아비딘의 비특이적 결합에 대한 연구 - 서울여자대학교

J. Natural Science, SWINS, Vol. 22, 37~44(2010)
아비딘의 비특이적 결합에 대한 연구
류지은․정소희․김은혜․정희재․박호영․이인숙*
서울여자대학교 자연과학대학 화학과
A Study on Non-specific Binding of Avidin
Jieun Ryu, Sohee Jeong, Eunhye Kim, Heejae Jung
Hoyoung Park and Insook Rhee*
Department of Chemistry, College of Natural Science, Seoul Women's University.
SUMMARY
The major distinguishing feature of the avidin/biotin system is the extraordinary affinity
(K a = 10 15 M -1 ) that characterizes the complex formed between the vitamin, biotin and
the egg white protein, avidin. Interaction is so strong that even biotin (or avidin) coupled
to proteins is available for binding by avidin (or biotin). Thus avidin/biotin system has
become so popular in biological sciences. This work proposed the possibility of
non-specific binding of free avidin to protein such as bovine serum albumin.
Key words:dopamine, immunoassay, avidin, non-specific binding.
서 론
면역분석법에서 일반적으로 항체의 사용이
보편화 되어 있지만, 항체를 얻고자 하는 분석
대상물질의 분자량이 작은 경우에는 면역원으
로서의 인지도가 크게 떨어지므로 동물에게
주사하여 면역반응을 일으키기 전에 분석대상
물질에 운반단백질을 부착시켜 면역반응을 유
도해야 한다. 이렇게 얻은 항체는 때로는 단백
질(효소 또는 competitor)과 결합되어 있지 않
은 분석대상물질보다 단백질-분석대상물질 결
합체에 더 잘 결합할 수 있게 되고, 이는 항체
와 분석대상물질의 친화도를 떨어뜨려 검출한
계나 민감도(sensitivity)를 낮추므로 (1) 위의 단
점을 극복하기 위하여 결합체의 구조를 화학
적으로 바꾸거나, 결합시킨 효소와 구조적으
* 이 논문은 2009학년도 서울여자대학교 자연과학연구소 교내학술연구비에 의해 지원되었음.
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Table 1. Association constants of binding protein-ligand systems useful in enzyme-linked competitive
binding assays
Ligand Binding Protein
Association Constant 1)
(M -1 )
Biotin Avidin 1.3 × 10 15
Cortisol Cortisol binding globulin 7.6 × 10 7
Cyclic-AMP Cyclic-AMP dependent proteinkinase 2.5 × 10 7
Floate Floate binding protein 2.5 × 10 7 - 9 × 10 9
Methotrexate Dihydrofolate reductase 2.1 × 10 8
Riboflavin Riboflavin binding protein 7.8 × 10 8
Testosterone Testosterone binding globulin 1.6 × 10 9
Thiamine Thiamine binding protein 3.4 × 10 7
Thyroxine Thyroxine binding protein 4.8 × 10 8 - 2.3 × 10 10
Vitamin B12
Intrinsic factor 6.9 × 10 9
R-Protein 2.0 × 10 11
Vitamin D Vitamin D binding protein 3.0 × 10 8
1) Association constant measured with radiolabeled ligands and soluble binding proteins.
로 유사한 물질을 결합시키는 방법 등을 사용
한다. 그러나 이와 같은 방법은 항체와 분석대
상물질 간의 근본적인 친화력을 향상시키지
못하고 오히려 유사 구조를 띄는 다른 물질에
의해 방해 작용을 받는다.
결합단백질은 강한 친화력과 민감도를 가
지므로 결합자리의 존재를 확실히 한다. 따라
서 리간드에 대해 선택적으로 결합하는 결합
단백질을 이용함으로써, 면역분석법에서 항체
로 인한 문제를 해결할 수 있다. 또한 항체를
만들기 어려운 물질들의 정량도 결합단백질을
사용하면 정량분석이 가능하다. Table 1은 주
로 사용되고 있는 결합단백질과 리간드간의
결합 상수를 나타내고 있다. (2)
다양한 결합단백질 중, avidin/biotin system
은 면역분석법에서 널리 사용되고 있는 방법
중 하나이다. Biotin은 수용성 비타민의 일종
인 저분자량 분자로서 Fig. 1과 같은 구조를
이루고 있다. (3-4) Biotin 구조에서 avidin과의
강력한 non-covalent interaction에 크게 작용
을 하는 부분은 ureido ring이므로, valeric acid
side chain의 carboxyl group을 통한 biotinyl
derivatives로의 modification이 가능하다. (5-6)
Avidin은 계란의 흰자 부분에 존재하는 당단
백질로 tetrameric structure를 가지기 때문에 1
분자 당 4개의 biotin 결합이 가능하다. 따라서
강한 결합력과 인식력을 이용함과 동시에
signal 증폭이 가능하다는 장점이 있기 때문에
avidin/biotin system이 널리 이용되고 있다. (7-11)
Fig. 1. Chemical structure of biotin.
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본 연구는 avidin/biotin system을 적용하여
signal 증폭을 통한 감도가 좋은 도파민(DA,
Fig. 2) 분석법을 개발하는 실험을 진행하던
중, avidin에 의한 비특이적 결합의 영향이 크
게 작용함을 발견하게 되었다. 이에, avidin이
단독으로 존재 할 때와 avidin이 다른 단백질
과 접합체를 형성하였을 때에 나타날 수 있는
비특이적 결합에 대하여 체계적으로 연구하고
자 한다.
Fig. 2. Chemical structure of dopamine.
재료 및 방법
시약:Rabbit polyclonal to DA는 Abcam
(Cambridge, MA, USA)에서 구매하였고, BSA-
DA 접합체는 US Biological (Swampscott, MA,
USA)로부터 구매하였다. 항체-biotin 접합체의
합성에 사용된 (+)-Biotin N-succinimidylester
(NHS-Biotin)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로
부터 구매하여 사용하였다. Blocking solution
에 사용된 biotin-free BSA와 horseradish
peroxidase conjugated avidin (avidin-HRP)은
Pierce (Rockford, IL, USA)에서 구매하였다.
DA, avidin (from egg white), peroxidasebiotinamidocaproyl
conjugate (biotin-HRP),
DMSO, 3,3’,5,5-tetramethylbenzidine dihydrochloride
(TMB) 그리고 phosphate-citrate buffer with
sodium perborate는 Sigma (St. Louis, MO,
USA)로부터 구매하였다. Sodium bicarbonate,
sodium carbonate, sodium phosphate monobasic,
sodium phosphate dibasic과 sodium chloride는
Duksan Pure Chemical (Ansan, Kyonggido,
Korea)에서 구입하여 사용하였다. 모든 시약은
분석용 특급시약을 사용하였다. 모든 용액은
탈이온수 (Milli-Q water purification system,
Millipore, Billerica, MA, USA)로 제조하였다.
기기:Enzymatic activity는 E-max precision
microplate reader (Molecular Device Co.,
Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 모든 실
험에 사용된 plate는 immulon 4 HBX Flat
bottom microtiter plate (high binding) (Dynex
technologies Inc., USA)이고, plate well에 결
합되지 않은 반응시료는 Multiwasher Ⅲ
(Tricontinent, Grass Vally, CA, USA)를 사용
하여 제거하였다.
완충용액:항체-biotin 접합체의 합성을
위한 coupling buffer는 50 mM sodium
bicarbonate buffer, pH 8.3이 사용되었고
dialysis buffer는 10 mM phosphate buffer, pH
7.2가 이용되었다. 비특이적 결합에 대한 실
험에서 coating buffer는 50 mM sodium
bicarbonate buffer, pH 9.6을 사용하였고,
assay buffer로는 10 mM PBS, pH 7.2를 이용
하였다. Blocking solution은 3% BSA in 10
mM PBS, pH 7.2, wash buffer로는 10 mM
PBS, 0.05% Tween20, pH 7.2가 사용되었다.
Substrate buffer는 50 mM phosphate-citrate
buffer, pH 5.0를 사용하였다.
항체-biotin 접합체:항체-biotin 접합체는
NHS-biotin을 사용하여 합성하였다. V- vial에
항체를 coupling buffer에 녹여 넣은 후,
DMSO에 녹인 NHS-biotin을 천천히 적가 하
여, 4℃에서 24시간 동안 교반하면서 반응시
켰다. 단, 적가 하는 DMSO의 양은 전체 부피
의 10% 이상이 되지 않도록 하였다. 반응이
끝난 반응 액을 centricon에 넣고 dialysis
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uffer로 dialysis시켜서 반응하지 않은 NHSbiotin을
제거하였다. 항체의 농도가 6.67×10 -8
M이 되도록 최종농도를 맞춰주었다. 이때 사
용된 NHS-biotin의 양은 항체의 몰수의 500배
에 해당하는 양이다.
접합체를 형성하지 않은 avidin의 작용:
실험은 plate에 BSA-DA 접합체를 흡착시켰을
때와 BSA만을 흡착시켰을 때의 두 가지 경우
로 나누어 진행하였다. BSA-DA 접합체를
coating buffer를 이용하여 적정 농도로 희석
한 후 plate에 첨가하고 실온에서 2시간 동안
incubation하여 plate 표면에 흡착시킨 후,
wash buffer로 3회 세척하여 흡착되지 않은
BSA-DA 접합체를 제거하였다. 이어서 3%
BSA blocking solution을 주입시킨 후 상온에
서 30분 반응시킨 후 washing step을 거쳤다.
그 후 항체-biotin 접합체를 넣고 1시간 동안
incubation을 시킨 후 세척하였다. Avidin을 주
입한 후 30분 동안 incubation을 거친 후 wash
buffer로 3회 세척하였다. 실험 design 상에 생
략되는 요소는 assay buffer만 동량 주입하여
동일한 시간의 incubation time을 갖도록 하였
다. Biotin-HRP 접합체를 주입한 후 30분 반
응시킨 후 접합되지 않은 biotin-HRP를 세척
하여 제거시킨 후 substrate solution을 넣어준
후 10분 동안 반응시켰다. 2 M H 2 SO 4 를 주입
하여 quenching시킨 후 450 nm에서 흡광도
값을 측정하였다. 두 번째 경우인 BSA만을 흡
착시키는 실험은 위와 동일한 방법으로 수행
하였다.
실험을 진행하였다. 이때 design에 따라 생략
되는 부분은 기본이 되는 assay buffer만 첨가
하였다. 항체-biotin을 assay buffer에 녹여 첨
가하여 incubation한 후, assay buffer를 이용하
여 적정 농도로 희석시킨 avidin-HRP를 넣어
incubation시켰다. 모든 step마다 washing step
을 통하여 결합하지 않은 요소들을 제거시켜
주었다. Substrate solution을 넣어준 후 10분
동안 반응시킨 후 2 M H 2 SO 4 를 첨가하여
quenching시켰다. 450 nm에서 흡광도 값을 측
정하였다.
결과 및 고찰
접합체를 이루지 않은 Avidin에 따른 영향
실험에 적용된 design을 정리하면 아래와
같다 (단, NO는 assay buffer만을 첨가하였다.)
BSA-DA (A)를 capture로 사용한 경우
design 1:▨BSA-DA / NO / NO / NO /
biotin-HRP
design 2:▨BSA-DA / BSA / NO / NO /
biotin-HRP
design 3:▨BSA-DA / BSA / Ab-biotin / NO
/ biotin-HRP
design 4:▨BSA-DA / BSA / NO / avidin /
biotin-HRP
design 5:▨BSA-DA / NO / NO / avidin /
biotin-HRP
design 6:▨BSA-DA / BSA / Ab-Biotin /
avidin / biotin-HRP
Avidin-HRP 접합체의 형태로 존재하는
avidin의 작용:접합체를 이루지 않은 avidin
의 작용에 관한 실험과 마찬가지로 plate 표면
에 BSA-DA 접합체를 흡착시켰을 때와 BSA
만을 흡착시켰을 때의 두 가지 경우로 나누어
BSA (B)만을 plate에 고착시켰을 때
design 1:▨NO / NO / NO / biotin-HRP
design 2:▨BSA / NO / NO / biotin-HRP
design 3:▨BSA / Ab-biotin / NO / biotin-
HRP
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design 4:▨BSA / NO / avidin / biotin-HRP
design 5:▨NO / NO / avidin / biotin-HRP
design 6:▨BSA / Ab-Biotin / avidin / biotin-
HRP
이론적으로 살펴보면 BSA-DA (A)의 경우
complex 형성에 의해 signal이 나타나야 하는
것은 design 6뿐이다. 단, design 1과 5의 경우
에는 plate의 blocking이 충분치 않아서 발생
될 수 있는 단백질 [biotin-HRP 중 HRP
(design 1)혹은 avidin (design 5)]의 흡착으로
인한 signal이 나타날 수 있다고 고려될 수 있
다. (B)에 관련된 design 1~6은 모두 HRP에
대한 signal이 나타나지 않아야 한다.
그러나 Fig. 3의 결과에서 보듯이 예상외의
값들이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 첫 번
째로는 BSA (B)에 관련된 design 중 design
4~6의 결과이다. BSA (B)의 design은 정상적
인 signal이 나타날 수 없으나 실제로는 어느
정도의 signal이 관찰되었다. 특히 BSA (B)의
design 6의 경우는 이론상 나타날 수 있는 최
대 signal을 보여야 하는 BSA-DA (A)의
design 6의 signal값의 약 1/2에 해당하는 크기
를 가지고 있다. 이 signal 이 나타나는 원인을
하나씩 분석해 볼 필요가 있다. 첫 번째로
biotin-HRP의 비특이적 결합에 의한 영향일
가능성을 고려해 볼 수 있다. (A)의 design 1,2
와 (B)의 design 1,2의 결과로 미루어보아
biotin-HRP에 의한 영향이 아님을 확인할 수
있다. 두 번째, biotin-HRP가 항체-biotin에 잘
못 결합할 경우도 (A)의 design 3과 (B)의
design 3에서 signal이 크게 나타나지 않기 때
문에 배제할 수 있다. 세 번째로는 avidin의 비
특이적 결합에 의한 영향을 고려해 볼 수 있
다. Avidin에 의해 영향을 받는 디자인은 (A)
의 design 4~6, (B)의 design 4~6에 해당한다.
(A)의 design 6을 제외하고는 모두 signal이 나
타나지 않아야 하지만, (A)의 design 6 이외의
design도 signal이 나타났으므로 avidin이 비특
이적 결합을 할 가능성이 있음을 확인할 수 있
다. (A)의 design 4와 5를 비교해 보았을 때
blocking의 유무에 의한 차이가 나타나지 않
Fig. 3. Non-specific binding of Avidin.
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았음을 확인할 수 있다. Avidin이 binding을
한다는 가정 하에 이 결과를 해석해보면
BSA-DA 접합체가 plate에 충분한 양이 흡착
되어 있어서 blocking에 의한 차이가 나타나
지 않았음을 예측할 수 있다. 그리고 (A)의
design 4와 6을 비교해 보았을 때 약 1/2 의
signal 차이가 나는 것은 (A)의 design 6에 항
체-biotin에 의한 signal이 더해졌기 때문이라
고 생각할 수 있다. (B)의 design 4~6 역시
avidin이 비특이적 결합을 한다는 가정 하에서
비교해 보았을 때 (B)의 design 4와 6의 signal
차이가 설명될 수 있다. 그렇다면 avidin이
plate에 흡착된 요소 중 어느 것과 결합 가능
성이 있는지 파악해보아야 한다. (A)의 design
4~6과 (B)의 design 4~6을 비교하면 (B)에 해
당하는 signal이 모두 (A)의 값보다 절반 정도
작은 값을 지니는 것을 확인할 수 있다.
이 결과에 대해 생각해보면 avidin이 DA와
결합을 할 수 있다는 가능성을 생각해볼 수 있
다. 이에 대해 DA와 biotin이 구조적인 유사성
을 지니고 있는지에 대해 고려해 보아야 한다.
Avidin과 biotin의 interaction시에 중요시 되는
biotin의 부분은 ureido ring으로 알려져 있다.
따라서 DA의 구조에도 ureido ring과 유사한
부분이 존재한다면 avidin이 DA과 결합할 수
있다는 가능성에 대해서도 긍정적으로 고려해
볼 수 있다. 하지만 실제로 DA는 하나의
phenolic group만을 가지고 있다. 따라서
avidin이 DA과 결합한다는 예측은 고려하기
어렵다.
그렇다면 (A)의 design 4,5와 (B)의 design
4,5의 signal을 통해 avidin이 BSA에 결합을
한다는 가능성에 대해 설명이 가능하게 된다.
마지막으로 고려해 볼 사항으로는 (B)의
design 4,5와 design 6과의 signal 값의 차이이
다. (A)에 해당하는 경우 항체-biotin 접합체에
의한 signal 크기 차이라는 설명이 가능하게
되지만 (B)의 경우는 plate에 DA가 존재하지
않기 때문에 이 설명이 성립하지 않게 된다.
(B)의 design 4와 design 6의 signal 차이를 설
명하기 위해서는 항체-biotin 접합체 역시
BSA와 비특이적 결합을 한다는 가능성을 열
어두어야 한다. 이에 대해서는 사용된 항체의
면역원이 BSA-DA이었기 때문에 가능성이 있
음을 배제할 수 없다.
Avidin-HRP 접합체의 형태로 존재하는 경
우 Avidin에 따른 영향
실험에 적용된 design을 정리하면 아래와
같다.
BSA-DA (C)를 capture로 사용한 경우
design 1:▨BSA-DA / NO / NO /
avidin-HRP
design 2:▨BSA-DA / BSA / NO /
avidin-HRP
design 3:▨BSA-DA / NO / Ab-biotin /
avidin-HRP
design 4:▨BSA-DA / BSA / Ab-biotin /
avidin-HRP
BSA (D)만을 plate에 고착시켰을 때
design 1:▨NO / NO / avidin-HRP
design 2:▨BSA / NO / avidin-HRP
design 3:▨NO / Ab-biotin / avidin-HRP
design 4:▨BSA / Ab-biotin / avidin-HRP
앞선 실험을 통해 free avidin이 BSA와 비
특이적 결합을 한다는 가능성을 확인하였다.
이번 실험은 avidin이 conjugate를 이루고 있
는 형태로 존재할 때에도 비특이적 결합을 할
가능성이 있는지에 대해 확인해보고자 하였
다. 우선 design을 통한 이론적 예측으로는
BSA-DA (C)의 design 3,4을 제외한 나머지
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Fig. 4. Non-specific binding of Avidin-HRP.
design은 signal이 나타나지 않아야 한다. 단,
BSA (D)의 design 3,4의 경우 plate가 blocking
이 되지 않아 단백질이 흡착할 가능성이 있으므
로 signal이 나타날 수 있음을 고려해야 한다.
실험을 통한 결과는 Fig. 4를 통해 확인할
수 있다. 우선 BSA-DA (C)와 BSA (D)에 해
당하는 design의 결과의 대부분은 이론적으로
예측한 바와 같은 결과를 보여주고 있다.
Design 1,3은 blocking을 하지 않았기 때문에
단백질이 plate에 흡착되어 signal이 나타났다
고 설명이 되고, design 2도 예측대로 signal이
나타나지 않았음이 확인되었다. BSA (D)의
design 4의 경우에는 plate 표면에 DA이 존재
하지 않기 때문에 signal이 나타나지 않아야
한다. 하지만 결과를 확인해보면 비교적 큰
signal이 존재함을 확인할 수 있다. 이에 대해
avidin-HRP의 avidin의 비특이적 결합에 의한
signal인 지를 확인해보아야 한다. BSA (D)의
design 2의 결과를 보면 signal이 크게 존재하
고 있지 않기 때문에 BSA (D)의 design 4의
signal이 avidin에 의한 영향이 아님을 확인할
수 있다. 두 design을 비교해 보았을 때 BSA
(D)의 design 4의 signal은 항체 biotin 접합체
에 의한 signal이라고 설명될 수 있다.
결 론
Avidin/biotin system은 avidin과 biotin 사이
의 강한 친화력과 signal 증폭 효과로 인한 분
석 감도를 높일 수 있다는 장점을 통해 면역분
석법에서 널리 사용되고 있다. 그러나 본 실험
을 통해 free avidin을 사용하는 경우는 주로
사용되는 blocker인 BSA와 비특이적 결합의
가능성이 있으며, avidin-HRP와 같은 형태의
conjugate를 이루고 있는 경우는 비특이적 결
합의 가능성이 배제됨을 볼 수 있었다. 따라서
이는 avidin/biotin system 도입 시 고려해야
할 부분으로 판단된다.
참 고 문 헌
1. Ferencik M, Handbook of Immunochem-
- 43 -

istry, Chapman&Hall, U.K., 1993.
2. Wild D, Immunoassay Handbook, 2nd ed.,
Nature Publishing Group, U.K., 2001.
3. Yoshitake M, Nohta H, Ogata S, Todoroki
K, Yoshida H, Yoshitake T and Yamaguchi
M, Liquid chromatography method for
detecting native fluorescent bioamines in
urine using post-column derivatization and
intramolecular FRET detection, J.
Chromatogr. B 858, 307-312, 2007.
4. Zheng J and Zhou X, Sodium dodecyl
sulfate-modified carbon paste electrodes
for selective determination of dopamine in
the presence of ascorbic acid, Bioelectrochemistry
70, 408-415, 2007.
5. Goyal RN, Gupta VK, Oyama M and
Bachheti N, Gold nanoparticles modified
indium tin oxide electrode for the simultaneous
determination of dopamine and
serotonin:application in pharmaceutical
formulations and biological fluids, Talanta
72, 976-983, 2007.
6. Wilchek M and Bayer EA, The avidinbiotin
complex in bioanalytical applications,
Anal. Biochem. 171, 1-32, 1988.
7. McMahon RJ, Avidin-Biotin interactions,
Methods and Applications, Methods in
molecular biology, Springer-Verlag, 2008.
8. Hilvrig F and Freitag R, Protein purification
by affinity precipitation, Analyt. Technol.
Biomed. Life Sci. 790, 79-90, 2003.
9. Green NM, Avidin, Adv. Protein. Chem.
29, 85-133, 1975.
10. Rybak JN, In vivo protein biotinylation
for identification of organ-specific antigens
accessible from the vasculature, Nat. Methods
2, 291-298, 2005.
11. Hamblett KJ, Kegley BB, Hamlin DK,
Chyan MK, Hyre DE, Press OW, Wilbur
DS and Stayton PS, A Streptavidin-Biotin
Binding System That Minimizes Blocking
by Endogenous Biotin, Bioconjug. Chem.
13, 588-598, 2002.
- 44 -