DNA Reparatur

Einführungskurs Genetik (SS 2006)
DNA Reparatur (10.08.2006)
Prof. Friederike Eckardt-Schupp
GSF-Institut für Strahlenbiologie,
Ingolstädter Landstr. 1, 85758 Neuherberg.
Tel. 089 3187 4101; Fax 089 3187 3381, email Eckardt-Schupp@gsf.de

Grundkurs Genetik: Mutagenese und Reparatur (09./10.08.2006)
Literatur
Genetik
J. Graw, Genetik (4. Aufl.), Springer Verlag 2006
W. Hennig, Genetik (3. Aufl.), Springer Verlag 2002
W. Janning, E. Knust, Genetik, Thieme Verlag 2004
R. Knippers, Molekulare Genetik (9. Auflage), Thieme Verlag 2006
Reparatur
E.C. Friedberg et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press 2006

Biologische Bewahrung der genomischen Stabilität Stabilit
Die Stabilität des Erbmaterials DNA
ist ein biologisches Phänomen
DNA
STABIL INSTABIL
Mechanismen der
Reparatur and des Schutzes

Biochemische Prozesse des Schutzes and der Reparatur
Koordinierte biochemische Netzwerke, die die strukturelle
und funktionelle Integrität der DNA bewahren:
• Mechanismen der Detoxifizierung (z.B. Antioxidantien)
• Kontrollmechanismen bei DNA Replikation und Zellteilung
• DNA Reparatur- und Schadens-Toleranz-Mechanismen

Übersicht: bersicht: DNA Schäden Sch den und ihre Reparaturwege
Basen- / Zuckerschäden;
AP Stellen; Mismatche:
BER (Base-Exzisions-Reparatur)
MMR (Mismatch Reparatur)
_ C _
T
O=G
Einzelstrang-Brüche (SSB):
Ligation
BER (Basen-Exzisions-Reparatur)
Dimere, Addukte, Intrastrang-Crosslinks:
NER (Nukleotid-Exzision-Reparatur)
TLS (Transläsions-Synthese)
T=T
Interstrang-Crosslinks (ILC):
NER (Nukleotid-Exzisions-Reparatur)
HR (Homologe Rekombination)
-G-G-
Doppelstrang Brüche (DSB)/gaps:
HR (Homologe Rekombination)
SSA (Single Strand Annealing)
NHEJ (Non-homologous end joining)

Basenschäden durch Alkylantien
Basen-Sch
Basen Schäden den
8-OxodGuanin
AP-Stellen
Oxidativer Basenschaden
durch ROS

„Short Patch BER“
AP-Lyase (3’)
OH
P
P
Basen-Exzisions
Basen Exzisions-Reparatur Reparatur (BER)
3’Phosphodiesterase
Ligation
DNA Synthese
DNA Glykosylasen,
spontane AP-Stellen
„Long Patch BER“
DNA Synthese
AP-Endonuklease (5’)
OH
OH
P
5’Deoxyribophosphodiesterase
(dRpase)
Flap Endonuklease
Ligation

Mutagener Bereich
Das Spektrum elektromagnetischer Strahlung
UV-Anteile des Sonnenlichtes:
UV-A 320 – 400 nm
UV-B 280 – 320 nm
--------------------------
UV-C 100 – 280 nm
Gamma-/Röntgenstrahlung

UV-induzierte
UV induzierte DNA-Sch DNA Schäden den
UV-C Strahlung wird vorwiegend absorbiert von Pyrimidinen:
es entstehen Pyrimidin Dimere (und andere Pyrimidinschäden).
(UV-C wird von der Ozonschicht total absorbiert)
UV-B Strahlung wird vorwiegend absorbiert von Pyrimidinen:
es entstehen Pyrimidin Dimere und andere Pyrimidin
schäden (geringer Anteil von UV-B wird von der Ozonschicht
nicht absorbiert und ist Teil des Sonnenlichtes)
UV-A Strahlung hat nicht genügend Energie zur Erzeugung
von Pyrimidin Dimeren; UV-A wird absorbiert von
Photosensibilisatoren, die die Energie auf DNA übertragen
+ indirekte Wirkung durch Sauerstoffradikale (radical oxygen
species = ROS), die Brüche und Basenschäden verursachen
Energie

UV-B UV B und UV-C UV C induzierte Pyrimidindimere
Cyclobutan-Pyrimidin Dimer (CPD)
(syn Konformation)
UV
Thymin
Thymin
Pyrimidin 6-4 Pyrimidon Dimer
(6-4 Photoprodukt = 6-4PP)

Cyclobutan-Pyrimidin Dimer (CPD)
(syn)
5‘ T T 3‘
>
C T
>
T C
>
C C
Pyrimidindimere
6-4 Photoprodukt (6-4PP)
5‘ T T 3‘
T C
C C
Nie C T
Im Gegensatz zu den Basenschäden sind Dimere „bulky lesions“, die die helikale Konfiguration
der DNA stören: „kinking“, partielle Entwindung, reduzierte Fähigkeit zur Basenpaarung

S(x)
Dosis-Effekt
Dosis Effekt-Kurven Kurven zur Analyse der Strahlenwirkung
Überlebensrate [S(x) = N (x) /N(o)]
Strahlenresistenter
Wildtyp (WT)
„Schulterkurve“
Strahlensensible
Mutanten
Dosis (X)
Dosis-Effekt-Kurven
und
strahlensensible Mutanten
sind wichtige Werkzeuge
zur Untersuchung von
DNA-Reparatur:
- Photoreaktivierung
- „Dunkelreparatur“
Zur Dunkelreparatur gehören
- Nukleotid-Exzisions-Reparatur
- Transläsionssynthese
- Postreplikations-Reparatur

Photoreaktivierung (PhR ( PhR)
Direkte Reversion der UV-Dimere (CPD, 6,4-PP) durch
Photolyase:
Benötigte Energie wird durch Chromophore (MTHF;
FADH) geliefert, die Licht der Wellenlängen 300-500nm
absorbieren
FADH- 1,5 Dihydroflavin-Adenin Dinukleotid (Folat-Derivat)
5,10-MTFH 5,10-MethenylTetrahydrofolyl-Polyglutamat (Pterin-Derivat)
Photoreaktivierung erhöht Überlebenswahrscheinlichkeit

Photolyase
A. Mees, …….T. Carell, L.O. Esser (2004) Science 306, 1789-1793

„Dunkelreparatur
Dunkelreparatur“ (dark dark reactivation)
reactivation
Radiation Research 21, 1964 „Cut and patch“ Modell

Reparaturwege für f r Pyrimidindimere (CPD, 6,4-PP) 6,4 PP)
Photoreaktivierung Exzisionsreparatur
Ausschließlich für Pyrimidin-Dimere!
Umkehrreaktion der Bildung
Für sehr viele „bulky lesions“ und
crosslinks! Meist fehlerfrei.

Nukleotid-Excisions
Nukleotid Excisions-Reparatur Reparatur (NER) bei E. coli
(Knippers, Abb.9.24, Tab. 9.5, S. 276)

Transläsions
Transl sions-Synthese Synthese (TLS) bei E. coli
Was passiert mit einem
nicht reparierten Dimer
bei der Replikation?
(Knippers Abb. 9.11, S. 263)

DNA-Polymerasen DNA Polymerasen von E. coli
Polymerase Exonuklease Funktion Moleküle/Zelle Genauigkeit
Pol I
Pol II
3‘-5‘; 5‘-3‘(nick
translation)
Verknüpfung der
Okazaki-Fragmente;
NER
3‘-5‘ TLS/SOS
(mit RecQ)
400
40 10 -5 –10 -6
Pol III 3‘-5‘ Replikation 10 - 20 10 -5 –10 -6
Pol IV
(Din B)
Pol V
(UmuC, D)
TLS/SOS 10 -3 –10 -4 ;
mutagen!
TLS/SOS
AP-sites, CPD
10 -3 –10 -4 ;
mutagen!
(nach Knippers Tab. 7.1./9.3., S. 177/264)

SOS-Antwort SOS Antwort bei E. coli
Einzelstrang-bindendes Protein
Protease
(Knippers Abb. 9.30, S. 285)
Das RecA Protein (352 AS) bindet unter ATP-Verbrauch als Multimer
an einzelsträngige DNA und ändert damit seine Funktion zu RecA* (Protease)
Durch SOS-Antwort werden 3 Polymerasen induziert: Pol II, Pol IV und Pol V
(DinB und UmuC,D), die geringe Prozessivität, erhöhte Schadenstoleranz und
erhöhte Fehlerhaftigkeit (DinB, UmuC,D) zeigen, was zu vermehrten Mutationen führt.

Post Replikations-Reparatur
Replikations Reparatur (PRR) in E. coli - Rekombination
DNA-Synthese
Strang-Austausch
Bildung einer Holliday Junction
Auflösung der Holliday Junction
(endonucleolytische Spaltung)
(nach Friedberg, Abb. 16-17, S. 586/ Abb. 16-22, S. 590)
RecA (RecO, RecR, RecF)
RecA (RecO, RecR, RecF)
RuvC
Branch Migration
RecA, RuvAB, RecG

Post Replikations-Reparatur
Replikations Reparatur (PRR) in E. coli – Strang-Wechsel
Strang Wechsel
Strang-Wechsel („strand switch“)
Zwei Modelle, wie durch einen „strand switch“
DNA-Replikation trotz eines noch nicht reparierten
Schadens (z.B. CPD, 6,4 PP) möglich wird: Pol III
stoppt am Schaden („stalling“) – es entsteht eine Lücke
A. Nach „branch migration“ erfolgt eine
„chicken foot formation“ der neu-synthesierten
Stränge (Pol II, REcQ), Fortsetzung der Synthese und
anschliessende „Rückfaltung“.
B. Mit einer „reverse branch migration“ verbundene
Auflösung der Holliday-Struktur (m.H. von
Resolvase RecG, RuvAB)
(Friedberg et al. 1995, Abb. 10-26, S. 443)

UV-Sensibilit
UV Sensibilität t – ein Beispiel polygenischer Vererbung
uvrA+ kompetent für NER
recA+ kompetent für PRR
uvrA defizient in NER (PRR+)
recA defizient in PRR (NER+)
uvrA recA defizient in NER/PRR
Die sehr hohe UV-Sensibilität der uvrA recA Doppelmutante weist darauf hin, dass
die beiden Proteine in völlig verschiedenen Reparaturwegen ihre Funktion haben.
(nach Friedberg, Abb. 16-18, S. 587)

DNA Reparatur – Zusammenfassung
1. Die Stabilität von DNA, einem prinzipiell instabilen Molekül, wird
durch Reparatur- und Toleranz-Prozesse gewährleistet.
2. Es gibt mechanistisch unterschiedliche, schadensspezifische
Reparatur- und Toleranz-Prozesse (z.T. redundanteFunktionen):
Photoreaktivierung, Basen-Exzisions-Reparatur (BER), Nukleotid-
Exzisions-Reparatur (NER), Transläsions-Synthese (TLS),
Postreplikations-Reparatur (PRR), u.v.m..
3. Basenschäden (z.B. 8-oxodGuanin, AP-Stellen, alkylierte Basen)
werden durch BER i.A. fehlerfrei repariert.
4. UV-induzierte Pyrimidindimere (CPD,6,4 PP) werden durch Photoreaktivierung
(spezifisch für Dimere!) revertiert und durch NER fehlerfrei
repariert. TLS an nicht entfernten CDP/6,4 PP erfolgt fehlerfrei oder
fehlerhaft; durch PRR können genomische Rearrangierungen entstehen.
5. Ausfall eines Reparaturweges führt i.allg. zu Strahlenempfindlichkeit
der Zellen (Ausnahme: Existenz redundanter Wege), die bei Ausfall
weiterer Wege stark zunimmt.