(bedürftig f. Wuchsfaktoren) Klassifizierung von Punkt-Mutationen

Einführungskurs Genetik (SS 06)
Mutagenese (09.08.2006)
Prof. Friederike Eckardt-Schupp
GSF-Institut für Strahlenbiologie,
Ingolstädter Landstr. 1, 85758 Neuherberg.
Tel. 089 3187 4101; Fax 089 3187 3381, email Eckardt-Schupp@gsf.de

Grundkurs Genetik: Mutagenese und Reparatur I (09./10.08.2006)
Literatur
Genetik
J. Graw, Genetik (4. Aufl.), Springer Verlag 2006
W. Hennig, Genetik (3. Aufl.), Springer Verlag 2002
W. Janning, E. Knust, Genetik, Thieme Verlag 2004
R. Knippers, Molekulare Genetik (9. Auflage), Thieme Verlag 2006
Reparatur
E.C. Friedberg et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press 2006

Definition und Bedeutung von Mutationen
� spontane oder induzierte (durch genotoxische Substanzen
verursachte) erbliche Änderungen der genetischen Information
einer Zelle
Mutation = erbliche Änderung der DNA-Sequenz
� in Pro- und Eukaryonten (in Keim- und somatischen Zellen)
� Ursache der Variabilität von Merkmalen.
Diese Variabilität ist die Voraussetzung für die Erkenntnisse der
Regeln und Mechanismen der Vererbung.
Mutationen sind die wichtigste Grundlage der Genetik!

Klassifizierung von Mutationen
Genom-Mutationen (Defekte im Spindelapparat-System)
• Polyploidie (Vervielfachung der Chromosomensätze)
• Aneuploidie (Änderung der Zahl einzelner Chromosomen, z.B. Monooder
Trisomie)
Chromosomen-Mutationen (durch DNA Brüche und -Rekombination)
• reziproke/nicht reziproke Austausche (Translokationen)
• Deletionen, Insertionen, Inversionen
• Chromatid-Austausche (z.B. SCE‘s = Sister Chromatid-Exchange)
Punkt-Mutationen (ein bis mehrere 1000 BP)
• Basenpaar-Substitutionen (BPS)
• Deletionen oder Insertionen („Rasterschub“, frame shift)

Klassifizierung von Punkt-Mutationen Punkt Mutationen (I)
1. nach Ursprung: spontan (DNA Zerfall; reaktiver Sauerstoff; Replikation)
induziert (genotoxische Agenzien)
2. nach Expression : dominant
(bei Diploidie) rezessiv/intermediär (Bsp.: Blütenfärbung)
3. nach Wachstumsverhalten: prototroph (Synthese essentieller Wuchsfaktoren)
auxotroph (bedürftig f. Wuchsfaktoren)
4. nach Funktion: Vorwärts-Mutation [Wildtype (WT) Mutante (M)]
„gain of function“ Streptomycin-sensibel Streptomycin-resistent
„ loss of function“ Wuchsfaktor-Synthese Wuchsfaktor-Syn.defekt
Rück-Mutation [Mutante Wildtyp]

Klassifizierung von Punkt-Mutationen Punkt Mutationen (II)
5. nach Typ der Sequenzveränderung:
Transversion (TV) Transition (TI)
TI
[siehe Graw, S. 373]
TV

Klassifizierung von Punkt-Mutationen Punkt Mutationen (III)
6. nach Typ der Sequenzveränderung und phänotypischer Auswirkung:
Basenpaar-Substitution (BPS)
[Knippers, Abb. 9-2]
stille Mutation
(BPS ohne Einfluss auf Code)
neutrale Mutation
(gleichwertige Aminosäure)
Missense-Mutation
(Einfluss auf Proteinkonfiguration:
konditional-letale Mutanten
temperatur-sensitiv, osmo-sensitiv)
Nonsense-Mutation (Stop-Codone UAG,
UAA, UGA)
(Proteinfragment)

Klassifizierung von Punkt-Mutationen Punkt Mutationen (IV)
6. nach Typ der Sequenzveränderung und phänotypischer Auswirkung:
Leseraster-Mutationen; frame shift (FS)
[Knippers, Abb. 9-3]
Leseraster-Mutationen
(Addition oder Deletion eines oder
mehrerer Basenpaare führt i.A. zu
defekten Proteinen;
durch Entstehung von Stop-
Codons: verkürzte Proteine)
Reversion von Leseraster-Mutationen

Klassifizierung von Punkt-Mutationen Punkt Mutationen (IV)
6. nach Typ der Sequenzveränderung und phänotypischer Auswirkung:
Leseraster-Mutationen; frame shift (FS)
[Knippers, Abb. 9-3]
Leseraster-Mutationen
(Addition oder Deletion eines oder
mehrerer Basenpaare führt i.A. zu
defekten Proteinen;
durch Entstehung von Stop-
Codons: verkürzte Proteine)
Reversion von Leseraster-Mutationen

Spontane Mutagenese
Molekulare Mechanismen der spontanen Mutagenese:
1. Spontaner Zerfall der DNA unter physiologischen
Bedingungen
2. Endogene Mutagene:
- reaktive Sauerstoff-Radikale (ROS)
- S-Adenosylmethionin („aktives Methyl“; SAM)
3. Fehler bei der Replikation
- ungewöhnliche Basenpaarungen („wobble“)
- Replikation von geschädigten oder fehlenden Basen
- Einbau von Nukleotiden mit geschädigten Basen

(1) Spontaner Zerfall der DNA (37 oC, , Reaktion mit Wasser und Sauerstoff)
Hydrolyse der
N-glykosidischen Bindung:
Bildung von "AP sites"
Deaminierung:
Cytosin � Uracil
5 Methyl-Cytosine � Thymine
Oxidative DNA Schäden
~ 100 Typen der Basen
und Zuckerschäden;
Nicht-enzymatische
Methylierung (SAM)
(T. Lindahl, Nature 362, 1993)

(2) ROS (Reactive ( Reactive Oxygen Species) Species
Nicht vermeidbare Konsequenz des Lebens in einer
Sauerstoff-reichen Atmosphere: „oxidativer Stress“.
Reaktive Sauerstoff-Radikale (ROS) werden als
Intermediate während der Atmung erzeugt:
O2 •O2 H2O2 •OH H2O Zahlreiche exogene Agenzien produzieren ROS:
Ionisierende Strahlung (indirekte Wirkung: •H, •OH Radikale)
UV-Licht (Photosensibilisierung)
Zahlreiche Chemikalien
Nanopartikel (ultrafeine Stäube)

8-OxodGuanin
(2) ROS (Reactive ( Reactive Oxygen Species)
Species
Wichtigster oxidativer DNA Schaden:
8-OxodGuanin
8-OxodG(syn) paart besser mit dA (anti) als mit dC(anti) und ist darum
sehr mutagen, da die falsche Paarung nicht leicht erkannt wird.

(3) Fehler und Fehlerkontrolle bei Replikation
• Korrekte Konzentrationen von Nukleotiden in der Zelle („precursor pools“)
abnormal niedrige/hohe Konzentrationen eines einzelnen Nukleotids sind mutagen!
• Komplementäre Basenpaarungen
Über Wasserstoffbrücken: Fehlerrate dabei ca. 10 -3 bis 10 -4
• „Induced Fit“ von Polymerase und DNA
aktives Zentrum der Polymerase passt sich korrektem Basenpaar an.
Kontext, d.h. benachbarte Nukleotide, beeinflussen Genauigkeit
Fehlerrate danach ca. 10 -5 bis 10 -6
• „Proofreading“ der Polymerase
bei falsch gepaartem Ende eines Stranges wird letztes Nukleotid entfernt
durch 3‘-5‘ Exonuklease-Aktivität der Polymerase
Fehlerrate dadurch nochmals um Faktor 10 2 -10 3 niedriger
• Mismatch-Reparatur
bringt Fehlerrate auf 10 -9 bis 10 -10 Fehler pro repliziertem Basenpaar.
Das entspricht der „spontanen Mutationsrate“

(3) Ungewöhnliche Ungew hnliche Basenpaarungen: Hoogsteen-Paarung
Hoogsteen Paarung
Ungewöhnliche, sog. Hoogsteen-Basenpaarungen zwischen Matrizenstrang und
der Base des hereinkommenden Nukleotids („Wobble-Paarung“) werden im
aktiven Zentrum der Polymerase erkannt („geometric selection“) und meistens entfernt.
[siehe Knippers, Kap. 9]
Standard-Paarungen
T = A; C G
Hoogsteen-Paarungen
C = A; T = G; G = A
Kristallisations-Modell einer Polymerase
(PolA-Typ) mit „beweglichen Fingern“
für Selektion der passenden Base
[siehe Friedberg, S. 86 ff.]

Häufigste Alkylierungs-Produkte
der DNA
[Hennig Abb. 30-5, S. 696]
Induzierte Mutagenese:
Mutagenese:
DNA-Alkylierung
DNA Alkylierung
Alkylantien:
S-Adenosylmethionin (SAM; endogen)
MNNG, MMS, MNU, ENU, etc.
O6-MeG kann mit T paaren und
ist somit hoch mutagen
O4-MeT kann mit G paaren und
ist somit hoch mutagen
N7-MeG (70-80 %) führt zu AP-
Stellen, korrekt reparierbar durch
Basen-Excisionsreparatur (BER);
ähnlich: N3-MeAdenin (6-10 %)

Mutagenese - Zusammenfassung
1. Mutationen sind erbliche Änderung der Basensequenz der DNA
2. Punkt-Mutationen:
Basenpaar-Substitutionen und Rasterschub-Mutationen
3. Spontane Mutationen entstehen durch
- spontanen Zerfall der DNA
- endogene Mutagene (ROS, SAM)
- nicht behobene Fehler bei der Replikation
(z.B. durch ungewöhnliche Basenpaarungen)
4. Induzierte Mutationen entstehen durch Fehler bei der Replikation
der durch Mutagene modifizierten Basen („geschädigte Basen“)

Versuch 2: Spontane Streptomycin-Resistenz Streptomycin Resistenz in Bakterien (I)
„gain of function mutation“: Streptomycin-sensibel Streptomycin-resistent
Streptomycin (Trisaccherid)
= Aminoglycosid Antibiotikum
Antibakterielle Wirkung:
Streptomycin lagert sich irrevesibel an die 30S
(kleine) Untereinheit der Ribosomen an:
- Hemmung der Initierung der Translation,
- Fehlablesungen der mRNA
- Verlangsamung der Translation.
Es entstehen Proteine mit falschen Aminosäuren
und verkürzte Proteine, sowie Zusammenbruch der
Polysomen und Akkumulation von Streptomycingebundenen
Monosomen treten ein.
„Nonsense“ Proteine:
katalytisch inaktive Enzyme,
ungeeignete Strukturproteine.
Permeabilitätsstörung, Veränderung
der Zellatmung, Tod der Bakterienzelle

Versuch 2: Spontane Streptomycin-Resistenz Streptomycin Resistenz in Bakterien (II)
Streptomycin (Trisaccherid)
= Aminoglycosid Antibiotikum
Resistenz-Mechanismen:
� Mutation des Gens für 30S ribosomales Protein
verhindert Bindung von Streptomycin.
� Inhibierung des Transports von Streptomycin
durch Membran
� Plasmidvermittelte Resistenz:
sog. R-Faktoren (Plasmide) tragen Gene für
Enzyme, die Streptomycin modifizieren, z.B.:
- Acetylierung der primären Aminogruppen;
- Phosphorylierung/Adenylierung der
Hydroxylgruppen
Streptomycin-resistente Bakterien bilden auf Medien mit Streptomycin Kolonien.
Die Mutanten können somit aus großen Populationen selektiv isoliert werden.

Versuch 2: Polygenie – Genetik quantitativer Merkmale
Additive Polygenie
Beispiel:
Das Merkmal ist durch zwei Gene
bestimmt, deren dominante Allele
einen additiven Beitrag zum
Phänotyp liefern.
In der F2 erfolgt eine
Aufspaltung in 5 verschiedene
Phänotypen,
die sich quantitativ in
der Ausprägung des
Merkmals unterscheiden.
F2
P
F1
AABB
resistent
X
aabb
sensibel
AaBb
intermediär resistent
1/16 4/16 6/16 4/16 1/16
1 x AABB 2 x AABb
2 x AaBB
Resistenz
Polygenie ist der Regelfall für viele Merkmale
[siehe Graw, S. 455 ff]
4 x AaBb
1 x AAbb
1 x aaBB
2 x Aabb
2 x aaBb
1 x aabb

Versuch 3: Auxotrophe Mutanten in E. coli (I)
Prototrophie:
Viele Mikroorganismen brauchen außer einer Energiequelle (Glukose) keine
organischen, sondern nur anorganische Komponenten im Medium
Minimalmedium.
Sie besitzen die genetischen Informationen zur Synthese aller Aminosäuren,
Nukleinsäurebausteine, Vitamine etc. – sie sind „prototroph“
Auxotrophie:
Verliert ein Bakterium infolge einer Mutation die Fähigkeit, eine der o.g.
Komponenten zu synthetisieren, kann sie nur wachsen = Kolonien bilden, wenn
im Medium diese Substanz zugeführt wird.
auxotrophe Mutanten brauchen komplementiertes Minimalmedium
Auxotrophe Mutanten bilden nur auf komplementierten Medien Kolonien.
Sie können somit aus großen Populationen nicht selektiv isoliert werden.

Versuch 3: Auxotrophe Mutanten in E. coli (II)
Stempeltechnik von Lederberg
zur nicht-selektiven Identifizierung auxotropher Mutanten
(Minimal-Medium)
Histidin-auxotroph Tryptophan-auxotroph
Mangel – Medien
Rück-Mutanten/Reversionen zum Wildtyp hingegen können aus großen
Populationen selektiv auf Mangelmedien isoliert werden.

Versuch 3: Chemische Mutagenese - DNA-Alkylierung
DNA Alkylierung (I)
MNNG
CH 3
Alkylierende Chemikalien sind wichtige Mutagene, die direkt oder nach
Metabolisierung zu einer Methylierung (-CH 3 ) oder Ethylierung (-CH 2 -CH 3 )
verschiedener Positionen (C2; -N; =O) von Nukleotiden führen können.
Mutagene Wirkung durch
- Fehlpaarung der alkylierten Basen
- Entstehung von AP-Stellen und deren Replikation
(Knippers Kap. 9; Graw Kap. 10)