急性高原缺氧大鼠脑损伤及其水通道蛋白1/4 的表达研究

· 326 · 中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 2012 年 11 月 第 19 卷 第 6 期 Chin J TCM WM Crit Care,November 2012,Vol.19,No.6· 论 著 ·急 性 高 原 缺 氧 大 鼠 脑 损 伤 及 其 水 通 道 蛋 白 1/4 的表 达 研 究 1a 1a 1a 1b2 2 1a2(1. 武 警 后 勤 学 院 a 药 物 化 学 教 研 室 , b 科 研 部 , 天 津 300162;2. 天 津 市 职 业 与 环 境 危 害 生 物 标 志 物 重 点 实 验 室 , 天 津 300162)【 摘 要 】 目 的 观 察 急 性 高 原 缺 氧 大 鼠 脑 组 织 损 伤 及 其 水 通 道 蛋 白 1/4(AQP1/4) 的 表 达 情 况 。 方 法 将60 只 雌 性 SD 大 鼠 按 完 全 随 机 方 法 分 为 正 常 对 照 组 及 缺 氧 6、12、24 h 组 , 每 组 15 只 。 利 用 数 控 低 压 舱 建 立 急 性高 原 缺 氧 模 型 。 苏 木 素 - 伊 红 (HE) 染 色 观 察 大 鼠 脑 组 织 的 损 伤 情 况 ; 用 干 湿 差 值 法 检 测 缺 氧 前 后 脑 组 织 含 水量 的 变 化 ; 采 用 酶 学 定 量 手 段 分 析 脑 组 织 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 活 性 及 丙 二 醛 (MDA) 含 量 ; 应 用 蛋 白 质 免 疫印 迹 法 (Western blotting) 检 测 脑 组 织 AQP1/4 的 表 达 情 况 。 结 果 各 缺 氧 组 大 鼠 出 现 了 不 同 程 度 的 脑 组 织 损伤 , 表 现 为 细 胞 胞 体 缩 小 , 核 固 缩 、 溶 解 , 且 损 伤 程 度 随 缺 氧 时 间 延 长 逐 渐 加 重 。 与 正 常 对 照 组 比 较 , 各 缺 氧 组 大鼠 脑 含 水 量 显 著 升 高 ,SOD 活 性 (U/mg) 显 著 降 低 ,MDA 含 量 (nmol/mg) 明 显 增 加 (P

中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 2012 年 11 月 第 19 卷 第 6 期 Chin J TCM WM Crit Care,November 2012,Vol.19,No.6 · 327 ·是 影 响 水 分 子 跨 膜 转 运 、 调 节 细 胞 水 代 谢 平 衡 的重 要 膜 蛋 白 [5] 。 研 究 显 示 , 大 鼠 脑 组 织 中 水 通 道 蛋白 1/4(AQP1/4) 主 要 位 于 脑 毛 细 血 管 内 皮 细 胞 及相 连 的 胶 质 细 胞 , 并 呈 现 一 定 方 向 性 , 提 示 其 分 布 与水 分 子 转 运 有 同 向 性 , 与 脑 水 肿 形 成 和 消 除 密 切 相关 [6-8] 。 本 实 验 中 采 用 大 鼠 急 性 高 原 缺 氧 损 伤 模 型 ,观 察 急 性 高 原 缺 氧 大 鼠 脑 组 织 损 伤 及 AQP1/4 表 达情 况 。1 材 料 与 方 法1.1 主 要 试 剂 : 乌 拉 坦 、 多 聚 甲 醛 ( 上 海 化 学 试 剂 公司 ); 苏 木 素 - 伊 红 (HE) 染 色 试 剂 盒 、 超 氧 化 物 歧 化酶 (SOD) 及 丙 二 醛 (MDA) 定 量 检 测 试 剂 盒 ( 购 自南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 );AQP1/4 及 β- 肌 动 蛋白 (β-actin) 鼠 单 克 隆 抗 体 ( 单 抗 , 美 国 Santa Cruz公 司 )。1.2 实 验 动 物 及 分 组 : 清 洁 级 成 年 雌 性 SD 大 鼠 60只 , 体 重 (230±20)g, 由 军 事 医 学 科 学 院 实 验 动 物 中心 提 供 , 动 物 合 格 证 号 :SCXK-( 军 )2007-004。 按完 全 随 机 方 法 分 为 正 常 对 照 组 以 及 高 原 缺 氧 6、12、24 h 组 , 每 组 15 只 。1.3 急 性 高 原 缺 氧 损 伤 模 型 的 建 立 : 在 数 控 低 压 舱内 放 置 适 量 的 无 水 氯 化 钙 及 钠 石 灰 以 吸 收 舱 内 水 分和 CO 2 。 设 置 舱 内 温 度 (20±3)℃、 湿 度 (30±5)%、气 流 量 0.09~0.10 m 3 /h、 氧 含 量 (10±2)%, 于 15 min内 将 舱 内 压 力 匀 速 降 至 0.06 MPa ( 海 拔 7000 m 大 气压 ), 缺 氧 结 束 后 , 控 制 舱 内 压 力 平 稳 回 升 , 避 免 气 压急 剧 变 化 。 对 照 组 大 鼠 于 舱 外 正 常 条 件 下 饲 养 。本 实 验 中 动 物 处 置 方 法 符 合 动 物 伦 理 学 标 准 。1.4 检 测 指 标 及 方 法1.4.1 脑 组 织 形 态 学 观 察1.4.1.1 脑 组 织 切 片 制 备 : 大 鼠 麻 醉 后 迅 速 打 开 胸腔 , 向 左 心 室 内 快 速 注 入 生 理 盐 水 , 同 时 剪 开 右 心 耳引 流 , 后 改 为 4% 多 聚 甲 醛 灌 注 液 以 完 全 固 定 大 鼠 各器 官 组 织 。 断 头 剥 离 完 整 脑 组 织 , 于 视 交 叉 处 冠 状切 开 , 置 于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 中 常 温 固 定 , 经 脱 水 、 透明 、 包 埋 后 制 备 石 蜡 切 片 。1.4.1.2 脑 组 织 病 理 学 观 察 : 石 蜡 切 片 常 规 脱 蜡 至水 ,HE 染 色 , 光 镜 下 观 察 脑 组 织 病 理 学 改 变 。1.4.2 脑 含 水 量 的 测 定 : 断 头 后 完 整 剥 离 大 鼠 脑 组织 , 采 用 干 湿 差 值 法 测 定 脑 含 水 量 。 脑 含 水 量 = ( 湿重 - 干 重 )/ 湿 重 ×100% 。1.4.3 脑 组 织 酶 学 检 测 : 断 头 后 完 整 剥 离 大 鼠 脑 组织 , 除 脑 膜 后 置 于 冷 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS,0.01 mol/L,pH 值 7.4) 中 冲 洗 , 冰 浴 下 匀 浆 ,4 ℃ 离 心 10 min, 取上 清 备 用 。 采 用 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 测 定 SOD 活性 及 MDA 含 量 , 具 体 操 作 按 试 剂 盒 说 明 进 行 。1.4.4 蛋 白 质 免 疫 印 迹 法 (Western blotting) 检 测 脑组 织 中 AQP1/4 表 达 : 提 取 总 蛋 白 质 , 采 用 考 马 斯 亮 蓝法 进 行 蛋 白 定 量 , 经 12.5% 十 二 烷 基 硫 酸 钠 - 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 (SDS-PAGE) 电 泳 后 转 移 至 聚 偏 二 氟 乙烯 (PVDF) 膜 上 , 用 5% 脱 脂 奶 粉 的 Tris-HCl 缓 冲 盐溶 液 (TBS) 室 温 封 闭 1 h, 加 入 一 抗 工 作 液 , 室 温 孵育 1 h,4 ℃ 过 夜 , 用 含 吐 温 20 的 TBS 缓 冲 液 (TBST)洗 膜 3 次 , 每 次 10 min, 加 入 生 物 素 标 记 的 二 抗 工作 液 , 室 温 孵 育 1 h,TBST 洗 膜 , 加 入 辣 根 过 氧 化 物酶 (HRP) 标 记 的 链 霉 卵 白 素 工 作 液 , 室 温 孵 育 1 h,TBST 洗 膜 , 采 用 HRP-3,3’- 二 氨 基 联 苯 胺 (DAB)法 显 色 。 图 像 分 析 系 统 摄 片 并 分 析 , 结 果 以 目 的 条 带与 内 参 条 带 β-actin 吸 光 度 (A) 值 比 值 表 示 。1.5 统 计 学 方 法 : 计 量 资 料 以 均 数 ± 标 准 差 (x±s)表 示 , 数 据 用 SPSS 11.5 统 计 软 件 进 行 单 因 素 方 差 分析 ,P

· 328 · 中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 2012 年 11 月 第 19 卷 第 6 期 Chin J TCM WM Crit Care,November 2012,Vol.19,No.6呈 淡 蓝 色 , 核 仁 清 晰 可 见 ; 缺 氧 6 h 后 以 神 经 细 胞 水肿 为 主 , 部 分 细 胞 胞 体 肿 胀 , 胞 质 不 规 则 淡 染 , 胞 核明 显 肿 大 ; 缺 氧 12 h 和 24 h 后 以 细 胞 凋 亡 和 坏 死 为主 , 可 见 大 量 神 经 细 胞 皱 缩 变 形 , 核 固 缩 或 碎 裂 、 溶解 , 胞 质 深 染 , 间 质 中 充 满 细 胞 碎 片 和 凋 亡 小 体 。2.3 脑 组 织 含 水 量 比 较 ( 表 1): 与 正 常 对 照 组 比 较 ,各 缺 氧 组 大 鼠 脑 组 织 含 水 量 均 显 著 升 高 (P

中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 2012 年 11 月 第 19 卷 第 6 期 Chin J TCM WM Crit Care,November 2012,Vol.19,No.6 · 329 ·达 未 见 报 道 。 本 实 验 中 采 用 数 控 低 压 缺 氧 舱 建 立 大鼠 急 性 高 原 缺 氧 损 伤 模 型 , 通 过 组 织 病 理 学 、 酶 学 及Western blotting 等 检 测 方 法 , 观 察 急 性 高 原 缺 氧 大 鼠脑 组 织 损 伤 及 其 AQP1/4 的 表 达 , 结 果 显 示 , 急 性 高原 缺 氧 可 造 成 脑 水 肿 等 严 重 脑 组 织 损 伤 , 其 机 制 可能 与 AQP1/4 表 达 上 调 有 关 。参 考 文 献[1] 杜 翠 琼 , 林 迳 苍 , 朱 世 泽 , 等 . 缺 氧 缺 血 性 脑 损 伤 新 生 兔 血 清 神经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 改 变 及 黄 芪 的 保 护 作 用 . 中 国 中 西 医 结合 急 救 杂 志 ,2009,16(6):342-344.[2] 王 胜 奇 , 李 春 盛 . 提 高 平 均 动 脉 压 对 猪 心 肺 复 苏 后 脑 功 能 及 超微 结 构 的 影 响 . 中 国 危 重 病 急 救 医 学 ,2010,22(11):674-679.[3] Baneke A. What role does the blood brain barrier play in acutemountain sickness?. Travel Med Infect Dis,2010,8(4):257-262.[4] 周 其 全 , 杨 景 义 , 高 钰 琪 . 高 海 拔 地 区 急 性 高 原 脑 水 肿 72 例 就地 治 疗 结 果 分 析 . 中 国 危 重 病 急 救 医 学 ,2006,18(5):311-314.[5] 张 长 国 , 郑 国 庆 , 黄 汉 津 , 等 . 三 化 汤 改 善 缺 血 性 脑 水 肿 水 通 道蛋 白 4 的 机 制 . 中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 ,2007,14(6):352-356.[6] 石 向 群 , 杨 金 升 , 张 志 琳 , 等 . 水 通 道 蛋 白 -4 在 正 常 大 鼠 脑 内 的分 布 研 究 . 中 华 神 经 医 学 杂 志 ,2004,3(4):257-259.[7] 郭 富 强 , 徐 玉 川 , 陈 隆 益 , 等 . 脑 出 血 患 者 血 肿 周 围 组 织 水 通 道蛋 白 -4 表 达 与 脑 水 肿 及 病 理 超 微 结 构 变 化 的 关 系 . 中 国 危 重病 急 救 医 学 ,2008,20(11):674-677.[8] 周 保 纯 , 刘 励 军 , 郭 梅 凤 , 等 . 亚 低 温 对 心 搏 骤 停 大 鼠 大 脑 皮 质水 通 道 蛋 白 4 基 因 表 达 的 影 响 . 中 国 危 重 病 急 救 医 学 ,2010,22(2):113-114.[9] Imray C,Wright A,Subudhi A,et al. Acute mountain sickness:pathophysiology,prevention,and treatment. Prog Cardiovasc Dis,2010,52(6):467-484.[10] Dallimore J, Rowbotham EC. Incidence of acute mountainsickness in adolescents. Wilderness Environ Med,2009,20(3):221-224.[11] 张 世 , 张 德 海 , 刘 惠 萍 , 等 . 多 脏 器 功 能 障 碍 评 分 系 统 : 一 种 适应 于 中 度 高 原 地 区 ARDS/MODS 的 诊 断 标 准 . 中 国 危 重 病 急救 医 学 ,2005,17(4):217-222.[12] Maa EH. Hypobaric hypoxic cerebral insults:the neurologicalconsequences of going higher. NeuroRehabilitation,2010,26(1):73-84.[13] Bailey DM,Kleger GR,Holzgraefe M,et al. Pathophysiologicalsignificance of peroxidative stress, neuronal damage, andmembrane permeability in acute mountain sickness. J ApplPhysiol,2004,96(4):1459-1463.[14] Manley GT,Fujimura M,Ma T,et al. Aquaporin-4 deletionin mice reduces brain edema after acute water intoxication andischemic stroke. Nat Med,2000,6(2):159-163.[15] Qing WG, Dong YQ, Ping TQ, et al. Brain edema afterintracerebral hemorrhage in rats:the role of iron overload andaquaporin 4. J Neurosurg,2009,110(3):462-468.[16] 李 燕 华 , 孙 善 全 . 大 鼠 出 血 性 脑 水 肿 水 通 道 蛋 白 4 表 达 的 研 究 .中 国 危 重 病 急 救 医 学 ,2003,15(9):538-541.( 收 稿 日 期 :2012-04-16)( 本 文 编 辑 : 李 银 平 )· 读 者 · 作 者 · 编 者 ·本 刊 对 文 后 参 考 文 献 著 录 格 式 的 要 求《 中 国 中 西 医 结 合 急 救 杂 志 》 参 考 文 献 的 著 录 格 式 , 基 本 参 照 GB/T 7714-2005《 文 后 参 考 文 献 著 录 规 则 》 执 行 。 采 用 顺 序编 码 制 著 录 , 依 照 文 献 在 文 中 出 现 的 先 后 顺 序 用 阿 拉 伯 数 字 标 出 , 并 将 序 号 置 于 方 括 号 中 , 排 列 于 文 后 。 尽 量 避 免 引 用 摘 要 作为 参 考 文 献 。 引 用 文 献 ( 包 括 文 字 和 表 达 的 原 意 ) 务 必 请 作 者 与 原 文 核 对 无 误 。 日 文 汉 字 请 按 日 文 规 定 书 写 , 勿 与 汉 字 及 简 化 字混 淆 。 同 一 文 献 作 者 不 超 过 3 人 , 全 部 著 录 ; 超 过 3 人 , 可 以 只 著 录 前 3 人 , 后 依 文 种 加 表 示 “, 等 " 的 文 字 ( 如 西 文 加 “,et al",日 文 加 “, 他 ")。 作 者 姓 名 一 律 姓 氏 在 前 , 名 字 在 后 , 外 国 人 的 名 字 采 用 首 字 母 缩 写 形 式 , 缩 写 名 后 不 加 缩 写 点 ; 不 同 作 者 姓 名之 间 用 “," 隔 开 , 不 用 “ 和 "、“and" 等 连 词 。 引 用 日 期 、 获 取 和 访 问 途 径 为 联 机 文 献 必 须 著 录 的 项 目 。 书 籍 出 版 项 中 的 出 版 地 ( 者 )有 多 个 时 , 只 著 录 第 一 出 版 地 ( 者 )。 出 版 项 中 的 期 刊 名 称 , 中 文 期 刊 用 全 称 ; 外 文 期 刊 名 称 用 缩 写 , 以 Index Medicus 中 的 格 式为 准 。 每 条 参 考 文 献 均 须 著 录 起 止 页 码 。 著 录 格 式 示 例 如 下 。1 期 刊 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 题 名 . 刊 名 , 年 , 卷 ( 期 ): 起 页 - 止 页 .2 图 书 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 题 名 . 版 本 项 ( 第 1 版 不 著 录 ). 出 版 地 : 出 版 者 , 出 版 年 : 引 文 起 页 - 止 页 .3 会 议 论 文 汇 编 ( 集 ) 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 题 名 . 出 版 地 : 出 版 者 , 出 版 年 : 引 文 起 页 - 止 页 .4 析 出 文 献 著 录 格 式 : 析 出 文 献 主 要 责 任 者 . 析 出 文 献 题 名 // 专 著 、 会 议 文 献 主 要 责 任 者 . 专 著 、 会 议 题 名 . 版 本 项 ( 第 1 版不 著 录 ). 出 版 地 : 出 版 者 , 出 版 年 : 析 出 文 献 起 页 - 止 页 .5 学 位 论 文 著 录 格 式 : 论 文 作 者 . 题 名 . 学 位 授 予 单 位 所 在 城 市 : 学 位 授 予 或 论 文 出 版 单 位 , 年 份 .6 专 利 文 献 著 录 格 式 : 专 利 申 请 者 或 所 有 者 . 专 利 题 名 : 专 利 国 别 , 专 利 号 . 公 告 日 期 或 公 开 日 期 .7 标 准 ( 包 括 国 际 标 准 、 国 家 标 准 、 行 业 标 准 等 ) 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 标 准 编 号 标 准 名 称 . 出 版 地 : 出 版 者 , 出 版 年 .注 : 标 准 编 号 与 标 准 名 称 之 间 留 1 个 汉 字 的 空 隙 。8 报 纸 文 章 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 题 名 . 报 纸 名 , 出 版 日 期 ( 版 次 ).9 电 子 文 献 著 录 格 式 : 主 要 责 任 者 . 题 名 [ 文 献 类 型 标 志 / 文 献 载 体 标 志 , 是 必 选 著 录 项 目 . 出 版 地 : 出 版 者 , 出 版 年 ( 更 新 或修 改 日 期 )[ 引 用 日 期 ]. 获 取 和 访 问 途 径 .10 待 发 表 材 料 : 对 于 已 明 确 被 杂 志 接 受 的 待 发 表 文 献 , 可 以 标 明 期 刊 及 年 代 , 其 后 标 注 : 待 发 表 , 或 In press。11 以 电 子 版 优 先 发 表 的 文 献 著 录 格 式 示 例 :Kurth T,Gaziano JM,Cook NR. Unreported financial disclosures in a study ofmigraine and cardiovascular disease[published online ahead of print July 18,2006]. JAMA,2006,296:E1.http://jama.ama-assn.org/cgi/data/296/3/283/DC1/1. Accessde August 1,2006.