Vortrag 3: Dr. Günter Gmeiner - Führung durch das
Vortrag 3: Dr. Günter Gmeiner - Führung durch das
Vortrag 3: Dr. Günter Gmeiner - Führung durch das
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<strong>Günter</strong> <strong>Gmeiner</strong><br />
Dopingtrends und<br />
ihr Analytischer<br />
Nachweis<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
World Anti-Doping-Agency (WADA)<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
International<br />
Seibersdorf<br />
Prozent Positive 2009<br />
Anzahl Proben<br />
277,928<br />
6 ,146<br />
% Positive<br />
2.02<br />
1.92<br />
Seite 1<br />
Seite 3<br />
Seite 5<br />
Was ist Doping im Sport?<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
WADA - Liste der verbotenen Substanzen<br />
Verbotene Substanzen<br />
• S1: Anabole Substanzen<br />
• S2: Hormone & verwandte Substanzen<br />
• S3: ß2-Agonisten<br />
• S4: Antiöstrogene<br />
• S5: Diuretika & maskierende Substanzen<br />
• S6: Stimulanzien<br />
• S7: Narkotika<br />
• S8: Cannabisprodukte<br />
• S9: Glucocortikosteroide<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 2<br />
Verbotene Methoden<br />
• M1: Erhöhung des O2-Transportes<br />
• M2: Pharmakologische, chemische<br />
und physikalische Manipulation<br />
• M3: Gendoping<br />
Verbot in bestimmten Sportarten<br />
• Alkohol<br />
• ß-Blocker<br />
Test Statistics for 2009 – Positive Cases<br />
- 135 (2,7%) Analytical Findings; Multiple findings per sample included<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 4<br />
Seite 6
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Ablauf einer Dopingkontrolle<br />
Probenerfassung<br />
Proben werden versiegelt angeliefert<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Probenaufteilung<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Probendaten werden erfasst<br />
Probenöffnung<br />
Volumsbestimmung<br />
pH- und Dichtemessung<br />
Seite 7<br />
Seite 9<br />
Aliquotierung<br />
für die<br />
Screenings<br />
Seite 11<br />
Probenahme<br />
Erfolgt <strong>durch</strong> akkreditierte Dopingkontrollore unter strikter<br />
Kontrolle<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Zustand der Proben<br />
• Siegel OK?<br />
• Berlinger: Farbe von A- und B-Probe identisch ?<br />
• Berlinger: Temperaturindikator neutral?<br />
• Flasche gebrochen?<br />
• B-Probe: Flasche übervoll?<br />
• Ausreichend Harnmenge? (ab 2009: 90 ml Minimum)<br />
• Protokoll vorhanden und Nummern identisch?<br />
• Herkunft der Probe bekannt?<br />
Analyse der jeweiligen Probe erst nach schriftlicher Rückmeldung <strong>durch</strong> die Testing Authority<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Probenaufarbeitung<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Reagenzienzugabe<br />
Extraktion<br />
Automatisierung ⇒<br />
Phasentransfer<br />
Derivatisierung<br />
Seite 8<br />
Seite 10<br />
Seite 12
Probenmessung<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Vertrauenskette<br />
Probenübernahme<br />
Analysenprozeduren<br />
Ergebnisauswertung<br />
Datenerfassung<br />
Probenaufteilung<br />
Probenaufarbeitung<br />
Messung und Datenerstellung<br />
Datenauswertung<br />
Positive Proben<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Messlösungen<br />
Gaschromatographie -<br />
Massenspekrometrie<br />
Bestätigung<br />
Negative Proben<br />
Probeneingangsprotokoll,<br />
EDV - Laufzettel<br />
Seite 13<br />
Zur Aufarbeitung fertige Proben<br />
Fertige Meßlösungen<br />
Auswertbare Analysenreporte<br />
Entscheidungsgrundlage<br />
Prüfberichte<br />
3 . 5 3<br />
Seite 15<br />
Gaschromatographie - Massenspektrometrie<br />
Gaschromatographie:<br />
Trennung einer Substanzmischung<br />
in Einzelkomponenten<br />
Intensit Intensität<br />
68<br />
57<br />
43 84<br />
111<br />
Masse<br />
197<br />
Intensit Intensität<br />
3 . 2 7 5 . 0 9<br />
3 . 6 3<br />
2 . 9 6<br />
4 . 1 8<br />
8 2<br />
4 . 3 1<br />
5 . 2 7<br />
6 . 0 6<br />
6 . 4 1<br />
Seite 17<br />
7 . 5 2<br />
Zeit<br />
Massenspektrometrie:<br />
„Fingerabdruck“ der Substanz<br />
in Form von Massenfragmenten<br />
Screeningprozeduren<br />
Name Substanzgruppe Probenvorbereitung Analyse<br />
Screening II Unkonj. Flücht. Stimulantien Extraktion; pH 14 GC-NPD/MS<br />
Screening II II Konj. Stimulantien, Narkotika Hydrol., Extraktion pH 7 LC-MS/MS<br />
Screening III III Anabole Fraktion Extrakt Screening II II<br />
LC-MS/MS<br />
Screening IV konj. Anabole Fraktion Enzym. Hydrol., Extraktion, Deriv. GC-MS<br />
Screening V Diuretika/Glucocorticosteroide Extrakt Screening II II<br />
LC-MS/MS<br />
Screening VI Peptid Hormone (HCG) keine Immunoassay<br />
Screening VIII Hydroxyethylstärke (HES) Hydrolyse, Derivatisation GC-MS<br />
Screening IX Erythropoietin Isoelektr. Fokussierung; D-Blot Chemilumin.<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Analyse: Vergleich Screening / Bestätigung<br />
Screening Analyse<br />
Auswahl potentiell Positiver<br />
• Schnell<br />
• Empfindlich<br />
• Billig<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Screening auf anabole Steroide<br />
RT: 6.25 - 11.70<br />
100<br />
Relative Abundance<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Bestätigungsanalyse<br />
Seite 14<br />
Eindeutige Identifizierung<br />
• Spezifisch<br />
• Empfindlich<br />
• Vor Gericht haltbar<br />
Nandrolon Boldenon<br />
Trenbolon<br />
Testosteron<br />
Methyltestosteron<br />
0<br />
6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5<br />
Chemical Analytics<br />
Time (min)<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 16<br />
NL: 1.90E6<br />
m/z= 432-433 F:<br />
MS 4du2809<br />
NL: 1.62E5<br />
m/z= 435-436 F: +<br />
m/z= 255-256 MS<br />
4du2809<br />
NL: 2.53E6<br />
m/z= 405-406 F:<br />
MS 4du2809<br />
NL: 2.51E5<br />
m/z= 194-195 F:<br />
MS 4du2809<br />
NL: 4.41E4<br />
m/z= 307-308 F: +<br />
m/z= 412-413 MS<br />
4du2809<br />
Seite 18
HO<br />
Direkter Nachweis - Körperfremde Substanz<br />
Vergleich der Harnprobe mit Blindprobe und dotierter Probe<br />
Beispiel:<br />
Nandrolon - Metabolit<br />
H<br />
H<br />
H<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
?<br />
��<br />
��<br />
��<br />
��<br />
��<br />
��<br />
10 0<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
O<br />
MA: 334706 1.43E5<br />
MA: 817079 2.72E5<br />
10 0<br />
10 0<br />
10 0<br />
m/z=<br />
m/ z=<br />
419.5-<br />
90<br />
404.5-<br />
90<br />
420.5 MS<br />
405.5 M S<br />
90<br />
nadu966_0 80<br />
nadu966_0<br />
80<br />
1<br />
70<br />
1<br />
80<br />
70<br />
60<br />
70<br />
50<br />
60<br />
60<br />
40<br />
10 .2 8<br />
50 10 .0 3<br />
50<br />
30<br />
10 .13<br />
10 .3 3<br />
10.2 10 .4<br />
10 .2 10 .4<br />
Relative Abundance<br />
Relative Abundance<br />
Relative Abundance<br />
MA: 3 57113<br />
10 .3 1<br />
10 .2 10 .4<br />
10 .3 0 NL:<br />
10.22<br />
NL:<br />
10 0<br />
6.56E4<br />
100.0<br />
6.28E4<br />
10 0<br />
10.0 3<br />
10 .0 4<br />
99<br />
10 .2 8<br />
m/ z=<br />
99.5 10 .2 1 10.23 m/z=<br />
10 .0 5<br />
419.5-<br />
404.5-<br />
98<br />
420.5 MS 99.0 10 .19<br />
405.5 MS 95<br />
nabw01<br />
10 .2 6 nabw01<br />
97<br />
98.5<br />
10 .0 9<br />
10 .10<br />
96<br />
10 .2 4<br />
98.0<br />
90<br />
10.12<br />
95<br />
97.5<br />
10 .3 3<br />
10 .0 9<br />
97.0<br />
85<br />
10 .18 10 .2 3<br />
94<br />
10 .3 3<br />
96.5<br />
93<br />
80<br />
96.0<br />
10 .2 10 .4<br />
10 .2 10 .4<br />
10 .2 10 .4<br />
MA: 409134 1.6 2 E5<br />
MA: 1058993 3.42E5<br />
MA: 482577<br />
100<br />
10 0<br />
10 0<br />
m/ z=<br />
m/ z=<br />
419.5-<br />
90<br />
404.5-<br />
90<br />
90<br />
420.5 MS<br />
405.5 MS<br />
80<br />
nasp05<br />
nasp05<br />
80<br />
80<br />
70<br />
70<br />
70<br />
60<br />
60<br />
50<br />
60<br />
40<br />
50<br />
50<br />
30<br />
10.0 4<br />
10 .0 2<br />
10 .4 3<br />
40<br />
40<br />
10.32<br />
20 10 .0 5<br />
10 .3 1<br />
10 .2 10 .4<br />
10 .2 10 .4<br />
10.2 10 .4<br />
Relative Abundance<br />
Testosteron<br />
1980: Verhältnis Testosteron zu Epitestosteron<br />
als Indikator für Testosterondoping<br />
Epitestosteron<br />
T/E = 0.8<br />
Testosteron<br />
0<br />
13,8 14 ,0 14 ,2 14 ,4 14 ,6 14 ,8 15,0<br />
10 0<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Epitestosteron<br />
Relative Abundance<br />
Relative Abundance<br />
T/E = 40<br />
Harnprobe Athlet<br />
Blindprobe<br />
13 ,8 14 ,0 14 ,2 14 ,4 14 ,6 14 ,8 15,0<br />
Informationsquellen über Doping - Trends<br />
z. B. die “Fuentes” – Affaire (“Operation Puerto”)<br />
Auszug aus der Substanzliste<br />
� Autologe Bluttransfusion<br />
� Dynepo und Epo-Biosimilars<br />
� Somatotropin (Growth Hormone)<br />
� Insulin<br />
� Testosteron Gel<br />
� Synacthen<br />
� Manipulation mit Proteasen<br />
Dotierte Probe<br />
Testosteron<br />
Seite 19<br />
Seite 21<br />
Seite 23<br />
• Testosteron<br />
Indirekt: Verhältnis Testosteron / Epitestosteron > 4<br />
Direkt: � Isotopenverhältnismassenspektroskopie<br />
• Erythropoietin<br />
Indirekt: Blutparameter<br />
Direkt � Isoelektrische Fokussierung: rEpo und Nesp<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Körpereigenes Dopingmittel<br />
Indirekter vs. direkter Nachweis<br />
Isotopenverhältnis - Massenspektroskopie<br />
Wachstumshormon<br />
C. Strasburger et. al., The Lancet, 1999, 353, 895.<br />
� Natürliches Wachstumshormon besteht<br />
aus vielen Isoformen<br />
� Steigerung der Muskelmasse, Verkürzung<br />
der Regenerationszeit<br />
� Künstliches Wachstumshormon besteht<br />
vornämlich aus der 22 kDa Isoform<br />
� Verhältnis 22 / 20 kDa zeigt<br />
Wachstumshormondoping auf<br />
� Verhältnisbestimmung mit<br />
monoklonalen Antikörpern<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 20<br />
� Vergleich der<br />
Isotopenverhältnisse von<br />
Testosteron – Vorläufern zu<br />
Testosteron - Metaboliten<br />
� Beweis einer exogenen<br />
Applikation bei einer Differenz<br />
von > 3 ‰<br />
Source: Institut für Biochemie, DSHS Köln<br />
Vorderlappen<br />
Blutbahn<br />
Hypothalamus<br />
+<br />
Hypophyse<br />
HGH 20 kD<br />
HGH 22 kD<br />
HGH 22 kD<br />
Verhältnis<br />
HGH 20 kD<br />
ändert sich nach<br />
HGH Applikation<br />
Seite 22<br />
Seite 24
Kurze Geschichte der Blut-Manipulation<br />
� 1970er: Erste Gerüchte über homologes Blutdoping in<br />
Ausdauersportarten (Radsport, Schwimmen, Langlauf..)<br />
� 1987: Synthetisches Erythropoietin zugänglich � Blutdoping<br />
verliert seine Attraktivität<br />
� 2000: Epo-Doping nachweisbar � Homologes Blutdoping<br />
� 2004: Homologes Blutdoping nachweisbar � Autologes<br />
Blutdoping<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Homologes Blutdoping<br />
Source: Nelson M. et al, AJMS, 2004.<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 25<br />
� Ziel: Nachweis einer homologen<br />
Bluttransfusion– Identifikation von heterogenen<br />
RBC - Populationen<br />
� Antigenprofil der RBC’s ist genetisch bedingt<br />
und homogen<br />
� Analysenmethode: Einsatz eines Panels von ca.<br />
10 Antikörpern gegen vom ABO System<br />
K1 – Positive RBC’s<br />
unterschiedlichen Antigenen<br />
� Quantifizierung der heterogenen Population von<br />
RBC’s mittels Flow Cytometry<br />
� Detektion von Blutgruppen-Antigenen mittels<br />
Fluoreszenzmarkierten Antikörpern<br />
� Nachweisfenster: 2 bis 3 Wochen nach Infusion<br />
Mischung K1-pos und K1-neg<br />
Gendoping - Nachweis<br />
Direkter Nachweis von transgener DANN bis 50 Tage nach Injektion<br />
http://www.sciencedaily.com/releases/2010/09/100902121221.htm<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 27<br />
Seite 29<br />
Blutdoping – Bluttransfusionen<br />
Blutdoping<br />
Blutdoping ist die Verwendung einer autologen (Eigenblut) oder homologen (Fremdblut)<br />
Blut-transfusion, roten Blutkörperchen oder anderen Blutzellen außerhalb einer<br />
medizinischen Behandlung.<br />
Autologe Transfusion<br />
• Bis zu 1l Blut wird abgenommen<br />
• Blut wird gekühlt gelagert<br />
• Durch den Verlust an RBK‘s -> Verstärkte Produktion<br />
körpereigener RBK‘s<br />
• Re-Infusion der Eigenblutkonserve<br />
Homologes Blutdoping ist nachweisbar, autologes noch nicht zufriedenstellend.<br />
zufriedenstellend.<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Gendoping<br />
Homologes Blutdoping?<br />
Nicht-therapeutische Verwendung von Genen, genetischen<br />
Elementen und/oder Zellen<br />
Ziel:<br />
• Schaffung von “Dopingkraftwerken” innerhalb des Körpers<br />
Anwendung:<br />
• Stimulierung des Muskelwachstum<br />
• Produktion von Erythropoietin<br />
Zwei Formen praktikabel:<br />
• Direkte Einbringung genetischen Materials in die Zelle<br />
(hohe Dosis, Immunantwort)<br />
• Einbringen von Fremdgenen über Gen-Fähren (nicht toxische Viren)<br />
Beispiel PepCK<br />
Phosphoenolpyrovat Carboxykinase: Regulator der Glyconeogenese<br />
Transgene Maus:<br />
• Gen für PepCK überexprimiert<br />
• Mehr physische Aktivität und<br />
Ausdauer<br />
• Längeres Leben<br />
• Weniger Körperfett trotz 60 % mehr<br />
Nahrungsaufnahme<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 26<br />
Seite 28<br />
Seite 30
Die Armstrong Maus<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Externe Qualitätskontrolle<br />
- Akkreditierung nach ISO 17025 Voraussetzung für die WADA<br />
Akkreditierung<br />
alle 1 – 2 Jahre ein externes Audit mit einem WADA Assessor<br />
- WADA Akkreditierung beinhaltet Externe Qualitätskontrollen:<br />
4 mal 5 Testproben pro Jahr inkl. volle Dokumentation<br />
Unbekannte Anzahl an Blindproben<br />
WADA: Monatlich eine Blutprobe<br />
WADA: 1 – 2 Educational Tests<br />
- World Association of Anti-Doping Scientists (WAADS)<br />
ca. 10 Testproben pro Jahr<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
GASepo and epoCAM<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 31<br />
Seite 33<br />
Seite 35<br />
Der Supersportler<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Internationalität<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 32<br />
�� WADA Projekte auf dem Gebiet der Epo – Forschung, Software - Entwicklung<br />
�� USADA – Projekte zur Synthese neuer Referenzsubstanzen<br />
�� Publikationen auf dem Gebiet der Dopingforschung<br />
�� Schulung von Mitarbeitern anderer akkred. Labors in der Dopinganalytik<br />
Dopinganalytik<br />
�� Seit 2004 zu allen Olympischen Spielen eingeladen<br />
�� Präsidentschaft Pr sidentschaft der WAADS<br />
�� Mitglied der WADA Laboratory Working Group<br />
�� Mitglied der WADA Epo Experts Group<br />
At the Olympic Games<br />
CAM<br />
was<br />
in Athens …<br />
in Athens … … and<br />
in Torino<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 34<br />
Seite 36
Das Seibersdorfer Antidoping - Team<br />
Chemical Analytics<br />
Autor: G. <strong>Gmeiner</strong> / E. Benetka<br />
Seite 37
Change language