oder
COVID-19 erholt haben, eine kleinere Population darstellen. Es stimmt jedoch mit den Ergebnissen
einer früheren Studie 11 überein, in der ORF1-spezifische T-Zellen bevorzugt in einigen Spendern
nachgewiesen wurden, die nicht mit SARS-CoV-2 exponiert waren, während T-Zellen von
Personen, die sich von COVID-19 erholt hatten, bevorzugt Strukturproteine erkannten. Die
Induktion von virusspezifischen T-Zellen bei Personen, die exponiert, aber nicht infiziert waren,
wurde bei anderen Virusinfektionen nachgewiesen 24,25,26 . Theoretisch könnten Personen, die
Coronaviren ausgesetzt waren, gerade ORF1-spezifische T-Zellen auslösen, da die ORF1-kodierten
Proteine zuerst in Coronavirus-infizierten Zellen produziert werden und für die Bildung des viralen
Replikase-Transkriptase-Komplexes notwendig sind, der für die anschließende Transkription des
viralen Genoms notwendig ist, die dann zur Expression verschiedener RNA-Spezies führt 18 . Daher
könnten ORF1-spezifische T-Zellen hypothetisch die virale Produktion abbrechen, indem sie
SARS-CoV-2-infizierte Zellen lysieren, bevor reife Virionen gebildet werden. Im Gegensatz dazu
würde man bei Patienten mit COVID-19 und SARS erwarten, dass das N-Protein - das in Zellen,
die reife Virionen sezernieren, reichlich produziert wird 17 - N-spezifische T-Zellen bevorzugt
antreibt.
Bemerkenswert ist, dass die ORF1-Region Domänen enthält, die bei vielen verschiedenen
Coronaviren hoch konserviert sind 9 . Die Verteilung dieser Viren in verschiedenen Tierspezies
könnte dazu führen, dass periodischer menschlicher Kontakt ORF1-spezifische T-Zellen mit
kreuzreaktiven Fähigkeiten gegen SARS-CoV-2 induziert. Das Verständnis der Verteilung, der
Häufigkeit und der Schutzkapazität von präexistenten, mit strukturellen oder nicht-strukturellen
Proteinen assoziierten kreuzreaktiven T-Zellen gegen SARS-CoV-2 könnte wichtig für die
Erklärung einiger der Unterschiede in den Infektionsraten oder der Pathologie sein, die während
dieser Pandemie beobachtet wurden. T-Zellen, die spezifisch für virale Proteine sind, sind in
Tiermodellen von Atemwegsinfektionen schützend 27,28 , aber die möglichen Auswirkungen von
vorbestehenden N- und/oder ORF1-spezifischen T-Zellen auf die unterschiedliche Modulation der
SARS-CoV-2-Infektion müssen sorgfältig ausgewertet werden.
Methoden
Datenerfassung
Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengröße vorher zu bestimmen.
Die Experimente waren nicht randomisiert und die Untersucher waren während der Experimente
und der Ergebnisbeurteilung nicht verblindet bezüglich der Allokation.
Ethische Erklärung
Alle Spender gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der
Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom NUS Institutional Review Board (H-20-006) und
dem SingHealth Centralised Institutional Review Board (Referenz CIRB/F/2018/2387) genehmigt.
Menschliche Proben

Die Spender wurden auf der Grundlage ihrer klinischen Vorgeschichte einer SARS-CoV- oder
SARS-CoV-2-Infektion rekrutiert. Blutproben von Patienten, die sich von COVID-19 erholten (n =
36), wurden 2-28 Tage nach PCR-Negativität und von Patienten, die sich von SARS erholten (n =
23) 17 Jahre nach der Infektion gewonnen. Proben von gesunden Spendern wurden entweder vor
Juni 2019 für Studien zur T-Zell-Funktion bei viralen Erkrankungen (n = 26) oder im März-April
2020 gesammelt. Alle Proben von gesunden Spendern wurden negativ auf RBD-neutralisierende
Antikörper und negativ in einem ELISA für N-IgG (n = 11) 19 getestet.
PBMC-Isolierung
PBMCs wurden durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque isoliert. Isolierte PBMCs
wurden entweder direkt untersucht oder kryokonserviert und bis zur Verwendung in den Assays in
flüssigem Stickstoff gelagert.
Peptid-Pools
Wir synthetisierten 15-mer Peptide, die sich um 10 Aminosäuren überlappten und die gesamte
Proteinsequenz der N-, NSP7- und NSP13-Proteine von SARS-CoV-2, sowie des N-Proteins von
SARS-CoV abdeckten (GL Biochem Shanghai; siehe ergänzende Tabellen 1, 2). Zur Stimulierung
von PBMCs wurden die Peptide in 5 Pools mit ca. 40 Peptiden für N (N-1, N-2) und NSP13
(NSP13-1, NSP13-2, NSP13-3) und einen Pool mit 15 Peptiden für NSP7 aufgeteilt. Für die
Einzelpeptididentifizierung wurden die Peptide in einer Matrix aus 12 numerischen und 7
alphabetischen Pools für N und 4 numerischen und 4 alphabetischen Pools für NSP7 organisiert.
ELISpot-Assay
ELISpot-Platten (Millipore) wurden mit humanem IFNγ-Antikörper (1-D1K, Mabtech; 5 μg/ml)
über Nacht bei 4 °C beschichtet. Dann wurden 400.000 PBMCs pro Vertiefung ausgesät und für 18
h mit Pools von SARS-CoV- oder SARS-CoV-2-Peptiden (2 μg/ml) stimuliert. Für die Stimulation
mit Peptidmatrix-Pools oder Einzelpeptiden wurde eine Konzentration von 5 μg/ml verwendet.
Anschließend wurden die Platten mit humanem biotinyliertem IFNγ-Detektionsantikörper (7-B6-1,
Mabtech; 1:2.000) entwickelt, gefolgt von einer Inkubation mit Streptavidin-AP (Mabtech) und
KPL BCIP/NBT Phosphatase Substrate (SeraCare). Spot bildende Einheiten (SFU) wurden mit
ImmunoSpot quantifiziert. Zur Quantifizierung der positiven peptid-spezifischen Reaktionen
wurden die 2× mittleren Spots der nicht stimulierten Vertiefungen von den peptid-stimulierten
Vertiefungen subtrahiert und die Ergebnisse als SFU/106 PBMCs ausgedrückt. Wir schlossen die
Ergebnisse aus, wenn negative Kontrollvertiefungen >30 SFU/106 PBMCs aufwiesen oder positive
Kontrollvertiefungen (Phorbol 12-Myristat 13-Acetat/Ionomycin) negativ waren.
Durchflusszytometrie
PBMCs oder expandierte T-Zelllinien wurden für 5 h bei 37 °C mit oder ohne SARS-CoV oder
SARS-CoV-2 Peptidpools (2 μg/ml) in Gegenwart von 10 μg/ml Brefeldin A (Sigma-Aldrich)
stimuliert. Die Zellen wurden mit dem gelben LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit
(Invitrogen) und Anti-CD3 (Klon SK7; 3:50), Anti-CD4 (Klon SK3; 3:50) und Anti-CD8 (Klon
SK1; 3:50) Antikörpern gefärbt. Zur Analyse des T-Zell-Differenzierungsstatus wurden die Zellen
zusätzlich mit anti-CCR7 (Klon 150503; 1:10) und anti-CD45RA (Klon HI100; 1:10) Antikörpern
gefärbt. Die Zellen wurden anschließend mit dem Cytofix/Cytoperm-Kit (BD Biosciences-
Pharmingen) fixiert und permeabilisiert und mit Anti-IFNγ (Klon 25723, R&D Systems; 1:25) und
Anti-TNF (Klon MAb11; 1:25) Antikörpern angefärbt und auf einem BD-LSR II FACS Scan
analysiert. Die Daten wurden mit FlowJo (Tree Star) ausgewertet. Die Antikörper wurden, sofern
nicht anders angegeben, von BD Biosciences-Pharmingen bezogen.

Expandierte T-Zelllinien
T-Zelllinien wurden wie folgt generiert: 20 % der PBMCs wurden mit 10 μg/ml der überlappenden
SARS-CoV-2-Peptide (alle Pools zusammen) oder einzelner Peptide für 1 h bei 37 °C gepulst,
gewaschen und mit den restlichen Zellen in AIM-V-Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific),
ergänzt mit 2 % AB-Humanserum (Gibco; Thermo Fisher Scientific), kokultiviert. Die T-Zelllinien
wurden für 10 Tage in Gegenwart von 20 U/ml rekombinantem IL-2 (R&D Systems) kultiviert.
HLA-Restriktions-Assay
Der HLA-Typ des gesunden Spenders H-3 wurde bestimmt und verschiedene Epstein-Barr-Virus
(EBV)-transformierte B-Zelllinien mit jeweils einem gemeinsamen Allel wurden für die
Präsentation des Peptids NSP7(36-50) ausgewählt (siehe unten). B-Zellen wurden mit 10 μg/ml des
Peptids für 1 h bei 37 °C gepulst, dreimal gewaschen und mit der expandierten T-Zell-Linie in
einem Verhältnis von 1:1 in Gegenwart von 10 μg/ml Brefeldin A (Sigma-Aldrich) kokultiviert.
Nicht gepulste B-Zelllinien dienten als Negativkontrolle für den Nachweis möglicher allogener
Reaktionen und autologe, peptidgepulste Zellen als Positivkontrolle. Der HLA Klasse I Haplotyp
der verschiedenen B-Zelllinien: CM780, A*24:02, A*33:03, B*58:01, B*55:02, Cw*07:02,
Cw*03:02; WGP48, A*02:07, A*11:01, B*15:25, B*46:01, Cw*01:02, Cw*04: 03; NP378,
A*11:01, A*33:03, B*51:51, B*35:03, Cw*07:02, Cw*14:02; NgaBH, A*02:01, A*33:03,
B*58:01, B*13:01, Cw*03:02.
Sequenz-Alignment
Referenzproteinsequenzen für ORF1ab (Hinterlegungsnummern: QHD43415.1, NP_828849.2,
YP_009047202.1, YP_009555238.1, YP_173236.1, YP_003766.2 und NP_073549.1) und das N-
Protein (Hinterlegungsnummern: YP_009724397.2, AAP33707.1, YP_009047211.1,
YP_009555245.1, YP_173242.1, YP_003771.1 und NP_073556.1) wurden von der NCBI-
Datenbank heruntergeladen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/). Die Sequenzen wurden mit
dem MUSCLE-Algorithmus mit Standardparametern aligniert und die prozentuale Identität wurde
in Geneious Prime 2020.1.2 (https://www.geneious.com) berechnet. Die Alignment-Zahlen wurden
in Snapgene 5.1 (GSL Biotech) erstellt.
Surrogat-Virus-Neutralisierungs-Assay
Es wurde ein Surrogat-Virus-Neutralisationstest verwendet. Dieser Test misst die Menge an Anti-
Spike-Antikörpern, die die Protein-Protein-Interaktionen zwischen der rezeptorbindenden Domäne
des Spike-Proteins und dem humanen ACE2-Rezeptor blockieren, unter Verwendung eines ELISAbasierten
Assays 29 .
Statistische Analysen
Alle statistischen Analysen wurden in Prism (GraphPad Software) durchgeführt; Details sind in den
Abbildungslegenden angegeben.
Zusammenfassung der Ergebnisse
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting
Summary, die mit dieser Arbeit verlinkt ist.

Verfügbarkeit der Daten
Referenzproteinsequenzen für ORF1ab (Hinterlegungsnummern: QHD43415.1, NP_828849.2,
YP_009047202.1, YP_009555238.1, YP_173236.1, YP_003766.2 und NP_073549.1) und das N-
Protein (Hinterlegungsnummern: YP_009724397.2, AAP33707.1, YP_009047211.1,
YP_009555245.1, YP_173242.1, YP_003771.1 und NP_073556.1) wurden von der NCBI-
Datenbank heruntergeladen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/). Alle Daten sind im Artikel
oder in den ergänzenden Informationen verfügbar. Die Quelldaten werden mit diesem Artikel
bereitgestellt.
Referenzen
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Danksagung
Wir danken M. K. Maini und S. Vasudevan für das kritische Lesen und Bearbeiten des Manuskripts.
Finanzielle Unterstützung wurde durch einen speziellen NUHS COVID-19 Seed Grant Call, Projekt
NUHSRO/2020/052/RO5+5/NUHS-COVID/6 (WBS R-571-000-077-733) gewährt.
Informationen zum Autor
Anmerkungen der Autoren
Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nina Le Bert, Anthony T. Tan
Zugehörigkeiten
Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Medical School, Singapur, Singapur
Nina Le Bert, Anthony T. Tan, Kamini Kunasegaran, Christine Y. L. Tham, Morteza Hafezi,
Adeline Chia, Melissa Hui Yen Chng, Meiyin Lin, Nicole Tan, Martin Linster, Wan Ni Chia, Lin-Fa
Wang, Eng Eong Ooi, Jenny Guek-Hong Low & Antonio Bertoletti
Institut für Molekular- und Zellbiologie (IMCB), A*STAR, Singapur, Singapur
Meiyin Lin & Yee-Joo Tan
Nationales Zentrum für Infektionskrankheiten, Singapur, Singapur
Mark I-Cheng Chen
Abteilung für Infektionskrankheiten, Singapore General Hospital, Singapur, Singapur
Shirin Kalimuddin & Jenny Guek-Hong Low
Abteilung für Medizin, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
Singapur, Singapur
Paul Anantharajah Tambyah
Abteilung für Infektionskrankheiten, University Medicine Cluster, National University Hospital,
Singapur, Singapur
Paul Anantharajah Tambyah
Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Yong Loo Lin School of Medicine, National
University of Singapore, Singapur, Singapur
Yee-Joo Tan
Singapur Immunologie Netzwerk, A*STAR, Singapur, Singapur
Antonio Bertoletti
Beiträge

N.L.B. und A.T.T. planten alle Experimente und analysierten alle Daten, erstellten die Abbildungen
und redigierten die Arbeit; K.K., C.Y.L.T., M.H., A.C., M.L. und N.T. führten ELISpots und
intrazelluläre Zytokinfärbungen durch und generierten Kurzzeit-T-Zelllinien; M.H.Y.C. und M.L.
führten virale Sequenzhomologie durch und analysierten Daten; W.N.C. und L.- F.W. führten
Antikörpertests durch; M.I-C.C., E.E.O., S.K., P.A.T., J.G.-H.L. und Y.-J.T. wählten die Patienten
aus, rekrutierten sie und analysierten die klinischen Daten; Y.-J.T. stellte die Finanzierung zur
Verfügung und konzipierte die Studie; AB konzipierte und koordinierte die Studie, stellte die
Finanzierung zur Verfügung, analysierte die Daten und schrieb die Arbeit.
Korrespondierender Autor
Korrespondenz mit Antonio Bertoletti.
Ethische Erklärungen
Konkurrierende Interessen
A.B. ist Mitbegründer von Lion TCR, einem Biotechnologie-Unternehmen, das T-Zell-Rezeptoren
für die Behandlung von virusbedingten Krankheiten und Krebs entwickelt. Alle anderen Autoren
haben keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit der Studie.
Zusätzliche Informationen
Informationen zur Begutachtung Nature dankt Petter Brodin, Stanley Perlman und dem/den
anderen, anonymen, Gutachter(n) für ihren Beitrag zur Begutachtung dieser Arbeit. Die Berichte
der Peer-Reviewer sind verfügbar.
Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt neutral in Bezug auf juristische Ansprüche in
veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.
Erweiterte Daten Abbildungen und Tabellen
Erweiterte Daten Abb. 1 Sequenzalignment des N-Proteins aus allen Typen von humanen
Coronaviren.
Die Aminosäuresequenzen für das N-Protein wurden von der NCBI-Datenbank heruntergeladen und
mit dem MUSCLE-Algorithmus ausgerichtet. Konservierte Reste sind gelb hervorgehoben und der
Grad der Konservierung ist durch die farbigen Balken oben angegeben.
Erweiterte Daten Abb. 2 Sequenzalignment der ORF1-kodierten Nicht-Strukturproteine NSP7 und
NSP13 aus allen Typen von humanen Coronaviren.
Die Proteinsequenzen für ORF1ab wurden von der NCBI-Datenbank heruntergeladen und mit dem
MUSCLE-Algorithmus ausgerichtet. Das Alignment für NSP7 und NSP13 ist dargestellt.
Erweiterte Daten Abb. 3 Durchflusszytometrische Gating-Strategie.
a, Dichteplot der Vorwärtsstreuungsfläche (FSC-A) gegen die Vorwärtsstreuungshöhe (FSC-H) zum
Ausschluss von Doubletten. b, Dichteplots der Vorwärts- und Seitenstreuung (SSC-A) zur
Identifizierung der Lymphozytenpopulation. c, Lebende T-Zellen wurden basierend auf der CD3-
Expression und einem Farbstoff zur Lebend/Tot-Diskriminierung gated. d, e, Nur einzeln
exprimierende CD8- und CD4-T-Zellen wurden boolesch gated (d) und für die IFNγ- und/oder
TNF-Analyse verwendet (e).
Erweiterte Daten Abb. 4 IFNγ- und TNF-Produktionsprofil von SARS-CoV-2-spezifischen T-Zellen
von Patienten, die sich von COVID-19 erholt haben.

PBMCs von Patienten, die sich von COVID-19 erholt haben (n = 7), wurden mit den N-
bedeckenden Peptidpools (NP-1, NP-2) für 5 h stimuliert und durch intrazelluläre Zytokinfärbung
auf IFNγ und TNF analysiert. Dot Plots zeigen Beispiele von Patienten mit CD8 (oben) oder CD4
(unten) T-Zellen, die IFNγ und/oder TNF als Reaktion auf die Stimulation mit N-1 oder N-2
Peptidpools produzierten. Die Balken zeigen die jeweiligen Einzel- und Doppel-Zytokinproduzierenden
T-Zellen als Anteil an der gesamten nachgewiesenen Reaktion nach Stimulation mit
den entsprechenden N-Peptid-Pools bei jedem Patienten, der sich von COVID-19 erholt hat.
Erweiterte Daten Abb. 5 Korrelationsanalyse der SARS-CoV-2-spezifischen IFNγ-Antworten mit
dem Vorhandensein von virusneutralisierenden Antikörpern, der Dauer der Infektion und dem
Schweregrad der Erkrankung.
a, b, Das Ausmaß der SARS-CoV-2-spezifischen Reaktionen, quantifiziert mittels IFNγ-ELISpot,
gegen alle (N, NSP7 und NSP13) getesteten SARS-CoV-2-Proteine (links), N (Mitte) oder NSP7
und NSP13 (rechts) wurde mit der Menge an virusneutralisierenden Antikörpern korreliert, die mit
einem Surrogat-Virusneutralisationstest bestimmt wurden (a; n = 28) und der Dauer der SARS-
CoV-2-PCR-Positivität (b; n = 34). Die jeweiligen P-Werte (two-tailed) und
Korrelationskoeffizienten (Spearman-Korrelation) sind angegeben. Patienten mit leichter (grau),
mittelschwerer (orange) oder schwerer (rot) Erkrankung sind angegeben. c, Ausmaß der SARS-
CoV-2-spezifischen Reaktionen stratifiziert nach leichter (n = 26), mittelschwerer (n = 5) und
schwerer (n = 5) Erkrankung. Die Balken stellen die mittlere Größe der Reaktion dar. Leichte
Erkrankung, mit oder ohne Veränderungen im Röntgenbild des Brustkorbs, die keine
Sauerstoffergänzung erfordert. Mäßige Erkrankung, Sauerstoffsupplementierung weniger als 50%.
Schwere Erkrankung, Sauerstoffsupplementierung 50% oder mehr oder High-Flow-Sauerstoff oder
Intubation.
Erweiterte Daten Abb. 6 Analyse der SARS-CoV N-Antwort.
PBMCs des Patienten S-20 wurden für 10 Tage expandiert und die Häufigkeit von T-Zellen, die
spezifisch für den N-1-Peptidpool sind, wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung für IFNγ und
TNF analysiert. Dot-Plots zeigen CD8- und CD4-T-Zellen, die IFNγ und/oder TNF als Reaktion auf
die Stimulation mit dem N-1-Peptidpool produzierten.
Erweiterte Daten Abb. 7 Dominanz der SARS-CoV-2 N-, NSP7- und NSP13-Antworten bei
Spendern, die sich von COVID-19 oder SARS erholt haben, sowie bei nicht exponierten Personen.
PBMCs der jeweiligen Personen wurden mit SARS-CoV-2-Peptidpools stimuliert, wie in Abb. 1
beschrieben. Die Zusammensetzung der SARS-CoV-2-Antwort ist als Prozentsatz der gesamten
nachgewiesenen Antwort in jeder Gruppe dargestellt. N-1, hellblau; N-2, dunkelblau; NSP7,
orange; NSP13-1, hellrot; NSP13-2, rot; NSP13-3, dunkelrot. Der Anteil der Personen mit NSPdominanten
Reaktionen ist in den Kreisdiagrammen dargestellt.
Erweiterte Daten Abb. 8 Identifizierung von SARS-CoV-2-Epitopen bei Spendern, die nicht mit
SARS-CoV und SARS-CoV-2 exponiert waren.
a, Longitudinalanalyse der SARS-CoV-2 N(101-120)-Reaktion in einzelnen H-2. PBMCs, die zu
den angegebenen Zeitpunkten gesammelt wurden, wurden mit Peptiden, die die Aminosäuren 101-
120 des N-Proteins umfassen, stimuliert und mittels IFNγ-ELISpot untersucht. Die Häufigkeiten
von IFNγ SFU sind dargestellt. b, PBMCs wurden mit den einzelnen Peptiden, die durch die
Peptidmatrix identifiziert wurden, parallel zu den benachbarten Peptiden stimuliert und mit IFNγ
ELISpot getestet. Links sind die Aminosäurereste dargestellt, rechts die Häufigkeit von IFNγ SFU.
Aktivierende Peptide sind in rot und benachbarte Peptide in schwarz dargestellt. c, PBMCs von

Individuen H-3 und H-21 wurden mit dem NSP7-Peptid stimuliert, das die Aminosäuren 36-50 von
SARS-CoV-2, MERS-CoV, OC43, HKU1, NL63 und 229E umfasst, und ex vivo mittels IFNγ
ELISpot analysiert. Eine aus dem Individuum H-3 expandierte NSP7(36-50)-T-Zelllinie wurde
ebenfalls mit den entsprechenden Peptiden anderer Coronaviren mittels IFNγ-ELISpot getestet. Die
Aminosäuresequenzen der verschiedenen Peptide sind in der Tabelle dargestellt. Konservierte
Aminosäuren sind gelb hervorgehoben. Quelldaten
Erweiterte Daten Abb. 9 Charakterisierung von SARS-CoV-2 NSP7-spezifischen T-Zell-Antworten
bei drei Personen, die nicht mit SARS-CoV und SARS-CoV-2 exponiert waren.
a, Dot-Plots zeigen die Häufigkeit von IFNγ- und/oder TNF-produzierenden CD8- oder CD4-T-
Zellen, die spezifisch für die SARS-CoV-2-Peptide sind, direkt ex vivo und nach einer 10-tägigen
Expansion bei drei nicht exponierten Spendern. b, Der HLA-Klasse-I-Haplotyp des Individuums H-
3 ist in der Tabelle dargestellt. Die HLA-Restriktion der NSP7(36-50)-spezifischen T-Zellen dieses
Individuums wurde durch Co-Kultivierung der T-Zellen mit NSP7(36-50)-Peptid-gepulsten EBVtransformierten
B-Zelllinien abgeleitet, die das angegebene HLA-Klasse-I-Molekül (+) teilen. Die
Aktivierung der NSP7(36-50)-spezifischen T-Zellen durch autologe Zellen wurde durch die direkte
Zugabe des Peptids erreicht und als Positivkontrolle verwendet. c, Der Gedächtnisphänotyp der
NSP7(36-50)-spezifischen CD8-T-Zellen der Individuen H-3 und H-21 wurde ex vivo analysiert
und in den Punktdiagrammen dargestellt. Die Häufigkeiten von naiven, Effektor-Gedächtnis-,
zentralen Gedächtnis- und terminal differenzierten NSP7(36-50)-spezifischen CD8-T-Zellen (rot)
sind dargestellt und die Dichteplots wurden mit den gesamten CD8-T-Zellen (grau) überlagert.
Originalartikel: https://www.nature.com/articles/s41586-020-2550-z
Der Artikel wurde mit Hilfe von deepL ins Deutsche übersetzt.