肿瘤基础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会胃 癌 是 我 国 最 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一 , 严 重 威胁 着 人 民 群 众 的 生 命 健 康 。 胃 癌 的 复 发 和 转 移 是影 响 疗 效 的 重 要 因 素 , 多 数 胃 癌 患 者 死 于 肿 瘤 复发 或 转 移 。 普 遍 认 为 只 有 深 入 研 究 胃 癌 的 分 子 机理 才 能 从 根 本 上 有 效 地 判 断 预 后 , 提 高 诊 疗 效 果 。我 们 前 期 利 用 高 密 度 基 因 芯 片 技 术 对 胃 癌 相 关 基因 进 行 了 较 为 全 面 、 大 样 本 的 研 究 。 在 既 往 的 试 验基 础 上 , 我 们 选 择 其 中 几 个 候 选 基 因 例 如 S100A6作 为 下 一 步 验 证 研 究 的 重 点 。首 先 , 我 们 选 取 胃 癌 石 蜡 组 织 标 本 为 研 究 对象 , 利 用 免 疫 组 化 验 证 了 S100A6 在 胃 癌 组 织 中 表达 水 平 的 改 变 。 进 一 步 扩 大 样 本 , 选 取 配 对 的 28例 胃 癌 肝 转 移 标 本 以 及 30 例 转 移 性 淋 巴 结 , 利 用免 疫 组 化 验 证 了 S100A6 在 胃 癌 转 移 标 本 中 的 表达 情 况 。 研 究 结 果 表 明 , 与 正 常 组 织 相 比 , 在 胃 癌组 织 中 S100A6 的 mRNA 和 蛋 白 质 水 平 均 上 调 。免 疫 组 化 结 果 显 示 ,S100A6 在 肿 瘤 细 胞 核 和 / 或 细胞 浆 中 高 表 达 (67.5%,112/166)。 在 转 移 性 淋 巴 结标 本 中 ,S100A6 高 表 达 率 为 100%(30/30) 显 著 高于 对 应 的 胃 癌 标 本 (66.7%,20/30, P=0.001)。 而 在肝 转 移 结 节 中 ,S100A6 的 高 表 达 率 (26/28, 92.9%) 高 于 配 对的 胃 癌 标 本 (24/28, 85.7%), 但 两 者 没 有 显 著 差 异(P=0.388)。 进 一 步 对 临 床 资 料 分 析 结 果 表 明 ,S100A6 与 淋 巴 结 转 移 (P=0.037) 和 肝 脏 转 移 (P=0.024) 等 因 素 相 关 。 应 用 Kaplan-Meier 单 因 素 分析 S100A6 与 胃 癌 患 者 5 年 生 存 率 的 相 关 性 。S100A6 高 表 达 组 病 例 5 年 生 存 率 (49.65%) 明 显低 于 低 表 达 组 的 5 年 生 存 率 (18.62%,P=0.0004)。经 过 Cox 回 归 分 析 表 明 ,S100A6 是 一 个 独 立 预 后因 子 (P=0.026)。为 明 确 其 上 调 的 原 因 我 们 研 究 了 S100A6 基因 CpG 位 点 的 甲 基 化 以 及 组 蛋 白 修 饰 状 况 。 此外 , 为 了 明 确 其 在 胃 癌 中 作 用 的 机 制 , 我 们 通 过ChIP-Chip 方 法 筛 查 了 其 可 能 影 响 的 下 游 因 子 。 表观 遗 传 对 肿 瘤 相 关 基 因 的 表 达 调 控 对 肿 瘤 的 发 生发 展 起 着 重 要 的 作 用 。 目 前 关 于 S100A6 表 达 调控 的 研 究 主 要 集 中 与 CpG 位 点 的 甲 基 化 以 及 组蛋 白 的 修 饰 , 但 关 于 影 响 S100A6 表 达 调 控 的 具 体CpG 位 点 以 及 组 蛋 白 修 饰 方 法 尚 未 被 筛 选 出 。 为了 研 究 S100A6 在 胃 癌 中 表 达 上 调 的 原 因 , 我 们 首先 通 过 免 疫 组 化 、RT-PCR 以 及 Western-blot 检测 了 S100A6 在 胃 癌 细 胞 系 中 的 表 达 , 挑 选 出S100A6 低 表 达 以 及 高 表 达 的 细 胞 系 并 检 测 了 不同 细 胞 系 中 S100A6 基 因 启 动 子 及 外 显 子 和 内 含子 区 CpG 位 点 的 甲 基 化 状 态 的 不 同 。 同 时 我 们 采用 染 色 体 免 疫 共 沉 淀 法 (ChIP) 检 测 了 组 蛋 白 H3甲 基 化 以 及 乙 酰 化 修 饰 对 S100A6 表 达 的 影 响 。结 果 显 示 , 在 胃 癌 细 胞 系 中 大 多 数 S100A6 的CpG 位 点 呈 去 甲 基 化 状 态 。 只 有 在 S100A6 低 表达 的 细 胞 系 中 promoter/exon1 (P/E1) 区 7th 和8th 以 及 exon2/intron2(E2/I2) 区 的 2nd-5th 位 点呈 现 甲 基 化 状 态 。 此 外 , 组 蛋 白 H3 的 乙 酰 化 修 饰在 S100A6 表 达 差 异 的 细 胞 系 中 有 明 显 不 同 。 为了 进 一 步 确 认 CpG 位 点 甲 基 化 以 及 组 蛋 白 修 饰对 S100A6 表 达 调 控 的 作 用 , 我 们 在 S100A6 低 表达 细 胞 系 中 加 入 了 5-azacytidine 和 trichostatin A,结 果 显 示 二 者 均 可 显 著 影 响 S100A6 表 达 水 平 。总 之 , 表 观 遗 传 调 控 参 与 了 S100A6 的 表 达 。S100A6 可 调 节 细 胞 骨 架 成 分 、 细 胞 生 长 以 及 分化 , 并 对 细 胞 增 殖 发 生 作 用 , 但 关 于 其 机 制 还 不 是很 明 了 。 我 们 探 讨 了 S100A6 是 否 可 以 通 过 刺 激rRNA 基 因 的 转 录 进 而 影 响 胃 癌 细 胞 的 增 殖 。 首先 , 我 们 通 过 免 疫 电 镜 以 及 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观察 了 S100A6 在 核 仁 的 表 达 定 位 。 结 果 发 现S100A6 表 达 于 细 胞 浆 中 内 质 网 、 线 粒 体 等 细 胞 器和 胞 核 , 包 括 核 仁 。 通 过 S100A6 细 胞 转 染 观 察 体外 S100A6 与 细 胞 增 殖 的 关 系 , 并 分 析 其 在 胃 癌 石蜡 组 织 切 片 中 其 与 Ki67 的 表 达 相 关 性 。 统 计 结 果显 示 ,S100A6 与 肿 瘤 细 胞 增 殖 (Ki-67 增 殖 指 数 )相 关 (P=0.043)。 S100A6 转 染 后 通 过 MTT 实 验 也发 现 S100A6 过 表 达 后 细 胞 增 殖 能 力 明 显 增 强 。 随后 的 研 究 我 们 证 明 S100A6 表 达 与 45S pre-rRNA的 表 达 水 平 呈 正 相 关 。 此 外 ,S100A6 在 rDNA 可能 的 结 合 位 点 也 被 检 测 , 结 果 表 明 S100A6 在 整 个rDNA 范 围 均 具 有 结 合 力 , 尤 其 在 8kb 区 域 特 别 丰富 , 且 在 两 个 S100A6 不 同 表 达 水 平 的 细 胞 系 之 间结 合 明 显 不 同 。 总 之 ,S100A6 可 能 会 结 合 到 rDNA肿 瘤 基 础91

序 列 , 然 后 促 进 rDNA 到 rRNA 的 转 录 , 进 而 影 响胃 癌 细 胞 的 增 殖 。此 外 , 我 们 还 观 察 了 体 外 S100A6 对 细 胞 转 移以 及 侵 袭 的 调 控 。 将 S100A6 基 因 转 染 入 胃 癌 细 胞株 AGS 后 , 通 过 细 胞 侵 袭 实 验 检 测 了 细 胞 侵 袭 能力 的 改 变 。 结 果 发 现 S100A6 高 表 达 后 细 胞 侵 袭能 力 较 细 胞 转 染 前 明 显 升 高 。 通 过 ChIP-Chip 方法 , 应 用 启 动 子 芯 片 , 我 们 检 测 了 S100A6 可 能 的下 游 因 子 。 对 其 进 行 GO 分 型 后 结 果 显 示 1328 个细 胞 因 子 被 筛 查 出 , 其 中 57 个 因 子 与 细 胞 增 殖 相关 ,25 个 因 子 与 细 胞 迁 移 相 关 ,2 个 因 子 与 细 胞 浸润 有 关 。 挑 选 Cdk5、FLJ12438、 CCNB1 和 MCM7等 因 子 , 检 测 S100A6 过 表 达 后 对 其 表 达 的 影 响 ,进 一 步 检 测 S100A6 可 能 与 这 些 因 子 启 动 子 部 位的 结 合 位 点 , 分 析 发 现 可 能 的 结 合 位 点 附 近 均 有Sp1 结 合 位 点 。 所 以 我 们 推 测 S100A6 可 能 间 接 地结 合 到 Sp1 结 合 位 点 进 而 调 节 一 些 下 游 相 关 因 子的 表 达 。总 结 :S100A6 在 胃 癌 中 表 达 上 调 , 肿 瘤 组 织S100A6 高 表 达 预 示 患 者 预 后 不 佳 。 肿 瘤 组 织 中S100A6 基 因 表 达 的 机 制 可 能 与 部 分 CpG 位 点 的甲 基 化 以 及 组 蛋 白 修 饰 状 况 有 关 。参 考 文 献[1] Emberley ED, Murphy LC, Watson PH: S100 proteins andtheir influence on pro-survival pathways in cancer, Biochem Cell Biol2004, 82:508-515.[2] Slomnicki LP, Nawrot B, Lesniak W: S100A6 binds p53 andaffects its activity, Int J Biochem Cell Biol 2009, 41:784-790.[3] Yang YQ, Zhang LJ, Dong H, Jiang CL, Zhu ZG, Wu JX,Wu YL, Han JS, Xiao HS, Gao HJ, Zhang QH: Upregulated expressionof S100A6 in human gastric cancer, J Dig Dis 2007, 8:186-193.[4] Lesniak W, Slomnicki LP, Kuznicki J: Epigenetic control ofthe S100A6 (calcyclin) gene expression, J Invest Dermatol 2007, 127:2307-2314.[5] Guo Y, Engelhardt M, Wider D, Abdelkarim M, Lubbert M:Effects of 5-aza-2'-deoxycytidine on proliferation, differentiation andp15/INK4b regulation of human hematopoietic progenitor cells,Leukemia 2006, 20:115-121.[6] Ito T: Role of histone modification in chromatin dynamics, JBiochem 2007, 141:609-614.92肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会一 种 早 期 诊 断 癌 症 新 方 法 的应 用 基 础 研 究徐 汉 友( 河 南 省 南 阳 纺 织 集 团 有 限 公 司 职 工 医 院 内 科 , 河 南 省 南 阳 市 473125)摘 要 : 总 结 一 种 早 期 诊 断 癌 症 新 方 法 的 方 案 , 以 利 于 进 一 步 研 究 和 临 床 应 用 及 预 防 。 方 法 : 根 据 当 今 肿 瘤 研 究 成果 , 设 计 一 种 新 的 癌 症 早 期 诊 断 方 法 的 方 案 。 结 果 : 分 别 用 两 种 不 同 的 抗 一 种 正 常 抑 癌 基 因 所 产 生 的 蛋 白 质 抗 体 ,如 : Rb 蛋 白 质 和 p53 蛋 白 质 , 通 过 亲 和 层 析 , 分 别 和 放 射 性 同 位 素 元 素 标 记 的 病 变 标 本 的 Rb 蛋 白 质 和 p53 蛋 白 质发 生 抗 原 抗 体 反 应 , 分 别 测 定 4 次 抗 原 抗 体 反 应 的 Rb 蛋 白 质 和 p53 蛋 白 质 的 放 射 性 强 度 , 而 不 发 生 抗 原 抗 体 反 应的 Rb 蛋 白 质 和 p53 蛋 白 质 则 不 能 被 测 定 , 从 而 判 断 Rb 蛋 白 质 及 其 基 因 和 p53 蛋 白 质 及 其 基 因 的 结 构 及 功 能 异常 , 由 此 来 早 期 诊 断 癌 症 。 结 论 : 目 前 , 肿 瘤 学 研 究 的 成 果 认 为 ,Rb 和 p53 蛋 白 质 及 其 基 因 发 生 异 常 改 变 是 引 起 癌症 的 起 始 原 因 , 因 此 , 本 文 作 者 设 想 通 过 放 射 性 同 位 素 、 免 疫 学 等 方 法 来 测 定 患 者 病 变 组 织 Rb 和 p53 蛋 白 质 发 生 异常 的 改 变 , 从 而 确 诊 患 者 此 处 病 变 已 经 发 生 极 早 期 癌 变 或 早 期 癌 变 , 达 到 早 期 手 术 治 愈 治 疗 和 预 防 的 目 的 。 这 种 临床 应 用 方 法 理 论 上 来 说 非 常 有 意 义 , 值 得 进 一 步 研 究 及 应 用 于 临 床 和 推 广 及 预 防 。 但 在 临 床 应 用 之 前 , 需 要 通 过 大量 精 确 的 实 验 室 研 究 , 从 而 确 定 各 实 验 阶 段 的 剂 量 标 准 , 同 时 , 应 同 数 字 化 电 脑 化 等 高 科 技 相 结 合 , 制 成 一 个 高 精 密的 仪 器 , 来 实 行 此 种 科 学 快 速 早 期 癌 症 的 诊 断 。 Rb 基 因 和 p53 基 因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 是 否 发 生 异 常 改 变 检 测 后 ,就 可 以 根 据 检 测 结 果 来 指 导 临 床 进 行 早 期 治 愈 治 疗 或 作 观 察 及 预 防 治 疗 , 其 判 断 方 法 如 下 :1 若 Rb 基 因 和 p53 基因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 全 部 发 生 异 常 改 变 , 就 可 以 进 行 早 期 手 术 治 愈 治 疗 。 2 若 仅 Rb 基 因 或 p53 基 因 及 其 所 表 达的 蛋 白 质 发 生 异 常 改 变 , 就 可 以 作 临 床 重 点 观 察 及 重 点 预 防 治 疗 , 同 时 定 期 复 查 。 3 若 Rb 基 因 和 p53 基 因 及 其 所 表达 的 蛋 白 质 全 部 未 发 生 异 常 改 变 , 只 作 临 床 观 察 及 一 般 预 防 治 疗 。 本 研 究 方 法 适 用 于 对 食 管 癌 、 胃 癌 、 乳 腺 癌 、 小 细胞 肺 癌 、 直 肠 癌 、 结 肠 癌 、 骨 肉 瘤 等 癌 症 的 早 期 诊 断 的 研 究 及 临 床 应 用 及 预 防 。 依 照 上 述 实 验 方 案 , 其 它 抑 癌 基 因 及其 所 产 生 的 蛋 白 质 , 当 必 要 时 , 也 可 以 测 定 。 另 外 , 本 方 案 的 研 究 方 法 也 值 得 重 视 和 进 一 步 研 究 , 她 用 抗 原 抗 体 免 疫反 应 的 方 法 , 来 探 测 蛋 白 质 的 结 构 和 功 能 是 否 发 生 异 常 改 变 , 从 而 探 测 相 应 基 因 的 结 构 和 功 能 是 否 发 生 异 常 改 变 ,她 是 一 种 新 的 、 简 单 的 和 特 殊 的 分 子 生 物 学 研 究 方 法 。关 键 词 : 癌 症 ; 分 子 诊 断 ; Rb 蛋 白 质 ; p53; 免 疫 学 ; 蛋 白 质 构 型肿 瘤 基 础93

A NOVEL MOLECULAR METHOD FOREARLIEST DIAGNOSING CANCERSXU Hanyou(Department of Internal and Emergency Medicine, Workers' Hhospital of Nanyang Textile Corporation, Nanyang473125, China)Abstract: The author of article invented a molecular method for diagnosing cancers in earliest stage of carcinogenesis to treatthe cancer well. Referenced the scientific achievements of cancer research up to now, the author designed the novel invention. Up tonow, the mortality and morbidity of majority cancers have not been controlled. Some kinds of cancers' mortality and morbidity evenare going up. As the cancer control has not reached satisfied achievements. The early diagnosing cancer has been being much too im 鄄portant and imperative. If one earliest diagnosing method could diagnose the cancers in situ or before the stage of cancers in situ. Thecancers treatment might almost be cured. The author of this paper has been studying and learning the oncology from his graduatestudy time and his working time when he created a new invention for diagnosing cancers in situ or before the stage of cancers in situ.Using two different normal Rb protein antibodies and two different normal p53 antibodies, develops antigens and antibodies immunereactions respectively, with specimen of Rb proteins and p53 by special analysis method. After comparing the two reactions of Rbproteins' and the two reactions of p53's by application of Affinity Chromatography and Flow Scintillation Counter, the structures andfunctions of Rb genes and proteins, p53 genes and proteins can be judged. So the cancers can be diagnosed earliest. This invention fordiagnosing cancers in earliest stage of carcinogenesis could be used for many kinds of cancers to be diagnosed in the same method.The new research method of molecular biology used by author in this paper is worth to be developed further. It is first reported by theauthor in this article. Which is identified through a MEDLINE search of the English-language literature on the title or on the keywords.Keywords: Cancer; Molecular diagnosis; p53; Retinoblastoma protein; Immunoassay; prevention; Molecular method, structureof protein.1 前 言癌 症 给 人 的 生 命 健 康 造 成 了 极 为 严 重 的 危 害 ,使 患 者 早 死 、 致 残 及 忍 受 巨 大 的 痛 苦 , 等 , 众 多 危 害大 大 降 低 了 患 者 的 生 活 质 量 , 人 类 在 与 癌 症 做 漫 长的 斗 争 中 , 花 费 了 大 量 的 人 力 和 财 力 , 在 世 界 范 围 内通 过 几 代 人 的 艰 苦 不 懈 努 力 , 在 癌 症 的 研 究 中 取 得了 一 些 可 贵 的 成 绩 , 但 到 目 前 为 止 , 癌 症 的 发 病 机 理仍 没 有 搞 清 , 癌 症 的 治 疗 效 果 仍 不 理 想 。 因 此 , 人 类在 攻 克 癌 症 难 关 的 过 程 中 不 得 不 边 研 究 癌 症 的 发 病机 理 , 同 时 研 究 癌 症 的 早 期 诊 断 及 提 高 癌 症 的 临 床治 疗 效 果 , 期 望 癌 症 研 究 中 的 机 理 研 究 、 诊 断 研 究 及治 疗 、 预 防 研 究 能 互 为 帮 助 , 互 为 利 用 , 不 断 总 结 经验 , 使 癌 症 研 究 防 治 更 有 效 和 有 意 义 。在 目 前 癌 症 研 究 的 现 状 下 , 癌 症 的 发 病 机 理 还没 有 搞 清 , 癌 症 的 治 疗 绝 大 部 分 效 果 仍 很 差 , 癌 症 的预 防 效 果 不 好 。 因 此 , 在 此 现 状 下 癌 症 的 早 期 诊 断 就显 得 非 常 重 要 , 若 有 一 种 癌 症 的 早 期 诊 断 方 法 能 在癌 症 发 生 的 原 位 癌 期 或 其 之 前 就 能 把 其 确 诊 , 或 在94肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会癌 症 发 生 的 癌 前 病 变 期 就 能 确 诊 患 者 病 变 必 将 要 发展 为 癌 症 , 那 么 , 在 此 期 间 的 及 时 确 诊 和 治 疗 , 癌 症的 治 愈 率 理 论 上 将 几 乎 达 到 100%。本 文 就 作 者 在 从 事 肿 瘤 学 的 专 科 学 习 和 研 究中 , 及 以 后 的 工 作 中 , 设 想 了 一 种 早 期 诊 断 癌 症 的 新方 法 , 从 分 子 生 物 学 水 平 进 行 癌 症 的 早 期 诊 断 , 现 未见 此 方 面 的 研 究 报 导 , 望 本 人 的 此 项 设 想 研 究 能 使广 大 同 行 参 考 利 用 , 为 攻 克 癌 症 做 贡 献 。2 癌 症 早 期 诊 断 设 想 的 原 理目 前 , 发 病 机 理 的 研 究 , 大 多 数 癌 症 科 学 工 作 者主 张 细 胞 癌 基 因 和 抑 癌 基 因 功 能 异 常 学 说 , 这 一 学说 的 基 本 而 简 单 的 解 释 就 是 : 人 体 细 胞 在 外 界 生 物 、物 理 和 化 学 等 因 素 长 期 不 断 地 作 用 下 , 使 细 胞 的 抑癌 基 因 功 能 被 异 常 抑 制 , 而 细 胞 癌 基 因 功 能 被 异 常激 活 , 致 使 细 胞 癌 变 。在 目 前 癌 症 细 胞 分 子 生 物 学 抑 癌 基 因 的 研 究中 ,Rb 基 因 和 p53 基 因 研 究 得 最 多 , 被 认 为 是 最 主要 的 抑 癌 基 因 。 研 究 发 现 有 很 多 种 常 见 的 癌 症 Rb 基因 和 p53 基 因 有 丢 失 或 突 变 等 功 能 异 常 改 变 现 象 ,Rb 基 因 和 p53 基 因 功 能 的 异 常 抑 制 改 变 是 癌 变 的起 始 原 因 。 Rb 基 因 和 p53 基 因 的 丢 失 或 突 变 等 功 能异 常 改 变 , 表 现 在 其 表 达 的 蛋 白 质 的 结 构 一 定 要 发生 相 应 的 改 变 , 这 种 改 变 大 部 分 是 分 子 量 变 小 和 构型 改 变 , 无 论 Rb 基 因 和 p53 基 因 发 生 哪 一 种 异 常 改变 , 其 翻 译 的 蛋 白 质 的 相 应 肽 段 将 不 被 翻 译 、 异 常 翻译 、 构 型 异 常 或 蛋 白 质 完 全 不 能 表 达 。本 文 作 者 设 想 , 用 不 常 发 生 异 常 变 化 的 Rb 基 因和 p53 基 因 各 一 个 外 显 子 表 达 的 蛋 白 质 的 相 应 肽 链制 备 相 应 的 抗 体 (I 抗 ), 同 时 , 用 常 发 生 异 常 变 化 的Rb 基 因 和 p53 基 因 各 一 个 外 显 子 表 达 的 蛋 白 质 的相 应 肽 链 制 备 相 应 的 抗 体 (II 抗 ), 分 别 用 Rb 蛋 白 质和 p53 的 肽 链 制 备 相 应 的 I 抗 和 II 抗 , 分 别 同 用 放射 性 同 位 素 硫 或 碘 标 记 的 同 等 量 可 疑 癌 症 标 本 表 达的 Rb 蛋 白 质 和 p53 进 行 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 , 在 用 适当 的 方 法 分 别 测 定 发 生 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 的 Rb 蛋白 质 和 p53 的 放 射 性 强 度 , 以 此 来 分 析 Rb 基 因 和p53 基 因 所 表 达 的 蛋 白 质 的 结 构 是 否 发 生 异 常 改 变 ,从 而 推 测 Rb 基 因 和 p53 基 因 是 否 发 生 异 常 改 变 , 若Rb 基 因 和 p53 基 因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 的 结 构 发生 异 常 改 变 , 就 可 确 定 此 标 本 所 取 的 器 官 组 织 处 , 将发 生 或 已 经 早 期 发 生 恶 性 肿 瘤 , 应 立 即 采 取 有 效 措施 治 愈 它 。为 了 简 明 期 间 , 本 文 作 者 只 以 Rb 基 因 和 其 蛋 白质 有 关 方 面 内 容 为 例 , 来 阐 明 如 何 推 测 Rb 基 因 和p53 基 因 是 否 发 生 异 常 改 变 , 因 为 , 在 这 方 面 Rb 基因 和 p53 基 因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 是 类 同 的 。制 备 的 I 抗 和 II 抗 , 分 别 同 时 和 标 本 中 的 Rb 蛋白 质 发 生 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 后 , 再 分 别 测 定 发 生 抗原 抗 体 免 疫 反 应 的 Rb 蛋 白 质 的 放 射 性 强 度 , 就 可 对Rb 蛋 白 质 的 性 质 作 出 分 析 , 分 析 方 法 如 下 :1 若 用II 抗 检 测 的 放 射 性 强 度 比 I 抗 的 低 或 II 抗 检 测 的 放射 性 强 度 完 全 缺 失 , 就 说 明 此 患 者 有 Rb 蛋 白 质 结 构和 功 能 异 常 , 因 此 , 可 以 推 断 此 患 者 有 Rb 基 因 已 发生 丢 失 , 突 变 等 结 构 和 功 能 异 常 改 变 。 2 若 用 I 抗 检测 的 放 射 性 强 度 比 II 抗 的 弱 或 I 抗 检 测 的 放 射 性 强度 完 全 缺 失 , 就 说 明 此 患 者 有 Rb 蛋 白 质 结 构 和 功 能异 常 , 因 此 , 可 以 推 断 此 患 者 有 Rb 基 因 已 发 生 丢 失 ,突 变 等 结 构 和 功 能 异 常 改 变 。 3 若 I 抗 和 II 抗 无 抗原 抗 体 免 疫 反 应 发 生 , 那 么 , 就 不 能 检 测 到 Rb 蛋 白质 的 放 射 性 强 度 , 就 说 明 此 患 者 有 Rb 蛋 白 质 结 构 和功 能 异 常 , 因 此 , 可 以 推 断 此 患 者 有 Rb 基 因 已 发 生丢 失 , 突 变 等 结 构 和 功 能 异 常 改 变 。 4 若 I 抗 和 II 抗抗 原 抗 体 免 疫 反 应 发 生 后 , 检 测 到 Rb 蛋 白 质 的 放 射性 强 度 一 样 , 基 本 上 可 以 排 除 Rb 基 因 和 其 蛋 白 质 有异 常 改 变 , 对 于 此 种 情 况 的 病 变 , 可 观 察 一 段 时 间 或进 行 改 换 II 抗 和 ( 或 )I 抗 后 , 再 进 行 检 测 。用 同 样 的 方 法 再 检 测 p53 基 因 及 其 所 表 达 的 蛋白 质 是 否 发 生 异 常 改 变 。肿 瘤 基 础95

Rb 基 因 和 p53 基 因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 是 否发 生 异 常 改 变 检 测 后 , 就 可 以 根 据 检 测 结 果 来 指 导临 床 进 行 早 期 治 愈 治 疗 或 作 观 察 及 预 防 治 疗 , 其 判断 方 法 如 下 : 1 若 Rb 基 因 和 p53 基 因 及 其 所 表 达的 蛋 白 质 全 部 发 生 异 常 改 变 , 就 可 以 进 行 早 期 手 术治 愈 治 疗 。 2 若 仅 Rb 基 因 或 p53 基 因 及 其 所 表 达 的蛋 白 质 发 生 异 常 改 变 , 就 可 以 作 临 床 重 点 观 察 及 重点 预 防 治 疗 , 同 时 定 期 复 查 。 3 若 Rb 基 因 和 p53 基因 及 其 所 表 达 的 蛋 白 质 全 部 未 发 生 异 常 改 变 , 只 作临 床 观 察 及 一 般 预 防 治 疗 。根 据 上 述 癌 症 早 期 诊 断 设 想 的 原 理 和 判 断 方法 , 就 能 对 仅 发 生 分 子 水 平 病 变 , 开 始 发 生 癌 变 , 但还 没 有 瘤 变 的 极 早 期 癌 变 病 变 , 做 极 早 期 诊 断 , 达 到早 期 手 术 治 愈 治 疗 的 目 的 。3 试 验 研 究 方 案根 据 以 上 原 理 及 当 今 可 以 开 展 的 实 验 研 究 条 件和 技 术 , 制 定 本 早 期 诊 断 癌 症 新 方 法 设 想 的 试 验 研究 方 案 , 为 了 简 明 起 见 , 本 文 作 者 只 以 Rb 蛋 白 质 有关 方 面 内 容 为 例 , 来 阐 明 试 验 研 究 方 案 , 因 为 , 在 这方 面 , Rb 基 因 和 p53 基 因 所 表 达 的 蛋 白 质 是 类同 的 。3.1 抗 原 的 制 备要 想 制 备 Rb 蛋 白 质 为 抗 原 的 抗 体 , 用 于 本 研究 的 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 , 就 必 须 先 制 备 Rb 基 因 适 当外 显 子 生 成 的 肽 段 , 现 Rb 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 已经 搞 清 , 选 择 适 当 外 显 子 翻 译 生 成 的 两 个 肽 段 作 为抗 原 , 选 择 的 原 则 已 如 前 所 述 。 肽 段 目 前 有 能 力 人 工合 成 , 可 能 将 有 肽 段 作 为 商 品 出 售 。3.2 抗 体 的 制 备目 前 有 关 Rb 蛋 白 质 抗 体 的 制 备 方 法 和 抗 体 的种 类 很 多 , 有 多 克 隆 的 , 也 有 单 克 隆 的 , 多 克 隆 和 单克 隆 抗 体 的 制 备 方 法 各 不 相 同 。 根 据 Rb 蛋 白 质 肽 段抗 原 不 同 而 制 备 出 相 应 的 不 同 种 抗 体 。 用 于 本 研 究的 抗 体 , 无 论 是 多 克 隆 或 单 克 隆 , 都 可 以 用 , 但 制 备多 克 隆 抗 体 成 本 要 低 得 多 。抗 体 制 备 简 单 的 流 程 图 如 下 : 肽 段 制 备 → 肽 段加 抗 原 佐 剂 , 制 成 完 全 抗 原 → 抗 原 免 疫 兔 → 提 取 相应 的 抗 体 → 验 证 并 提 纯 抗 体 , 备 用 。3.3 标 本 的 制 备对 于 可 疑 癌 变 的 组 织 , 特 别 是 癌 前 病 变 和 原 位癌 , 应 尽 快 、 尽 早 活 检 取 标 本 , 组 织 标 本 的 取 材 方 法 ,应 根 据 现 代 或 现 有 最 有 效 的 方 法 来 进 行 。3.4 标 本 放 射 性 元 素 的 标 记对 于 Rb 蛋 白 质 的 标 记 , 有 两 种 方 法 , 一 种 是 放射 性 同 位 素 S 元 素 的 标 记 , 此 元 素 的 标 记 需 要 把 活体 标 本 与 含 有 放 射 性 同 位 素 S 元 素 的 培 养 液 进 行 短时 间 的 活 体 细 胞 培 养 , 使 Rb 蛋 白 质 含 有 放 射 性 同 位素 S 元 素 。 另 一 种 方 法 是 放 射 性 同 位 素 I 元 素 的 标记 , 此 种 放 射 性 元 素 的 标 记 是 把 活 体 标 本 细 胞 粉 碎处 理 , 放 射 性 同 位 素 I 元 素 直 接 标 记 到 Rb 蛋 白 质上 。 这 两 种 方 法 哪 一 种 最 好 ? 本 文 作 者 认 为 , 可 能 用放 射 性 同 位 素 S 元 素 标 记 较 精 确 。3.5 亲 和 层 析 方 法 的 应 用用 同 等 量 放 射 性 同 位 素 元 素 标 记 的 Rb 蛋 白 质抗 原 , 在 亲 和 层 析 的 实 验 方 法 下 , 分 别 与 I 抗 和 II 抗发 生 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 , 达 到 分 离 及 提 纯 有 放 射 性元 素 标 记 的 Rb 蛋 白 质 的 目 的 , 才 能 准 确 地 完 成 下 一步 的 研 究 和 应 用 。3.6 流 式 闪 烁 记 数 器 的 应 用按 照 该 仪 器 的 使 用 方 法 , 测 出 分 别 和 I 抗 和 II抗 发 生 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 、 亲 和 层 析 分 离 及 提 纯 的Rb 蛋 白 质 的 放 射 性 强 度 , 从 而 判 断 出 Rb 蛋 白 质 的结 构 和 功 能 是 否 异 常 。 在 测 定 时 应 设 空 白 对 照 。用 同 样 的 方 法 再 准 备 、 检 测 及 判 断 p53 蛋 白 质是 否 发 生 异 常 改 变 。4 临 床 应 用 探 索从 上 述 一 系 列 实 验 研 究 准 备 , 到 患 者 病 变 用 本方 法 进 行 诊 断 , 以 现 有 肿 瘤 学 研 究 的 成 果 作 原 理 , 可96肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会以 从 理 论 上 来 说 本 早 期 诊 断 癌 症 的 方 法 直 接 应 用 于临 床 有 相 当 高 的 应 用 价 值 。 但 为 了 更 科 学 地 、 更 精 确地 防 治 癌 症 研 究 , 有 必 要 进 行 临 床 应 用 试 验 研 究 , 即进 行 随 机 临 床 病 例 对 照 研 究 , 以 确 定 本 研 究 方 法 有切 实 可 行 的 科 学 效 果 应 用 于 临 床 。 随 机 临 床 病 例 对照 最 好 以 同 种 癌 症 大 规 模 的 用 本 方 法 进 行 早 期 诊 断和 治 疗 为 研 究 组 , 研 究 组 包 括 Rb 和 p53 蛋 白 质 同 时发 生 异 常 改 变 的 患 者 和 仅 Rb 或 仅 p53 蛋 白 质 发 生异 常 改 变 的 患 者 。 而 对 照 组 为 Rb 和 p53 蛋 白 质 的 发现 同 研 究 组 的 患 者 , 但 研 究 组 做 上 述 方 法 治 疗 , 而 对照 组 做 常 规 方 法 治 疗 , 然 后 统 计 学 处 理 两 组 病 例 的癌 症 发 病 率 和 死 亡 率 , 进 行 显 著 性 检 验 , 从 而 可 清 楚地 验 证 本 早 期 诊 断 癌 症 方 法 的 科 学 性 。5 结 论目 前 , 肿 瘤 学 研 究 的 成 果 认 为 ,Rb 和 p53 蛋 白质 及 其 基 因 发 生 异 常 改 变 是 引 起 癌 症 的 起 始 原 因 ,因 此 , 本 文 作 者 设 想 通 过 放 射 性 同 位 素 、 免 疫 学 等 方法 来 测 定 患 者 病 变 组 织 Rb 和 p53 蛋 白 质 发 生 异 常的 改 变 , 从 而 确 诊 患 者 此 处 病 变 已 经 发 生 极 早 期 癌变 或 早 期 癌 变 , 达 到 早 期 手 术 治 愈 治 疗 和 预 防 的 目的 。 这 种 临 床 应 用 方 法 理 论 上 来 说 非 常 有 意 义 , 值 得进 一 步 研 究 及 应 用 于 临 床 和 推 广 及 预 防 。 但 在 临 床应 用 之 前 , 需 要 通 过 大 量 精 确 的 实 验 室 研 究 , 从 而 确定 各 实 验 阶 段 的 剂 量 标 准 , 同 时 , 应 同 数 字 化 电 脑 化等 高 科 技 相 结 合 , 制 成 一 个 高 精 密 的 仪 器 , 来 实 行 此种 科 学 快 速 早 期 癌 症 的 诊 断 。本 研 究 方 法 适 用 于 对 食 管 癌 、 胃 癌 、 乳 腺 癌 、 小细 胞 肺 癌 、 直 肠 癌 、 结 肠 癌 、 骨 肉 瘤 等 癌 症 的 早 期 诊断 的 研 究 及 临 床 应 用 及 预 防 。依 照 上 述 实 验 方 案 , 其 它 抑 癌 基 因 及 其 所 产 生的 蛋 白 质 , 当 必 要 时 , 也 可 以 测 定 。另 外 , 本 设 想 的 研 究 方 法 也 值 得 重 视 和 进 一 步研 究 , 她 用 抗 原 抗 体 免 疫 反 应 的 方 法 , 来 探 测 蛋 白 质因 的 结 构 和 功 能 是 否 发 生 异 常 改 变 , 它 是 一 种 新 的 、简 单 的 和 特 殊 的 分 子 生 物 学 研 究 方 法 。参 考 文 献[1] Tidy JA, Wrede D. Tumor suppressor genes: new pathways ingynecological cancer. Int J Gynecol Cancer. 1992; 2: 1-8.[2] Batinac T, Gruber F, Lipozencic J, et al. Protein p53--structure,function, and possible therapeutic implications. Acta DermatovenerolCroat. 2003; 11: 225-230.[3] Hofseth LJ, Hussain SP, Harris CC. p53: 25 years after itsdiscovery. Trends Pharmacol Sci. 2004; 25: 177-181.[4] Lai S, Benedict WF, Silver SA, et al. Loss of retinoblastomagene function and heterozygosity at the RB locus in renal corticalneoplasms. Hum Pathol. 1997; 28: 693-697.[5] Ioachim E, Assimakopoulos D, Agnantis NJ, et al. Alteredpatterns of retinoblastoma gene product expression in benign, premalignantand malignant epithelium of the larynx: an immunohistochemicalstudy including correlation with p53, bcl-2 and proliferating indices.Anticancer Res. 1999; 19: 541-545.[6] Xing EP, Yang GY, Wang LD, et al. Loss of heterozygosity ofthe Rb gene correlates with pRb protein expression and associateswith p53 alteration in human esophageal cancer. Clin Cancer Res.1999; 5: 1231-1240.[7] Anton M, Horky M, Blaha O. The role of tumour suppressorsand viral oncoproteins in cervical carcinogenesis. Ceska Gynekol.2000; 65: 275-278.[8] Flesken-Nikitin A,Choi KC,Eng JP,et al. Induction of carcinogenesisby concurrent inactivation of p53 and Rb1 in the mouseovarian surface epithelium.Cancer Res. 2003; 63: 3459-3463.[9] Olivier M, Hussain SP, Caron de Fromentel C, et al. TP53mutation spectra and load: a tool for generating hypotheses on the e-tiology of cancer. IARC Sci Publ. 2004;157: 247-270.[10] Yuan LW,Tang W,Kokudo N,et al. Disruption of pRb -p16INK4 pathway: a common event in ampullary carcinogenesis.Hepatogastroenterology. 2005; 52: 55-59.[11] Cenci M,Pisani T,French D,et al. PRb2/p130, p107 andp53 expression in precancerous lesions and squamous cell carcinomaof the uterine cervix.Anticancer Res. 2005; 25: 2187-2192.[12] Girod SC, Pfeiffer P, Ries J, et al. Proliferative activity andloss of function of tumour suppressor genes as‘biomarkers’ in diagnosisand prognosis of benign and preneoplastic oral lesions and oralsquamous cell carcinoma. Br J Oral Maxillofac Surg. 1998; 36: 252-260.[13] Kawakubo H,Ozawa S,Ando N,et al. Alterations of p53,cyclin D1 and pRB expression in the carcinogenesis of esophagealsquamous cell carcinoma.Oncol Rep. 2005; 14: 1453-1459.的 结 构 和 功 能 是 否 发 生 异 常 改 变 , 从 而 探 测 相 应 基肿 瘤 基 础97

基 于 癌 周 免 疫 微 环 境 的预 测 模 型 的 建 立 与 验 证周 闯 , 董 琼 珠 , 周 海 军 , 王 骥 , 贾 户 亮 , 钦 伦 秀( 复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院 肝 癌 研 究 所 , 上 海 200032)摘 要 : 目 的 : 肝 癌 患 者 预 后 预 测 仍 然 困 难 , 本 研 究 建 立 基 于 癌 周 免 疫 微 环 境 的 预 测 模 型 , 检 验 其 对 肝 癌 预 后 预 测的 效 果 。 方 法 : 实 时 定 量 PCR 技 术 (qRT-PCR) 检 测 肝 癌 癌 旁 组 织 中 27 个 免 疫 炎 症 相 关 因 子 ( 包 括 17 个 预 测 标 签 因子 和 文 献 报 告 的 10 个 复 发 转 移 相 关 因 子 )mRNA 表 达 水 平 , 应 用 生 物 信 息 学 机 器 学 习 方 法 构 建 有 效 的 预 测 模 型 , 分析 肝 癌 患 者 细 胞 因 子 表 达 水 平 与 肝 癌 复 发 及 预 后 的 关 系 , 检 验 其 预 测 效 果 。 结 果 : 选 取 180 例 肝 癌 切 除 患 者 癌 旁 肝组 织 , 分 为 训 练 组 (n=80) 和 测 试 组 (n=100)Cox 风 险 比 例 回 归 模 型 分 析 27 个 因 子 分 别 对 预 后 的 影 响 , 影 响 大 小 排 序后 CSF-1,HLA-DRA,TNF,SPP1,IL-6 为 前 5 位 , 构 建 预 测 模 型 。 以 mRNA 表 达 水 平 的 中 位 数 为 临 界 值 , 训 练 组 根 据临 界 值 分 为 高 风 险 组 和 低 风 险 组 ,Kaplan-Meier 分 析 显 示 高 风 险 组 总 生 存 期 短 于 低 风 险 组 (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会ZHOU Chuang, DONG Qiongzhu, ZHOU Haijun, WANG Ji, JIA Huliang, QIN Lunxiu(Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Institutes of Biomedical Sciences,Fudan University, Shanghai, 200032 China)Abstract: Objective: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common malignancy, but the prognosis remains poor due to metas 鄄tasis and recurrence after curative hepatectomy. The aim of this study is to explore whether a more refined cytokine gene expressionprofile of noncancerous liver tissue could predict survival of HCC after curative hepatectomy. Methods: 27-cytokine gene expressionprofile in noncancerous liver tissue from 180 patients was analyzed with RT-PCR arrays. Supervised hierarchical clustering and logranktest to were used analyze the prognostic ability of the cytokine gene profile. Methods of bioinformatics were used to build a pre 鄄dicting model, then optimal factors were explored. Results: Cox analyzed effect on survival CSF-1,HLA-DRA,TNF,SPP1,and IL-6were ranked in the first five sites. The mRNA-based predictor with logistic regression method, which employed the 5 cytokine geneexpression, was excellent survival predictor in gene dataset accuracy(74.7%) on testing dataset. The survival predictor was validatedby real time RT-PCR on another independent cohort of surgieal HCC patients(accuracy=72.3%). Conclusion: 5-cytokine predict model ofimmunity-associated gene signature should allow a sensitive and specific monitoring of survival in HCC after curative hepatectomy.Keywords: surgery; hepatocellular carcinoma (HCC); prognosis prediction原 发 性 肝 癌 ( 简 称 肝 癌 ) 是 全 球 最 常 见 的 恶 性 肿瘤 之 一 , 在 中 国 , 肝 癌 的 发 病 率 占 肿 瘤 发 病 率 的 第 三位 , 而 其 死 亡 率 为 第 二 位 。 虽 然 肝 癌 研 究 与 治 疗 己 取得 很 大 进 展 , 根 治 切 除 术 后 的 十 年 生 存 率 已 提 高 到30% 左 右 , 但 肝 癌 根 治 性 切 除 术 后 5 年 转 移 复 发 率为 61.5%, 即 使 是 小 肝 癌 也 达 43.5%。 因 此 发 现 肝 癌的 预 后 因 子 , 准 确 区 分 患 者 , 已 成 为 进 一 步 提 高 肝 癌生 存 率 的 关 键 。 有 研 究 表 明 , 肿 瘤 的 复 发 转 移 与 肿 瘤周 围 微 环 境 有 密 切 关 系 。 我 所 前 期 发 现 癌 旁 组 织 17个 免 疫 炎 症 相 关 细 胞 因 子 表 达 谱 可 以 准 确 预 测 肝 癌术 后 早 期 复 发 。 基 于 前 期 研 究 成 果 , 本 研 究 拟 进 一 步在 转 录 水 平 分 析 癌 周 免 疫 细 胞 因 子 表 达 构 成 、 优 化肝 癌 预 后 预 测 指 标 , 为 其 向 临 床 应 用 转 化 奠 定 基 础 。1 材 料 与 方 法1.1 材 料1.1.1 研 究 对 象选 取 2002~2006 年 在 复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院 肝外 科 实 施 根 治 性 手 术 切 除 的 肝 癌 患 者 的 癌 旁 组 织 ,患 者 为 首 次 诊 断 肝 癌 , 术 前 术 后 未 接 受 其 他 化 学 治疗 、 生 物 治 疗 、 无 门 脉 、 静 脉 主 干 转 移 。 有 完 整 的 临 床病 理 和 随 访 资 料 , 末 次 随 访 时 间 为 临 床 2010 年 6 月 。手 术 后 切 取 距 离 肿 瘤 边 缘 2cm 以 上 新 鲜 标 本 , 体 积约 0.5cm 3 大 小 , 液 氮 冻 存 , 后 转 移 至 -80℃ 保 存 , 避 免反 复 冻 融 。 患 者 签 订 了 知 情 同 意 书 。1.1.2 子 生 物 学 试 剂 及 仪 器Trizol: 购 自 Invitrogen,USA。PCR 仪 :GeneAmp PCR system9700HT 型 , 美 国ABI 公 司 产 品 。1.2 方 法1.2.1 癌 旁 肝 组 织 总 RNA 提 取 和 cDNA 制 备1.2.2 Taqman 探 针 RT-PCR 检 测 27 个 因 子 表 达按 表 1 配 制 实 时 定 量 PCR 反 应 混 合 液肿 瘤 基 础99

表 1各 组 成 部 分ABI7900HTPCR 仪 使 用 程 序 设 定 :95℃ 10 min;94℃ 15 s, 60℃ 30 s, 进 行 40 个 循 环 。运 行 结 束 后 , 导 出 结 果 包 括 扩 增 曲 线 ,Ct 值 。 通过 传 统 的 △Ct 法 ( 即 目 的 基 因 的 Ct 值 减 去 内 参 照 基因 的 Ct 值 ), 计 算 目 标 基 因 在 癌 旁 组 织 中 的 表 达 量 。1.3 统 计 学 方 法用 SPSS16.0 统 计 软 件 进 行 统 计 学 分 析 。 Cox 比例 风 险 模 型 用 于 单 、 多 因 素 分 析 。 生 存 率 曲 线 用Kaplan-Meier 法 绘 制 并 以 log-rank 法 进 行 组 间 比较 , 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 (receiver operator characteristiccurve,ROC) 及 曲 线 下 面 积 (area under the curve,AUC) 用 于 判 断 预 测 指 标 作 为 诊 断 标 准 的 可 行 性 。 利用 生 物 信 息 学 分 析 , 应 用 支 持 向 量 机 (SVM) 学 习 法对 进 行 患 者 分 类 构 建 预 后 预 测 模 型 。生 存 期 按 月 计 算 , 它 被 定 义 为 从 诊 断 至 患 者 死亡 或 末 次 随 访 信 息 的 时 间 。 单 因 素 分 析 采 用 Kaplan-Meier 生 存 分 析 和 Log-rank 检 验 。 对 单 因 素 分 析 有 意义 的 变 量 进 行 多 因 素 Cox 回 归 分 析 。 所 有 结 果 均 以双 尾 检 验 P50 45 55 0.102

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会TNF,SPP1,IL-6 为 前 5 位 , 即 应 用 这 5 个 免 疫 炎 症相 关 细 胞 因 子 可 以 区 别 患 者 预 后 ( 图 1)。无 监 督 系 统 聚 类 构 建 预 后 预 测 模 型 。 应 用 三 种分 类 器 : 支 持 向 量 机 (SVM)、Rweka(J48)、Logistic 回归 机 器 学 习 法 对 训 练 组 进 行 训 练 , 最 终 得 到 5 个 预测 基 因 列 表 及 其 贡 献 度 如 表 3 所 示 。表 3预 测 基 因 列 表 及 其 贡 献 度SPP1 OS 生 存 曲 线IL-6 mRNA OS 生 存 曲 线基 因 名 称 贡 献 度 P 值IL6 0.299212598 0.001HLA_DRA 0.141732283 0.125CSF1 0.244094488 0.074SPP1 0.188976378 0.035TNF 0.125984252 0.147HLA-DRA OS 生 存 曲 线 CSF-1 OS 生 存 曲 线TNF OS 生 存 曲 线图 1 CSF-1,HLA-DRA,TNF,SPP1,IL-6 mRNAOS 生 存 曲 线2.2.2 基 因 mRNA 表 达 谱 复 发 预 测 模 型 的 构 建基 于 CSF-1,HLA-DRA,TNF,SPP1,IL-6 最 显 著基 因 表 达 情 况 , 应 用 有 监 督 的 聚 类 分 析 表 明 , 这 5 种基 因 的 表 达 谱 可 以 较 有 效 的 区 分 肿 瘤 术 后 预 后 情 况( 图 2)。图 2 CSF-1,HLA-DRA,TNF,SPP1,IL-6 表 达 系统 聚 类 图(1) 利 用 SVM 算 法 对 5 个 预 测 基 因 做 预 测 模型 , 并 选 用 径 向 基 核 函 数 (radical basis function):k(x i x j )=exp(-γ|x-xi| 2 )其 中 ,k(x i x j ) 表 示 径 向 基 核 函 数 ,x 表 示 某 个 病人 的 基 因 表 达 值 ,x i 表 示 每 个 基 因 的 表 达 值 , 核 参 数γ=19。(2) 预 测 计 算 公 式 如 下 :P=∑k(x i x j )Y i +C其 中 ,k(x i x j ) 表 示 径 向 基 核 函 数 ,Y i 为 基 因 的 贡献 度 ,C 为 惩 罚 因 子 ( 为 LIBSVM 中 对 错 误 分 类 的 惩罚 常 数 )。 根 据 SVM 的 预 测 结 果 和 基 因 的 贡 献 度 加权 投 票 后 的 总 分 P 值 , 如 果 P 值 大 于 等 于 0.879 为 高风 险 , 小 于 0.879 为 低 风 险 。2.2.3 预 测 模 型 在 测 试 组 验 证我 们 进 一 步 在 测 试 组 (100 例 ) 中 检 验 5 个 mR-NA 细 胞 因 子 预 测 因 子 的 检 测 效 能 ,Cox 风 险 比 例 模型 分 析 预 测 因 子 与 生 存 、 复 发 的 关 系 。 基 于 mRNA 表达 谱 可 以 将 测 试 组 分 为 高 复 发 风 险 组 (68 例 ) 和 低 复发 风 险 组 (32 例 )。 为 了 验 证 模 型 的 稳 定 性 , 运 用Leave-one-out 及 10 倍 交 叉 验 证 方 法 , 结 果 显 示 : 高复 发 风 险 组 总 生 存 期 显 著 低 于 低 分 显 著 (P=0.002)。5 因 子 mRNA 表 达 预 测 标 签 的 复 发 预 测 效 能 通 过ROC 曲 线 评 价 , 准 确 度 74.7%, 敏 感 度 73.6 %, 特 异肿 瘤 基 础101

度 75.1 %。本 实 验 所 有 患 者 临 床 病 理 特 征 在 复 发 多 因 素 风险 回 归 中 仅 有 肿 瘤 大 小 具 有 意 义 显 著 (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会示 癌 周 的 炎 症 免 疫 状 态 与 HCC 术 后 的 总 生 存 明 显相 关 , 它 独 立 于 肝 硬 化 程 度 及 肝 功 能 等 临 床 指 标 。 通过 这 项 研 究 发 现 , 发 现 了 的 癌 周 预 后 预 测 基 因 标 签 ,则 可 判 断 患 者 愈 后 的 差 别 。 基 因 工 具 将 被 用 于 选 出易 感 人 群 而 进 行 个 体 化 治 疗 ; 另 外 , 对 于 经 过 手 术 治疗 的 患 者 中 , 基 因 标 签 内 某 些 特 定 的 基 因 也 有 望 成为 辅 助 治 疗 的 靶 点 。 Kulbe 等 通 过 采 用 RNA 干 扰 技术 发 现 , 当 TNFα 的 产 生 被 阻 断 时 , 肿 瘤 的 生 长 及 播[6]散 被 明 显 抑 制 。 通 过 反 义 寡 核 苷 酸 和 SiRNA 等 技 术抑 制 CSF-1 的 表 达 将 可 以 延 长 负 瘤 小 鼠 的 生 存 时 间并 且 减 少 肿 瘤 相 关 巨 噬 细 胞 的 浸 润 和 新 生 血 管 的 生[7-8]成 。为 了 检 验 这 一 模 型 的 预 测 效 能 , 在 另 一 组 随 机 、独 立 的 肝 癌 患 者 队 列 中 进 行 了 预 测 能 力 的 检 验 。 结果 发 现 , 此 模 型 同 样 可 以 将 验 证 组 患 者 区 分 复 发 转移 风 险 显 著 不 同 的 高 风 险 和 低 风 险 组 , 即 验 证 了 该模 型 的 稳 定 性 、 有 效 性 和 通 用 性 。 由 于 微 环 境 非 肿 瘤细 胞 基 因 组 较 稳 定 , 在 不 同 类 型 肿 瘤 间 的 差 异 小 , 这一 基 于 免 疫 微 环 境 特 征 的 预 测 模 型 必 将 在 肝 癌 中 有着 广 泛 的 应 用 前 景 , 可 加 速 科 研 向 临 床 转 化 速 度 , 指导 临 床 治 疗 。参 考 文 献[1] Iizuka N, Hamamoto Y, oka M. Predicting individual outcomesin hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2004:364(9448):1837-1839.[2] Wyekoff J,Wang W,Lin EY, et al. A paracrine loop betweentumor cells and macrophages is required for tumor cell migration inmammary tumors[J]. Cancer Res, 2004, 64(19):7022-7029.[3] Hoshida Y, Villanueva A, Kobayashi M, et al. Gene Expressionin Fixed Tissues and Outcome in Hepatocellular Carcinoma[J]. NEngl J Med, 2008, 359: 1995-2004.[4] Budhu A, Forgues M, Ye QH, et al. Prediction of venousmetastases, recurrence, and Prognosis in Hepatocellular carcinomabased on a unique immune response signature of the liver microenvironment[J].Cancer Cell, 2006, 10(2):99-111.[5] Chew V, Tow C, Teo M, et al. Inflammatory tumour microenvironmentis associated with superior survival in hepatocellular carcinomapatients[J]. J Hepatol, 2010, 52(3): 370-379.[6] Kulbe H, Thompson R, Wilson JL, et al. The inflammatorycytokine tumor necrosis factor-alpha generates an autocrine tumorpromotingnetwork in epithelial ovarian cancer cells [J]. Cancer Res,2007, 67: 585-592.[7] Aharinejad S, Abraham D, Paulus P, et al. Colony-stimulatingfactor-1 antisense treatment suppresses growth of human tumorxenografts in mice[J]. Cancer Res, 2002, 62: 5317-5324.[8] Aharinejad S, Paulus P, Sioud M, et al. Colony-stimulatingfactor-1 blockade by antisense oligonucleotides and small interferingRNAs suppresses growth of human mammary tumor xenografts inmice[J]. Cancer Res, 2004, 64: 5378-5384.肿 瘤 基 础103

12 项 肿 瘤 标 志 物 蛋 白芯 片 法 检 测 肺 癌 的 临 床 价 值刘 锦 程 , 施 常 备 , 陈 其 亮( 陕 西 省 结 核 病 防 治 院 陕 西 省 第 五 人 民 医 院 , 西 安 710100)摘 要 : 目 的 : 探 讨 多 肿 瘤 标 志 物 蛋 白 芯 片 检 测 法 在 肺 癌 诊 断 中 的 应 用 。 方 法 : 对 89 例 肺 癌 患 者 蛋 白 芯 片 结 果 进行 分 析 。 结 果 :CA19-9、CEA、CA125、SF 阳 性 表 达 率 较 高 , 分 别 为 17.9%、38.2%、26.9%、22.4%, 联 合 检 测 阳 性 率 为55.1%。 结 论 :C-12 蛋 白 芯 片 法 多 肿 瘤 标 志 物 检 查 在 肺 癌 诊 断 、 监 测 中 有 重 要 的 临 床 价 值 。关 键 词 : 肿 瘤 标 志 物 ; 蛋 白 芯 片 法 ; 肺 癌12 TUMOR MARKER PROTEIN CHIPASSAY VALUE OF LUNG CANCERLIU Jincheng, SHI Changbei, CHEN Qiliang(Shaanxi TB Prevention and Treatment Hospital, Xián 710100, China)Abstract: Objective: To investigate the multi-tumor marker proteinchip detection of lung cancer diagnosis. Method: 89 casesof lung cancer protein microarray analysis. Results: CA19-9, CEA, CA125, SF positive expression rate was higher, 17.9%, 38.2%,26.9%, 22.4%,the joint testing positive was 55.1%. Conclusion: C-12protein chip method checks multiple tumor markers in lungcancerdiagnosis, monitoring has important clinical value.Keywords: tumor markers; protein chip; lung cancer肿 瘤 近 年 有 不 断 增 加 的 趋 势 , 早 发 现 、 早 诊 断 、早 治 疗 是 关 键 。 肺 癌 是 发 病 率 较 高 的 恶 性 肿 瘤 ,5 年生 存 率 仍 低 于 15%, 因 此 早 治 疗 就 显 得 更 为 重 要 。 但是 单 项 肿 瘤 标 志 物 检 测 阳 性 率 低 , 联 合 检 查 可 以 明显 提 高 诊 断 阳 性 率 。 蛋 白 芯 片 是 一 种 集 微 电 子 、 微 机械 化 学 物 理 论 技 术 计 算 机 为 一 体 , 分 析 过 程 为 连 续化 、 集 成 化 、 微 型 化 的 蛋 白 分 析 技 术 , 具 有 高 速 度 、 高[1]通 量 、 高 灵 敏 的 特 性 。 本 研 究 对 89 例 肺 癌 患 者 应 用蛋 白 芯 片 进 行 的 12 项 肿 瘤 标 志 物 联 合 检 查 结 果 进行 分 析 , 并 评 价 各 项 指 标 的 临 床 应 用 价 值 。104肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会1 材 料 与 方 法1.1 临 床 资 料收 集 2009 年 5 月 至 2010 年 5 月 在 本 院 病 理 证实 为 肺 癌 患 者 89 例 。 男 性 67 例 , 女 性 23 例 , 年 龄23~77 岁 , 平 均 年 龄 51.3 岁 。 其 中 腺 癌 41 例 , 鳞 癌 35例 , 腺 鳞 癌 2 例 , 未 分 化 癌 6 例 , 小 细 胞 肺 癌 5 例 。1.2 检 测 方 法空 腹 采 集 外 周 血 2mL, 离 心 分 离 血 清 ,4℃ 冰 箱保 存 且 在 4 d 内 检 测 完 毕 。 检 测 时 取 待 测 血 清 或 标 准品 100uL 加 入 芯 片 的 小 方 格 内 , 按 照 蛋 白 芯 片 说 明书 步 骤 操 作 , 最 后 用 HD-2001A 蛋 白 芯 片 检 测 仪 检测 。 试 剂 盒 来 自 湖 州 数 康 有 限 公 司 。1.3 阳 性 判 断 标 准一 项 或 一 项 以 上 肿 瘤 标 志 物 的 检 测 值 高 于 正 常值 视 为 阳 性 , 以 下 两 项 情 况 需 要 排 除 :(1) 单 独 一 项铁 蛋 白 值 增 高 ;(2) 全 部 指 标 都 呈 强 阳 性 , 或 除 了PSA、F-PSA 外 其 他 指 标 都 呈 阳 性 者 的 携 带 嗜 异 性 抗[2]体 者 。1.4 统 计 学 分 析所 有 指 标 以 均 值 (x±s) 表 示 , 选 用 SPSS13.0 进 行分 析 。2 结 果对 各 项 检 查 结 果 、 单 项 阳 性 率 及 联 合 阳 性 率 进行 统 计 。肿 瘤 标 志 物 均 值 ± 标 准 差 正 常 参 考 值 阳 性 率 /%CA199 27.42±54.29

CYFRA211、FGF、M2-PK 等 未 选 用 。 病 理 类 型 分 析 可知 , 腺 癌 居 多 , 因 此 CEA、SF、CA125 三 者 联 合 检 出 率稍 高 , 未 列 入 鳞 癌 敏 感 指 标 , 这 可 能 也 是 影 响 阳 性 检出 率 的 原 因 之 一 。[7]也 有 学 者 认 为 , 蛋 白 芯 片 法 也 存 在 局 限 性 , 其线 性 范 围 窄 , 特 异 性 并 不 很 高 , 不 适 于 临 床 确 诊 , 还需 要 结 合 临 床 及 影 像 提 高 早 期 诊 断 率 。 但 作 为 疗 效评 价 、 预 后 判 断 和 复 发 监 测 而 言 , 蛋 白 芯 片 法 有 较 好的 临 床 应 用 价 值 。参 考 文 献[1] Sanders G.h.w,ManzA.Chip-based Microsytems for genomicand proteomic analysis[J]. Trends.And chem.,2000;19(6):364-378.[2] 路 丹 , 赵 晓 丹 , 姜 秋 颖 , 等 . 肿 瘤 标 志 物 蛋 白 芯 片 检 测 系 统 在肺 癌 诊 断 中 的 价 值 [J]. 中 国 肺 癌 杂 志 ,2006,2,9(1):84-86.[3] 孔 宪 涛 , 肿 瘤 标 志 物 应 用 进 展 与 评 价 [J]. 实 用 肿 瘤 杂 志 ,2002,17:289-292.[4] 王 伟 , 汪 安 兰 , 刘 建 国 , 等 .Ⅲ 期 非 小 细 胞 肺 癌 中 C-12 的 检测 及 其 预 后 意 义 [J]. 现 代 肿 瘤 医 学 ,2006,3,14(3):281-283.[5] 王 容 丽 , 李 代 渝 . 联 合 检 测 CA125 和 NSE 在 肺 癌 诊 断 和 预后 的 竟 义 [J]. 实 用 肿 瘤 杂 志 ,1999,13(2):145.[6] Toa p,Fomier M,Micel R,et al Tumour markers CEA NSESCC TAP and.CYFRA211 in respectable non small cell lung cancer[J],Anticancer Res,1999;19(4c):3613-3618.[7] 沈 云 松 , 赵 崇 吉 , 台 虹 , 等 .C-12 多 种 肿 瘤 标 志 物 蛋 白 芯 片检 测 系 统 的 临 床 评 价 [J]. 现 代 检 验 医 学 杂 志 ,2003,12,18(6):11-12.106肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会携 带 人 癌 胚 抗 原 (576-669 段 ) 和热 休 克 蛋 白 70 样 分 子 融 合 基 因 的重 组 腺 病 毒 治 疗 肿 瘤 的 实 验 研 究刘 书 逊 , 江 金 霞 , 刘 娟 , 夏 梦 , 于 益 芝 , 曹 雪 涛( 第 二 军 医 大 学 , 医 学 免 疫 学 国 家 重 点 实 验 室 & 免 疫 学 教 研 室 , 上 海 200433)摘 要 : 本 文 的 前 期 研 究 发 现 , 含 有 癌 胚 抗 原 CEA 576-669 段 和 全 长 的 Hsp70L1 蛋 白 的 融 合 蛋 白 能 够 有 效 地 诱 导 CEA抗 原 特 异 性 CTL 的 产 生 和 Th1 免 疫 应 答 反 应 , 因 此 可 以 用 于 CEA 阳 性 肿 瘤 的 治 疗 。 鉴 于 Hsp70L1 蛋 白 是 胞 内 天 然表 达 的 分 子 , 并 且 肿 瘤 抗 原 主 要 通 过 抗 原 的 胞 内 途 径 进 行 加 工 呈 递 , 因 此 我 们 通 过 同 源 重 组 方 法 构 建 了 携 带 特 异 性肿 瘤 抗 原 CEA 576-669 和 Hsp70L1 融 合 基 因 的 腺 病 毒 载 体 (AdCEA 576-669 hsp70L1), 并 利 用 此 重 组 腺 病 毒 载 体 转 染 人 树 突状 细 胞 (dendritic cell,DC) 和 外 周 血 单 个 核 细 胞 (peripheral blood monoclear cell, PBMC), 观 察 AdCEAhsp70L1 修 饰 的树 突 状 细 胞 (AdCEA 576-669 hsp70L1-DC) 的 表 型 特 点 、 功 能 状 态 以 及 诱 导 CEA 特 异 性 CTL 的 活 性 , 以 及 AdCEA 576-669hsp70L1 修 饰 的 PBMC(AdCEA 576-669 hsp70L1-PBMC) 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 活 性 。 研 究 证 明 ,AdCEA576-669hsp70L1-DC具 有 成 熟 DC 的 表 性 特 征 和 功 能 , 可 以 有 效 诱 导 针 对 CEA576-669 抗 原 特 异 性 的 杀 伤 性 T 细 胞 生 成 , 后 者 能 够 有 效的 杀 伤 CEA+ 肿 瘤 细 胞 。 此 外 ,AdCEA 576-669 hsp70L1-PBMC 能 够 有 效 地 杀 伤 多 种 肿 瘤 细 胞 , 其 中 NK 细 胞 的 活 性 明 显增 强 。 因 此 , AdCEA 576-669 hsp70L1-DC 或 者 AdCEA 576-669 hsp70L1 体 内 直 接 应 用 可 以 作 为 治 疗 性 疫 苗 , 应 用 于 CEA+ 或 者多 种 肿 瘤 的 治 疗 。关 键 词 : 热 休 克 蛋 白 70 样 分 子 ; 癌 胚 抗 原 ; 重 组 腺 病 毒 ; 树 突 状 细 胞 ; 肿 瘤 免 疫肿 瘤 基 础107

THE THERAPEUTIC EFFECT OFRECOMBINANT ADENOVIRUS CARRYINGFUSION GENE ENCODING HUMAN CEA 576-669AND HEAT SHOCK PROTEIN 70-LIKEPROTEIN ON TUMOR:ACT ON DENDRITICCELLS AND NK CELLSLIU Shuxun, JIANG Jinxia, LIU Juan, XIA Meng, YU Yizhi, CAO Xuetao(National Key Laboratory of Medical Immunology & Institute of Immunology,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)Abstract: Objective: Recombinant fusion protein containing the CEA576-669 fragment of the carcinoembryonic antigen andhuman heat shock 70-like protein 1 (Hsp70L1) has been revealed to have potent capability to induce CEA-specific CD8+ CTL andTh1 responses. The aim of this study is to investigate whether intracellular expression of CEA576-669hsp70L1 has the ability to in 鄄duce CEA-specific CTL and Th1 response, and thereby to induce anti-tumor immunity. Methods: Recombinant adenovirus carryingfusion gene of CEA576-669 and Hsp70L1 were constructed, and anti-tumor activity of AdCEA576-669hsp70L1-transfected den 鄄dritic cells (AdCEA576-669hsp70L1-DC) or peripheral blood cells (AdCEA576-669hsp70L1-PBMC) was evaluated. Results: Ad 鄄CEA576-669hsp70L1-transfected DC displayed mature DC feature, characterized by high expression of CD86 and HLA-DR and po 鄄tent induction of allo-T responses, and had potent capability to induce CEA-specific CTL which mediated cytotoxicity to CEA+ tumorcells. AdCEA576-669hsp70L1-transfected PBMCs had potent cytotoxicity to several tumor types, of which CD56+ NK cells were ob 鄄viously activated. Conclusion: In vitro adminstration of AdCEA576-669hsp70L1 or AdCEA576-669hsp70L1-DC provide potentialnovel therapeutic methods to be used in the treatment of tumors.Keywords: heat shock protein 70-like protein; CEA; recombinant adenovirus; dendritic cell; tumor immunity1 前 言肿 瘤 视 为 当 今 社 会 威 胁 人 类 健 康 的 首 位 死 亡 因素 , 探 索 其 发 病 机 制 以 及 寻 找 有 效 的 治 疗 手 段 是 当今 生 物 医 学 领 域 所 面 临 的 巨 大 挑 战 之 一 。 对 肿 瘤 抗原 的 免 疫 识 别 和 免 疫 应 答 是 诱 导 抗 肿 瘤 免 疫 应 答 的中 心 环 节 , 因 此 如 何 增 强 机 体 对 肿 瘤 的 免 疫 识 别 和应 答 能 力 , 激 发 出 有 效 的 抗 肿 瘤 抗 原 的 免 疫 应 答 , 成为 攻 克 肿 瘤 的 关 键 , 这 是 当 前 免 疫 学 领 域 的 共 识 , 也成 为 抗 肿 瘤 新 药 研 发 的 一 个 中 心 环 节 。 机 体 内 的 抗肿 瘤 免 疫 主 要 来 自 于 : 属 于 适 应 性 免 疫 系 统 的 识 别肿 瘤 抗 原 的 特 异 性 杀 伤 性 T 细 胞 以 及 属 于 固 有 免 疫系 统 的 NK 细 胞 。 如 何 增 强 这 两 大 类 免 疫 效 应 细 胞108肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会对 肿 瘤 抗 原 的 识 别 以 及 激 活 它 们 的 杀 伤 功 能 是 肿 瘤免 疫 治 疗 的 宗 旨 。树 突 状 细 胞 是 机 体 中 功 能 最 多 样 性 的 抗 原 提 呈[1]细 胞 , 是 联 络 固 有 免 疫 和 适 应 性 免 疫 的 桥 梁 。 成 熟树 突 状 细 胞 主 要 发 挥 激 发 和 增 强 免 疫 应 答 的 功 能 ,介 导 体 内 抗 感 染 和 抗 肿 瘤 免 疫 应 答 ; 未 成 熟 的 树 突状 细 胞 主 要 发 挥 负 向 调 控 免 疫 应 答 的 功 能 , 介 导 自[1]身 免 疫 耐 受 。 树 突 状 细 胞 的 成 熟 状 态 受 控 于 体 内 微环 境 , 当 微 环 境 因 素 激 活 树 突 状 细 胞 内 的 促 进 成 熟的 信 号 后 , 树 突 状 细 胞 则 成 熟 ; 反 之 , 激 活 其 内 部 抑制 成 熟 的 信 号 后 , 树 突 状 细 胞 则 展 现 未 成 熟 特 征 。 许多 肿 瘤 疾 病 患 者 存 在 免 疫 功 能 的 低 下 , 这 源 于 肿 瘤释 放 的 多 种 免 疫 抑 制 性 因 子 , 这 些 免 疫 抑 制 性 因 子强 烈 抑 制 了 树 突 状 细 胞 的 成 熟 , 此 外 一 些 肿 瘤 细 胞具 有 低 免 疫 原 性 的 特 点 , 这 些 特 点 共 同 导 致 了 肿 瘤[2]逃 避 和 抑 制 机 体 免 疫 系 统 的 识 别 和 攻 击 。 因 此 , 如何 改 善 肿 瘤 患 者 体 内 的 免 疫 抑 制 状 态 和 增 加 肿 瘤 抗原 的 免 疫 原 性 是 设 计 和 发 展 抗 肿 瘤 新 药 的 先 进 手 段 。热 休 克 蛋 白 (Heat shock protein, hsp) 是 一 类 在 生物 进 化 中 高 度 保 守 、 广 泛 存 在 于 原 核 及 真 核 生 物 中的 一 类 蛋 白 质 , 是 生 物 细 胞 应 激 反 应 的 诱 导 产 物 ,hsp 在 机 体 的 免 疫 反 应 过 程 中 发 挥 着 重 要 作 用 , 通 过参 与 抗 原 加 工 递 呈 、 促 进 抗 原 提 呈 细 胞 和 T 细 胞 活化 等 重 要 的 生 理 过 程 , 与 机 体 的 抗 肿 瘤 免 疫 、 抗 感 染免 疫 、 自 身 免 疫 性 疾 病 等 生 理 及 病 理 机 制 密 切 相 关 ,[3]是 一 类 重 要 的 免 疫 分 子 。我 们 经 对 人 树 突 状 细 胞 的 大 规 模 测 序 , 自 主 发现 的 一 种 新 型 免 疫 分 子 , 与 热 休 克 蛋 白 70 分 子 具 有同 源 性 , 命 名 为 人 热 休 克 蛋 白 70 样 分 子 (Hsp70L1)。前 期 研 究 发 现 , 重 组 的 Hsp70L1 分 子 在 体 外 应 用 能够 诱 导 人 树 突 状 细 胞 成 熟 活 化 , 非 特 异 的 增 强 Th1[4]型 免 疫 应 答 的 功 能 。 将 人 癌 胚 抗 原 CEA 的 部 分 基因 与 Hsp70L1 全 长 基 因 的 融 合 基 因 , 经 体 外 原 核 表达 的 融 合 蛋 白 (CEAhsp70L1) 在 体 内 和 体 外 应 用 可 以[5]显 著 地 诱 导 出 抗 CEA 特 异 性 的 CTL 应 答 。 虽 然 该融 合 蛋 白 显 示 了 具 有 很 好 的 诱 导 抗 CEA 特 异 性 免疫 应 答 的 活 性 , 但 是 该 融 合 蛋 白 体 外 表 达 的 效 率 较低 , 目 前 尚 未 建 立 成 熟 的 大 规 模 的 制 备 工 艺 。 更 重 要的 是 ,hsp70L1 是 天 然 表 达 在 胞 内 的 分 子 , 而 且 肿 瘤抗 原 的 加 工 递 呈 主 要 通 过 MHC-I 介 导 的 胞 内 途 径进 行 , 而 许 多 研 究 表 明 热 休 克 蛋 白 可 以 作 为 伴 侣 分[6]子 促 进 NHC-I 类 途 径 介 导 的 胞 内 抗 原 的 加 工 递 呈 ,是 否 Hsp70L1 分 子 也 具 有 这 种 功 能 , 目 前 是 能 够 不清 楚 。 在 此 基 础 上 , 我 们 构 建 了 携 带 该 融 合 基 因 的 重组 腺 病 毒 , 研 究 了 该 重 组 腺 病 毒 (AdCEAhsp70L1) 经体 外 转 染 树 突 状 细 胞 (AdCEAhsp70L1-DC) 的 诱 导 抗原 特 异 性 免 疫 应 答 以 及 抗 CEA 阳 性 肿 瘤 的 活 性 , 以及 AdCEAhsp70L1 转 染 的 外 周 血 单 个 核 细 胞 (PBMC)中 NK 细 胞 的 活 性 以 及 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 活 性 。2 实 验 试 剂 和 方 法2.1 主 要 实 验 试 剂 和 仪 器人 外 周 血 单 个 核 细 胞 主 要 购 于 长 海 医 院 血 库 。人 重 组 GM-CSF 和 IL-4 主 要 购 置 于 Peprotech 公司 。 免 疫 磁 珠 购 于 Miltenyi Biotech 公 司 。 CAP-1-HLA-A.1 四 聚 体 购 自 ProImmune 公 司 ; ELISPOT 试剂 盒 (IFN-γ) 和 免 疫 荧 光 抗 体 购 自 B.D.Pharmingen公 司 。 流 式 细 胞 仪 (FACSCalibur) 购 自 B.D.Biosicense公 司 。2.2 单 核 细 胞 来 源 DC(MoDC) 的 诱 导[4]MoDC 的 体 外 诱 导 详 见 参 考 文 献 。2.3 重 组 腺 病 毒 转 染收 集 培 养 6d 的 MoDC 或 新 鲜 分 离 的 PBMC, 调整 浓 度 为 107 个 细 胞 /mL; 按 照 MOI=10-1000:1, 分别 用 AdLacZ 或 AdCEAhsp70L1 感 染 ,4h 后 洗 去 游 离病 毒 , 继 续 培 养 24h, 然 后 收 集 MoDC 或 PBMC。2.4 CEA 抗 原 特 异 性 CTL 的 诱 导选 取 HLA-A2 阳 性 外 周 血 单 个 核 细 胞 , 如 上 获得 HLA-A2+MoDC, 并 进 行 重 组 Ad 感 染 ,48h 后 收 集肿 瘤 基 础109

MoDC, 分 装 成 4 份 ; 一 份 与 自 身 CD3+T 淋 巴 细 胞 按照 1:20 的 比 例 混 合 培 养 , 其 余 3 份 冻 存 。 培 养 7 d后 , 复 苏 一 支 冻 存 的 MoDC, 将 其 按 照 同 样 比 例 加 入到 混 合 培 养 体 系 中 , 培 养 3 d 后 , 添 加 人 IL-2(100U/mL), 继 续 培 养 。 同 法 进 行 第 3 个 循 环 的 刺 激 。 在 21d 后 , 进 行 如 下 检 测 :1) HLA-A2.1-CAP-1 四 聚 体 ;2)CEA576-669 抗 原 特 异 性 CD8+ T 细 胞 分 泌 IFN-γ的 ELISPOT 检 测 ;3) 杀 伤 CEA 阳 性 肿 瘤 检 测 。2.5 流 式 细 胞 仪 检 测[4]细 胞 表 面 和 胞 内 分 子 标 记 和 检 测 参 见 文 献 。 在杀 伤 实 验 中 , 肿 瘤 细 胞 预 先 用 CFSE 标 记 , 在 杀 伤 结束 后 , 于 上 机 前 5 min 加 入 7-AAD, 然 后 分 析 CFSE+7-AAD+ 细 胞 比 例 。2.6 WB 检 测抗 CEA 576-669 hsp70L1 由 京 天 成 生 物 技 术 有 限 公司 制 备 。 蛋 白 裂 解 物 制 备 、SDS-PAGE 电 泳 、 转 膜 、 免[4]疫 印 记 和 检 测 见 参 考 文 献 。2.7 ELISPOT 检 测分 离 AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 的 自 身 MoDC 与T 共 培 养 体 系 中 的 CD8+T 淋 巴 细 胞 , 与 复 苏 的 AdCEAhsp70L1 转 染 的 自 身 MoDC 按 照 5∶1 比 例 培 养 ,体 系 中 添 加 人 CEA 576-669 蛋 白 (10μg/mL), 培 养 至 包 被有 抗 人 IFN-γ 的 96 孔 培 养 板 , 培 养 3 d 后 终 止 , 按照 ELISPOT 说 明 书 进 行 IFN-γ 分 泌 斑 点 的 检 测 。3 实 验 结 果3.1 重 组 腺 病 毒 转 染 的 人 树 突 状 细 胞 表 达CEA 576-669 hsp70L1 的 水 平应 用 重 组 腺 病 毒 分 别 感 染 人 MoDC, 在 48 h 后采 用 WB 检 测 融 合 基 因 和 蛋 白 CEA 576-669 hsp70L1 的表 达 。 如 图 1, AdCEA 576-669 hsp70L1 感 染 的 人 MoDC表 达 CEA 576-669 hsp70L1 融 合 蛋 白 的 水 平 显 著 高 于 未转 染 组 和 Ad LacZ 转 染 组 。 表 明 ,AdCEA 576 -669hsp70L1 感 染 的 人 MoDC 可 以 特 异 性 的 在 胞 内 高表 达 CEA 576-669 hsp70L1 蛋 白 。AdCEA 576-669 hsp70L1 分 别 以 MOI=10,100,300 感染 人 MoDC,48h 后 WB 检 测 CEA 576-669 hsp70L1 的 表达 (66KD)。 上 述 结 果 来 自 3 次 独 立 实 验 中 的 一 个 代表 性 实 验 。图 1 AdCEA 576-669 hsp70L1 感 染 的 人 MoDC 特 异性 高 表 达 CEA 576-669 hsp70L1 蛋 白 。3.2 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC 具有 成 熟 DC 的 表 型 和 功 能我 们 应 用 流 式 细 胞 仪 检 测 了 AdCEAhsp70L1 转染 的 人 MoDC 的 表 型 以 及 刺 激 同 种 T 淋 巴 细 胞 增 殖的 水 平 。 AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 的 人 MoDC 表 达 共刺 激 分 子 CD86,MHCII 分 子 -HLA-DR, 以 及 粘 附 分子 CD54, 结 果 显 示 , 与 未 感 染 组 和 AdLacZ 组 比 较 ,重 组 腺 病 毒 AdCEA 576 -669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人MoDC 表 达 共 刺 激 分 子 CD54、CD86 和 MHC-II 分 子的 水 平 上 调 ( 图 2A)。 与 未 感 染 组 和 AdLacZ 组 比 较 ,重 组 腺 病 毒 Ad CEA 576 -669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人MoDC 刺 激 同 种 CD3+ T 淋 巴 细 胞 增 殖 的 水 平 上 调( 图 2B)。 上 述 结 果 表 明 , 重 组 AdCEA 576-669 hsp70L1 基因 修 饰 的 人 MoDC 的 具 有 成 熟 活 化 DC 的 功 能 特 点 。图 2 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC高 表 达 CD86, HLA-DR 和 CD54, 以 及 具 有 更 强 的 刺激 同 种 T 淋 巴 细 胞 增 殖 的 活 性110肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会A:FACS 检 测 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的人 MoDC 表 达 CD86,HLA-DR 和 CD54 的 水 平 ;B:AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC 与 CFSE 标记 的 同 种 CD4+T 细 胞 以 1:20 比 例 共 培 养 5 d, 然 后FACS 检 测 T 细 胞 的 增 殖 。 上 述 结 果 来 自 3 次 独 立 实验 中 的 一 个 代 表 性 实 验 。3.3 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC 能够 诱 导 CEA 抗 原 特 异 性 CTL 产 生 , 并 杀 伤 CEA 阳性 肿 瘤 细 胞因 为 CEA 576-669 含 有 人 HLA-A2.1 限 制 性 表 位CAP-1 (CEA605-613), 因 此 我 们 选 取 HLA-A2+ 的MoDC, 进 行 AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 , 获 得 HLA-A2+ 的 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 MoDC。 然 后 与自 身 CD3+T 淋 巴 细 胞 混 合 培 养 。 在 完 成 3 个 循 环 的自 身 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 MoDC 刺 激 后 , 我们 分 别 采 用 Tetramer 染 色 和 FACS 方 法 、ELISPOT方 法 、 以 及 杀 伤 实 验 证 实 经 的 AdCEA 576-669 hsp70L1 基因 修 饰 HLA-A2+MoDC 刺 激 的 自 身 T 细 胞 中 是 否 含有 识 别 HLA-A2.1- 抗 原 肽 (CAP-1) 的 特 异 性 T 淋 巴细 胞 、 以 及 对 CEA 阳 性 肿 瘤 的 杀 伤 活 性 。 如 图 3A: 与未 感 染 、AdLacZ 感 染 组 比 较 ,AdCEA 576-669 hsp70L1 基因 修 饰 MoDC 组 能 够 明 显 诱 导 识 别 HLA-A2.1- 抗 原肽 (CAP-1) 的 特 异 性 CD8+T 细 胞 的 生 成 ; 如 图 3B:与 未 感 染 、AdLacZ 感 染 组 比 较 , AdCEA 576-669 hsp70L1基 因 修 饰 的 人 MoDC 诱 导 的 CD8+T 细 胞 在 CEA 576-669抗 原 刺 激 后 , 出 现 IFN-γ 斑 点 的 数 量 和 斑 点 大 小 明显 增 加 ; 如 图 3C: 与 未 感 染 、AdLacZ 感 染 组 比 较 ,AdCEA 576 -669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC 诱 导 的CD8 +T 细 胞 杀 伤 CEA + 肿 瘤 细 胞 株 (LS174T 和SW480) 的 水 平 显 著 增 加 。 综 上 表 明 ,AdCEA 576 -669hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 MoDC 组 能 够 显 著 诱 导 识别 CEA 抗 原 特 异 性 的 CD8+T 细 胞 生 成 , 并 能 够 杀 伤CEA+ 肿 瘤 细 胞 。图 3 AdCEA576 -669hsp70L1 基 因 修 饰 的 人MoDC 能 够 诱 导 识 别 HLA-A2.1 限 制 性 CAP-1- 抗 原肽 特 异 性 CD8+T 产 生 , 诱 导 CEA 抗 原 特 异 性 Th1 应答 , 以 及 杀 伤 CEA 阳 性 肿 瘤 细 胞 的 CTLAdCEA 576 -669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 HLA2.1 +MoDC 与 自 身 T 淋 巴 细 胞 在 1:20 比 例 共 培 养 7 d, 然后 补 充 AdCEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人 HLA2.1+MoDC, 继 续 培 养 7 d, 如 此 经 过 3 个 循 环 共 21 d, 进行 如 下 检 测 :A:FACS 检 测 T 细 胞 中 识 别 HLA-A2.1限 制 性 CAP-1- 抗 原 肽 特 异 性 CD8+T 细 胞 比 例 ;B:在 抗 原 CEA 576-669 存 在 下 , 共 培 养 体 系 中 的 T 细 胞 与自 身 MoDC 共 培 养 3 d,ELISPOT 检 测 IFN-γ 水 平 ;C: 共 培 养 体 系 中 的 T 细 胞 与 CFSE 标 记 的 CEA 阳 性肿 瘤 细 胞 共 培 养 18 h,FACS 检 测 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 情况 。 上 述 结 果 来 自 3 次 独 立 实 验 中 的 一 个 代 表 性 实 验 。3.4 重 组 AdCEA 576 -669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 人PBMC, 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 能 力 明 显 增 加鉴 于 机 体 内 的 抗 肿 瘤 免 疫 主 要 效 应 细 胞 是CD8+CTL 和 天 然 免 疫 系 统 的 NK 细 胞 , 此 外 , 将 来 应用 重 组 AdCEA 576-669 hsp70L1 治 疗 肿 瘤 有 可 能 采 用 静脉 途 径 , 因 此 我 们 观 察 了 AdCEA 576-669 hsp70L1 介 导 的CEA 576-669 hsp70L1 基 因 修 饰 的 PBMC 是 否 对 肿 瘤 细 胞具 有 杀 伤 效 应 。 如 表 1, 与 未 转 染 组 和 AdLacZ 转 染组 比 较 ,AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 的 PBMC 对 各 种 肿瘤 细 胞 均 具 有 更 强 的 杀 伤 效 应 , 提 示 AdCEA 576 -669hsp70L1 有 可 能 通 过 作 用 于 NK 细 胞 , 介 导 NK 细胞 的 功 能 活 化 , 非 特 异 性 的 杀 伤 肿 瘤 。 为 了 验 证 此 设想 , 我 们 进 一 步 观 察 了 AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 的肿 瘤 基 础111

NK 细 胞 分 泌 IFN-γ 水 平 , 发 现 与 未 转 染 组 和 Ad-LacZ 转 染 组 比 较 ,AdCEA 576-669 hsp70L1 转 染 的 PBMC中 分 泌 IFN-γ 的 CD56+NK 细 胞 比 例 显 著 上 升 ( 图 4)。表 明 AdCEA 576-669 hsp70L1 介 导 的 CEA 576-669 hsp70L1 基因 修 饰 可 以 增 强 NK 细 胞 杀 伤 肿 瘤 细 胞 的 功 能 。表 1 重 组 腺 病 毒 转 染 的 人 PBMC 对 肿 瘤 细 胞 的杀 伤肿 瘤 类 型未 转 染 组CFSE+7-AAD+ 肿 瘤 细 胞 比 例 (%)AdLacZ转 染 组AdCEA 576-669hsp70L1 转 染 组7721 9.33(1.56) 26.77(5.86) 38.44(6.89)*Lovo 22.62(18.26) 30.99(15.63) 49.20(12.47)*LS174T 8.38(4.23) 15.49(4.85) 49.87(18.65)*MCF7 16.47(5.63) 7.69(2.56) 30.77(6.96)*SW48 19.05(6.83) 28.57(7.86) 57.88(3.69)*SW480 17.18(12.03) 27.27(10.36) 41.76(5.89)*SW620 28.70(12.63) 22.84(13.10) 45.58(7.97)*注 : 采 用 重 组 腺 病 毒 (AdLacZ 和 AdCEAhsp70L1)分 别 转 染 人 PBMC (MOI=300),24 h 后 与CFSE 标 记 的 肿 瘤 细 胞 (100:1) 共 培 养 18 h,FACS 检测 肿 瘤 细 胞 的 死 亡 情 况 (CFSE+7-AAD+%)。 *:P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会避 抗 原 特 异 性 CTL 的 识 别 。 既 然 AdCEA 576-669 hsp70L1转 染 的 DC 能 够 上 调 DC 表 面 的 MHC-I- 抗 原 肽 的 表达 , 是 否 该 重 组 腺 病 毒 转 染 肿 瘤 细 胞 后 也 具 有 这 种效 果 。 如 果 是 , 这 就 为 我 们 基 于 该 重 组 腺 病 毒 的 基 因治 疗 方 案 提 供 了 另 一 个 可 以 尝 试 的 途 径 - 瘤 内 注 射 ,探 讨 瘤 内 注 射 、 或 联 合 静 脉 注 射 等 其 他 途 径 方 式 , 观察 基 于 该 重 组 腺 病 毒 的 多 种 基 因 治 疗 方 案 的 抗 瘤 效果 。 因 此 , 在 临 床 前 研 究 中 还 需 要 完 善 多 种 免 疫 治 疗方 案 , 寻 找 到 具 有 最 佳 抗 瘤 效 果 的 免 疫 治 疗 方 案 。在 应 用 AdCEA 576-669 hsp70L1 治 疗 肿 瘤 的 新 药 研发 中 , 还 有 许 多 尚 未 解 决 的 问 题 , 我 们 的 最 为 担 心 的一 个 问 题 是 , 因 为 Hsp70L1 具 有 非 特 异 性 的 免 疫 佐剂 效 应 , 是 否 增 加 体 内 产 生 自 身 免 疫 应 答 的 危 险 性 。由 于 腺 病 毒 介 导 了 CEA 抗 原 的 转 移 , 是 否 CEA 抗 原能 够 异 位 表 达 在 其 他 正 常 组 织 , 从 而 激 发 体 内 的 针对 自 身 组 织 的 免 疫 应 答 。 所 以 , 在 该 重 组 腺 病 毒 的 安全 性 评 价 中 , 需 要 着 重 考 虑 这 种 可 能 性 , 观 察 体 内 产生 针 对 自 身 组 织 的 自 身 抗 体 等 自 身 免 疫 应 答 反 应指 标 。综 上 , 本 文 课 题 进 行 了 一 个 兼 具 免 疫 佐 剂 效 应和 肿 瘤 特 异 性 抗 原 两 种 特 点 的 重 组 腺 病 毒 的 抗 瘤 药效 学 研 究 , 发 现 该 重 组 腺 病 毒 能 够 在 体 外 激 发 出 肿瘤 抗 原 特 异 性 CTL 和 NK 细 胞 介 导 的 非 特 异 性 杀 伤肿 瘤 的 活 性 , 为 我 们 下 一 步 完 善 基 于 该 重 组 腺 病 毒的 基 因 治 疗 方 案 提 供 了 可 靠 的 依 据 , 也 为 我 们 提 出了 深 入 探 讨 基 于 Hsp70L1 的 分 子 机 制 的 问 题 , 同 时在 推 动 该 重 组 腺 病 毒 进 入 临 床 治 疗 肿 瘤 过 程 中 还 需要 关 注 自 身 免 疫 应 答 等 危 险 性 , 相 信 随 着 上 述 问 题的 逐 步 阐 明 , 有 可 能 为 将 来 的 临 床 治 疗 肿 瘤 提 供 一个 新 的 基 因 治 疗 新 药 。参 考 文 献[1] Bousso P. T-cell activation by dendritic cells in the lymphnode: lessons from the movies[J]. Nat Rev Immunol. 2008 8(9):675-684.[2] Ma Y, Aymeric L, Locher C, Kroemer G, Zitvogel L. Thedendritic cell -tumor cross -talk in cancer [J]. Curr Opin Immunol.2011,23(1):146-152.[3] Calderwood SK, Theriault JR, Gong J. Message in a bottle:role of the 70-kDa heat shock protein family in anti-tumor immunity[J]. Eur J Immunol. 2005 Sep;35(9):2518-2527.[4] Wan T, Zhou X, Chen G, An H, Chen T, Zhang W, Liu S,Jiang Y, Yang F, Wu Y, Cao X. Novel heat shock protein Hsp70L1activates dendritic cells and acts as a Th1 polarizing adjuvant. Blood.2004, 103(5):1747-1754.[5] Wu Y, Wan T, Zhou X, Wang B, Yang F, Li N, Chen G, DaiS, Liu S, Zhang M, Cao X. Hsp70-like protein 1 fusion protein enhancesinduction of carcinoembryonic antigen -specific CD8 + CTLresponse by dendritic cell vaccine [J]. Cancer Res. 2005, 65 (11):4947-4954.[6] Tobian AA, Canaday DH, Boom WH, Harding CV. Bacterialheat shock proteins promote CD91 -dependent class I MHC cross -presentation of chaperoned peptide to CD8 + T cells by cytosolicmechanisms in dendritic cells versus vacuolar mechanisms inmacrophages[J]. J Immunol. 2004 May 1;172(9):5277-5286.[7] Eagle RA, Trowsdale J. Promiscuity and the single receptor:NKG2D[J]. Nat Rev Immunol. 2007, 7(9):737-744.肿 瘤 基 础113

饲 喂 来 福 美 胶 囊 后 小 鼠 对药 物 损 伤 的 耐 力 实 验赵 岩 , 赵 维 诚( 辽 宁 省 肿 瘤 医 院 , 辽 宁 省 肿 瘤 研 究 所 , 沈 阳 市 )摘 要 : 目 的 : 观 察 饲 喂 来 福 美 胶 囊 后 小 鼠 对 抗 药 物 对 机 体 损 伤 的 调 节 与 修 复 作 用 , 并 从 氧 化 损 伤 角 度 探 讨 其 可能 机 制 。 方 法 : 饲 喂 来 福 美 后 小 鼠 使 用 环 磷 酰 胺 建 立 损 伤 模 型 , 观 察 不 同 剂 量 来 福 美 对 上 述 模 型 动 物 不 同 指 标的 影 响 。 结 果 : 实 验 数 据 显 示 了 来 福 美 胶 囊 的 调 节 作 用 。 结 论 : 来 福 美 具 有 明 显 增 强 机 体 对 抗 药 物 损 伤 后 的 细 胞 修 复作 用 。关 键 词 : 生 物 酶 ; 谷 胱 甘 肽 ; 超 氧 化 物 歧 化 酶 ; 氧 自 由 基 ; 环 磷 酰 胺 ; 游 泳 时 间THE PRIMARY RESTORATIONMECHANISM OF LIFE ENZYME ONCP-DESTORIED MICE MODELZHAO Yan,ZHAO Weicheng(Cancer Hospital of Liaoning Province, Cancer Institute of Liaoning Province, Shenyang, China)Abstract: Objective: To study the adjustment and repiremet effect of Life Enzyme in CP-destoried mice model, and to explovethe possible mechanisms. Changes in the physiological function of experimental animals were observed by feeding Life Enzyme andadministrating CP at the same time. Methods: The whole experimental animals were divided into four groups including the control,CP, Life Enzyme and Life Enzyme +CP. Results: There were significant differences in weight, PLT, SOD in liver and swimming timeof experimental groups compared with the control. (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会观 察 喂 服 来 福 美 胶 囊 后 小 鼠 对 抗 药 物 对 机 体 损伤 的 调 节 与 修 复 作 用 , 并 从 氧 化 损 伤 角 度 探 讨 其 可能 机 制 。 来 福 美 是 一 种 从 发 芽 玉 米 中 提 取 的 纯 天 然植 物 保 健 品 , 含 有 丰 富 的 植 物 激 素 、 天 然 色 素 、 蛋 白多 肽 、 微 量 元 素 、 生 物 酶 ( 谷 胱 甘 肽 是 唯 一 可 抵 御 非生 物 自 由 基 的 物 质 ) 等 , 对 机 体 有 较 强 的 抗 氧 化 、 抗衰 老 及 免 疫 增 强 作 用 , 这 些 天 然 物 质 具 有 预 防 细 胞和 器 官 衰 老 和 抗 病 生 理 功 能 ; 可 在 脂 质 氧 化 过 程 中清 除 氧 自 由 基 ( 生 物 氧 自 由 基 和 非 生 物 氧 自 由 基 ) 对细 胞 和 器 官 造 成 的 损 伤 ; 有 文 献 报 道 : 在 对 临 床 患 者遇 到 辐 射 损 伤 , 药 物 损 伤 后 有 较 强 的 修 复 能 力 , 本 产品 可 诱 发 机 体 产 生 强 有 力 应 激 反 应 , 而 宿 主 的 应 激反 应 , 对 控 制 相 关 病 变 具 有 十 分 重 要 的 作 用 。 为 了 验证 来 福 美 胶 囊 对 机 体 损 伤 的 调 节 与 修 复 作 用 , 课 题组 采 用 SPF 级 KM 种 小 鼠 , 经 来 福 美 胶 囊 进 行 干 预后 , 制 造 药 物 损 伤 模 型 , 再 用 来 福 美 胶 囊 进 行 修 复 作用 的 观 察 实 验 。 同 时 每 组 6 只 小 鼠 进 行 耐 力 实 验 , 观察 受 试 动 物 游 泳 开 始 至 死 亡 的 时 间 。1 材 料 与 方 法1.1 实 验 材 料1.1.1 受 试 药 物 : 来 福 美 为 白 色 胶 囊 , 批 号 :2009/12/23, 批 准 文 号 : 卫 食 健 字 (2003) 第 0457 号 , 执 行 标准 :O/DKLF.J.001-2002, 胶 囊 内 为 白 色 疏 松 颗 粒 , 易溶 于 水 , 含 量 以 sod 计 为 378800U/100 克 , 样 品 由 辽宁 成 大 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供 , 实 验 室 普 通 冰 箱 4℃下 避 光 、 密 封 保 存 , 实 验 前 去 胶 囊 用 生 理 盐 水 配 制 。化 疗 药 物 : 注 射 用 环 磷 酰 胺 针 剂 (CP),0.2g/ 支 , 内 为白 色 粉 末 , 透 明 玻 璃 瓶 包 装 铝 塑 封 口 ; 批 号 08071721,批 准 文 号 : 国 药 准 字 021057, 购 自 江 苏 恒 瑞 医 药 股 份有 限 公 司 。 对 照 药 物 : 匹 多 莫 得 口 服 液 , 规 格 400/7mL/ 每 支 , 样 品 内 为 红 色 透 明 液 体 , 透 明 玻 璃 瓶 包 装白 塑 封 口 ; 批 号 :09013, 进 口 注 册 证 号 :H20070015,购 自 普 利 化 学 工 业 公 司 意 大 利 多 泊 药 业 有 限 公 司 。溶 剂 对 照 : 氯 化 钠 注 射 液 , 批 号 :07080604, 批 准 文号 : 国 药 准 字 H21020984,250mL/ 支 , 购 自 沈 阳 志 鹰制 药 厂 。 剂 量 分 组 : 实 验 组 的 高 剂 量 为 1.8g/kg, 中 剂量 为 1.2g/kg, 低 剂 量 为 0.6g/kg; 对 照 组 的 匹 多 莫 得 口服 液 低 剂 量 为 13.3mg/kg; 中 剂 量 为 133mg/kg; 高 剂量 为 267mg/kg; 生 理 盐 水 对 照 (NS), 使 用 等 容 量 的 生理 盐 水 。 剂 量 确 定 :1) 来 福 美 药 物 剂 量 根 据 厂 家 提 供临 床 有 效 剂 量 0.6g/kg( 人 体 质 量 按 60kg 计 );2) 匹 多莫 得 口 服 液 , 说 明 书 提 供 临 床 有 效 剂 量 为 13.3mg/kg; 3) 化 疗 剂 量 根 据 《 医 学 动 物 学 实 验 方 法 》。1.1.2 试 剂 盒 : 谷 胱 甘 肽 (GSH)( 除 蛋 白 ) 测 定 试剂 盒 购 自 南 京 建 成 科 技 有 限 公 司 , 批 号 :20110104。超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 测 试 盒 购 自 南 京 建 成 科 技 有限 公 司 , 批 号 :20110104。1.1.3 仪 器 :20-2 型 日 立 分 光 光 度 计 。1.1.4 实 验 材 料 : 动 物 :SPF 级 KM 种 小 鼠 , 体 质量 (20±2)g, 每 次 实 验 用 同 一 性 别 , 由 中 国 科 大 学 实验 动 中 心 提 供 。 实 验 动 物 生 产 许 可 证 号 :SYXK( 辽 )2008-0005 , 小 鼠 随 机 分 组 , 每 组 16 只 ( 其 中 6 只 用于 耐 力 实 验 ), 实 验 室 饲 养 观 察 1 日 后 用 于 实 验 。 饲料 为 小 鼠 颗 粒 料 , 由 沈 阳 实 验 动 物 颗 粒 饲 料 厂 提 供 。实 验 室 温 度 :22~24℃ , 相 对 湿 度 40%~45%, 塑 料 鼠盒 体 积 29cm×18cm×12cm, 不 锈 钢 丝 顶 盖 , 白 色 塑 料水 瓶 , 不 锈 钢 嘴 胶 塞 封 口 , 饮 用 水 为 实 验 室 饮 用 水 。1.1.5 实 验 : 实 验 组 分 高 、 中 、 低 三 个 剂 量 , 以 生理 盐 水 配 制 , 每 日 口 服 灌 胃 给 药 0.2mL/ 只 , 连 续 45 d后 , 制 做 损 伤 模 型 ( 化 疗 模 型 全 过 程 停 药 10 d; 放 疗模 型 全 过 程 停 药 3 d); 继 续 给 药 45 d。 对 照 组 分 高 、中 、 低 三 个 剂 量 , 以 生 理 盐 水 配 成 ng/mL, 每 日 口 服 罐胃 给 药 0.2 mL/ 只 , 连 续 45 d, 制 做 损 伤 模 型 ( 化 疗 模型 全 过 程 停 药 10 d; 放 疗 模 型 全 过 程 停 药 3 d); 继 续给 药 45 d。 每 天 上 午 观 察 记 录 小 鼠 的 一 般 体 症 , 摄 食量 , 饮 水 量 及 死 亡 情 况 , 发 现 有 中 毒 反 应 及 行 为 异 常的 动 物 , 取 出 单 笼 饲 养 , 重 点 观 察 , 如 有 死 亡 或 频 临死 亡 的 动 物 , 及 时 做 尸 检 , 行 大 体 观 察 及 病 理 组 织 学肿 瘤 基 础115

检 查 。 100 d 后 观 察 各 组 受 试 动 物 游 泳 开 始 至 死 亡 的时 间 。 血 清 及 肝 脏 、 脾 脏 、 肾 等 脏 器 做 超 氧 化 物 歧 化酶 (SOD) 活 力 测 定 ( 黄 嘌 呤 氧 化 酶 法 )。 小 鼠 损 伤 模型 建 立 : 化 疗 药 为 环 磷 酰 胺 ( 江 苏 恒 瑞 医 药 股 份 有 限公 司 0.2g/ 瓶 ) 以 生 理 盐 水 配 成 2mg/mL, 备 用 , 腹 腔 给药 0.2mL/ 只 , 共 用 药 5 d。1.2 统 计 方 法采 用 EXCEL 数 据 库 录 用 数 据 ,SPSS11.5 进 行 实验 数 据 处 理 及 统 计 分 析 。 数 据 统 计 描 述 主 要 以 形 式表 示 。 根 据 数 据 的 正 态 性 和 方 差 齐 性 , 采 用 单 因 素 方差 分 析 ,LSD 进 行 组 间 多 重 比 较 。 检 验 水 准 α=0.05。2 结 果2.1 实 验 动 物 一 般 状 态 观 察来 福 美 胶 囊 各 剂 量 组 及 其 他 各 组 一 般 状 态 良好 , 实 验 组 前 5 d 尿 量 正 常 , 后 逐 渐 增 多 , 十 余 天 后 尿量 明 显 高 于 其 他 组 尿 量 。 实 验 组 每 日 饮 水 量 明 显 高于 其 他 组 , 饮 食 量 各 组 间 无 显 著 差 异 。 体 质 量 在 各 组间 未 见 显 著 性 差 异 (P>0.05, 图 1)实 小 6 43.77±8.99 86.95对 大 6 36.54±10.26 56.52对 中 6 37.81±6.94 60.86对 小 6 38.42±5.36 65.22注 : 与 空 白 组 相 比 ,* P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会实 验 组 优 异 于 空 白 组 。3 讨 论来 福 美 胶 囊 是 由 玉 米 中 提 取 的 纯 天 然 植 物 保 健品 , 在 发 芽 过 程 中 富 含 大 量 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 和 维生 素 E [1-2] 、 蛋 白 多 肽 、 微 量 元 素 、 生 物 酶 等 人 体 必 需的 营 养 素 , 这 些 天 然 物 质 进 入 机 体 后 可 调 动 机 体 产生 一 系 列 的 应 激 反 应 , 具 有 预 防 细 胞 和 器 官 衰 老 和抗 病 生 理 功 能 ; 说 明 书 提 示 本 品 含 有 大 量 SOD、GSH等 酶 类 , 在 机 体 内 , 由 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)、 谷 胱 甘肽 过 氧 化 物 酶 (GPx)、 谷 胱 甘 肽 S- 转 移 酶 (GST) 等 组成 的 抗 氧 化 酶 系 统 的 协 同 作 用 , 能 够 清 除 多 余 的 活性 氧 物 种 (ROS) 使 得 ROS 浓 度 维 持 在 正 常 的 生 理 范围 内 , 维 持 氧 化 - 抗 氧 化 平 衡 , 这 对 于 细 胞 行 使 正 常 的生 理 功 能 及 适 应 各 种 生 长 环 境 至 关 重 要 。 SOD( 超 氧化 物 歧 化 酶 ) 是 一 种 源 于 生 命 体 的 活 性 物 质 , 能 消 除生 物 体 在 新 陈 代 谢 过 程 中 产 生 的 有 害 物 质 ;SOD 具有 抗 衰 老 的 特 殊 效 果 。 SOD 是 生 物 体 内 抗 氧 化 能 力最 强 的 酶 类 , 其 活 性 的 高 低 与 衰 老 、 肿 瘤 和 突 变 密 切[3]相 关 。 而 自 由 基 的 活 性 之 一 , 表 现 在 脂 质 过 氧 化 作用 , 主 要 攻 击 生 物 膜 中 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 , 造 成 组 织[8]细 胞 膜 毒 性 反 应 , 化 疗 剂 则 可 能 通 过 活 性 氧 自 由 基发 挥 这 种 细 胞 毒 作 用 。 饲 喂 来 福 美 补 充 了 多 不 饱 和脂 肪 酸 和 维 生 素 E 等 营 养 素 , 可 能 阻 断 了 这 种 攻 击[4]作 用 , 或 干 扰 细 胞 氧 化 和 脂 质 过 氧 化 的 途 径 , 从 而保 护 和 促 进 了 抗 氧 化 活 性 。饲 喂 来 福 美 补 充 了 大 量 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 和 维生 素 E [1-2] 、 蛋 白 多 肽 、 微 量 元 素 、 生 物 酶 等 人 体 必 需的 营 养 素 , 使 小 鼠 游 泳 时 间 延 长 , 这 种 抗 疲 劳 的 作 用[5]可 能 与 多 不 饱 和 脂 肪 酸 有 关 。总 之 , 来 福 美 对 生 物 体 的 免 疫 、 抗 氧 化 、 抗 疲 劳肾 小 球 及 肾 小 管 分 布 规 则 , 肾 小 管 细 胞 及 肾 小 球细 胞 无 异 常肝 小 叶 结 构 正 常 , 肝 细 胞 索 环 绕 中 心 静 脉 , 肝 细胞 大 小 均 匀脾 结 构 正 常 , 淋 巴 细 胞 分 布 正 常 , 脾 窦 规 则胰 腺 小 叶 结 构 正 常 , 腺 上 皮 细 胞 大 小 均 匀肿 瘤 基 础117

有 一 定 影 响 , 产 生 不 同 的 调 理 作 用 , 但 其 详 细 的 作 用机 制 尚 待 研 究 。参 考 文 献[1] 田 仁 村 . 谷 类 油 脂 . 第 1 版 . 北 京 : 科 学 出 版 社 ,1983:25-28.[2] 赵 长 峰 , 徐 贵 发 , 韩 玉 荣 , 等 . 麦 胚 营 养 成 分 测 定 与 分 析 [J].实 用 营 养 杂 志 ,1996,3(1):21-22.[3] 张 培 彤 , 张 莹 . SOD 与 恶 性 肿 瘤 的 治 疗 与 预 防 [J]. 肿 瘤 防治 研 究 ,1994,21(1):58-59.[4] Okada S. Iron-induced tissue damage and cancer the role ofreactive oxygen species-free readicals [J]. Pathol Int,1996,46:311-312.[5] 吴 自 豪 . 肿 瘤 恶 病 质 机 制 与 防 治 对 策 [J]. 肠 外 与 肠 内 营养 ,2000,7(3):182-187.118肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会新 疆 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 鳞 癌C/EBPα 基 因 突 变 分 析潘 泽 民 , 郑 威 楠 , 张 鑫 芝 , 李 冬 妹 , 高 蕊 , 刘 引 引 , 李 星 ,康 华 丽 , 蒋 旭 鹏 , 张 东 辉( 石 河 子 大 学 医 学 院 生 物 化 学 教 研 室 , 新 疆 地 方 与 民 族 高 发 病 教 育 部 重 点 实 验 室 , 新 疆 石 河 子 832002)摘 要 : 目 的 : 本 研 究 探 讨 新 疆 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 鳞 癌 组 织 C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显 子 区 域 基 因 突 变和 多 态 性 。 方 法 : 收 集 12 例 维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌 组 织 和 2 例 子 宫 颈 正 常 组 织 。 提 取 基 因 组 DNA, C/EBPα 基 因 启 动子 500bp 和 外 显 子 区 域 共 设 计 6 对 引 物 , 扩 增 6 个 片 段 。 结 果 : 通 过 PCR 扩 增 和 基 因 测 序 , 在 维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌 组织 发 现 C/EBPα 基 因 6 个 已 知 SNP 位 点 ,2 个 新 发 现 多 态 位 点 和 1 个 突 变 位 点 ; 而 在 维 吾 尔 族 正 常 子 宫 颈 组 织 未 发现 突 变 位 点 。 结 论 : 新 疆 维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌 的 发 生 可 能 与 C/EBPα 基 因 突 变 有 关 。关 键 词 : 子 宫 颈 鳞 癌 ; C/EBPα 基 因 ; 突 变 分 析 ; 维 吾 尔 族 妇 女ANALYSIS OF MUTATION OF C/EBPΑGENE IN CERVICAL SQUAMOUSCELL CARCINOMA OF UIGUR WOMENIN XINJIANGPAN Zemin, ZHENG Weinan, ZHANG Xinzhi, LI Dongmei, GAO Rui, LIU Yinyin, LI Xing, KANG Huali, JIANGXupeng, ZHANG Donghui(Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shihezi University, Xinjiang Endemic andEthnic Disease and Education Ministry Key Laboratory, Shihezi 832002,China)肿 瘤 基 础119

Abstract: Objective: To explore C/EBPα gene mutation and polymorphism in the promoter of 500bp region and exon region incervical squamous cell carcinoma of Uigur women in Xinjiang. Methods: Twelve cervical squamous cell carcinoma tissues from Uigurwomen and 2 normal cervical tissues were collected. Genome DNA was extracted, 6 pairs of primers in the promoter of 500bp regionand exon region of C/EBPα gene were designed, and 6 fragments were amplified. Results: Six known SNPs, 2 new SNPs and 1 muta 鄄tion site were detected on C/EBPα gene in cervical squamous cell carcinoma of Uigur women by gene sequencing, however, no muta 鄄tion site was detected in normal cervical tissues of Uigur women. Conclusion: C/EBPα gene mutation maybe related to cervical car 鄄cinogenesis of Uigur women in Xinjiang.Keywords: cervical squamous cell carcinoma; C/EBPα gene; mutation analysis; Uigur women子 宫 颈 癌 是 女 性 生 殖 系 统 常 见 的 恶 性 肿 瘤 , 在世 界 范 围 内 , 子 宫 颈 癌 严 重 危 害 广 大 妇 女 的 生 命 健[1]康 。 我 国 子 宫 颈 癌 患 病 率 和 病 死 率 都 很 高 , 约 占 世[2]界 的 三 分 之 一 。 维 吾 尔 族 妇 女 患 病 率 为 459/10 万 ~590/10 万 , 病 死 率 为 15.78/10 万 , 明 显 高 于 汉 族 和 其[3]他 民 族 。 在 研 究 维 吾 尔 族 子 宫 颈 癌 差 异 表 达 基 因时 , 用 消 减 抑 制 杂 交 实 验 发 现 CCAAT 增 强 子 结 合 蛋白 α(CCAAT/enhancer binding proteinsα,C/EBPα) 基因 在 子 宫 颈 癌 组 织 中 mRNA 表 达 水 平 降 低 , 利 用 半定 量 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 实 验 (RT-PCR) 发 现 C/EBPα 基 因 在 维 吾 尔 族 子 宫 颈 癌 组 织 中 mRNA 表 达水 平 降 低 。 本 研 究 分 析 新 疆 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 癌组 织 C/EBPα 基 因 突 变 情 况 。1 材 料 与 方 法1.1 收 集 标 本 和 引 物 设 计收 集 12 例 新 疆 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 鳞 癌 组 织标 本 ( 标 本 号 为 :31、38、43、44、45、47、48、49、50、54、55 和 56 号 ) 及 2 例 维 吾 尔 族 正 常 子 宫 颈 组 织 标 本( 标 本 号 为 :15 和 20 号 )。 提 取 子 宫 颈 组 织 DNA。 在C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显 子 区 域 ( 长 度 为3276bp) 设 计 引 物 , 共 设 计 6 对 引 物 , 扩 增 6 个 片 段 。引 物 用 在 线 Primer3 软 件 设 计 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。1.2 PCR 反 应PCR 反 应 体 系 总 体 积 为 20 μL: 双 蒸 水 6.4 μL,2x GC buffer I (TAKARA) 10 μL,dNTP 0.4 μL, 正 向和 反 向 引 物 各 1 μL,1 U HotStarTaq 聚 合 酶 (QiagenInc.) 0.2 μL, 模 板 DNA 1 μL 。PCR 反 应 条 件 :95℃,15 min;94℃,15 s, 68℃,60 s,35 个 循 环 。1.3 PCR 产 物 使 用 SAP 和 Exo I 纯 化将 1U SAP 和 6U Exo I 加 入 8 μL PCR 产 物 。 混合 物 放 入 37 ℃,60min, 接 着 放 在 70℃,10min。1.4 DNA 测 序反 应 混 合 物 包 括 :2 μL BigDye3.1 mix, 2 μL 测序 引 物 (0.4 μM) 和 1~2 μL 纯 化 后 的 PCR 产 物 。 反应 条 件 为 : 96℃,1 min; 96℃,10 s;50℃,5 s;60℃,4min, 进 行 28 个 循 环 。 测 序 产 物 上 ABI3130XL 测 序仪 , 测 序 文 件 用 Polyphred 软 件 分 析 , 并 结 合 人 工 校对 记 录 后 整 理 出 结 果 。2 结 果2.1 C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显 子 区 域 分六 段 PCR 扩 增 电 泳 结 果将 C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显 子 区 域 分为 6 段 , 设 计 引 物 ,PCR 扩 增 后 , 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 分 析 , 可 见 PCR 扩 增 片 段 大 小 正 确 , 可 以 进 行120肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会DNA 测 序 分 析 ( 图 1)。图 1 第 31 号 样 本 C/EBPα 基 因 6 个 片 段 电 泳 图2.2 C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显 子 测 序结 果对 14 个 标 本 C/EBPα 基 因 启 动 子 500bp 和 外 显子 进 行 了 测 序 , 在 新 疆 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 鳞 癌 组织 中 C/EBPα 基 因 上 检 测 出 6 个 已 知 SNP 位 点 和 2个 新 发 现 的 或 低 频 的 多 态 位 点 , 以 及 一 个 突 变 位 点 ;而 在 维 吾 尔 族 正 常 子 宫 颈 组 织 中 , 未 发 现 突 变 位 点( 表 1)。从 表 1 可 知 ,C/EBPα 基 因 位 于 2 683 碱 基 位 置 ,44 号 标 本 发 现 新 的 多 态 位 点 C/T; 在 3 896 碱 基 位置 ,31 号 标 本 发 现 新 的 多 态 位 点 G/A; 位 在 2 699~2 700 碱 基 位 置 ;31、47 和 55 号 标 本 发 现 新 的 突 变 位点 ,3 例 子 宫 颈 鳞 癌 标 本 在 C/EBPα 基 因 第 一 外 显 子插 入 ACCCGC 6 个 碱 基 , 造 成 195 号 组 氨 酸 和 196号 脯 氨 酸 重 复 出 现 的 插 入 突 变 (p.His195_Pro196dup突 变 )。2.3 C/EBPα 基 因 第 一 外 显 子 基 因 突 变 结 果通 过 基 因 测 序 发 现 , 子 宫 颈 鳞 癌 31、47、55 号 3例 标 本 在 C/EBPα 基 因 第 一 外 显 子 插 入 ACCCGC 6个 碱 基 , 造 成 p.His195_Pro196dup 突 变 ( 图 2)。3 讨 论CCAAT/ 增 强 子 结 合 蛋 白 属 于 基 本 的 亮 氨 酸 拉链 转 录 因 子 家 族 成 员 。 蛋 白 质 结 构 中 包 含 一 个 基 本的 DNA 结 合 域 和 亮 氨 酸 拉 链 域 。 C/EBPα 蛋 白 质 在表 1子 宫 颈 鳞 癌 C/EBPα 基 因 突 变 位 点 及 SNP 位 点 分 布 表碱 基 位 置 1 2 3 4 5 6 7 8 9标 本 号 1645 2683 2699-2700 2800 3489 3624 3896 3902 430415 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C20 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C31 G/G C/C -/N G/G C/C A/A G/A C/C C/C38 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C43 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C44 G/G C/T -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C45 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C47 G/G C/C -/N G/G C/C A/A G/G C/C C/C48 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C49 G/G C/C -/- G/G C/C A/A G/G C/C C/C50 G/G C/C -/- G/T C/C A/G G/G C/G C/T54 G/G C/C -/- G/T C/C A/G G/G C/G C/T55 G/G C/C -/N G/G C/C A/A G/G C/C C/C56 G/A C/C -/- G/G C/T A/A G/G C/C C/CN=acccgc肿 瘤 基 础121

遗 传 易 感 性 位 点 , 尚 需 扩 大 样 本 进 一 步 研 究 。3 例 维 吾 尔 族 妇 女 子 宫 颈 鳞 癌 组 织 中 , 均 检 测 出C/EBPα 基 因 第 一 外 显 子 插 入 ACCCGC 6 个 碱 基 , 造成 p.His195_Pro196dup 突 变 , 提 示 新 疆 维 吾 尔 族 子宫 颈 鳞 癌 的 发 生 可 能 与 C/EBPα 基 因 突 变 相 关 , 但 尚需 扩 大 样 本 进 一 步 研 究 。图 2 子 宫 颈 鳞 癌 C/EBPα 基 因 第 一 外 显 子 突 变测 序 图[4]多 种 细 胞 中 , 调 节 细 胞 代 谢 和 细 胞 增 殖 、 分 化 。 目 前研 究 发 现 C/EBPα 基 因 在 急 性 髓 样 白 血 病 有 突 变 存[5]在 , 并 影 响 C/EBPα 基 因 的 功 能 。 研 究 表 明 在 急 性 髓[6]样 白 血 病 中 C/EBPα 基 因 存 在 相 对 低 的 频 率 。 核 型异 常 的 的 C/EBPα 基 因 突 变 的 急 性 髓 样 白 血 病 患 者[7]表 现 出 较 短 的 存 活 时 间 。 C/EBPα 基 因 在 急 性 髓 样白 血 病 患 者 可 以 出 现 基 因 编 码 的 蛋 白 质 N 末 端 和 C末 端 氨 基 酸 变 化 , 可 以 通 过 C/EBPα 基 因 突 变 来 判 断[8]疾 病 的 预 后 。 另 外 , 研 究 表 明 , 细 胞 核 型 正 常 的 急 性髓 样 白 血 病 的 C/EBPα 基 因 突 变 的 基 因 型 与 患 者 治[9]疗 的 疗 效 有 关 。C/EBPα 基 因 突 变 在 新 疆 维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌人 群 中 的 分 布 , 是 否 与 新 疆 维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌 的发 生 有 关 , 国 内 外 均 未 见 文 献 报 道 。 为 此 , 我 们 选 择维 吾 尔 族 子 宫 颈 鳞 癌 作 为 研 究 对 象 , 检 测 C/EBPα 基因 的 突 变 情 况 , 为 进 一 步 深 入 研 究 维 吾 尔 族 患 者 子宫 颈 鳞 癌 的 分 子 发 生 机 制 奠 定 基 础 。C/EBPα 基 因 多 态 性 变 化 是 否 与 新 疆 维 吾 尔 族患 者 子 宫 颈 鳞 癌 的 发 生 相 关 , 还 有 待 于 扩 大 样 本 研究 这 些 多 态 性 位 点 在 正 常 人 群 中 的 发 生 频 率 。 因 此 ,通 过 大 样 本 和 选 择 不 同 人 群 进 行 C/EBPα 基 因 多 态性 研 究 十 分 必 要 。 通 过 基 因 测 序 发 现 的 C/EBPα 基 因多 态 性 位 点 是 否 是 新 疆 维 吾 尔 族 患 者 子 宫 颈 鳞 癌 的参 考 文 献[1] Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer statistics, 2010[J].CA Cancer J Clin, 2010 ,60(5):277-300[2] 高 琼 , 韦 创 建 , 刘 筱 娴 . 宫 颈 癌 的 筛 查 及 早 期 诊 断 [J]. 医 学 与社 会 ,2007,20(1):41-42[3] 古 扎 丽 努 尔 · 阿 不 力 孜 , 程 静 新 , 米 克 热 木 , 古 兰 丹 , 李 华 , 米合 日 尼 沙 , 米 日 古 丽 , 米 日 古 丽 · 艾 乃 土 , 路 玲 . 新 疆 维 吾 尔 族 妇 女宫 颈 癌 的 HPV 谱 研 究 [J]. 肿 瘤 ,2007,27(5):379-382[4] Rishi V, Bhattacharya P, Chatterjee R, Rozenberg J, Zhao J,Glass K, Fitzgerald P, Vinson C. CpG methylation of half-CRE sequencescreates C/EBPα binding sites that activate some issue-specificgenes [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107 (47):20311-20316[5] Szankasi P, Ho AK, Bahler DW, Efimova O, Kelley TW.Combined testing for CCAAT/enhancer-binding protein alpha (CEB-PA) mutations and promoter methylation in acute myeloid leukemiademonstrates shared phenotypic features [J]. Leuk Res, 2011, 35(2):200-207[6] Lu Y, Chen W, Chen W, Stein A, Weiss LM, Huang Q. C/EBPA gene mutation and C/EBPA promoter hypermethylation in a-cute myeloid leukemia with normal cytogenetics [J]. Am J Hematol,2010, 85(6):426-430[7] Renneville A, Boissel N, Gachard N, Naguib D, Bastard C,de Botton S, Nibourel O, Pautas C, Reman O, Thomas X, Gardin C,Terré C, Castaigne S, Preudhomme C, Dombret H. The favorable impactof CEBPA mutations in patients with acute myeloid leukemia isonly observed in the absence of associated cytogenetic abnormalitiesand FLT3 internal duplication[J]. Blood, 2009 ,113(21):5090-5093[8] Pabst T, Eyholzer M, Fos J, Mueller BU. Heterogeneitywithin AML with CEBPA mutations; only CEBPA double mutations,but not single CEBPA mutations are associated with favourable prognosis[J].Br J Cancer, 2009, 100(8):1343-1346[9] Schlenk RF, D?hner K, Krauter J, Fr?hling S, Corbacioglu A,Bullinger L, Habdank M, Sp?th D, Morgan M, Benner A, SchlegelbergerB, Heil G, Ganser A, D?hner H; German -Austrian AcuteMyeloid Leukemia Study Group. Mutations and treatment outcome incytogenetically normal acute myeloid leukemia [J]. N Engl J Med,2008 ,358(18):1909-1918122肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会卵 巢 肿 瘤 组 织 中 端 粒 酶 活 性 的 表 达李 红 霞( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 世 纪 坛 医 院 妇 产 科 , 北 京 100038)摘 要 : 目 的 : 分 析 端 粒 酶 活 性 在 卵 巢 肿 瘤 中 的 表 达 , 探 讨 端 粒 酶 活 性 作 为 卵 巢 肿 瘤 诊 断 肿 瘤 标 记 物 的 意 义 。 资 料和 方 法 : 取 冰 冻 肿 瘤 组 织 , 采 用 端 粒 重 复 序 列 扩 增 法 (Telomeric Repeat Amplication Protocol), 结 合 银 染 , 共 测 定 了 27例 卵 巢 癌 、5 例 良 性 卵 巢 肿 瘤 、22 例 卵 巢 癌 癌 旁 组 织 以 及 12 例 正 常 卵 巢 组 织 中 端 粒 酶 活 性 , 并 分 析 其 与 组 织 分 级 、FIGO 分 期 、 病 理 类 型 以 及 有 无 转 移 的 关 系 。 PCR 产 物 以 采 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 析 , 以 出 现 特 征 性 的 6-bp 间 隔的 特 征 性 阶 梯 状 条 带 为 阳 性 。 出 现 >100bp 的 条 带 为 强 阳 性 , 出 现

脑 胶 质 瘤 的 免 疫 治 疗李 文 斌 , 陈 慧 媛 , 康勋( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 世 纪 坛 医 院 , 北 京 100038)摘 要 : 脑 胶 质 瘤 的 免 疫 治 疗 , 尤 其 是 以 树 突 状 细 胞 为 基 础 的 主 动 免 疫 治 疗 在 基 础 研 究 和 临 床 试 验 中 已 经 显 示 出良 好 的 疗 效 。 免 疫 治 疗 可 能 成 为 除 手 术 、 化 疗 、 和 放 疗 以 外 的 , 治 疗 胶 质 瘤 和 防 止 肿 瘤 复 发 的 手 段 。关 键 词 : 胶 质 瘤 ; 免 疫 治 疗 ; 树 突 状 细 胞IMMUNOTHERAPY FOR GLIOMASLI Wenbin, CHEN Huiyuan, KANG XunBeijing Shijitan Hospital, Capital Medical University(10 Tieyi Rd, Yangfangdian, Haidian district, Beijing 100038)Abstract: High grade gliomas are the most common and devastating primary brain tumours. Despite important progresses ingliomas treatment includes surgery combined to radio- and chemotherapy, high grade gliomas patients' prognosis remains very poor.Adoptive and active immunotherapies using lymphokine-activated killer cells, cytotoxic T cells, tumour-infiltrating lymphocytes, au 鄄tologous tumour cells, and dendritic cells have been tested in clinical trials with glioma patients, which may become a important ad 鄄junctive therapy for gliomas patients.Keywords: glioma; immunotherapy; dendritic cells目 前 治 疗 胶 质 瘤 的 主 要 手 段 是 手 术 治 疗 辅 以放 、 化 疗 。 近 几 十 年 来 手 术 技 术 和 辅 助 治 疗 已 经 有 了很 大 的 发 展 , 但 由 于 脑 胶 质 瘤 富 有 高 度 的 侵 袭 性 , 浸润 到 毗 邻 的 脑 组 织 的 肿 瘤 细 胞 极 易 导 致 复 发 , 胶 质瘤 患 者 的 预 后 仍 不 乐 观 。 尤 其 是 胶 质 母 细 胞 瘤 , 目 前其 术 后 患 者 的 两 年 生 存 率 只 有 27.2% [1] , 中 位 生 存 期[2]仅 为 14 个 月 左 右 。 如 何 杀 死 残 留 的 瘤 细 胞 , 是 留 给神 经 肿 瘤 学 者 的 一 个 难 题 。 而 由 于 这 些 瘤 细 胞 具 有高 度 的 选 择 性 和 长 效 的 记 忆 性 , 使 得 免 疫 治 疗 可 能成 为 一 个 防 止 肿 瘤 复 发 的 非 常 好 的 治 疗 手 段 。1 胶 质 瘤 的 免 疫 学 特 征血 脑 屏 障 的 存 在 , 典 型 的 树 突 细 胞 (DendriticCells, DCs) 和 淋 巴 引 流 系 统 的 缺 乏 , 以 及 有 研 究 显 示中 枢 神 经 系 统 (central nervous system, CNS) 在 接 受 同种 异 体 移 植 时 缺 乏 排 斥 反 应 , 这 些 现 象 使 得 人 们 之前 认 为 CNS 是 “ 免 疫 特 惠 器 官 ”(Immunologically124肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会Privileged Organ)。 但 是 越 来 越 多 的 研 究 表 明 实 际 情况 并 非 如 此 。 小 胶 质 细 胞 已 被 发 现 可 以 表 达 一 些 巨噬 细 胞 相 关 的 表 面 标 志 物 , 其 中 包 括 MHC 抗 原 , 因此 人 们 认 为 它 在 脑 中 可 以 作 为 提 呈 细 胞 (Antigen[3]Presenting Cell,APC) 来 发 挥 作 用 。 此 外 , 尽 管 有 血脑 屏 障 的 存 在 , 活 化 的 T 细 胞 实 际 上 是 可 以 通 过[4]BBB 进 入 中 枢 神 经 系 统 的 。 大 多 数 的 胶 质 瘤 组 织 中可 以 发 现 有 淋 巴 细 胞 的 浸 润 (Tumor-Infiltration Lymphocyte,TILS), 而 且 这 种 现 象 往 往 预 示 着 好 的 预 后 。[5]体 外 培 养 TILS 的 研 究 发 现 有 肿 瘤 特 异 性 抗 原 淋 巴细 胞 的 存 在 , 这 表 示 在 胶 质 瘤 中 已 经 发 生 了 比 较 成熟 的 获 得 性 免 疫 反 应 。尽 管 如 此 , 胶 质 瘤 患 者 显 示 了 一 定 的 免 疫 反 应性 的 缺 陷 , 胶 质 瘤 细 胞 能 够 逃 避 宿 主 免 疫 系 统 的 杀伤 作 用 。 表 现 在 以 下 几 个 方 面 :(1) 研 究 显 示 胶 质 瘤患 者 全 身 整 体 的 免 疫 系 统 功 能 缺 陷 , 表 现 在 T 细 胞反 应 性 降 低 、 循 环 中 调 节 T 细 胞 (regulatory T cells, Treg) 的 增 加 及 单 核 细 胞 和 DCs 功 能 缺 陷 。(2) 胶 质 瘤细 胞 本 身 分 泌 免 疫 抑 制 因 子 , 包 括 可 溶 性 免 疫 抑 制因 子 和 胶 质 瘤 细 胞 表 面 免 疫 抑 制 因 子 。 前 者 如 TGFβ、PGE2、IL10、GANGs等 , 后 者 如 Fas-FasL、B7-H1(PDL-1)、RCAS1、HLA-G、CD70 等 。 这 些 因 子 或 通 过抑 制 免 疫 细 胞 的 活 化 和 成 熟 , 或 通 过 诱 导 免 疫 细 胞[6]的 凋 亡 , 起 到 了 帮 助 胶 质 瘤 细 胞 免 疫 逃 逸 的 作 用 。(3) 肿 瘤 微 环 境 中 存 在 的 免 疫 抑 制 细 胞 如 T reg、 胶 质瘤 中 浸 润 的 巨 噬 细 胞 / 小 胶 质 细 胞 (Glioma-infiltratingmacrophages /microglia, GIM)、 髓 系 抑 制 细 胞 (myeloidderivedsuppressor cells, MSDC) 也 均 参 与 了 胶 质 瘤 免疫 抑 制 的 过 程 。这 些 免 疫 缺 陷 的 共 同 作 用 下 , 肿 瘤 患 者 本 身 很难 对 肿 瘤 发 起 有 效 的 免 疫 反 应 , 在 这 种 免 疫 抑 制 的微 环 境 下 , 肿 瘤 不 断 生 长 。 而 通 过 各 种 手 段 来 增 强 免疫 系 统 对 胶 质 瘤 细 胞 的 靶 向 作 用 , 就 成 为 了 我 们 对抗 肿 瘤 的 重 要 手 段 。2 主 动 免 疫 治 疗 (active immunotherapy)主 动 免 疫 治 疗 实 际 上 就 是 人 工 导 入 肿 瘤 细 胞 的特 异 性 抗 原 , 用 来 激 活 体 内 的 主 动 免 疫 功 能 的 一 种治 疗 。 抗 原 的 来 源 包 括 完 整 的 肿 瘤 细 胞 、 肿 瘤 蛋 白 提取 物 或 肿 瘤 洗 脱 多 肽 以 及 人 工 合 成 的 多 肽 。 这 些 抗原 或 直 接 注 射 使 用 , 或 致 敏 树 突 细 胞 ( 树 突 细 胞 疫苗 ) 后 注 射 使 用 , 以 启 动 抗 肿 瘤 的 T 细 胞 免 疫 反 应 。这 种 治 疗 手 段 特 异 性 强 , 疗 效 高 , 是 当 今 肿 瘤 免 疫 治疗 的 发 展 方 向 , 而 树 突 细 胞 疫 苗 是 目 前 胶 质 瘤 免 疫治 疗 中 研 究 最 多 的 方 法 。2.1 树 突 状 细 胞 疫 苗免 疫 反 应 中 专 职 抗 原 提 成 细 胞 (APC) 的 发 现 和其 作 用 的 阐 明 为 肿 瘤 疫 苗 发 展 带 上 了 一 个 新 台 阶 。在 CNS 中 , 小 胶 质 细 胞 有 APC 的 作 用 , 但 是 提 取 这种 细 胞 技 术 上 还 有 困 难 。 因 此 , 人 们 转 而 从 外 周 循 环中 提 取 树 突 状 细 胞 。 树 突 状 细 胞 是 体 内 最 重 要 的APC, 表 达 高 水 平 的 MHC1、2 类 分 子 , 共 刺 激 分 子 如B7-1(CD80)、 B7-2(CD86)、CD40, 黏 附 分 子 如 LFA-1α 等 , 是 体 内 免 疫 反 应 的 启 动 者 , 具 有 摄 取 各 类 抗原 的 能 力 , 并 分 泌 IL-2, 激 活 初 始 T 细 胞 , 产 生 免 疫应 答 。2.1.1 树 突 状 细 胞 疫 苗 的 理 论 基 础在 胶 质 瘤 中 只 有 很 少 的 APC, 即 使 有 小 胶 质 细胞 的 存 在 , 其 抗 原 提 呈 的 能 力 也 是 很 弱 的 。 然 而CD4+Th 细 胞 的 活 化 和 CD8+ 细 胞 毒 性 T 细 胞 的 活 化都 需 要 抗 原 提 呈 过 程 。 因 此 , 在 这 样 的 肿 瘤 微 环 境中 , 这 两 种 T 细 胞 活 化 就 受 到 影 响 , 从 而 影 响 下 一 步的 免 疫 反 应 。 为 了 解 决 这 个 问 题 , 人 们 将 各 种 类 型 的肿 瘤 抗 原 在 体 外 冲 击 致 敏 DCs, 然 后 回 输 体 内 , 来 诱导 肿 瘤 抗 原 特 异 性 免 疫 应 答 。2.1.2 树 突 状 细 胞 疫 苗 的 临 床 试 验2.1.2.1 肿 瘤 洗 脱 多 肽 冲 击 致 敏 的 树 突 状 细 胞Liau [4] 等 用 肿 瘤 洗 脱 多 肽 冲 击 致 敏 的 树 突 状 细 胞治 疗 12 名 胶 质 瘤 患 者 , 结 果 1 名 患 者 出 现 了 非 常 明肿 瘤 基 础125

显 的 临 床 好 转 。 6 名 患 者 出 现 了 抗 肿 瘤 细 胞 毒 性 反应 。 这 种 治 疗 对 进 展 较 慢 的 和 TGF-β2 低 表 达 的 肿瘤 细 胞 , 治 疗 的 效 果 较 好 。2.1.2.2 肿 瘤 细 胞 与 DCs 融 合肿 瘤 细 胞 与 DCs 的 融 合 细 胞 荷 载 了 整 个 肿 瘤 细胞 的 抗 原 肽 , 它 既 能 表 达 MHC-I 和 MHC-II 类 抗 原 、共 刺 激 分 子 、 粘 附 分 子 和 肿 瘤 表 面 标 记 物 , 又 具 有 处[7]理 和 呈 递 肿 瘤 特 异 性 抗 原 的 能 力 。 Kikuchi 等 运 用融 合 瘤 苗 联 合 重 组 人 白 细 胞 介 素 12(rhIL-12) 治 疗15 例 胶 质 瘤 患 者 , 磁 共 振 检 查 显 示 4 例 患 者 的 肿 瘤体 积 缩 小 超 过 50%。 虽 然 该 方 法 在 部 分 病 人 身 上 出现 明 显 的 抗 瘤 反 应 , 且 无 明 显 不 良 反 应 的 报 道 , 但 缺乏 对 rhIL-12 在 抗 瘤 作 用 方 面 的 对 照 研 究 。2.1.2.3 肿 瘤 细 胞 溶 解 产 物 致 敏 的 DCs肿 瘤 洗 脱 多 肽 致 敏 的 DCs 和 肿 瘤 细 胞 -DCs 融合 的 治 疗 需 要 数 量 很 多 的 自 体 肿 瘤 细 胞 , 也 需 要 很多 时 间 。 为 了 克 服 这 个 缺 点 , 一 些 学 者 直 接 用 肿 瘤 细[8]胞 溶 解 产 物 来 致 敏 树 突 细 胞 , 他 们 发 现 ,60% 的 肿瘤 细 胞 溶 解 产 物 来 致 敏 树 突 细 胞 免 疫 接 种 后 的 患 者出 现 了 T 细 胞 介 导 的 细 胞 毒 性 反 应 , 比 洗 脱 多 肽 致敏 树 突 细 胞 组 的 40% 高 。[9]Yamanaka 等 选 择 24 例 复 发 恶 性 胶 质 瘤 患 者 ,接 受 了 肿 瘤 细 胞 溶 解 产 物 来 致 敏 树 突 细 胞 免 疫 皮 下和 瘤 内 接 种 。 一 些 同 时 接 受 瘤 内 注 射 , 一 些 皮 下 注 射者 , 其 树 突 细 胞 还 使 用 OK-432 促 进 成 熟 , 结 果 1 例有 部 分 临 床 反 应 、3 例 有 微 弱 的 反 应 。 和 对 照 组 相 比 ,实 验 组 的 生 存 期 延 长 , 特 别 是 那 些 接 受 成 熟 DCs 接种 的 和 同 时 接 受 皮 下 和 瘤 内 接 种 者 。 而 最 近 ,[10]Wheeler 等 也 报 道 了 GBM 患 者 接 受 肿 瘤 溶 解 产 物致 敏 的 树 突 细 胞 疫 苗 接 种 后 其 介 导 的 免 疫 反 应 与 肿瘤 进 展 和 生 存 期 之 间 存 在 着 有 统 计 学 意 义 的 相 关[9]性 。 目 前 参 与 例 数 最 多 的 DC 疫 苗 的 临 床 试 验 , 报道 了 56 例 复 发 GBM 接 受 了 至 少 三 次 的 自 体 肿 瘤 溶解 产 物 致 敏 的 DC 免 疫 接 种 。 试 验 表 明 , 疫 苗 接 种 间隔 越 短 的 患 者 其 无 进 展 生 存 期 越 长 。2.1.2.4 人 工 合 成 的 肿 瘤 抗 原 致 敏 的 DCs人 工 合 成 的 肿 瘤 抗 原 也 可 用 于 致 敏 DCs, 最 近报 道 的 有 EGFRVⅢ [11] , 其 他 合 成 多 肽 致 敏 的 DC 也在 研 究 当 中 。 此 外 , 由 于 肿 瘤 干 细 胞 在 肿 瘤 复 发 中 的重 要 作 用 , 使 用 肿 瘤 干 细 胞 所 表 达 的 抗 原 致 敏 DC 可[12,13]能 是 非 常 有 意 义 的 应 用 前 景 。这 种 肿 瘤 洗 脱 多 肽 和 肿 瘤 细 胞 提 取 物 冲 击 致 敏的 树 突 状 细 胞 接 种 的 方 法 , 不 需 要 鉴 别 特 异 性 的 肿瘤 抗 原 , 在 理 论 上 可 以 减 少 肿 瘤 免 疫 逃 逸 的 发 生 , 但是 可 能 增 加 了 自 身 免 疫 病 的 风 险 。 在 一 组 黑 色 素 瘤患 者 接 受 肿 瘤 溶 解 物 所 致 敏 的 树 突 细 胞 后 , 有 两 例[14]患 者 患 上 了 白 斑 病 。 目 前 为 止 胶 质 瘤 患 者 中 应 用DC 疫 苗 尚 未 报 道 严 重 副 作 用 , 这 个 问 题 还 需 要 人 们继 续 关 注 。2.1.2.5 肿 瘤 细 胞 RNA 或 cDNA 致 敏 DC[15]Yamanka 等 研 究 发 现 , 这 种 方 法 不 但 可 延 长 荷瘤 小 鼠 生 存 期 , 而 且 还 可 抑 制 肿 瘤 的 种 植 转 移 。 但是 , 这 种 技 术 要 求 较 高 , 非 特 异 性 影 响 因 素 较 多 , 操作 复 杂 , 其 发 展 受 到 了 一 定 程 度 的 限 制 。综 上 所 述 , 目 前 对 于 DC 作 为 脑 胶 质 瘤 免 疫 治 疗尚 处 于 起 步 阶 段 , 已 经 显 示 出 了 广 阔 的 应 用 前 景 。 但是 DC 瘤 苗 真 正 广 泛 应 用 于 临 床 尚 有 一 段 距 离 , 仍 存在 许 多 的 问 题 : 如 何 诱 导 出 数 量 大 、 纯 度 高 的 DC; 特异 性 肿 瘤 抗 原 的 选 择 及 合 适 的 DC 瘤 苗 回 输 时 间 、 方式 、 次 数 和 剂 量 的 选 择 ; 脑 胶 质 瘤 缺 乏 特 异 性 的 抗原 , 而 用 肿 瘤 全 抗 原 制 备 的 疫 苗 又 有 引 发 自 身 免 疫疾 病 的 危 险 等 , 所 有 这 些 都 需 要 我 们 去 做 进 一 步 的研 究 。2.2 肿 瘤 细 胞 疫 苗DCs 疫 苗 的 制 备 都 是 在 体 外 进 行 的 。 但 是 DCs的 分 离 和 体 外 培 养 有 很 高 的 技 术 要 求 、 需 要 严 格 的培 养 条 件 和 昂 贵 的 费 用 。 而 肿 瘤 细 胞 的 体 外 培 养 则要 容 易 的 多 , 如 果 能 通 过 肿 瘤 细 胞 疫 苗 在 体 内 高 效126肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会的 向 DC 递 送 肿 瘤 抗 原 则 可 大 大 降 低 治 疗 费 用 。人 们 通 过 对 自 体 肿 瘤 细 胞 进 行 遗 传 修 饰 , 赋 予其 更 多 的 免 疫 原 性 。 如 B7-1、GM-CSF(granulocytemacrophagecolony-stimulating factor) [16] 和 新 城 病 毒(Newcastle disease virus NDV) 转 染 胶 质 瘤 细 胞 。[17]Steiner 等 对 28 例 胶 母 患 者 在 接 受 放 射 治 疗 后 ,皮 下 免 疫 接 种 转 染 NDV 的 肿 瘤 细 胞 , 结 果 , 一 例 术后 有 肿 瘤 残 留 的 患 者 看 到 了 完 全 的 影 像 学 上 的 改变 。 总 的 中 位 生 存 期 是 23 个 月 , 比 常 规 治 疗 结 果 要 好 。此 外 ,8 例 复 发 胶 质 瘤 手 术 患 者 中 有 5 位 出 现 显 著 的CD8+ 淋 巴 细 胞 浸 润 。 这 个 结 果 是 非 常 令 人 鼓 舞 的 。全 胶 质 瘤 相 关 抗 原 疫 苗 的 优 点 是 它 具 有 胶 质 瘤自 然 表 达 的 肿 瘤 肿 瘤 抗 原 成 分 , 对 肿 瘤 治 疗 有 较 全的 免 疫 原 性 , 但 因 其 制 作 工 艺 的 繁 琐 和 引 起 自 身 免疫 性 疾 病 的 可 能 性 而 限 制 了 其 在 临 床 方 面 的 应 用 。2.3 多 肽 类 疫 苗 。在 50% 的 胶 质 瘤 患 者 中 , 存 在 着 EGFR 的 变 异以 及 过 表 达 其 中 EGFRvIII 是 最 常 见 的 变 异 型 , 可 导致 酪 氨 酸 激 酶 的 持 续 的 活 性 , 进 一 步 导 致 肿 瘤 生 长 。一 组 临 床 试 验 将 针 对 肿 瘤 变 异 的 EGFRvIII 的 肽 类疫 苗 与 GM-CSF 一 同 注 入 19 例 原 发 胶 母 细 胞 瘤 患者 颅 内 , 结 果 患 者 无 进 展 生 存 期 为 12 个 月 , 中 位 生存 期 超 过 18 个 月 。 而 且 当 这 些 病 人 复 发 胶 质 瘤 时 ,[18,19]体 内 就 不 再 有 EGFRvIII 的 表 达 了 。 虽 然 结 果 令人 鼓 舞 , 但 是 这 个 试 验 选 择 病 人 的 标 准 十 分 严 格 , 要求 肿 瘤 全 部 切 除 ,KPS 评 分 (Karnofsky performancescore) 大 于 70。 而 最 新 的 另 一 组 临 床 1 期 和 2 期 研 究也 表 明 , 新 诊 断 的 GBM 患 者 接 种 针 对 EGFRvIII 变异 区 域 多 肽 的 疫 苗 后 , 介 导 产 生 了 有 效 的 EGFRvIII特 异 性 免 疫 反 应 , 而 且 患 者 的 生 存 期 明 显 好 于 历 史[20]对 照 。还 有 一 种 疫 苗 是 从 患 者 切 除 的 肿 瘤 组 织 中 提 取热 休 克 蛋 白 gp96 及 其 相 关 多 肽 (heat-shock proteinpeptidecomplex, HSPPC-96)。 这 种 疫 苗 已 在 肾 细 胞癌 和 黑 色 素 瘤 中 有 了 比 较 成 熟 的 研 究 。 在 胶 质 瘤 中的 研 究 刚 刚 起 步 。 这 种 疫 苗 的 安 全 性 已 经 得 到 证 实 ,[21]也 已 发 现 肿 瘤 特 异 性 免 疫 反 应 的 证 据 。主 动 免 疫 治 疗 可 以 导 致 体 内 的 抗 肿 瘤 的 细 胞 毒性 反 应 , 使 得 一 部 分 患 者 从 中 获 益 。 但 是 还 有 很 多 待解 决 的 问 题 , 如 细 胞 体 外 培 养 的 成 功 率 、 回 输 的 频率 、 注 射 细 胞 的 数 量 和 注 射 途 径 以 及 鉴 定 合 适 的 肿瘤 抗 原 仍 需 进 一 步 研 究 。3 过 继 免 疫 治 疗 (adoptive immunotherapy)过 继 免 疫 治 疗 是 指 将 已 激 活 的 免 疫 效 应 细 胞 输注 给 肿 瘤 患 者 , 使 其 直 接 在 患 者 体 内 发 挥 抗 肿 瘤 的作 用 , 以 达 到 治 疗 肿 瘤 的 目 的 。 目 前 研 究 较 多 的 是 运用 T 细 胞 的 过 继 免 疫 治 疗 。应 用 较 为 广 泛 的 过 继 免 疫 治 疗 手 段 之 一 是 采 用淋 巴 因 子 激 活 的 杀 伤 细 胞 (lymphokine -activatedkiller cell,LAK) 治 疗 。LAK 细 胞 就 是 自 体 的 淋 巴 细 胞在 IL2 的 条 件 下 体 外 培 养 的 细 胞 。 在 手 术 切 除 后 的空 腔 内 注 入 LAK, 由 于 其 杀 伤 作 用 并 非 特 异 性 , 往 往只 有 有 限 的 疗 效 , 并 有 很 大 的 神 经 毒 性 。 一 组 临 床 试验 在 40 例 复 发 胶 质 瘤 患 者 的 术 中 的 空 腔 内 , 注 入LAK, 结 果 显 示 患 者 的 中 位 生 存 期 仅 为 9 个 月 ,1 年生 存 率 为 34% [22] 。相 比 之 下 , 抗 原 特 异 性 细 胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL ) 可 以 选 择 性 的 杀 死 肿瘤 细 胞 。 CTL 来 源 有 两 种 , 分 别 由 体 外 肿 瘤 特 异 性 抗原 反 复 的 刺 激 外 周 血 单 核 细 胞 (peripheral bloodmonouclear cells, PBMC) 和 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞 (TIL)得 来 。 随 着 各 种 胶 质 瘤 相 关 抗 原 (glioma-associatedantigens, GAA) 的 陆 续 发 现 , 使 得 即 使 在 没 有 肿 瘤 细胞 的 情 况 下 也 能 在 体 外 培 养 针 对 这 些 GAA 的 CD8+T 细 胞 。 这 些 抗 原 包 括 IL-13Rα2, TRP-2, AIM-2,HER-2, gp100, MAGE-1,EGFRvIII, EphA2, EphB6 [6]和 MRP3 [23] 。[24]最 近 的 进 展 是 使 用 基 因 工 程 修 饰 的 淋 巴 细 胞 ,肿 瘤 基 础127

特 异 性 的 表 达 针 对 胶 质 瘤 细 胞 特 异 抗 原 的 T 细 胞 受体 , 这 种 方 法 为 从 外 周 血 淋 巴 细 胞 中 培 育 大 量 的 肿瘤 特 异 性 淋 巴 细 胞 提 供 了 可 能 , 并 显 示 了 很 好 的 治疗 前 景 。其 他 的 过 继 免 疫 治 疗 还 用 到 了 自 然 杀 伤 细 胞 、同 种 异 体 T 淋 巴 细 胞 等 。 尽 管 T 细 胞 治 疗 前 景 广 阔 ,但 还 是 有 很 多 问 题 含 待 解 决 , 例 如 :T 抑 制 性 细 胞 对T 细 胞 的 调 节 , 以 及 中 枢 神 经 系 统 的 血 脑 屏 障 和 免疫 抑 制 因 子 对 T 细 胞 作 用 的 影 响 等 。 但 与 主 动 免 疫相 比 ,T 细 胞 治 疗 又 有 着 自 己 独 特 的 优 势 , 即 通 过 对T 细 胞 进 行 体 内 操 作 可 赋 予 T 细 胞 一 定 的 功 能 来 克服 脑 组 织 微 环 境 的 一 些 限 制 。 值 得 一 提 的 是 CD4+T细 胞 和 NK 细 胞 也 可 以 作 为 T 细 胞 治 疗 的 主 体 , 使[25]得 T 细 胞 治 疗 不 局 限 于 CD8+T 细 胞 。4 其 他 类 型 的 免 疫 治 疗4.1 抗 体由 于 分 子 量 大 而 难 以 穿 越 血 脑 屏 障 等 原 因 , 抗体 在 胶 质 瘤 免 疫 治 疗 中 的 应 用 还 存 在 挑 战 , 尽 管 如此 , 目 前 针 对 这 方 面 的 研 究 仍 取 得 了 一 定 进 展 。 针 对EGFR 和 EGFRvIII 的 单 克 隆 抗 体 — 西 妥 昔 单 抗 可 增强 放 化 疗 的 抗 肿 瘤 效 应 。 更 有 研 究 显 示 , 复 发 的EGFR 阳 性 的 胶 质 瘤 患 者 对 单 纯 应 用 西 妥 昔 单 抗 有[26]效 。4.2 放 射 免 疫 治 疗 (radioimmunotherapy, RIT)。RIT 是 将 放 射 性 同 位 素 与 抗 体 结 合 , 以 肿 瘤 相 关抗 原 为 靶 点 的 治 疗 方 法 , 从 而 将 辐 射 量 集 中 于 肿 瘤 ,而 对 正 常 组 织 影 响 较 小 。 此 种 治 疗 的 给 药 途 径 一 般是 在 切 除 肿 瘤 后 注 入 术 后 空 腔 。 胶 质 瘤 中 研 究 较 多的 肿 瘤 相 关 抗 原 靶 点 是 Tenascinc。 研 究 已 显 示 抗Tenascinc 的 抗 体 81C6 与 I131 结 合 可 以 提 高 胶 质 瘤[27]患 者 的 生 存 期 。研 究 中 的 其 他 抗 原 靶 点 还 有 DNA/histone HIcomplex,fibronectin, IL-2 受 体 ,EGFR 等 。4.3 配 对 导 向 毒 素研 究 发 现 包 括 IL-4R 和 IL-13Rα2 在 内 的 多 种细 胞 因 子 受 体 在 胶 质 瘤 细 胞 中 上 调 。 因 此 人 们 通 过将 细 胞 因 子 与 毒 素 融 合 以 达 到 特 异 性 的 杀 死 肿 瘤 细胞 的 目 的 , 称 为 配 对 导 向 毒 素 (Coupled Targeted Toxins)。现 在 研 究 当 中 的 有 以 下 几 种 :IL4- 假 单 胞 菌 外毒 素 (IL4- Pseudomonas exotoxin, PE), IL13-PE, TG-Fα-PE, 运 铁 蛋 白 - 白 喉 毒 素 (Transferrin-DiphtheriaToxin)。4.4 其 他 免 疫 调 节 疗 法T 细 胞 表 面 表 达 的 细 胞 毒 性 T 细 胞 相 关 抗 原 4(cytotoxic T-lymphocyte A-4,CTL-A4) 对 T 细 胞 可 起到 了 抑 制 性 的 作 用 , 它 与 APC 表 面 的 共 刺 激 分 子 B7结 合 而 导 致 其 不 能 发 挥 正 常 作 用 ,T 细 胞 就 会 呈 现“ 无 能 ” 状 态 。 因 此 , 阻 断 CTL-A4 可 以 促 进 T 细 胞 反应 性 和 抗 肿 瘤 免 疫 性 。 关 于 这 种 治 疗 的 临 床 试 验 , 对其 他 肿 瘤 治 疗 中 有 报 到 , 但 还 没 用 于 胶 质 瘤 的 治 疗 ;TGF-β 是 一 种 胶 质 瘤 细 胞 分 泌 的 免 疫 抑 制 因 子 , 因此 抑 制 TGF-β 也 可 能 是 一 种 有 效 的 治 疗 方 法 , 现 在已 有 几 种 方 法 如 反 义 寡 核 苷 酸 技 术 、TGF-β 受 体 I激 酶 抑 制 剂 及 抗 TGF-β 抗 体 等 ;T reg 可 以 抑 制 T 细胞 的 激 活 和 增 殖 , 因 此 通 过 抑 制 这 种 T 细 胞 的 活 性也 可 以 增 加 机 体 抗 肿 瘤 免 疫 反 应 。5 小 结综 上 所 述 , 胶 质 瘤 特 别 是 恶 性 胶 质 瘤 一 直 是 困绕 临 床 的 难 题 , 免 疫 治 疗 是 除 手 术 治 疗 和 放 、 化 疗 之外 的 又 一 种 治 疗 方 法 , 经 过 大 量 的 基 础 和 临 床 研 究也 证 明 了 其 有 效 性 和 可 行 性 。 随 着 人 们 对 免 疫 学 、 胶质 瘤 免 疫 生 物 学 、 分 子 生 物 学 的 研 究 不 断 深 入 , 研 究者 们 也 提 出 了 一 些 新 的 治 疗 策 略 , 部 分 动 物 实 验 也 显示 了 令 人 鼓 舞 的 结 果 。 虽 然 目 前 还 是 一 种 有 待 成 熟的 治 疗 方 法 , 但 其 广 阔 的 应 用 前 景 值 得 我 们 继 续 研究 和 实 践 。参 考 文 献[1] Stupp R, Hegi ME, Mason WP, et al. Effects of radiotherapy128肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapyalone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC -NCIC trial. Lancet Oncol, 2009, 10:459-466.[2] STUPP R, MASON WP, VAN DEN BENT MJ, et al. Radiotherapyplus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.N Engl JMed, 2005, 352: 1036-1038.[3] GRIFFIN DE. Immune responses to RNA-virus infection ofthe CNS. Nat Rev Immunol, 2003, 3: 493-502.[4] LIAU LM, PRINS RM, KIERTSCHER SM, et al. Dendriticcell vaccination in glioblastoma patients induces systemic and intracranialT cell responses modulated by the local CNS tumor microenviroment.Clin Cancer Res, 2005, 11: 5515-5525.[5] DUNN GP, DUNN IF, CURRY WT. Focus on TILs: prognosticsignificance of tumor infiltrating lymphocytes in human glioma.Cancer Immun, 2007, 7: 12-29.[6] Hideho Okada, Gary Kohanbash, Xinmei Zhu, et al. Immunotherapeuticapproaches for glioma. Crit Rev Immunol, 2009, 29(1): 1-42.[7] Kikuchi T, Akasaki Y, Abe T, et al. Vaccination of gliomapatients with fusions of dendritic and glioma cells and recombinanthuman interleukin 12. J Immunother, 2004, 27(6): 452-459.[8] YU JS, WHEELER CJ, ZELTZER PM, et al. Vaccination ofmalignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicitssystemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. Cancer Res,2001, 61: 842-847.[9] YAMANAKA R, HOMMA J, YAJIMA N, et al. Clinical e-valuation of dendritic cell vaccination for patients with recurrentglioma: results of a clinical phase I/II trial. Clin Cancer Res, 2005,11: 4160-4167.[10] WHEELER CJ, BLACK KL, LIU G, et al. Vaccination elicitscorrelated immune and clinical responses in glioblastoma multiformepatients. Cancer Res, 2008, 68: 5955-5964.[11] Sampson JH, Archer GE, Mitchell DA, et al. An epidermalgrowth factor receptor variant III -targeted vaccine is safe and immunogenicin patients with glioblastoma multiforme. Molecular CancerTherapeutics, 2009, 8(10): 2773-2779.[12] Stupp R, Hegi ME. Targeting brain-tumor stem cells. NatureBiotechnology, 2007, 25(2): 193-194.[13] Ahmed N, Salsman VS, Kew Y, et al. HER2 -specific Tcells target primary glioblastoma stem cells and induce regression ofautologous experimental tumors. Clinical Cancer Research, 2010, 16(2): 474-485.[14] NESTLE FO, ALIJAGIC S, GILLIET M, et al. Vaccinationof melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendriticcells. Nat Med, 1998, 4: 328-332.[15] Yamanka R,Zullo SA,Tanaka R,et al. Enhancement of antitumorimmune response in glioma models in mice by geneticallymodified dendritic cells pulsed with Seemliki Forest Virus-mediatedcomplementary DNA. J Neurosurg, 2001, 94(3): 474-481.[16] PARNEY IF, CHANG LJ, FARR-JONES MA, et al. Technicalhurdles in a pilot clinical trial of combined B7-2 and GM-CSFimmunogene therapy for glioblastomas and melanomas. J Neurooncol,2006, 78: 71-80.[17] STEINER HH, BONSANTO MM, Beckhove P, et al. Antitumorvaccination of patients with glioblastoma multiforme: a pilotstudy to assess feasibility, safety, and clinical benefit. J Clin Oncol,2004, 22: 4272-4281.[18] HEIMBERGER AB, CROTTY LE, ARCHER GE, et al.Epidermal growth factor receptor vIII peptide vaccination is efficaciousagainst established intracerebral tumors. Clin Cancer Res,2003, 9: 4247-4254.[19] HEIMBERGER AB, HUSSAIN SF, ALDAPE K, et al. Tumorspecificpeptide vaccination in newly -diagnosed patients withGBM. J Clin Oncol, 2006, 24: 1072.[20] SAMPSON JH, ARCHER GE, MITCHELL DA, et al. Tumor-specificimmunotherapy targeting the EGFRvIII mutation in patientswith malignant glioma. Semin Immunol 2008, 20: 267-275.[21] PARSA AT, CRANE C, WILSON S, et al. Autologous tumorderived gp96 evokes a tumor specific immune response in recurrentglioma patients that correlates with clinical response to therapy.AACR-NCI-EORTC International Conference Molecular Targets andCancer Therapeutics 2007, abstract C274; 2007.[22] DILLMAN RO, DUMA CM, SCHILTZ PM, et al. Intracavitaryplacement of autologous lymphokine-activated killer (LAK) cellsafter resection of recurrent glioblastoma. J Immunother, 2004, 27:398-404.[23] Kuan CT, Wakiya K, Herndon JE Ⅱ et al. MRP3: a moleculartarget for human glioblastoma multiforme immunotherapy. BMCCancer, 2010, 10: 468.[24] YAGHOUBI SS, JENSEN MC, SATYAMURTHY N, et al.Noninvasive detection of therapeutic cytolytic T cells with 18F-FH-BG PET in a patient with glioma. Nat Clin Pract Oncol, 2009, 6: 53-58.[25] Hunder NN, Wallen H, Cao J, et al. Treatment of metastaticmelanoma with autologous CD4+ T cells against NY-ESO-1. N EnglJ Med, 2008, 358(25): 2698-2703.[26] Belda-Iniesta C, Carpeno JC, Saenz EC, et al. Long termresponses with cetuximab therapy in glioblastoma multiforme. CancerBiol Ther, 2006, 5(8): 912-14.[27] Aarts F, Bleichrodt RP, Oyen WJ, et al. Intracavitary radioimmunotherapyto treat solid tumors. Cancer Biother Radiopharm,2008, 23(1): 92-107.肿 瘤 基 础129

P120 连 环 素 及 Bmi-1 在乳 腺 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义张 建 兵 1, 黄 荣 2, 朱 兴 华 1, 何 松 1, 陶 玉 1, 陆 晓 云1(1. 江 苏 省 南 通 大 学 附 属 肿 瘤 医 院 病 理 科 , 江 苏 南 通 市 226361;2. 江 苏 省 海 门 市 第 四 人 民 医 院 病 理 科 )摘 要 : 目 的 : 探 讨 P120 及 Bmi-1 在 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 中 的 表 达 及 其 与 临 床 病 理 特 征 的 关 系 。 方 法 : 采 用 免 疫 组化 方 法 检 测 135 例 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 组 织 中 P120,Bmi-1 及 ER,PR,c-erbB-2 表 达 情 况 , 并 检 测 了 20 例 乳 腺 增 生症 中 P120,Bmi-1 表 达 情 况 。 结 果 :P120 异 常 表 达 率 及 Bmi-1 高 表 达 率 在 135 例 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 中 分 别 为 67.4%和 48.1%, 在 20 例 乳 腺 增 生 症 中 分 别 为 5% 和 10%, 以 上 两 组 之 间 有 显 著 性 差 异 (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会Abstract: Objective: To investigate the relationship between the expression of P120,Bmi-1 and clinicopathological charac 鄄teristics in invasive mammary ductal cancer. Methods: The immunohistochemical staining was performed to detect the expression ofP120, Bmi-1 and ER, PR, c-erbB-2 in 135 cases with invasive mammary ductal carcinoma and detect the expression of P120,Bmi-1 in 20 cases of mammary adenosis. Results: The rate of P120 aberrant expression and Bmi -1 overexpression were 67.4% and48.1%, respectively in 135 cases with invasive mammary ductal carcinoma, and were 5% and 10% , respectively in 20 cases of mam 鄄mary adenosis. Significant relationships were found among P120 aberrant expression and high histologic grades, lymph node metasta 鄄sis and TNM staging(P

的 表 达 。 收 集 本 院 20 例 乳 腺 增 生 症 住 院 手 术 病 例 均检 测 了 P120、Bmi-1 表 达 作 为 对 照 , 患 者 年 龄 27~72岁 , 中 位 年 龄 46 岁 。 所 有 组 织 标 本 均 经 10% 中 性 甲醛 固 定 , 石 蜡 包 埋 。1.2 试 剂 与 方 法1.2.1 免 疫 组 织 化 学 方 法所 有 组 织 块 均 为 常 规 固 定 包 埋 , 进 行 4 μm 厚 切片 , 经 脱 蜡 、 水 化 后 ,Bmi-1 标 记 采 用 免 疫 组 化 SP 法染 色 ,EDTA 高 压 锅 热 修 复 ;P120 及 其 余 标 记 采 用 免疫 组 化 Envision 二 步 法 染 色 , 枸 椽 酸 盐 高 压 锅 热 修复 。 DAB 显 色 , 苏 木 素 复 染 胞 核 。 用 PBS 代 替 一 抗 作阴 性 对 照 , 用 已 知 阳 性 标 本 切 片 作 阳 性 对 照 。 鼠 抗 人单 克 隆 抗 体 Bmi-1(1∶50) 购 自 美 国 Abcam 公 司 ; 鼠抗 人 单 克 隆 抗 体 P120(1∶60)、 兔 抗 人 单 克 隆 抗 体 ER(1∶170)、 兔 抗 人 单 克 隆 抗 体 PR(1∶150)、 兔 抗 人 单 克隆 抗 体 c-erbB-2(1∶150) 及 SP 试 剂 盒 购 自 北 京 中 杉金 桥 生 物 技 术 公 司 ; Envision 试 剂 盒 购 自 DaKo公 司 。1.2.2 结 果 判 断 标 准P120 棕 黄 色 颗 粒 定 位 于 细 胞 膜 为 正 常 表 达 , 细胞 膜 表 达 缺 失 、 显 著 减 弱 或 / 和 细 胞 质 明 显 表 达 为 异常 表 达 。 Bmi-1 棕 黄 色 颗 粒 定 位 于 细 胞 核 和 细 胞 质 ,采 用 半 定 量 方 法 判 断 结 果 , 即 根 据 阳 性 细 胞 百 分 比以 及 阳 性 细 胞 染 色 强 弱 判 断 免 疫 组 化 结 果 。 A: 按 阳性 细 胞 百 分 比 记 分 , 阳 性 细 胞 数 ≤10% 为 0 分 , 阳 性细 胞 数 11%~25% 为 1 分 , 阳 性 细 胞 数 26%~50% 为 2分 , 阳 性 细 胞 数 51%~75% 为 3 分 , 阳 性 细 胞 数 76%~100% 为 4 分 。 B: 按 细 胞 染 色 强 弱 记 分 , 无 阳 性 反 应细 胞 为 0 分 , 浅 黄 色 为 1 分 , 棕 黄 色 为 2 分 , 棕 褐 色为 3 分 。 根 据 A、B 两 项 之 乘 积 判 断 其 结 果 , 如 在 同 一病 变 中 存 在 多 个 不 同 评 分 的 视 野 , 则 取 最 大 值 和 最小 值 的 平 均 值 作 为 免 疫 组 化 评 分 ,≤4 分 判 断 为 低 表达 (-),>4 分 判 断 为 高 表 达 (+)。ER、PR 阳 性 物 质 定 位 于 细 胞 核 , c-erbB-2 阳 性物 质 定 位 于 细 胞 膜 , 每 例 切 片 至 少 观 察 10 个 高 倍 视野 , 将 肿 瘤 细 胞 超 过 或 等 于 30% 阳 性 染 色 的 病 例 定为 阳 性 表 达 (+), 小 于 30% 阳 性 染 色 的 病 例 定 为 阴 性表 达 (-),1.3 统 计 学 方 法采 用 STATA10.0 统 计 软 件 包 进 行 统 计 学 分 析 ,率 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 , 当 样 本 含 量 较 小 , 且 有 理 论 频数 小 于 5 时 , 采 用 Fisher 确 切 概 率 检 验 。 应 用Spearman 等 级 相 关 分 析 处 理 不 同 指 标 间 的 相 关 性 。以 P 值

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会Bmi-1 蛋 白 低 表 达 , 反 之 亦 然 ( 表 1)。 而 Bmi-1 蛋 白表 达 与 患 者 年 龄 、 肿 瘤 大 小 、 肿 瘤 组 织 学 分 级 及 ER、PR、c-erbB-2 表 达 间 均 未 见 明 显 相 关 性 (P>0.05)。表 1 P120、Bmi-1 蛋 白 表 达 与 乳 腺 浸 润 性 导 管癌 临 床 病 理 特 征 的 关 系P120Bmi-1组 别 n异 常 表 达 (%) P 值 高 表 达 (%) P 值年 龄>50 岁 71 47(66.2) >0.05 34(47.9) >0.05≤50 岁 64 44(68.7) 31(48.4)肿 瘤 大 小≤3cm 69 43(62.3) >0.05 29(42.0) >0.05记 为 细 胞 膜 正 常 表 达 病 例 中 ,13 例 (29.6%) 为 Bmi-1高 表 达 ; 在 91 例 P120 免 疫 标 记 为 异 常 表 达 病 例 中 ,52 例 (57.1%) 为 Bmi-1 高 表 达 。 经 统 计 学 分 析 显 示 ,乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 组 织 中 P120 异 常 表 达 与 Bmi-1高 表 达 呈 显 著 正 相 关 (r=0.259,P3cm 66 48(72.7) 36(54.6)组 织 学 分 级低 级 别 组 87 51(58.6) 0.002 38(43.7) >0.05高 级 别 组 48 40(83.3) 27(56.3)淋 巴 结 转 移无 转 移 81 47(58.0) 0.005 25(30.9) 0.000有 转 移 54 44(81.5) 40(74.1)TNM 分 期Ⅰ、Ⅱ 期 108 67(62.0) 0.010 46(42.6) 0.017Ⅲ、Ⅳ 期 27 24(88.9) 19(70.4)ER阳 性 70 44(62.9) >0.05 28(40.0) >0.05阴 性 65 47(72.3) 37(56.9)PR1a:Envision 法 ×4001b:Envision 法 ×400阳 性 58 37(63.8) >0.05 24(41.4) >0.05阴 性 77 54(70.1) 41(53.3)cerbB-2阳 性 55 42(76.4) >0.05 24(43.6) >0.05阴 性 80 49(61.2) 41(51.3)2.3 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 中 P120 蛋 白 异 常 表 达 与Bmi-1 蛋 白 表 达 的 关 系本 组 135 例 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 组 织 同 时 进 行 了P120 及 Bmi-1 免 疫 组 化 标 记 , 在 44 例 P120 免 疫 标1c:SP 法 ×200 1d:SP 法 ×400图 1 P120 及 Bmi-1 在 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 组 织中 的 表 达1a: positive expression of P120 of cell membrane ininvasive mammary ductal cancer; 1b: aberrant expressionof P120 of cytoplasm in invasive mammary ductal cancer;1c and 1d: overexpression of Bmi-1 of nucleus and cytoplasmin invasive mammary ductal cancer.肿 瘤 基 础133

3 讨 论已 有 研 究 显 示 , 多 种 基 因 相 互 激 活 与 失 活 、 各 种信 号 转 导 通 路 的 相 互 作 用 在 乳 腺 癌 的 发 生 、 发 展 过程 中 构 成 了 一 个 复 杂 的 基 因 调 控 网 络 结 构 。连 环 素 (Catenin) 是 一 组 具 有 相 似 结 构 的 链 蛋 白家 族 ,P120 属 于 连 环 素 家 族 的 成 员 , 在 正 常 成 熟 细 胞中 能 与 E 钙 粘 素 (E-Cadherin) 形 成 连 环 素 - 钙 粘 素复 合 体 (Catenin Cadherin Complex,CCC), 在 维 持 上皮 细 胞 的 结 构 完 整 性 和 抑 制 肿 瘤 的 侵 袭 转 移 过 程 中发 挥 重 要 作 用 。 研 究 表 明 在 乳 腺 癌 细 胞 中 E- Cadherin表 达 的 减 少 或 缺 失 , 主 要 是 通 过 激 活 Wnt 信 号[9]传 导 通 路 引 起 的 。 而 P120 与 E- Cadherin 胞 质 近 膜[10]端 (juxtamembrane domain, JMD) 结 合 , 并 且 能 调[2-4]控 E- Cadherin 的 表 达 水 平 。 研 究 显 示 P120 的 异常 表 达 与 结 肠 癌 、 肺 癌 的 较 强 侵 袭 性 和 不 良 预 后 有[11-12]关 。本 研 究 发 现 , 在 20 例 乳 腺 增 生 症 中 19 例(95.0%)P120 免 疫 组 化 标 记 呈 细 胞 膜 正 常 表 达 , 而在 135 例 乳 腺 浸 润 性 导 管 癌 中 ,44 例 (32.6%)P120免 疫 标 记 为 细 胞 膜 正 常 表 达 ,91 例 (67.4%) 为 细 胞 异常 表 达 , 两 组 之 间 具 有 显 著 性 差 异 (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会[4] Chetty R, Jain D and Serra S . P120 catenin reduction andcytopalsmic relocalization leads to dysregulation of E -cadherin insolid pseudopapillary tumors of the pancreas[J]. Am J Clin Pathol, 2008,130: 71-76.[5] Rakha EA, Patel A, Powe DG, et al. Clinical and biologicalsignificance of E-cadherin protein expression in invasive lobular carcinomaof the breast[J].Am J Surg Pathol, 2010, 34(10):1472-1478.[6] Zhai B, Yan HX, Liu SQ, et al. Reduced expression of P120catenin in Cholangiocarcinoma correlated with clinicopathologic parameters[J].World J Gastroenterol, 2008, 14(23): 3739-3744.[7] Neto BS, Smith GL , Mandeville JA, et al. prognostic significanceof alteredP120ctn expression in bladder cancer[J]. BJU Int, 2008,101(6): 746-752.[8] Glinsky W, Gennadi V, Berezovska J, et al. Microarray analysisidentifies a death-from-cancer signature predicting therapy failurein patients with multiple types of cancer[J]. J Clini Invest, 2005,15(6):1503-1519.[9] Nong CZ, Pan LL, He WS, et al. P120ctn overexpressionenhances beta-catenin-E-cadherin binding and down regulates expressionof survivin and cyclin D1 in BEL-7404 hepatoma cells [J].World J Gastroenterol, 2006, 12(8): 1187-1191.[10] Hengel JV and Roy FV. Diverse functions of P120ctn intumors[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1773(1): 78-88.[11] Bellovin DI, Bates RC, Muzikansky A, et al. Altered localizationof P120 catenin during epithelial to mesenchymal transition ofcolon carcinoma is prognostic for aggressive disease[J]. Cancer Res,2005, 65: 10938-10945.[12] Wang EH, Liu Y, Xu HT, et al. Abnormal expression andclinicopathologic significance of P120 -catenin in lung cancer [J].Histol Histopathol, 2006, 21: 841-847.[13] Kim JH, Yoon SY, Jeong SH, et al. Overexpression of Bmi-1 oncoprotein correlates with axillary lymph node metastases in invasiveductal breast cancer[J]. Breast, 2004, 13(5): 383-388.[14] Silva J, Garcia V, Garcia JM, et al. Circulating Bmi-1 mR-NA as a possible prognostic factor for advanced breast cancer patients[J].Breast Cancer Res, 2007, 9(4): R55.[15] Liu S, Dontu G, Mantle ID, et al. Hedgehog signaling andBmi-1 regulate Self-renewal of normal and malignant human mammarystem cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(12): 6063-6071.肿 瘤 基 础135

PROTEOMIC ANALYSIS OF HUMANEPITHELIAL OVARIAN CANCERXENOGRAFTS IN IMMUNODEFICIENTMICE EXPOSED TO CHRONICPSYCHOLOGICAL STRESSGAO Jun, GAO GuoLan*,XIONG Lijuan, ZHANG Yanyu, WANG Fen(Department of Gynecology, General Hospital of CAAC, Beijing 100012, China)Abstract: This study aims to compare alterations in the proteomes of human epithelial ovarian cancer xenografts between thestressed and non-stressed immunodeficient mice. Also, to explore the molecular mechanisms linking chronic psychological stress toovarian cancer oncogenesis and progression. Methods: SK -OV -3 cells were injected subcutaneously into nude mice. The stressgroup was subjected to a chronic physical restraint protocol for 6 h on 35 consecutive days, while the control group was unrestrained.All mice were sacrificed on Day 36 after SK-OV-3 cell injection, and tumors were excised. Tumor tissues were processed for 2D gelelectrophoresis, mass spectrometry (nanoUPLC-ESI-MS/MS) and western blotting. Results: The expression of twenty proteins wasfound to be significantly altered between the stress and control groups, of which fourteen were up-regulated, five were down-regulat 鄄ed, and one protein was found only in the stress group. All proteins were identified by UPLC-ESI-MS/MS, and western blotting resultswere consistent with those of proteomic methods. Conclusions: The present results provide new evidence relating to the molecularmechanism underlying the relationship between psychological stress and tumor progression.Keywords: proteomic; psychological stress; ovarian cancer; 2-D electrophoresis; UPLC-ESI-MS/MS136肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会肝 癌 转 移 分 子 机 制 与分 子 预 测 的 研 究 进 展 和 趋 势周 海 军 综 述 , 钦 伦 秀 审 校( 复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院 , 上 海 200032)转 移 是 恶 性 肿 瘤 最 重 要 的 生 物 学 表 型 , 是 影 响恶 性 肿 瘤 预 后 的 首 要 因 素 。 癌 转 移 的 过 程 是 一 个 多因 素 参 与 、 多 阶 段 发 展 极 其 复 杂 的 动 态 过 程 , 涉 及 癌细 胞 本 身 ( 肿 瘤 细 胞 异 质 性 等 )、 癌 与 微 环 境 及 机 体( 包 括 免 疫 、 内 分 泌 、 神 经 、 代 谢 等 ) 之 间 相 互 作 用 等多 方 面 因 素 。 肿 瘤 转 移 可 以 简 单 地 概 括 为 以 下 的 连续 过 程 :1) 原 发 灶 的 肿 瘤 细 胞 获 得 侵 袭 转 移 潜 能 。 2)侵 袭 转 移 能 力 的 癌 细 胞 离 开 原 发 瘤 进 入 血 循 环 。 3)癌 细 胞 到 达 转 移 靶 器 官 后 定 居 并 生 长 。 近 年 来 围 绕肿 瘤 转 移 的 机 制 各 国 学 者 已 进 行 了 大 量 的 研 究 , 取得 了 许 多 进 展 。 在 研 究 转 移 复 发 分 子 机 制 的 同 时 大量 的 潜 在 分 子 预 测 标 志 物 也 应 运 而 生 。 肝 细 胞 癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是 世 界 上 常 见 的 癌 症之 一 , 其 发 病 率 仍 在 上 升 。 本 文 以 肝 细 胞 癌 为 例 , 围绕 肿 瘤 转 移 的 主 要 过 程 , 简 要 介 绍 肿 瘤 转 移 复 发 分子 机 制 和 分 子 预 测 的 发 展 现 状 与 趋 势 。 同 时 鉴 于 炎症 免 疫 在 肿 瘤 转 移 中 的 重 要 作 用 以 及 它 贯 穿 于 肿 瘤转 移 的 各 阶 段 , 故 将 癌 相 关 炎 症 免 疫 单 独 讨 论 。1 癌 细 胞 侵 袭 转 移 潜 能 的 获 得1.1 肿 瘤 细 胞 自 身 遗 传 学 特 性 与 肿 瘤 转 移 潜 能的 关 系癌 细 胞 获 得 侵 袭 转 移 能 力 是 完 成 转 移 过 程 的 前提 , 但 并 非 所 有 癌 细 胞 都 有 这 种 能 力 并 完 成 整 个 过程 。 经 典 理 论 认 为 转 移 是 癌 细 胞 高 度 克 隆 选 择 的 过程 , 在 原 发 瘤 中 仅 少 数 细 胞 具 有 转 移 潜 能 , 癌 进 展 中部 分 细 胞 获 得 更 多 的 遗 传 学 改 变 , 从 而 获 得 转 移 能[1,2]力 , 因 此 转 移 发 生 在 晚 期 。 一 方 面 笔 者 曾 利 用 全 基因 组 分 子 遗 传 学 技 术 比 较 10 对 原 发 瘤 与 转 移 灶 基因 组 变 化 , 发 现 染 色 体 8p 缺 失 与 肝 癌 转 移 关 系 最 为[3]明 显 , 可 预 测 转 移 复 发 。 新 近 我 们 证 实 8p 上 的 肿 瘤抑 制 基 因 HTPAP 的 特 殊 基 因 型 与 肝 癌 的 转 移 和 临[4]床 预 后 密 切 相 关 。 另 一 方 面 , 临 床 上 常 见 肿 瘤 很 小 、很 早 即 已 出 现 远 处 转 移 , 甚 至 原 发 瘤 隐 匿 不 现 而 全身 转 移 , 且 许 多 病 理 诊 断 相 同 、 临 床 特 征 相 似 的 患 者预 后 完 全 不 同 。 近 年 笔 者 及 其 团 队 利 用 cDNA 微 阵列 技 术 研 究 发 现 肝 癌 转 移 基 因 改 变 在 原 发 瘤 阶 段 即[5]已 存 在 , 并 成 功 建 立 了 由 153 个 基 因 组 成 的 肝 癌 转移 分 子 预 测 模 型 。 此 后 其 它 的 肝 癌 基 因 表 达 谱 研 究[6-8]也 有 相 似 结 论 。 这 些 发 现 提 示 转 移 潜 能 的 获 得 是[9]癌 的 早 期 事 件 。 如 何 理 解 这 两 种 不 同 的 结 论 ? 笔 者及 其 团 队 通 过 对 肝 癌 转 移 复 发 分 子 机 制 研 究 的 系 统解 析 , 提 出 “ 肿 瘤 转 移 潜 能 在 原 发 瘤 阶 段 即 已 获 得 ,在 进 展 进 程 中 , 受 内 外 因 素 等 影 响 而 调 变 ” 的 新 观点 , 进 一 步 完 善 和 充 实 经 典 的 肿 瘤 转 移 理 论 。1.2 干 细 胞 与 肿 瘤 转 移 潜 能 的 关 系肿 瘤 干 细 胞 (cancer stem cells, CSC) 是 肿 瘤 群 体中 具 有 自 我 更 新 、 分 化 和 稳 态 控 制 能 力 的 细 胞 亚 群 ,尽 管 它 们 占 全 部 肿 瘤 细 胞 的 微 小 一 部 分 , 然 而 正 是肿 瘤 基 础137

[10]这 些 CSCs 亚 群 是 肿 瘤 恶 性 进 程 的 关 键 起 始 者 。 目前 我 们 已 从 乳 腺 癌 、 肝 癌 、 大 肠 癌 、 前 列 腺 癌 、 胃 癌 、肺 腺 癌 、 胰 腺 癌 等 实 体 瘤 中 根 据 各 自 不 同 的 表 面 标[11]记 分 离 出 具 有 干 细 胞 特 征 的 细 胞 亚 群 , 但 问 题 是 :这 些 CSCs 是 癌 固 有 的 还 是 进 展 中 诱 生 的 ? CSC 与 肿[12]瘤 侵 袭 转 移 的 关 系 ? Brabletz 等 提 出 转 移 癌 干 细 胞的 概 念 (Migrating cancer stem,MCSC), 认 为 并 非 每 个CSC 都 有 转 移 能 力 , 仅 小 部 分 CSC 具 有 转 移 能 力 。 近年 研 究 表 明 , 肿 瘤 干 细 胞 及 其 微 环 境 之 间 相 互 作 用不 容 忽 视 。 肿 瘤 细 胞 的 微 环 境 或 CSC 的 微 环 境 是 由多 种 间 质 细 胞 以 及 其 分 泌 的 细 胞 因 子 构 成 的 , 对CSC 的 存 活 及 干 性 的 维 持 起 到 了 重 要 的 调 控 作 用 ,[9]其 机 制 有 待 于 深 入 研 究 。 最 近 发 展 的 将 终 末 分 化 细胞 诱 导 为 干 细 胞 样 细 胞 的 “ 重 编 程 ” 技 术 为 CSC 研 究[13-14]提 供 了 独 特 的 研 究 思 路 和 平 台 。 人 工 诱 导 具 有 多向 分 化 潜 能 的 癌 细 胞 (induced pluripotent cancer,iPC) 具 有 CSC 特 性 , 目 前 已 成 功 诱 导 直 肠 癌 等 多 种癌 症 患 者 的 iPC [15-16] 。随 着 对 肿 瘤 干 细 胞 的 研 究 , 人 们 也 发 现 肿 瘤 干细 胞 相 关 分 子 也 有 预 测 肝 癌 预 后 的 潜 能 。 通 过 免 疫组 化 的 分 析 发 现 肿 瘤 干 细 胞 相 关 标 志 物 CD133 对 肝[17] [18]癌 预 后 有 预 测 价 值 。 Villanueva 等 发 现 肿 瘤 抑 制基 因 TP53 基 因 的 突 变 会 使 肝 癌 细 胞 具 有 了 干 细 胞样 基 因 表 达 特 征 , 这 些 能 预 示 肝 癌 患 者 的 预 后 。 Yamashita等 研 究 发 现 用 肝 癌 组 织 表 达 的 肝 癌 干 细 胞[19]相 关 标 志 物 EpCAM 结 合 AFP 可 以 对 肝 癌 患 者 进 行预 后 的 分 层 , 并 可 能 指 导 术 后 治 疗 。 另 有 研 究 报 道 肝癌 干 细 胞 中 GEP 和 ABCB5 的 表 达 明 显 与 肝 癌 患 者[20]对 化 疗 的 抵 抗 和 总 生 存 时 间 。1.3 癌 细 胞 上 皮 - 间 质 转 化 (EMT) 与 肿 瘤 细 胞 转移 潜 能 的 关 系在 癌 进 展 过 程 中 , 进 展 的 癌 细 胞 常 表 现 出 内 皮标 志 物 的 明 显 下 调 以 及 细 胞 间 连 接 的 缺 失 , 导 致 细胞 极 性 的 缺 失 、 细 胞 间 黏 附 降 低 和 运 动 能 力 的 增 强 。这 一 过 程 称 为 上 皮 细 胞 间 质 转 化 (Epithelial-mesenchymaltransitions,EMT)。 研 究 发 现 细 胞 可 通 过 多种 途 径 启 动 并 进 行 EMT。 肿 瘤 细 胞 发 生 EMT 即 可 以是 瞬 时 的 , 也 可 以 是 永 久 的 , 而 且 是 不 同 程 度 的 , 有时 还 可 以 出 现 逆 转 化 (mesenchymal - Epithelial transitions,MET)[21] 。 已 发 现 的 调 控 EMT 的 转 录 因 子 有Snail、Slug、Twist、Goosecoid、ZEB1、SIP1、FoxC2、HOXB7、TCF3、CBF-A 和 E12/E47 等 十 种 以 上 , 其 中 研 究 较多 的 是 Snail、Twist 和 ZEB1。 其 下 游 激 酶 , 如 Ras、Src、PI3K、MAPK 等 均 被 认 为 可 促 进 恶 性 表 型 。Src 激[22]活 可 增 加 侵 袭 性 并 促 进 E-cadherin 的 降 解 。 而 且越 来 越 多 的 证 据 表 明 肿 瘤 细 胞 与 邻 近 的 肿 瘤 相 关 基质 细 胞 之 间 的 相 互 作 用 诱 导 肿 瘤 细 胞 EMT 也 是 通过 上 述 转 录 因 子 。 最 近 研 究 证 实 EMT 能 诱 导 非 癌SCs 进 入 CSCs 状 态 , 肿 瘤 EMT 进 程 的 激 活 通 常 需 要癌 细 胞 和 邻 近 基 质 细 胞 间 的 信 号 互 换 , 进 展 的 原 发 癌细 胞 可 募 集 各 型 细 胞 : 成 纤 维 细 胞 , 肌 纤 维 细 胞 , 粒 细胞 , 巨 噬 细 胞 间 叶 细 胞 和 淋 巴 细 胞 , 进 入 周 围 基 质 , 这些 募 集 的 细 胞 形 成 了 一 种 “ 反 应 性 ” 基 质 , 诱 导 EMT信 号 释 放 , 通 过 激 活 EMT 转 录 因 子 (EMT-TFs) 而 起 始[9,23]肿 瘤 细 胞 EMT 进 程 。 因 为 捕 获 肿 瘤 进 展 的 某 一 瞬间 , 在 技 术 上 有 很 大 难 度 所 以 目 前 EMT 在 肿 瘤 侵 袭转 移 中 的 作 用 仍 未 证 实 。在 研 究 EMT 在 肝 癌 转 移 复 发 中 作 用 的 过 程 中 ,人 们 也 发 现 了 一 些 可 预 测 肝 癌 转 移 的 重 要 分 子 。 信号 转 导 分 子 STAT5b 可 通 过 诱 导 EMT 过 程 增 加 肝 癌[24]细 胞 的 运 动 和 侵 袭 能 力 , 并 且 与 患 者 的 预 后 相 关 。Niu 等 报 道 EMT 过 程 的 转 录 因 子 Twist 在 肝 癌 组 织中 高 表 达 预 示 着 肝 癌 患 者 更 容 易 肝 内 或 肝 外 转 移 ,[25-26]而 Snail 的 表 达 也 与 患 者 的 坏 预 后 相 关 。 另 有 报道 P28 蛋 白 可 促 进 肝 癌 细 胞 的 EMT, 是 肝 癌 转 移 复[27]发 的 有 力 预 测 分 子 。2 循 环 肿 瘤 细 胞肿 瘤 细 胞 脱 离 原 发 瘤 部 位 到 达 远 处 转 移 靶 器 官138肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会之 前 要 先 进 入 血 液 循 环 , 许 多 进 展 期 肿 瘤 患 者 血 液中 能 够 监 测 到 循 环 肿 瘤 细 胞 (Circulating tumor cells,CTCs),CTCs 和 播 散 肿 瘤 细 胞 (Disseminated tumorcells,DTCs) 与 肿 瘤 的 进 展 程 度 以 及 临 床 复 发 密 切 相[28]关 , 而 且 对 于 临 床 诊 断 和 预 后 评 估 有 着 重 要 价 值 。目 前 对 CTCs 以 及 它 们 在 转 移 中 作 用 的 理 解 还 很 不清 楚 , 主 要 因 为 CTCs 和 DTCs 的 检 测 技 术 敏 感 性 低等 技 术 问 题 。 另 外 肿 瘤 细 胞 表 面 的 组 织 蛋 白 可 吸 引血 小 板 集 聚 , 聚 集 的 血 小 板 掩 盖 了 CTCs 的 表 面 抗[29]原 , 增 加 了 检 测 CTCs 的 难 度 。 尽 管 很 复 杂 , 从 血 循环 中 分 离 CTCs 是 一 个 相 对 无 损 伤 的 诊 断 措 施 , 而 且CTCs 主 要 来 源 于 原 发 瘤 , 通 过 监 测 肿 瘤 病 人 的 CTCs会 帮 助 我 们 对 治 疗 效 果 进 行 评 估 。 目 前 分 离 循 环 肿瘤 细 胞 (CTC) 的 标 准 方 法 是 基 于 肿 瘤 细 胞 表 面 上 皮性 抗 原 的 磁 性 激 活 细 胞 分 选 技 术 (magnetic-activatedcell separation,MACS)。 由 于 缺 乏 针 对 肝 癌 细 胞 表 面特 异 性 抗 原 的 单 克 隆 抗 体 , 迄 今 鲜 见 MACS 用 于 分离 循 环 肝 癌 细 胞 的 报 道 。 基 于 上 皮 细 胞 粘 附 分 子(EpCAM) 抗 体 磁 珠 的 CellSearch 系 统 已 被 美 国 FDA批 准 用 于 检 测 乳 腺 癌 、 结 肠 癌 和 前 列 腺 癌 循 环 肿 瘤[30]细 胞 。 尽 管 肝 癌 细 胞 属 于 上 皮 性 细 胞 , 但 EpCAM仅 在 约 35% 的 HCC 中 表 达 。 因 此 ,CellSearch 系 统 并不 适 合 用 于 分 离 、 检 测 循 环 肝 癌 细 胞 。 最 近 ,Yin 等 基于 去 唾 液 酸 糖 蛋 白 受 体 及 其 配 体 相 互 作 用 的 原 理 创建 了 一 种 较 为 特 异 和 敏 感 的 循 环 肝 癌 细 胞 磁 性 分 离方 法 。 并 证 实 其 对 肝 癌 的 诊 断 和 转 移 复 发 预 测 具 潜[31]在 临 床 应 用 价 值 。3 转 移 癌 细 胞 在 靶 器 官 定 居 与 生 长循 环 肿 瘤 细 胞 会 特 异 地 归 巢 到 远 处 靶 器 官 , 一旦 到 达 新 组 织 的 毛 细 血 管 床 , CTCs 不 久 就 从 血 管 侵出 到 新 组 织 。 癌 细 胞 和 组 织 的 特 殊 生 物 学 特 性 在 靶向 性 转 移 中 起 了 一 定 的 作 用 , 转 移 癌 细 胞 所 表 达 的蛋 白 ( 如 integrin) 在 这 个 过 程 中 起 了 一 个 关 键 的 作[32-33]用 。 但 目 前 癌 细 胞 靶 向 性 归 巢 的 机 理 仍 不 清 楚 。笔 者 所 在 复 旦 大 学 肝 癌 研 究 所 近 期 已 优 化 建 立 了 基于 人 肝 癌 高 转 移 潜 能 细 胞 株 HCCLM9 的 肝 癌 肺 转 移裸 鼠 模 型 和 纵 膈 淋 巴 结 定 向 转 移 的 裸 鼠 模 型 , 为 靶向 转 移 的 机 理 研 究 和 靶 向 转 移 的 分 子 预 测 提 供 了 有利 的 研 究 工 具 。癌 细 胞 在 靶 器 官 定 居 与 拓 殖 性 生 长 必 须 先 主 动适 应 并 改 造 微 环 境 , 形 成 利 于 其 定 居 与 生 长 的 环 境( 即 转 移 小 生 境 ,metastatic niche)。 而 微 环 境 对 癌 细[34]胞 进 入 也 发 生 反 相 适 应 并 可 能 调 变 癌 细 胞 特 性 。 癌细 胞 与 微 环 境 间 的 互 动 对 话 (cross-talk) 被 广 为 关注 。 我 们 在 建 立 人 肝 癌 转 移 模 型 过 程 中 发 现 “ 土 壤 反过 来 可 改 变 种 子 的 特 性 ”。 目 前 人 们 正 尝 试 破 解 癌 细胞 与 其 微 环 境 间 相 互 作 用 的 “ 语 言 密 码 ”, 最 终 阻 断其 “ 对 话 ” [35] 。在 这 一 时 期 肿 瘤 已 发 生 转 移 , 故 基 于 此 期 的 分子 预 测 意 义 不 大 , 但 研 究 这 一 时 期 有 助 于 探 索 抗 癌转 移 疗 法 。4 炎 症 免 疫 反 应 与 肿 瘤 的 侵 袭 转 移癌 相 关 炎 症 免 疫 反 应 是 一 新 热 点 。 越 来 越 多 的证 据 表 明 炎 症 可 促 进 癌 的 发 生 、 生 长 与 转 移 。 炎 症 免疫 在 肿 瘤 的 免 疫 逃 逸 中 起 重 要 作 用 , 当 炎 症 细 胞 被 募集 到 进 行 性 生 长 的 肿 瘤 位 置 时 , 受 到 肿 瘤 产 生 的 产 物[36]( 如 VEGF) 的 激 活 , 可 以 抑 制 保 护 性 的 抗 肿 瘤 免 疫 。肿 瘤 微 环 境 存 在 大 量 炎 性 细 胞 , 它 们 分 泌 细 胞 因 子 、趋 化 因 子 及 生 长 因 子 等 在 对 损 伤 免 疫 应 答 的 同 时 ,更 为 癌 的 发 生 发 展 、 特 别 是 侵 袭 转 移 提 供 了 必 要 的[37]炎 性 微 环 境 。 我 们 与 美 国 合 作 研 究 发 现 微 环 境 炎 症免 疫 失 衡 是 影 响 转 移 的 重 要 方 面 、 炎 症 免 疫 因 子 标[38-40]签 可 预 测 转 移 ; 巨 噬 细 胞 分 泌 的 CSF-1 促 癌 转[41]移 。 但 炎 症 免 疫 反 应 的 作 用 复 杂 多 变 , 促 癌 与 抗 癌作 用 并 存 , 例 如 ,IL-1 和 MyD88 在 鼠 模 型 实 验 中 有明 显 的 促 肿 瘤 形 成 作 用 , 但 在 肿 瘤 形 成 的 后 期 它 们 却起 相 反 作 用 。 最 新 提 出 “ 癌 的 免 疫 编 辑 ”(cancer immunoediting)概 念 , 其 相 互 转 化 机 制 并 不 清 楚 , 对 其肿 瘤 基 础139

深 入 研 究 有 望 找 到 调 变 炎 症 免 疫 微 环 境 防 治 癌 转 移[23]的 新 策 略 。综 上 所 述 , 尽 管 肿 瘤 转 移 的 研 究 进 行 了 多 年 , 在肿 瘤 转 移 的 理 念 上 发 生 了 很 大 的 变 化 。 但 转 移 过 程具 有 相 当 复 杂 性 , 仍 有 许 多 问 题 不 清 , 如 : 肿 瘤 细 胞转 移 能 力 是 先 天 固 有 的 , 还 是 后 天 经 克 隆 筛 选 或 受环 境 作 用 影 响 获 得 的 ? 诱 生 或 重 编 程 肿 瘤 干 细 胞 样细 胞 的 来 源 ,EMT 和 MET 的 转 换 ? 播 散 癌 细 胞(DTC) 如 何 逃 避 机 体 免 疫 攻 击 以 及 如 何 抗 凋 亡 ? 癌细 胞 靶 向 性 归 巢 的 机 理 ? 器 官 组 织 微 环 境 包 括 炎 症微 环 境 对 肿 瘤 细 胞 的 识 别 , 及 其 相 互 诱 导 和 对 话 机制 ? 肿 瘤 血 管 及 代 谢 的 适 应 性 变 化 等 病 理 过 程 的 触发 、 维 持 和 进 展 的 机 制 ? 等 , 仍 然 是 肿 瘤 转 移 的 研 究重 点 和 热 点 。 尽 管 迄 今 为 止 已 经 发 现 了 许 多 与 肿 瘤患 者 预 后 和 转 移 复 发 相 关 的 分 子 指 标 , 但 这 些 发 现重 叠 性 小 , 特 别 是 通 过 基 因 和 蛋 白 表 达 谱 筛 选 的 结果 , 实 验 方 法 、 病 例 的 选 择 标 准 以 及 结 果 的 统 计 分 析方 法 等 的 不 同 都 可 能 造 成 结 果 的 偏 差 。 今 后 在 肝 癌分 子 预 测 的 研 究 上 , 以 下 几 个 方 向 值 得 探 索 :1 对 已有 分 子 指 标 继 续 扩 大 样 本 验 证 优 化 ;2 开 展 “ 由 因 及果 ” 的 前 瞻 性 临 床 研 究 , 才 能 明 确 真 正 可 用 于 临 床 预测 的 分 子 标 志 物 ;3 血 清 学 标 志 物 因 其 创 伤 小 、 可 重复 , 仍 然 是 目 前 生 物 标 志 物 发 展 的 主 要 方 向 ;4 目 前肝 癌 的 临 床 分 期 主 要 是 基 于 肿 瘤 的 临 床 和 组 织 病 理特 征 来 划 分 的 , 将 大 样 本 验 证 优 化 后 的 分 子 标 志 物与 这 些 临 床 病 理 特 征 相 结 合 , 可 能 会 提 高 现 有 临 床分 期 的 预 测 准 确 率 ; 5 肝 癌 的 复 发 可 分 为 早 期 复 发[42]和 晚 期 复 发 , 其 术 后 辅 助 治 疗 方 案 有 所 不 同 , 因 此针 对 两 种 复 发 的 精 确 预 测 , 也 将 会 有 效 的 指 导 术 后治 疗 , 使 肝 癌 患 者 更 为 受 益 。参 考 文 献[1] Gupta GP, Massagué J. Cancer metastasis: building a framework.Cell. 2006 Nov 17;127(4):679-95.[2] McCarthy N. Metastasis: Influencing bad behaviour. Nat RevCancer. 2009 Sep;9(9):609.[3] Qin LX, Tang ZY, Sham JS, Ma ZC, Ye SL, Zhou XD, WuZQ, Trent JM, Guan XY. The association of chromosome 8p deletionand tumor metastasis in human hepatocellular carcinoma. CancerRes. 1999 Nov 15;59(22):5662-5.[4] Ren N, Wu JC, Dong QZ, Sun HJ, Jia HL, Li GC, Sun BS,Dai C, Shi J, Wei JW, Sheng YY, Zhou HJ, Ye QH, Qin LX. Associationof Specific Genotypes in Metastatic Suppressor HTPAP withTumor Metastasis and Clinical Prognosis in Hepatocellular Carcinoma.CancerRes. 2011 May 1;71(9):3278-86.[5] Ye QH, Qin LX, Forgues M, He P, Kim JW, Peng AC, SimonR, Li Y, Robles AI, Chen Y, Ma ZC, Wu ZQ, Ye SL, Liu YK, TangZY, Wang XW. Predicting hepatitis B virus-positive metastatic hepatocellularcarcinomas using gene expression profiling and supervisedmachine learning. Nat Med. 2003 Apr;9(4):416-23.[6] Budhu A, Jia HL, Forgues M, et al. Identification of metastasis-relatedmicroRNAs in hepatocellular carcinoma. Hepatology2008; 47:897-907.[7] Lee JS, Chu IS, Heo J, et al. Classification and prediction ofsurvival in hepatocellular carcinoma by gene expression profiling.Hepatology 2004; 40:667-676.[8] Villanueva A, Minguez B, Forner A, Reig M, Llovet JM.Hepatocellular carcinoma: novel molecular approaches for diagnosis,prognosis, and therapy. Annu Rev Med. 2010;61:317-28.[9] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the nextgeneration. Cell. 2011 Mar 4;144(5):646-74.[10] Shackleton M, Quintana E, Fearon ER, Morrison SJ. Heterogeneityin cancer: cancer stem cells versus clonal evolution. Cell.2009 Sep 4;138(5):822-9.[11] Dirks P. Cancer stem cells: Invitation to a second round.Nature. 2010 Jul 1;466(7302):40-1.[12] Brabletz T, Jung A, Spaderna S, Hlubek F, Kirchner T.Opinion: migrating cancer stem cells - an integrated concept of malignanttumour progression.Nat Rev Cancer. 2005 Sep;5(9):744-9.[13] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76.[14] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-BourgetJ, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R,Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derivedfrom human somatic cells. Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20.[15] Miyoshi N, Ishii H, Nagai K, Hoshino H, Mimori K, TanakaF, Nagano H, Sekimoto M, Doki Y, Mori M. Defined factors inducereprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Jan 5;107(1):40-5.[16] Utikal J, Polo JM, Stadtfeld M, Maherali N, Kulalert W,Walsh RM, Khalil A, Rheinwald JG, Hochedlinger K. Immortalizationeliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1145-8.[17] Song W, Li H, Tao K, Li R, Song Z, Zhao Q, Zhang F, DouK. Expression and clinical significance of the stem cell markerCD133 in hepatocellular carcinoma. Int J Clin Pract. 2008 Aug;62(8):140肿 瘤 基 础

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Semin Liver Dis.2010 Feb;30(1):35-51.肿 瘤 基 础141

抑 制 LOX 下 调 荷 胃 癌裸 鼠 肿 瘤 MMP-2、9韩 梅 , 马 百 箐1(1. 宁 夏 医 科 大 学 , 免 疫 学 系 , 宁 夏 银 川 750004)摘 要 : 目 的 : 研 究 用 β- 氨 基 丙 腈 (BAPN) 抑 制 赖 氨 酰 氧 化 酶 (Lysyl Oxidase,LOX) 后 , 对 荷 胃 癌 裸 鼠 肿 瘤 组 织 基 质金 属 蛋 白 酶 -2 和 9(Matrix Metalloproteinase-2 and 9,MMP-2 and 9) 的 表 达 及 酶 活 性 的 影 响 , 以 探 讨 在 肿 瘤 发 生 发 展过 程 中 LOX 与 MMP-2、9 的 关 系 。 方 法 :6 周 龄 的 裸 鼠 随 机 分 为 对 照 组 和 BAPN 预 处 理 组 ( 实 验 组 ), 每 组 10 只 。 其 中实 验 组 每 天 用 LOX 的 抑 制 剂 BAPN 腹 腔 注 射 , 对 照 组 每 天 用 相 同 体 积 的 无 菌 PBS 腹 腔 注 射 。 两 周 后 , 两 组 小 鼠 均 以胃 癌 细 胞 SGC-7901 细 胞 接 种 于 背 部 皮 下 。 接 种 4 周 后 取 肿 瘤 组 织 。 分 别 检 测 肿 瘤 MMP-2、9 的 蛋 白 含 量 和 酶 活 性 .结 果 : 当 LOX 活 性 被 抑 制 后 , 对 照 组 的 MMP-2 酶 原 及 活 性 形 式 表 达 高 于 实 验 组 。 明 胶 酶 谱 检 测 MMP-2 的 酶 活 性 ,对 照 组 明 显 高 于 实 验 组 。 对 于 MMP-9, 对 照 组 的 表 达 和 酶 活 性 明 显 高 于 实 验 组 。 结 论 :BAPN 抑 制 LOX 活 性 后 , 荷 胃癌 裸 鼠 肿 瘤 中 的 MMP-2 和 MMP-9 的 蛋 白 表 达 和 酶 活 性 均 下 降 。 提 示 抑 制 LOX 可 下 调 MMP-2 和 9,LOX 与 MMP-2 和 9 可 能 同 步 表 达 , 在 胃 癌 的 发 生 发 展 中 协 同 作 用 。关 键 词 : 赖 氨 酰 氧 化 酶 ; 基 质 金 属 蛋 白 酶 2; 基 质 金 属 蛋 白 酶 9; 胃 癌142肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会江 西 省 美 沙 酮 维 持 治 疗海 洛 因 依 赖 者 的 生 活 质 量 及各 维 度 影 响 因 素 研 究颜 兴 伟 1, 杨 玉 金 2, 龚 俊 平 3, 闵 建 华 1, 李 国 恩4(1. 南 昌 市 东 湖 区 疾 病 预 防 控 制 中 心 , 江 西 南 昌 33008;2. 南 昌 大 学 第 二 附 属 医 院 ;3. 江 西 省 疾 病 预 防 控 制 中 心 中 心 ;4. 南 昌 市 药 物 维 持 治 疗 西 湖 门 诊 部 )摘 要 : 目 的 : 分 析 江 西 省 南 昌 市 和 九 江 市 接 受 美 沙 酮 维 持 治 疗 (MMT) 前 后 的 海 洛 因 依 赖 者 生 活 质 量 各 维 度 的 变化 及 其 影 响 因 素 , 为 MMT 综 合 治 疗 提 供 理 论 依 据 。 方 法 : 选 择 江 西 省 南 昌 市 东 湖 区 、 西 湖 区 及 九 江 市 三 个 美 沙 酮 门诊 2008 年 1-6 月 新 入 组 的 海 洛 因 依 赖 者 为 调 查 对 象 , 使 用 阿 片 类 药 物 成 瘾 者 生 活 质 量 量 表 对 调 查 对 象 进 行 问 卷 调查 , 用 Excel 软 件 建 立 数 据 库 ,SPSS 软 件 进 行 数 据 资 料 的 统 计 分 析 。 结 果 :MMT 治 疗 前 后 海 洛 因 依 赖 者 身 体 健 康 状况 、 家 庭 关 系 与 社 会 支 持 、 毒 品 依 赖 3 个 维 度 生 活 质 量 得 分 有 统 计 学 意 义 (P0.05)。 身 体 健 康 状 况 改 变 的 单 因 素 分 析 影 响 因 素 有 地 区 、 经 济 来 源 和 治 疗 期 间 家 庭 精 神 支 持 。 多元 逐 步 回 归 分 析 显 示 影 响 因 素 有 地 区 、 治 疗 前 经 济 来 源 是 否 为 临 时 工 、 治 疗 期 间 家 人 那 里 得 到 精 神 支 持 、 年 龄 和 维持 治 疗 累 计 服 药 天 数 。 家 庭 关 系 与 社 会 支 持 改 变 的 单 因 素 分 析 影 响 因 素 有 地 区 、 治 疗 期 间 家 庭 精 神 支 持 、 治 疗 期 间家 庭 经 济 支 持 和 治 疗 期 间 朋 友 精 神 支 持 。 多 因 素 分 析 结 果 为 治 疗 期 间 家 人 精 神 支 持 、 地 区 和 治 疗 期 间 朋 友 经 济 支 持是 家 庭 关 系 与 社 会 支 持 改 善 的 影 响 因 素 。 毒 品 依 赖 改 变 的 单 因 素 分 析 影 响 因 素 有 地 区 和 美 沙 酮 首 日 剂 量 。 多 因 素 分析 结 果 为 首 日 剂 量 、 既 往 强 制 戒 毒 次 数 和 吸 毒 时 间 长 短 是 毒 品 依 赖 改 善 的 影 响 因 素 。 结 论 : 长 期 坚 持 MMT 可 以 改 善海 洛 因 依 赖 者 的 生 活 质 量 。 家 人 的 精 神 支 持 对 患 者 身 体 健 康 状 况 、 心 理 健 康 状 况 及 家 庭 关 系 和 社 会 支 持 改 善 程 度 影响 显 著 , 家 人 用 于 治 疗 费 和 生 活 费 等 经 济 支 持 对 患 者 满 意 度 改 善 影 响 显 著 , 吸 毒 时 间 较 长 患 者 经 过 1 年 MMT 后 毒品 依 赖 改 善 程 度 更 高 。关 键 词 : 美 沙 酮 维 持 治 疗 (MMT); 海 洛 因 依 赖 者 ; 生 活 质 量 ; 影 响 因 素肿 瘤 基 础143

THE INFLUENCING FACTOR OFDIFFERENT DIMENSIONS OF THEMETHADONE MAINTENANCETREATMENT FOR HEROIN ADDICTS’SLIFE QUALITY AFTER TREATMENTYAN Xingwei, YANG Yujin, GONG Junping, et al(Donghu District of Nan Chang City Provincial CDC, Nanchang Jiangxi 330008, China)Abstract: Objective: To analyze the Methadone Maintenance treatment (MMT) for heroin addicts’s life quality dimensions be 鄄fore and after the treatment in Nanchang and Jiujiang City in Jiangxi province, and also about the influencing factor of it. to provide atheoretical basis for comprehensive treatment of MMT. Methods: Choose Three methadone clinics in Jiujiang City and Donghu Dis 鄄trict and Xihu District of Nanchang city, Jiangxi Province in 2008, in the first 6 months of patient as the new group survey, Opioid ad 鄄dicts using the quality of life questionnaire for the survey questionnaires, Excel software with a database, SPSS software for statisticalanalysis of data. Results: MMT treatment of heroin addicts before and after the physical health status, family relationships and socialsupport, drug dependence 3 dimensions of quality of life scores was statistically significant (P0.05). Changes in physical health impact of single factor analysis of regionalfactors, economic resources and family emotional support during treatment. Multiple stepwise regression analysis showed that thereare regional factors, economic resources before treatment whether temporary, treatment received moral support during the family, age,and medication maintenance treatment of cumulative number of days. Changes in family relationships and social support of singlefactoranalysis of regional factors, treatment, emotional support during the family, family economic support during treatment and psy 鄄chological support during treatment friends. Multivariate analysis showed the spirit of support for the family during treatment, regionaland economic support during treatment is the family friends and social support factors of improvement. Drug-dependent changes infactors of univariate analysis of the first region and the daily dose of methadone. Multivariate analysis led daily dose, previous numberof compulsory treatment and drug abuse is the length of time to improve the impact of factors of drug dependence. Conclusion: Insist 鄄ed for a long time after MMT may improve heroin used patient's quality of life. Family member's spirit supports to the patient overallquality of life improvement, the health condition, the psychologically healthy condition and the diplomatic relation and the societysupports the improvement degree influence to be remarkable, the family member uses in economies and so on cost of treatment andliving expenses supports to the patient degree of satisfaction improvement influence is remarkable, after the taking drugs time longpatient passes through 1 year MMT, the narcotic dependence improvement degree is higher.Keywords: methadone maintains the treatment (MMT) ; heroin addicts ;quality of life; influencing factor144肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会已 有 研 究 表 明 , 海 洛 因 依 赖 者 血 液 微 量 元 素 及[1-2]肝 肾 功 能 等 生 化 指 标 发 生 改 变 , 生 活 质 量 明 显 降[3]低 。 美 沙 酮 维 持 治 疗 (MMT) 是 针 对 阿 片 类 药 物 依 赖的 一 种 替 代 治 疗 方 法 。 我 们 从 江 西 省 已 开 展 的 13 个MMT 门 诊 点 中 选 择 较 早 开 展 美 沙 酮 维 持 治 疗 服 务的 东 湖 区 、 西 湖 区 和 九 江 市 门 诊 作 为 研 究 现 场 , 从2008 年 1-6 月 所 有 新 入 组 接 受 治 疗 的 海 洛 因 依 赖 者为 研 究 对 象 , 研 究 其 治 疗 1 年 前 后 生 活 质 量 改 变 及各 维 度 影 响 因 素 , 为 提 高 MMT 患 者 的 生 活 质 量 提 供理 论 依 据 。 现 报 告 如 下 :1 对 象 和 方 法1.1 研 究 对 象 确 定 南 昌 市 东 湖 区 、 西 湖 区 和 九江 市 社 区 维 持 治 疗 门 诊 为 研 究 现 场 , 选 择 从 2008 年1~6 月 所 用 新 入 组 接 受 MMT 的 海 洛 因 依 赖 者 为 跟踪 研 究 对 象 , 跟 踪 期 限 为 1 年 , 即 到 2009 年 6 月 底止 仍 保 持 在 门 诊 接 受 MMT 的 研 究 对 象 为 最 终 研 究对 象 , 共 182 人 , 其 中 男 132 人 (72.53%), 女 50 人(27.47%), 男 女 性 别 比 为 2.64:1。 年 龄 为 37.66±6.427岁 , 最 大 为 53 岁 , 最 小 为 22 岁 , 吸 毒 年 龄 主 要 集 中在 30~50 年 龄 段 最 多 , 有 161 人 。 全 部 病 例 均 符 合 美国 精 神 病 学 协 会 制 定 的 精 神 障 碍 诊 断 和 统 计 手 册 第三 版 修 订 版 (DSM-Ⅲ-R) 海 洛 因 依 赖 者 和 药 物 滥 用[4]诊 断 标 准 。1.2 研 究 方 法 采 用 自 填 式 问 卷 调 查 方 法 。 填 写问 卷 前 统 一 的 培 训 , 说 明 本 次 调 查 目 的 和 意 义 , 受 试者 在 指 定 的 时 间 里 以 自 评 的 方 式 集 中 填 写 问 卷 , 答题 后 回 收 问 卷 , 筛 除 无 效 问 卷 。 调 查 工 具 包 括 :(1) 自编 问 卷 : 内 容 包 括 海 洛 因 依 赖 者 的 基 本 情 况 和 药 物滥 用 情 况 等 ;(2) 生 活 质 量 测 定 量 表 (QOLDA-61) [5] :共 61 个 条 目 , 包 括 身 体 健 康 状 况 、 心 理 健 康 状 况 、 家庭 关 系 与 社 会 支 持 、 日 常 生 活 活 动 与 经 济 状 况 、 毒 品依 赖 、 生 活 满 意 度 6 个 维 度 构 成 , 该 量 表 克 郎 巴 赫 系数 为 0.958, 重 测 信 度 为 0.917。1.3 统 计 分 析 用 Excel 软 件 进 行 数 据 的 录 入 ,将 数 据 SPSS13.0 软 件 , 对 数 据 进 行 描 述 性 统 计 , 计 量资 料 用 均 数 ± 标 准 差 (x±s) 表 示 , 进 行 t 检 验 、 单 因 素方 差 分 析 , 计 数 资 料 用 构 成 比 表 示 , 生 活 质 量 总 分 与各 自 变 量 的 关 系 采 用 逐 步 筛 选 法 进 行 多 元 线 性 回 归分 析 , 检 验 水 准 α=0.05, 双 侧 检 验 。2 结 果2.1 研 究 对 象 一 般 情 况本 次 研 究 182 名 接 受 MMT 的 人 员 , 其 中 男 132人 (72.53%), 女 50 人 (27.47%), 男 女 性 别 比 为 2.64:1。 年 龄 平 均 为 37.66±6.427 岁 , 主 要 集 中 在 30~50岁 , 东 湖 区 、 西 湖 区 、 九 江 市 三 地 接 受 MMT 的 人 群 年龄 无 统 计 学 差 异 (P>0.05)。 民 族 全 部 为 汉 族 。 文 化 程度 小 学 及 以 下 18 人 (9.89%), 初 中 104 人 (57.14%),高 中 / 中 专 57 人 (31.32%), 大 专 及 以 上 3 人(1.65%)。 居 住 情 况 : 与 家 人 同 住 的 有 138 人(75.82%), 与 朋 友 同 住 的 有 8 人 (4.40%), 独 自 居 住36 人 (19.78%)。 经 济 状 况 : 治 疗 前 一 个 月 自 己 有 工作 或 做 生 意 的 工 作 生 意 的 43 人 (23.63%), 其 中 主 要经 济 来 源 是 固 定 工 作 的 22 人 (12.09%), 临 时 工 的 21人 (11.54%), 没 有 的 139 人 (76.37%)。2.2 MMT 治 疗 前 后 生 活 质 量 比 较MMT 治 疗 前 后 海 洛 因 依 赖 者 身 体 健 康 状 况 、 家庭 关 系 与 社 会 支 持 、 毒 品 依 赖 3 个 维 度 生 活 质 量 得分 有 统 计 学 意 义 (P0.05)。 见 表 1。表 1 MMT 治 疗 前 后 海 洛 因 依 赖 折 生 活 质 量 得分 比 较治 疗 前 治 疗 后 t P身 体 健 康 状 况 71.23±13.71 75.35±15.34 -2.739 0.007心 理 健 康 状 况 72.46±15.64 74.54±14.58 -1.400 0.164家 庭 关 系 与 社 会 支 持 72.11±17.31 76.23±16.76 3.340 0.001日 常 生 活 活 动 与 经 济 状 况 62.20±14.09 61.07±13.60 0.783 0.435毒 品 依 赖 68.20±21.79 86.43±13.38 -8.936 0.000满 意 度 60.70±15.51 61.42±16.44 -0.437 0.663总 体 生 活 质 量 67.82±12.25 70.84±10.86 -2.647 0.009肿 瘤 基 础145

2.3 MMT 治 疗 前 后 生 活 质 量 改 变 各 维 度 的 单 因素 分 析MMT 治 疗 前 后 海 洛 因 依 赖 者 单 因 素 分 析 发 现身 体 健 康 状 况 改 变 的 影 响 因 素 有 地 区 、 经 济 来 源 和治 疗 期 间 家 庭 精 神 支 持 有 统 计 学 意 义 (P

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会婚 姻 状 况未 婚 3.63±16.70 1.49±16.02 -8.88±21.05 -4.04±15.89 16.53±24.20 1.15±20.22已 婚 5.43±18.69 1.81±17.80 -3.65±20.87 1.35±17.05 17.50±22.51 2.34±17.05离 异 或 丧 偶 2.51±15.53 3.24±17.03 -5.85±17.75 -1.63±16.20 21.64±24.02 -2.59±20.01F 0.320 0.109 0.807 1.312 0.488 0.729P 0.727 0.897 0.449 0.273 0.615 0.484居 住 状 况与 家 人 3.83±17.30 2.02±17.12 -5.88±21.31 -0.08±17.12 17.05±23.98 0.46±17.76与 朋 友 7.61±28.62 4.04±18.91 -0.37±9.87 -3.33±7.55 15.71±18.67 17.61±18.90独 自 居 住 4.39±14.21 1.81±16.43 -7.17±-7.17 -4.61±15.49 23.29±21.82 -2.19±21.40F 0.139 0.044 0.275 0.830 0.769 2.813P 0.871 0.957 0.760 0.439 0.466 0.064工 作有 0.78±18.17 0.50±16.30 -4.01±21.84 -2.32±16.99 17.60±24.33 -1.19±22.65无 5.31±16.89 2.68±17.22 -6.48±19.80 -0.86±16.48 18.96±22.65 1.47±17.59t -1.279 -0.622 0.592 -0.425 -0.286 -0.686P 0.203 0.535 0.555 0.671 0.775 0.494经 济 来 源固 定 工 作 7.58±18.57 1.87±17.43 2.08±20.48 -4.50±19.02 18.03±25.03 5.53±19.39临 时 工 -9.04±16.26 -5.14±19.20 -6.37±17.79 0.80±14.88 15.80±23.63 -6.85±28.21家 庭 或 朋 友 供 给 5.99±16.12 2.78±16.06 -6.88±20.12 -1.08±16.91 17.49±23.12 2.25±15.88其 他 3.60±17.93 4.88±18.23 -7.95±21.84 0.00±14.52 23.45±23.87 -3.90±20.16F 3.679 1.134 0.967 0.315 0.393 1.750P 0.014 0.338 0.410 0.815 0.758 0.160治 疗 期 间 家 人 的 精 神 支 持根 本 没 有 -8.00±21.24 -8.57±19.31 -23.77±21.84 -5.40±15.11 22.00±19.52 0.85±24.24偶 尔 -2.58±14.73 -3.12±16.91 -8.47±16.23 -2.50±12.68 23.92±30.91 -7.67±15.74有 时 有 2.52±16.09 -0.21±15.80 -10.98±18.01 -5.23±14.22 15.04±25.87 -0.16±15.21经 常 8.87±17.45 5.83±17.65 -1.94±21.06 1.33±18.47 18.84±21.16 3.30±18.11总 是 5.00±12.56 5.81±9.68 6.19±12.30 3.42±17.06 14.28±19.05 1.83±27.07F 3.218 2.503 4.896 1.316 0.564 1.099P 0.015 0.046 0.001 0.268 0.689 0.360治 疗 期 间 家 人 的 经 济 支 持根 本 没 有 -1.87±17.81 2.94±16.91 -16.38±21.23 -4.37±18.21 29.82±26.08 -6.78±25.05偶 尔 1.63±16.08 -3.06±16.70 -17.93±21.25 -5.57±11.92 15.71±26.34 -6.32±17.65有 时 有 5.62±16.33 2.46±17.96 -10.90±18.09 -1.75±15.41 15.93±23.78 -0.43±15.56经 常 5.26±20.06 1.90±18.59 -0.37±18.56 -0.79±17.54 14.94±21.30 3.57±19.19总 是 5.42±10.61 4.71±10.98 6.00±15.69 4.80±16.87 22.42±21.70 6.71±15.92F 0.696 0.451 6.386 1.071 1.530 1.997P 0.596 0.771 0.000 0.374 0.197 0.099肿 瘤 基 础147

治 疗 期 间 朋 友 的 精 神 支 持根 本 没 有 0.23±15.03 -2.46±17.22 -15.18±20.12 -7.33±14.09 22.06±26.88 0.95±17.55偶 尔 0.38±19.78 -3.37±18.78 -12.72±19.30 -7.21±13.80 17.40±21.88 -2.94±16.09有 时 有 4.76±15.75 4.25±15.78 -6.46±19.24 0.570±16.63 17.07±26.23 -1.58±17.83经 常 9.65±18.40 7.08±19.54 7.91±18.13 8.32±16.81 20.80±18.58 9.25±16.37总 是 6.71±13.19 5.85±11.23 1.55±12.74 -1.20±17.51 12.85±20.87 1.42±32.72F 1.348 2.103 5.971 4.319 0.360 1.814P 0.256 0.084 0.000 0.003 0.837 0.130治 疗 期 间 朋 友 的 精 神 支 持根 本 没 有 7.46±15.35 5.86±15.26 -5.06±16.81 -1.47±12.30 21.55±23.71 3.10±19.73偶 尔 -0.25±17.50 0.12±17.66 -12.18±23.83 -1.45±18.50 18.00±23.10 -3.20±18.01有 时 有 1.72±15.38 -4.34±15.84 -3.14±21.50 -1.00±21.99 13.45±26.15 -2.61±16.20经 常 3.40±25.29 1.09±22.92 -3.07±20.45 1.38±14.45 13.84±18.69 5.05±19.34总 是 9.28±17.55 5.71±8.49 8.88±15.50 -2.50±27.73 15.71±17.68 5.00±25.59F 1.295 1.782 1.566 0.089 0.660 0.999P 0.276 0.137 0.188 0.986 0.621 0.411治 疗 期 间 社 区 的 支 持 和 帮 助根 本 没 有 4.26±15.68 1.95±16.42 -4.80±19.01 0.35±14.98 22.35±21.31 -0.04±16.51偶 尔 3.36±18.72 -0.35±16.68 -11.42±20.85 -4.21±14.76 19.18±25.67 -0.30±18.70有 时 有 8.00±19.72 5.21±19.24 -5.88±22.31 -4.10±18.05 11.57±23.55 4.28±18.24经 常 -1.02±19.86 2.24±20.36 -6.50±21.90 1.71±20.78 8.36±27.73 1.83±18.70总 是 5.10±12.11 3.46±9.43 7.93±13.62 0.85±23.66 16.73±15.85 -0.81±38.28F 0.578 0.322 1.416 0.653 1.558 0.244P 0.679 0.863 0.232 0.626 0.189 0.913治 疗 期 间 门 诊 的 支 持 和 帮 助根 本 没 有 2.85±15.81 2.66±19.02 -3.55±22.18 -4.93±15.02 30.85±22.18 7.61±16.78偶 尔 2.65±14.18 2.75±14.95 -3.65±16.13 0.71±16.03 33.06±26.74 0.20±14.50有 时 有 3.33±18.56 0.29±14.09 -6.20±16.77 -3.16±17.28 10.00±21.64 -6.07±17.67经 常 3.93±18.15 1.72±17.41 -5.70±22.08 2.75±16.34 13.31±21.20 1.77±17.79总 是 6.85±17.22 3.77±19.20 -8.62±20.86 -6.16±16.33 20.68±22.38 1.14±24.06F 0.212 0.141 0.205 1.680 4.307 1.345P 0.931 0.967 0.935 0.159 0.003 0.257治 疗 期 间 公 安 的 支 持 和 帮 助根 本 没 有 3.26±17.11 4.36±17.22 -4.05±17.30 1.50±14.42 22.91±23.97 -0.10±19.41偶 尔 7.03±13.34 2.30±13.91 -8.88±17.49 -5.69±16.91 14.50±20.03 2.08±15.59有 时 有 1.51±19.48 -2.10±14.54 -12.67±29.60 -3.52±14.58 17.14±24.34 -5.04±22.86经 常 2.75±19.59 -1.53±19.77 -5.31±22.28 0.50±20.83 14.79±25.13 3.36±18.27总 是 10.53±16.79 7.85±17.74 4.44±8.31 -4.00±14.38 14.28±20.77 4.64±18.70F 0.629 1.049 1.273 1.045 0.903 0.676P 0.643 0.385 0.284 0.387 0.465 0.610148肿 瘤 基 础

第 十 三 届 中 国 科 协 年 会 第 18 分 会 场《 癌 症 流 行 趋 势 和 防 控 策 略 研 究 》 研 讨 会2.4 MMT 治 疗 前 后 生 活 质 量 改 变 各 维 度 的 多 因素 分 析2.4.1 身 体 健 康 状 况 的 改 善 多 元 逐 步 回 归 分 析显 示 有 地 区 、 经 济 来 源 是 否 为 临 时 工 、 治 疗 期 间 家 庭精 神 支 持 、 年 龄 和 维 持 治 疗 累 计 服 药 天 数 是 身 体 健康 状 况 的 改 善 的 影 响 因 素 (P

3 讨 论3.1 加 强 家 人 的 支 持 家 人 的 精 神 支 持 是 改 善 身体 健 康 状 况 、 心 理 健 康 状 况 及 家 庭 关 系 和 社 会 支 持的 因 素 , 而 满 意 度 的 提 高 与 获 得 家 人 的 用 于 治 疗 费和 生 活 费 等 经 济 支 持 频 率 有 关 。 心 理 干 预 是 提 高 戒毒 者 的 心 理 稳 定 性 、 依 从 性 的 重 要 措 施 , 且 可 减 少 复[6]吸 。 来 自 家 人 的 精 神 支 持 和 必 要 的 物 质 支 持 是 患 者[7]坚 持 治 疗 , 配 合 治 疗 的 重 要 动 力 。 因 此 , 提 高 家 人 的参 与 度 , 在 MMT 治 疗 中 做 好 家 属 的 工 作 , 可 能 是MMT 成 败 与 否 的 重 要 因 素 。3.2 控 制 朋 友 间 的 经 济 支 持 吸 毒 人 员 的 朋 友 非[8-9]常 少 , 且 多 为 毒 友 , 这 决 定 了 朋 友 间 的 经 济 支 持 有正 反 两 方 面 的 意 义 : 如 果 过 于 频 繁 的 经 济 支 持 , 虽 然可 以 获 得 一 定 程 度 的 归 属 感 , 但 可 能 带 来 对 海 洛 因欣 快 感 的 渴 求 , 从 而 加 剧 偷 吸 风 险 或 中 途 间 断 MMT天 数 , 降 低 了 生 活 质 量 改 善 的 程 度 , 另 一 方 面 , 正 如本 次 研 究 结 果 所 示 : 朋 友 间 的 经 济 支 持 越 多 , 家 庭 关系 和 社 会 支 持 改 善 程 度 越 高 。3.3 美 沙 酮 用 量 适 度 , 控 制 尿 检 阳 性 率 尿 检 阳性 率 越 高 , 日 常 生 活 活 动 与 经 济 状 况 的 改 善 、 心 理 健康 状 况 和 满 意 度 改 善 程 度 均 越 差 。 要 控 制 好 尿 检 阳性 率 , 也 就 是 要 减 少 患 者 偷 吸 海 洛 因 的 现 象 , 需 要 有适 度 的 美 沙 酮 用 量 , 使 之 对 海 洛 因 的 渴 求 感 得 到 充分 控 制 。 广 西 研 究 发 现 服 用 美 沙 酮 剂 量 与 维 持 治 疗时 间 呈 高 度 正 相 关 (P